Methodenartikel

Formulering van vitamine A-tracerdoses voor toediening aan menselijke proefpersonen met behulp van de retinolisotoopverdunningstechniek

187 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/69240

⸱

31 maart 2026

 , 
1Human Nutrition and Exercise Research Centre, Newcastle University, 2Fera Science Ltd

In dit artikel

Samenvatting

De bereiding van stabiele, isotoopgelabelde vitamine A, noodzakelijk voor de retinolisotoopverdunningstechniek, moet voldoen aan voedselveiligheidsnormen. Het protocol toont doseringsbereiding in plantaardige olie in concentraties die geschikt zijn voor het gekozen toedieningssysteem en het toegepaste analyseplatform.

Samenvatting

De retinolisotoopverdunningstechniek (RID) is gebaseerd op het toedienen van isotopisch gelabelde vitamine A-tracers aan menselijke proefpersonen. Hier presenteren we een methode om onderzoeksteams te begeleiden bij het bereiden van stabiele isotooptracers van vitamine A voor zowel onderzoeksstudies als populatieonderzoeken. Het artikel geeft een overzicht van de voorbereiding, inkoop van materialen, benodigde apparatuur en procedures om ervoor te zorgen dat de tracers veilig zijn voor menselijke consumptie. Vitamine A stabiele isotopentracers kunnen commercieel worden verkregen en zijn meestal gelabeld met deuterium [2H] of koolstof-13 [13C] met >95% all-trans isomerische zuiverheid en >99% isotopische verrijking. De bereiding van de vitamine A-stabiele isotooptracers houdt in dat de tracer oplost in eetbare plantaardige olie door sonicatie en hitte. Tracers moeten worden voorbereid op een concentratie die ruim binnen de volumetrische grenzen van het afgiftesysteem ligt. Ten slotte wordt de tracer gealiquoteerd in steriele amberkleurige glazen flesjes, en worden de concentraties van tracers spectrofotometrisch bevestigd.

Inleiding

Om effectieve monitoring mogelijk te maken van interventieprogramma's die gericht zijn op het verminderen van vitamine A-tekorten, is de retinolisotoopverdunningsmethode (RID) met succes toegepast om informatie te verschaffen over de totale vitamine A-voorraden (TBS) in verschillende bevolkingsgroepen 1,2,3,4. Hoewel serumretinol5, serum retinol bindend eiwit (RBP)6,7,8 en gemodificeerde relatieve dosis respons (MRDR) tests9 vaak worden gebruikt om vitamine A-tekort te bevestigen, is RID de enige methode die de totale lichaamsvoorraad A-voorraad over het volledige spectrum nauwkeurig kwantificeert — van subklinisch tekort tot toxiciteit 3,10. Door een bekende dosis gelabelde vitamine A toe te dienen en de verdunning ervan in plasma na evenwicht te meten, levert de RID-methode nauwkeurige schattingen van TBS en leverreservesvitamine A 11,12. Belangrijk is dat de RID-methode ook betrouwbaar blijft in populaties met ontsteking, waardoor deze onmisbaar is voor het evalueren van de effectiviteit van interventies en het beoordelen van toxiciteitsrisico's in overlappende supplementatie- en versterkingsprogramma's13,14.

Om de RID-methode uit te voeren, moet isotopisch gelabelde vitamine A worden toegediend als orale dosis retinylester, wat in de meeste gevallen retinylacetaat is opgelost in eetbare plantaardige olie. De meeste laboratoria verkrijgen isotoop-gelabelde vitamine A van commerciële leveranciers 1,3,7,15,16,17,18,19,20,21,22. Bijna alle commercieel verkrijgbare vitamine A-isotooptracers zijn gelabeld met stabiele isotopen van koolstof-13 [13C] of deuterium [2H] (Tabel 1). De keuze van de toegepaste isotoopdosis hangt af van het analytische instrument dat wordt gebruikt om de serum- of plasmaconcentratie van massa-gelabeld retinol te bepalen. Terwijl gaschromatografie-massaspectrometrie (GC-MS) en vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometrie (LC-MS/MS) zowel [13C] als [2H]22,23,24,25,26,27 kunnen analyseren, kan gaschromatografie-verbrandings-isotoopverhouding massaspectrometrie (GC-C-IRMS) alleen [13C] gelabelde retinoltracers 4,25 analyseren,28. De detectielimieten van het gekozen analytisch instrument, de doelgroep (kinderen of volwassenen) en de duur van het onderzoek bepalen de grootte van de dosis die moet worden toegepast 3,25,29. Tot nu toe varieerden de toegediende isotoopdoses van 0,3 - 4,3 mg retinol-equivalent (RE; gelijk aan 1 - 15 μmol RE) bij kinderenvan 3,4,30 jaar en van 0,6 - 10,0 mg RE (gelijk aan 2 - 35 μmol RE) bij volwassenenvan 2,3,3,31, waarbij recentere studies lagere doses toepassen tussen 0,3 - 0,6 mg RE (1 - 3 μmol RE) voor kinderen en 0,6 - 2,0 mg RE (2 - 7 μmol RE) bij volwassenen. Hoewel er vrees werd geuit dat een hoge massa vitamine A in de dosis de onderliggende kinetiek van vitamine A zou kunnen verstoren, bevestigde een recente analyse met compartimentaire modellering dat isotopendoses tot 7 μmol RE voor kinderen of 14 μmol RE voor volwassenen de nauwkeurigheid van TBS-voorspellingenniet zouden moeten beïnvloeden. Hier demonstreren we hoe een isotoop-gelabelde tracer wordt voorbereid voor orale toepassing met de RID-methode, rekening houdend met voedselveiligheidszorgen en het verkrijgen van nauwkeurige dosisconcentraties. De isotoopdosering is essentieel voor de RID-methode.

