Methodenartikel

Een multiplex