Protocol

Studie 1 werd goedgekeurd door de National Research Ethics Service, North-East Sunderland Committee (REC 09/H0904/20) vóór registratie bij het UK Clinical Research Network (UKCRN: 7413). Studie 2 werd goedgekeurd door de Research Ethics Board van de University of the Philippines, Manilla (IRB ID: UPMREB 2016-282-01), de Institutional Review Board van UC, Davis (IRB ID: 903681-2) en geregistreerd bij ClinicalTrials.gov (ID: NCT03030339). Studie 2 maakte deel uit van het GloVitAS-project, gefinancierd door de Bill and Melinda Gates Foundation (OPP1115464: Het risico van vitamine A-toxiciteit door grootschalige voedselverrijking en andere interventies beoordelen). Georg Lietz was de hoofdonderzoeker van het GloVitAS-project en hield toezicht op de uitvoering van de veldstudie. Een overzicht van het studieprotocol is te vinden in Figuur 1.

1. Inclusie- en exclusiecriteria

  1. Voor studie 1 waren de gegeven criteria: Inclusiecriteria: Neem gezonde mannelijke en vrouwelijke vrijwilligers met een leeftijdsbereik van 18-45 jaar op. Exclusiecriteria: Vrijwilligers met zwangerschap, roken, hoge bloeddruk, diabetes, BMI >30, lever-/nier-/maag-darmziekte, lipidestofwisselingsstoornissen en inname van multivitaminen (met vitamines A, C, E) of β-caroteen supplementen 3 maanden voor de start van het onderzoek uitsluiten.
  2. Voor studie 2 waren de gegeven criteria: Inclusiecriteria: Includeer kinderen van 12-18 maanden die gedurende de duur van het onderzoek in het studiegebied bleven. Exclusiecriteria: Uitsluiten als kinderen geen hoge dosis vitamine A-suppletie kregen en woonden in gebieden die niet werden blootgesteld aan vitamine A-verrijkte voedingsmiddelen op lokale markten.

2. Het bepalen van de totale hoeveelheid stabiele isotooptracer voor RID

  1. Bepaal de hoeveelheid stabiele isotooptracer die elk proefpersoon moet ontvangen, rekening houdend met isomerische zuiverheid. Het wordt aanbevolen om vitamine A-stabiele isotopen met >95% all-trans zuiverheid te gebruiken, aangezien biologische activiteit en metabole routes significant verschillen tussen geometrische isosomeren. Bereken het dosisniveau op basis van retinol-equivalenten (RE). Een voorbeeld van hoe dit wordt berekend is te vinden in Tabel 2.
  2. Vermenigvuldig het dosisniveau met het totale aantal proefpersonen. Basistotaal aantal proefpersonen op vermogensberekeningen voor de vereiste steekproefgrootte, maar verhoog op basis van verwachte uitval (zie bijvoorbeeld Tabel 2 ). Verhoog de totale hoeveelheid tracer die nodig is door pipetverliesen tot 20% mee te nemen.
    OPMERKING: Als regel moet de isotoopbereiding een overschot bevatten, omdat het niet mogelijk is om al het materiaal uit het flesje terug te winnen. Verliezen zullen verder optreden door de viscositeit van de olie die aan de buitenkant van de pipettip achterblijft. Om nauwkeurige volumes van de dosis tijdens de aflevering te verkrijgen, moet overtollige olie aan de buitenkant van de pipettip worden weggeveegd. Operators kunnen pipetverliesen minimaliseren als de pipettip niet te diep in de olie wordt gedoopt.

3. Het bepalen van de hoeveelheid plantaardige olie die nodig is om de stabiele isotooptracer op te lossen

  1. Bepaal welke plantaardige olie je gebruikt en welk doseringsvolume per proefpersoon is (Tabel 2). Bepaal de hoeveelheid toegevoegde olie door het toedieningssysteem dat wordt gebruikt tijdens het doseren van proefpersonen.
    OPMERKING: We gebruiken zonnebloemolie vanwege het hoge vitamine E-gehalte, wat de stabiliteit van de vitamine A-bereiding32,33 bevordert. Andere plantaardige oliën zijn echter door andere groepen gebruikt om aan lokale dieetnormen te voldoen. Aangezien de RID afhankelijk is van nauwkeurige afgifte van stabiele, isotoopgelabelde tracers, wordt aanbevolen een positieve verplaatsingspipet te gebruiken voor dosistoepassing bereid in eetbare olie. De meeste recente studies hebben volumes tot 250 μL gebruikt, vooral als de dosis aan kinderenwordt toegediend 1,7,23.
  2. Bereken de dosisconcentratie van de stabiele isotooptracer in [mg/mL] plantaardige olie. Bepaal het totale volume plantaardige olie dat nodig is. Bereken het gewicht van de benodigde olie, gebaseerd op het berekende volume en de relatieve dichtheid van de plantaardige olie (zie Tabel 2 voor een voorbeeld).
    OPMERKING: Voor nauwkeurigheid wordt aanbevolen de olie te wegen voor stabiele isotooptracer-voorbereiding. Zodra het totale volume benodigde olie is berekend, kan de stabiele isotoop-gelabelde tracer worden besteld. Het is belangrijk om te verzoeken dat de isotooptracer wordt verzonden in een fles met voldoende volume zodat het onderzoeksteam de plantaardige olie direct in de fles met de isotoopgelabelde tracer kan wegen.

4. Bereiding van stabiele isotoop-gelabelde tracer in speciale gebieden voor voedselbereiding

  1. Open voorzichtig het deksel van de amberkleurige fles met de vooraf bepaalde totale hoeveelheid van de stabiele isotooptracer en plaats deze op een analyseweegschaal, die vervolgens tot nul wordt getard.
  2. Voeg de olie druppelgewijs toe totdat het gewenste gewicht is bereikt (met een nauwkeurigheid van ± 0,1 g) met een steriele 10 mL spuit.
    OPMERKING: Omdat sommige retinylacetaatkristallen mogelijk in de dop van de amberkleurige fles zitten, moet de fles zeer voorzichtig worden geopend. Na het toevoegen van de plantaardige olie aan de amberkleurige fles wordt de dop voorzichtig teruggeplaatst, waarna deze voorzichtig met de hand wordt geschud om eventuele retinylacetaatkristallen die in de dop achterbleven opnieuw te laten ophangen.
  3. Plaats de fles in een sonicerend waterbad met ultrasone vermogen: 14 W/L en bedrijfsfrequentie: 44 kHz. Vul met water tot boven het olieniveau in de fles, maar onder het dekselniveau, om te voorkomen dat er per ongeluk water in de bereiding terechtkomt.
  4. Sonicaer de fles 15 minuten voordat je voorzichtig met de hand mengt, gevolgd door nog eens 15 minuten soniceren. Er moet op worden gelet dat de temperatuur van het sonicerende waterbad niet hoger is dan 50 °C.
    OPMERKING: Met zonnebloemolie voor de bereiding hebben we vastgesteld dat isomerisatie naar cis-retinoïden niet plaatsvindt wanneer de dosis 30 minuten aan 50 °C wordt blootgesteld (zie Figuur 2). Toch moeten preparaten door HPLC worden geanalyseerd om de mate van thermische isomerisatie te beoordelen.
  5. Plaats de fles in een verwarmd waterbad op 50 °C gedurende 30 minuten om de microkristallen volledig op te lossen.
  6. Neem een oliemonster van 20 μL om te controleren op de aanwezigheid van microkristallen onder een lichtmicroscoop met 200x vergroting in een laboratorium. Als er microkristallen aanwezig zijn, herhaal dan de sonicatie- en verwarmingsprocedure.
  7. Zodra de volledige oplossing is bereikt, aliquot de volledige oliebereiding in 2 - 4 ml steriele glazen amberkleurige flesjes. Gebruik voor deze procedure positieve verplaatsingspipetten om kruisbesmetting te voorkomen.
    OPMERKING: Het volume stabiele isotooptracer dat aan de glazen amberkleurige flesjes wordt toegevoegd, kan worden bepaald door de dagelijkse rekruteringssnelheid, bijvoorbeeld als er dagelijks 5 proefpersonen worden gerekruteerd en het dosisvolume 150 μL is, moet het buisje voldoende volume bevatten om 5 doses plus pipetverliesen te compenseren: 5 x 150 μL x 1,2 = 900 μL.
  8. Bepaal de stabiele isotoopconcentratie in drievoudig exemplaar. Reserve 200 μL pure plantaardige olie (gebruikt voor de bereiding van een spectrofotometrische blank) en 200 - 350 μL van de stabiele isotoopdosis in aparte 2 mL amberkleurige flesjes tijdens de bereiding van de stabiele isotoop-gelabelde tracer.
    1. Als de dosisconcentratie ≤ 0,5 mg RE is, reserveer dan 350 μL van het stabiele isotoop in een apart amberkleurig flesje van 2 mL. Voor dosisconcentraties > 0,5 mg RE reserveer je 200 μL van de stabiele isotoopdosis in een apart amberkleurig flesje van 2 mL.
  9. Bedek de flesjes met een inert gas (Ar) om de potentiële oxidatie van de isotoop-gelabelde tracer te vertragen, sluit ze stevig en bewaar ze in een cryobox met een label met isotoopconcentratie, dosisvolume (later bepaald bepaald), voorbereidingsdatum en projectnaam. Bewaar de cryobox in een voedselvriezer van -20 °C tot verzending. Onder deze omstandigheden blijft de tracer-dosis minstens 2 jaar stabiel.

5. Bepaling van stabiele isotooptracerconcentratie in het laboratorium

  1. Verdun de stabiele isotooptracer in 3 volumetrische kolven met n-hexaan. Vul volumetrische kolven met n-hexaan tot 1 cm onder de kalibratielijn voordat je de tracer-dosis toevoegt.
    1. Bepaal de verdunning van de stabiele isotooptracer door de concentratie van de tracerdosis. Als de dosisconcentratie van de stabiele isotooptracer ≤ 0,5 mg RE is, verdun dan 100 μL van de stabiele isotoopdosis in een 50 mL volumetrische kolf met n-hexaan. Als de dosisconcentratie tussen 0,5 - 2 mg RE ligt, dan 50 μL van de stabiele isotoopdosis in een 50 mL volumetrische kolf met n-hexaan. Als de dosisconcentratie >2 mg RE is, dan 50 μL van de stabiele isotoopdosis in een volumetrische kolf van 100 mL met n-hexaan.
    2. Doseer direct 50 of 100 μL olie in het hexaan en de kolf maakt 50 of 100 mL volume met extra hexaan met een glazen Pasteur-pipet. Draai de kolf 10 keer om om de olie met het hexaan te mengen.
      VOORZICHTIG: Hexaan moet worden behandeld in een dampkast, met het juiste PBM. Afvalhexaan wordt verzameld in een speciale container voor gespecialiseerde verwijdering door een goedgekeurde aannemer.
  2. Bereid de spectrofotometrische blanco fles voor door hetzelfde volume plantaardige olie als de stabiele isotooptracer (50 of 100 μL) te pipetten en dit in hexaan te doseren. Zorg ervoor dat de toegepaste verdunning (50 of 100 mL) hetzelfde is als voor de stabiele isotooptracer. Draai de kolf 10 keer om om de olie met het hexaan te mengen.
    OPMERKING: Voor het pipetten van stabiele isotooptracer of pure olie wordt een 100 μL verplaatsingspipet gebruikt. Om nauwkeurige volumes te laten pipetteren, is het cruciaal dat de punt naar beneden wordt afgeveegd met pluisvrij papier om resterende tracer/olie van de buitenkant van de tip te verwijderen. Bij het afvegen van de directe vervangende pipettip moet voorzichtig worden behandeld zodat het papier niet in contact komt met de tipopening, omdat er olie uit de tip wordt gezogen.
  3. Meet de stabiele concentraties isotooptracers in een kwartscuvette met een spectrofotometer ingesteld op een golflengte van 325 nm, waarbij de plantaardige olie in hexaan als spectrofotometrische blanco wordt gebruikt (zie Tabel 3 voor een voorbeeld).
    1. Begin met metingen met de plantaardige olie in hexaan als spectrofotometrische blank. Maak de kwarts UV-cuvette tussen elke meting schoon door hem 3x te spoelen met n-hexaan. Nadat alle monsters zijn gemeten, maak je de cuvette zorgvuldig schoon met pure n-hexaan.
  4. Bepaal de concentratie van de stabiele isotooptracer met behulp van de gemiddelde AU-metingen en pas de isotoopspecifieke molaire extinctiecoëfficiënt toe met behulp van de Beer-Lambertwet. Hieruit bereken je het volume van de voorbereide stabiele isotooptracer die per dosis nodig is (zie voorbeeld in representatieve resultaten hieronder en in Tabel 3).

Resultaten

Berekening van totale isotooptracer-dosisgrootte
Voor een studie van een steekproefgrootte van 100 proefpersonen werd de totale hoeveelheid [13C10] retinylacetaat berekend om de hoeveelheid [13C10] retinylacetaat te identificeren die gesynthetiseerd moest worden (Tabel 2). De hoeveelheid is gebaseerd op vermogensberekeningen voor de vereiste steekproefgrootte (n = 100), verwachte uitputting (n=15; 15% uitval), pipetverliesen (20%) en [13C10] retinylacetaatconcentratie per dosis (0,4 mg RE; gebaseerd op de gevoeligheid van de toegepaste massaspectrometer, de duur van het experiment en de leeftijdsgroep van de proefpersonen). De verkregen totale hoeveelheid RE die nodig is (55,2 mg RE) wordt vervolgens omgezet in het vereiste gewicht voor [13C10]retinylacetate (63 mg).

Om het benodigde volume zonnebloemolie te berekenen om [13C10]retinylacetate op te lossen in de gewenste concentratie, stellen we eerst het dosisafgiftevolume in op 150 μL/dosis (0,15 mL/dosis). Hierna wordt de concentratie van [13C10]retinylacetaat in 1 mL zonnebloemolie berekend (Tabel 2). Door het vereiste gewicht van [13C10]retinylacetat (63 mg) te delen door de vereiste dosisconcentratie, ontstaat het totale volume zonnebloemolie dat nodig is. Ten slotte wordt het gewicht van zonnebloemolie bepaald door gebruik te maken van de relatieve dichtheid van zonnebloemolie.

De nauwkeurige streefdosisconcentratie van [13C10]retinylacetat in olie werd bevestigd door het meten van de stabiele isotooptracerconcentraties met een spectrofotometer op basis van de Beer-Lambertwet (Tabel 3). Rekening houdend met de verdunning van de stabiele isotooptracer tijdens de meting (verdunningsfactor van 500) levert een concentratie van 2,58 μmol/μL [13C10] retinylacetat in olie op. Het uiteindelijke volume van de voorbereide stabiele isotooptracer die nodig was voor een 0,4 mg RE-dosis werd daarom vastgesteld op 155 μL (Tabel 3).

Controleren op mogelijke isomerisatie van de tracer-dosis
De isomerische zuiverheid van de verkregen tracer-dosis werd bepaald door te controleren op cis-isomerisatie met behulp van High Performance Liquid Chromatography (HPLC; Figuur 2). Om dit uit te voeren werd een monster uit de verdunde traceroplossing uit stap 5.1.2 gedroogd onder stikstofgas en het residu opnieuw opgelost tot 100% ethanol voor injectie. HPLC-analyse van 3 herhaalde monsters werd uitgevoerd met de methode van Liu et al.34 om te controleren op cis-isomerisatie (zie Figuur 2). De zuiverheid van de tracer-dosis moet gedurende het hele onderzoek worden gecontroleerd om te zorgen dat de dosis niet degradeert.

Effect van tracerdosisconcentraties op een fractie van de dosis in de tijd
Toepassing van verschillende dosisniveaus leidt tot een variërend aandeel van de ingenomen dosis in de loop van de tijd, wat het vermogen van het analyseplatform kan beïnvloeden om [13C10] retinol bij alle proefpersonen op de vereiste tijdstippen te detecteren. Het toepassen van een dosis van 1 mg of 0,4 mg [13C10] retinylacetat in olie bij volwassenen (Figuur 3A) of kinderen (Figuur 3B) gaf een hoger aandeel van de dosis na toediening van 1 mg aan vergeleken met 0,4mg [13C10]retinylacetaat en bevestigde het vermogen van de toegepaste LC-MS/MS om [13C10] te detecteren]retinol bij proefpersonen tot 28 dagen na de dosering. Dit bevestigt dat de informatie over het aandeel van de dosis op verschillende tijdstippen cruciaal is om te bepalen of het toegepaste dosisniveau hoog genoeg is om een signaal boven het detectieniveau voor het toegepaste analyseplatform te verkrijgen, en dat deze informatie idealiter tijdens een pilotstudie met representatieve monsters moet worden verkregen.

figure-results-1
Figuur 1: Stroomdiagram voor de bereiding van vitamine A-tracerdoses. Belangrijke stappen voor het uitvoeren van stabiele isotoopdosering zijn onder andere het bepalen van de benodigde hoeveelheden, de concentratie van de verkregen tracer-dosis en bevestiging van de zuiverheid van de dosis. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: HPLC-chromatogram van de tracerdosis om de isomerisatie van retinylacetaat te onderzoeken. Potentiële isomerisatie van [13C10]retinylacetat na (A) sonicatie en (B) verhitting tot 50 °C gedurende elk 30 minuten werd beoordeeld met HPLC-analyse van de isotoopdosis na elke stap. De analyse werd uitgevoerd op een HPLC met diode-arraydetectie met de methode van Liu et al.34. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Waargenomen gemiddelden van de plasmaretinolfractie van de dosis over tijd na inname van [13C10]retinylacetaat. Aandeel van de dosis van (A) 45 Britse volwassenenvan 16 jaar en (B) 112 Filipijnse kinderen1 die respectievelijk een dosis van 1 mg of 0,4 mg [13C10] retinylacetatie kregen toegediend. Fractie van de dosis = {plasma [13C]retinolconcentratie (μmol/L) X geschatte plasmavolume (L) / [13C]dosis (μmol). Gegevens weergegeven als geometrisch gemiddelde ± SEM. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Stabiele isotoopLeverancier/Fabrikant
[D4]-retinylacetaatBuchem BV/ReseaChem GmbH/ Cambridge Isotope Laboratorium
[D6]-retinylacetaatBuchem BV/ReseaChem GmbH/ Cambridge Isotope Laboratorium
[D8]-retinylacetaatBuchem BV/ReseaChem GmbH/ Cambridge Isotope Laboratorium
[13C3]-retinylacetatieBuchem BV/ReseaChem GmbH
[13C4]-retinylacetatieBuchem BV/ReseaChem GmbH/ Cambridge Isotope Laboratorium
[13C8]-retinylacetatieBuchem BV/ReseaChem GmbH/ Cambridge Isotope Laboratorium
[13C10]-retinylacetatieBuchem BV/ReseaChem GmbH/ Cambridge Isotope Laboratorium

Tabel 1: Commercieel verkrijgbare stabiele vitamine A-isotoop tracers. Lijst van 13C en 2H gelabelde retinylacetaat tracers van verschillende leveranciers.

Parameters
Steekproefgrootte [n]:100
Uitputting [n] (%):15 (15%)
Pipetverlies:20%
MW [13C10] retinylacetaat:338,5 μg/μmol
MW [13C10] retinol:296,46 μg/μmol
Doseringsgrootte:0,4 mg RE van [13C10]retinylacetatie per vrijwilliger
Berekening
Totale hoeveelheid RE die nodig is:= dosisgrootte in mg RE x steekproefgrootte x uitval x afname x pipetverlies.
= 0,4 mg RE x 100 x 1,15 x 1,2
= 55,2 mg RE
Totale benodigde hoeveelheid [13C10]retinylacetaat:= mg RE x MW [13C10]retinylacetat / MW [13C10]retinol
= 55,2 mg RE x 338,5 μg/μmol / 296,46 μg/μmol
= 63,0 mg [13C10]retinylacetatie
Dosisconcentratie van [13C10] retinylacetatie in olie:[13C10]retinylacetatie [mg/ml] =
(mg RE x MW [13C10] retinylacetaat / MW [13C10] retinol) / 0,15 ml
= (0,4 mg RE x 338,5 μg/μmol / 296,46 μg/μmol) / 0,15 ml
= 3,04 mg/ml
Totale hoeveelheid zonnebloemolie die nodig is:= Totale [13C10]gewicht / dosis van retinylacetatie in olie
= 63,0 mg / 3,04 mg/ml
= 20,7 ml olie
Gewicht van zonnebloemolie dat nodig is:= Totaal volume zonnebloemolie x relatieve dichtheid zonnebloemolie
= 20,7 ml x 0,92 g/ml
= 19,0 g zonnebloemolie

Tabel 2: Voorbeeld van de berekening van de dosisgrootte van de isotoop tracer. Indicatie van parameters en berekeningen om de tracer-dosis en de hoeveelheden plantaardige olie te bepalen.

Parameters
Molaire extinctiecoëfficiënt (E1%1cm) van [13C10]retinylacetatie in hexaan:52718 L mol-1 cm-1 x 1 cm
Verdunningsfactor:500 (100μL oliebereiding in 50 ml hexaan)
Gemeten gemiddelde absorptie:0.917
MW [13C10] retinol:296,46 μg/μmol
Berekening
Concentratie (mol/L) van [13C10]retinylacetat in hexaan:Concentratie (mol/L) = Absorptie / E1%1 cm x lengte van de cuvette (1 cm)
= 0,917 / 52718 L mol-1 cm-1 x 1 cm = 1,739 x 10-5 mol/L
Concentratie omzetten in μmol/μL:Concentratie (mol/L) = Concentratie (μmol/μL)
1,739 x 10-5 mol/L is gelijk aan 1,739 x 10-5 μmol/μL
Corrigeren voor verdunning:1,739 x 10-5 μmol/μL x 500 = 8,697 x 10-3 μmol/μL in olie
Gewicht per μL (μg/μL):= [13C10]retinylacetaat μmol/μL in olie x MW [13C10]retinol
= 8,697 x 10-3 μmol/μL x 296,45 μg/μmol = 2,58 μg/μL
Volume per dosis:= Volume (μL/ 400 μg dosis) = 400μg / 2,58 μg/μL = 155 μL

Tabel 3: Bepaling van de stabiele isotoop-tracerdosisconcentratie. Vereiste parameters en berekeningen om de concentraties van tracer-doseringen en de benodigde volumes voor orale dosering te bepalen.

Discussie

Stabiele isotooptracers die in menselijke studies worden gebruikt, worden over het algemeen als veilig beschouwd, zonder gerapporteerde nadelige biologische of fysiologische effecten bij de toegepaste concentraties25,35. Omdat de stabiele isotooptracer echter oraal toegediend moet worden, is het essentieel dat de tracer-dosis voldoet aan voedselveiligheidsnormen. Dit kan worden bereikt door te eisen dat leveranciers en fabrikanten van stabiele, isotoop-gelabelde vitamine A voedselveiligheidstests uitvoeren op de geleverde isotopen 7,20,24. Evenzo is het van groot belang dat isotopenbereiding en opslag alleen plaatsvinden in speciale gebieden voor voedselbereiding. Bovendien moet alle apparatuur die wordt gebruikt voor het bereiden van stabiele isotopen uitsluitend voor isotopenbereiding worden gebruikt en in gebieden worden bewaard voor voedselbereiding.

Isotopen gelabeld met retinylacetatie zijn eerder opgelost met ethanol, vervolgens gedroogd onder stikstofgas voordat ze werden opgelost in plantaardige olie36. Hier presenteren we een methode waarmee de isotoop-gelabelde tracer kan worden opgelost tot plantaardige olie door een combinatie van sonicatie en warmte. Hoewel deze methode gemakkelijker uit te voeren is in een voedselbereidingsgebied, moet er voorzichtig worden omgegaan bij het aanbrengen van hitte om de tracer op te lossen in plantaardige olie. All-trans-retinol wordt tijdens warmtebehandeling geïsomeriseerd tot 13-cis-retinol, dat versnelt bij hogere temperaturenvan 37. Isomerisatie van retinol neemt verder toe door blootstelling aan licht32. Bovendien wordt de stabiliteit van retinol beïnvloed door de lipidoxidatie-eigenschap van de plantaardige olie32,38. Omdat het α-tocopferolgehalte in plantaardige olie een positief effect heeft op vitamine A-retentie32, en zonnebloemolie een van de hoogste gehaltes α-tocopherol33 heeft, hebben we ervoor gekozen zonnebloemolie te gebruiken bij het bereiden van de tracerdoseringen. De beslissing om tot 50°C warmte toe te passen om de tracer op te lossen was gebaseerd op het aanbrengen van warmte om retinolkristallen in cosmetische producten op te lossen zonder significant verliesvan 39. Hoewel we onder het beschreven protocol geen significante afbraak van retinylacetaat hebben waargenomen, is het essentieel om direct na de warmtebehandeling te controleren op cis-isomerisatie van de tracer-dosis (Figuur 2). We bevelen verder aan dat de stabiliteit van de tracer-dosis gedurende het hele onderzoek wordt gemonitord om de toegepaste tracerdosisconcentratie te bevestigen.

De tracer moet worden bereid in een concentratie die ruim binnen de volumetrische grenzen van het afgiftesysteem ligt dat wordt gebruikt om de vereiste dosis toe te dienen. Aangezien de RID afhankelijk is van nauwkeurige afgifte van stabiele, isotoopgelabelde tracers, wordt aanbevolen een positieve verplaatsingspipet te gebruiken voor dosistoepassing. Hoewel dosegroottes tot 1 mL in het verleden zijn toegepast op volwassenenvan 16, 20 en 40, is het gemakkelijker om volumes tussen 100 en 250 μL toe te passen, omdat deze volumes goed verdragen zijn door zuigelingenen kinderen. Alternatief kunnen doses ook in capsulevorm17 worden toegediend, maar het is essentieel capsules te selecteren die specifiek zijn ontworpen om olielekkage te voorkomen en acceptatie binnen de studiepopulatie te waarborgen. Ten slotte zijn de toegepaste dosisniveaus afhankelijk van de leeftijdsgroep van de doelpopulatie29, het vermogen van het toegepaste analytische platform om lage niveaus te detecteren3 en de totale lichaamsvoorraden van de doelpopulatie, met een lagere plasmafractie van de dosis bij hogere totale lichaamsvoorraden1.

Zoals aangegeven in het bovenstaande voorbeeld, zal [13C10]retinylacetat bij een concentratie van 2,58 μg/μL in zonnebloemolie een dosis 0,4 mg RE-tracer leveren in 155 μL zonnebloemolie, die nauwkeurig kan worden toegediend met een 250 μL positieve verplaatsingspipet. Om concentraties te verkrijgen binnen de volumetrische grenzen van het afgiftesysteem, is het cruciaal dat de plantaardige olie die gekozen is om de tracer te oplossen nauwkeurig wordt gewogen met een analytisch weeggewicht (nauwkeurig tot 0,1 g) in de fles met de stabiele isotooptracer. Als bijvoorbeeld in totaal 63 mg [13C10] retinylacetat wordt bereid bij een concentratie van 3,04 mg/mL in zonnebloemolie, en de soortelijke massa van zonnebloemolie is 0,92 g/mL bij 25 ◦C, dan moet 19,0 g (20,7 mL x 0,92 g/mL) olie worden wegend in de fles met de tracer. Hoewel de uiteindelijke concentratie van de stabiele isotooptracer wordt bevestigd met behulp van een spectrofotometer, garandeert nauwkeurig wegen van de isotooptracer en de toegepaste olie dat de verkregen concentraties dicht bij het gekozen afgiftevolume voor elke dosis liggen.

Het is raadzaam om oliebereidingen te aliquoteren op basis van de verwachte dagelijkse behoefte, zodat alle doses in een flesje binnen 2 weken na het openen van het flesje worden gebruikt. Het is het beste om de oliepreparaten tijdens gebruik op ijspakken in het veld te bewaren en ze zo snel mogelijk opnieuw in te vriezen nadat de dosering is voltooid. Hoewel de oliepreparaten niet worden beïnvloed door herhaalde vries- en ontdooicycli, moeten ze altijd beschermd worden tegen licht en bevroren worden wanneer ze niet in gebruik zijn.

Samenvattend beschrijft dit protocol de precieze voorbereiding en kwaliteitscontrole van tracerdoses voor de RID-methode, waarbij nauwkeurige dosering, stabiliteit en veiligheid worden gegarandeerd. De methode berekent de tracerbehoefte, optimaliseert oplosbaarheid in plantaardige olie en verifieert zuiverheid en concentratie met behulp van spectrofotometrie en HPLC. Strenge richtlijnen voor behandeling en opslag garanderen betrouwbare tracerintegriteit voor nauwkeurige isotoop-gebaseerde beoordelingen.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te verklaren.

Dankbetuigingen

Ondersteuning voor dit werk werd geleverd door de Bill & Melinda Gates Foundation (Projectnummer: OPP1115464) en het Internationaal Atoomenergieagentschap (IAEA) in Wenen (Projectnummer E4.30.30).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
2ml barnstenen glazen injectieflacons voor het verdelen van dosesFisher11573690Afhankelijk van de monsterschaal van het onderzoek en het aantal vrijwilligers dat dagelijks wordt gedoseerd, kan het efficiënter zijn om grotere, bijv. 4ml, barnstenen injectieflacons te gebruiken
100ml volumetrische kolvenFisher11323644Pyrex Borosilicaat Glas Klasse A Gecertificeerde Volumetrische Kolf
50ml volumetrische kolvenFisher11313644Pyrex Borosilicaat Glas Klasse A Gecertificeerde Volumetrische Kolf
Analytische weegschalen Fisher13592970
Capillaire plunjerpompen (pipettips) CP100 10x96 TIPACKGilsonFD148314
Capillaire plunjerpompen CP1000ST 2x91GilsonF148180
Capillaire plunjerpompen CP250ST 6x96GilsonF148714
Karton cryoboxStarlabA9623-8181
Hellma cuvet UV kwartsSLSCEL1600
Hexaan 95% n-Hexaan voor HPLC Gecertificeerd HPLCFisherH/0406/17
Decklidjes voor 2ml barnstenen glazen injectieflaconsFisher11573542
Microman E M1000E Pipet (positieve verplaatsing)GilsonFD10006
Microman E M100E Pipet (positieve verplaatsing)GilsonFD10004
Microman E M250E Pipet (positieve verplaatsing)GilsonFD10005
MicroscoopNikonEclipse E400
Microscoop glazen slides Sigma41122601
Sonicerende waterbadVWRUSC100T
SpectrofotometerThermo Fisher ScientificA51119600C
Stabiel isotoop gelabelde retinylacetaat tracerBuchem BVN/AEen reeks stabiele isotopen kan worden gebruikt voor de RID-methode. Een lijst van verschillende commercieel verkrijgbare isotopen wordt gegeven in Tabel 1. 
Ongeroerde waterbadSLSSLS1176
Plantaardige olieElke supermarktN/AHet is belangrijk om verse plantaardige olie met voldoende houdbaarheid te gebruiken voor het bereiden van isotoopdoses.
Volac ongeplugde glazen pasteurpipet 150mmSLSPIP4150

Referenties

  1. Ford, J. L., et al. Use of Model-Based Compartmental Analysis and a Super-Child Design to Study Whole-Body Retinol Kinetics and Vitamin A Total Body Stores in Children from 3 Lower-Income Countries. J Nutr. 150 (2), 411-418 (2020).
  2. Haskell, M. J., Jamil, K. M., Peerson, J. M., Wahed, M. A., Brown, K. H. The paired deuterated retinol dilution technique can be used to estimate the daily vitamin A intake required to maintain a targeted whole body vitamin A pool size in men. J Nutr. 141 (3), 428-432 (2011).
  3. Lietz, G., et al. Current Capabilities and Limitations of Stable Isotope Techniques and Applied Mathematical Equations in Determining Whole-Body Vitamin A Status. Food Nutr Bull. 37, S87-S103 (2016).
  4. Pinkaew, S., et al. Triple-Fortified Rice Containing Vitamin A Reduced Marginal Vitamin A Deficiency and Increased Vitamin A Liver Stores in School-Aged Thai Children. J Nutr. 144 (4), 519-524 (2014).
  5. VMNIS: Serum retinol concentrations for determining the prevalence of vitamin A deficiency in populations. , World Health Organisation. https://www.who.int/publications/i/item/WHO-NMH-NHD-MNM-11.3 (2011).
  6. Engle-Stone, R., et al. Plasma retinol-binding protein predicts plasma retinol concentration in both infected and uninfected Cameroonian women and children. J Nutr. 141 (12), 2233-2241 (2011).
  7. Engle-Stone, R., et al. Filipino Children with High Usual Vitamin A Intakes and Exposure to Multiple Sources of Vitamin A Have Elevated Total Body Stores of Vitamin A But Do Not Show Clear Evidence of Vitamin A Toxicity. Curr Dev Nutr. 6 (8), nzac115(2022).
  8. Larson, L. M., et al. Approaches to Assess Vitamin A Status in Settings of Inflammation: Biomarkers Reflecting Inflammation and Nutritional Determinants of Anemia (BRINDA) Project. Nutrients. 10 (8), (2018).
  9. Sheftel, J., Tanumihardjo, S. A. Systematic Review and Meta-Analysis of the Relative Dose-Response Tests to Assess Vitamin A Status. Adv Nutr. 12 (3), 904-941 (2021).
  10. Tanumihardjo, S. A., et al. Biomarkers of Nutrition for Development (BOND)-Vitamin A Review. J Nutr. 146 (9), 1816-1848 (2016).
  11. Furr, H. C., et al. Vitamin A concentrations in liver determined by isotope dilution assay with tetradeuterated vitamin A and by biopsy in generally healthy adult humans. Am J Clin Nutr. 49 (4), 713-716 (1989).
  12. Haskell, M. J., et al. Assessment of vitamin A status by the deuterated-retinol-dilution technique and comparison with hepatic vitamin A concentration in Bangladeshi surgical patients. Am J Clin Nutr. 66 (1), 67-74 (1997).
  13. Green, M. H., Ford, J. L., Green, J. B. Development of a Compartmental Model to Investigate the Influence of Inflammation on Predictions of Vitamin A Total Body Stores by Retinol Isotope Dilution in Theoretical Humans. J Nutr. 151 (3), 731-741 (2021).
  14. Suri, D. J., et al. Association between Biomarkers of Inflammation and Total Liver Vitamin A Reserves Estimated by (13)C-Retinol Isotope Dilution among Preschool Children in 5 African Countries. J Nutr. 153 (13), 622-635 (2023).
  15. Furr, H. C., et al. Stable isotope dilution techniques for assessing vitamin A status and bioefficacy of provitamin A carotenoids in humans. Public Health Nutr. 8 (6), 596-607 (2005).
  16. Green, M. H., et al. A Retinol Isotope Dilution Equation Predicts Both Group and Individual Total Body Vitamin A Stores in Adults Based on Data from an Early Postdosing Blood Sample. J Nutr. 146 (10), 2137-2142 (2016).
  17. Green, M. H., et al. Use of Population-Based Compartmental Modeling and Retinol Isotope Dilution to Study Vitamin A Kinetics and Total Body Stores among Ghanaian Women of Reproductive Age. Curr Dev Nutr. 8 (11), 104484(2024).
  18. Haskell, M. J., et al. Population-based plasma kinetics of an oral dose of [2H4]retinyl acetate among preschool-aged, Peruvian children. Am J Clin Nutr. 77 (3), 681-686 (2003).
  19. Lopez-Teros, V., et al. Use of a "Super-child'' Approach to Assess the Vitamin A Equivalence of Moringa oleifera Leaves, Develop a Compartmental Model for Vitamin A Kinetics, and Estimate Vitamin A Total Body Stores in Young Mexican Children. J Nutr. 147 (12), 2356-2363 (2017).
  20. Oxley, A., et al. An LC/MS/MS method for stable isotope dilution studies of beta-carotene bioavailability, bioconversion, and vitamin A status in humans. J Lipid Res. 55 (2), 319-328 (2014).
  21. Ribaya-Mercado, J. D., et al. Quantitative assessment of total body stores of vitamin A in adults with the use of a 3-d deuterated-retinol-dilution procedure. Am J Clin Nutr. 77 (3), 694-699 (2003).
  22. Tang, G. W., Qin, J., Hao, L. Y., Yin, S. A., Russell, R. M. Use of a short-term isotope-dilution method for determining the vitamin A status of children. Am J Clin Nutr. 76 (2), 413-418 (2002).
  23. Oxley, A., et al. Determination of Vitamin A Total Body Stores in Children from Dried Serum Spots: Application in a Low- and Middle-Income Country Community Setting. J Nutr. 151 (5), 1341-1346 (2021).
  24. Oxley, A., Lietz, G. Use of stable isotopes to study bioconversion and bioefficacy of provitamin A carotenoids. Methods Enzymol. 670, 399-422 (2022).
  25. Preston, T. Existing and emerging technologies for measuring stable isotope labelled retinol in biological samples: isotope dilution analysis of body retinol stores. Int J Vitam Nutr Res. 84 (Suppl 1), 30-39 (2014).
  26. Tang, G. W., Qin, J., Dolnikowski, G. Deuterium enrichment of retinol in humans determined by gas chromatography electron capture negative chemical ionization mass spectrometry. J Nutr Biochem. 9 (7), 408-414 (1998).
  27. Wang, J., et al. Vitamin A equivalence of spirulina beta-carotene in Chinese adults as assessed by using a stable-isotope reference method. Am J Clin Nutr. 87 (6), 1730-1737 (2008).
  28. Gannon, B., et al. Biofortified orange maize is as efficacious as a vitamin A supplement in Zambian children even in the presence of high liver reserves of vitamin A: a community-based, randomized placebo-controlled trial. Am J Clin Nutr. 100 (6), 1541-1550 (2014).
  29. Green, M. H., Lopez-Teros, V., Green, J. B. Does the Amount of Stable Isotope Dose Influence Retinol Kinetic Responses and Predictions of Vitamin A Total Body Stores by the Retinol Isotope Dilution Method in Theoretical Children and Adults. J Nutr. 152 (1), 86-93 (2022).
  30. Ribaya-Mercado, J. D., et al. Bioconversion of plant carotenoids to vitamin A in Filipino school-age children varies inversely with vitamin A status. Faseb J. 14 (4), A486-A486 (2000).
  31. Valentine, A. R., Davis, C. R., Tanumihardjo, S. A. Vitamin A isotope dilution predicts liver stores in line with long-term vitamin A intake above the current Recommended Dietary Allowance for young adult women. Am J Clin Nutr. 98 (5), 1192-1199 (2013).
  32. Hemery, Y. M., et al. Influence of light exposure and oxidative status on the stability of vitamins A and D3 during the storage of fortified soybean oil. Food Chem. 184, 90-98 (2015).
  33. Shahidi, F., de Camargo, A. C. Tocopherols and Tocotrienols in Common and Emerging Dietary Sources: Occurrence, Applications, and Health Benefits. Int J Mol Sci. 17 (10), (2016).
  34. Liu, Z., Lee, H. J., Garofalo, F., Jenkins, D. J. A., El-Sohemy, A. Simultaneous Measurement of Three Tocopherols, All-trans-retinol, and Eight Carotenoids in Human Plasma by Isocratic Liquid Chromatography. J Chromatograph Sci. 49 (3), 221-227 (2011).
  35. Davies, P. S. W. Stable isotopes: their use and safety in human nutrition studies. Eur J Clin Nutr. 74 (3), 362-365 (2020).
  36. Haskell, M. J., Ribaya-Mercado, J. D. Handbook on Vitamin A Tracer Dilution Methods to Assess Status and Evaluate Intervention Programs. , Harvest Plus Technical Monographs. (2005).
  37. Han, S. H., et al. Quantitative characterization of degradation behaviors of antioxidants stabilized in lipid particles. Talanta. 71 (5), 2129-2133 (2007).
  38. Park, H., Mun, S., Kim, Y. R. UV and storage stability of retinol contained in oil-in-water nanoemulsions. Food Chem. 272, 404-410 (2019).
  39. Retinol 50C, 15D and 10S. , BASF. https://www.skinident.world/fileadmin/img/spanish-pictures/pdf/BASF_Vitamin_A.pdf (2005).
  40. Green, M. H., et al. Plasma Retinol Kinetics and beta-Carotene Bioefficacy Are Quantified by Model-Based Compartmental Analysis in Healthy Young Adults with Low Vitamin A Stores. J Nutr. 146 (10), 2129-2136 (2016).

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Stabiele isotopen tracerisotopische verrijkingtracerbereidingspectrofotometrische bevestigingdeuteriummarkeringkoolstof 13 markeringoplossing in plantaardige olie
Formulering van vitamine A-tracerdoses voor toediening aan menselijke proefpersonen met behulp van de retinolisotoopverdunningstechniek
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.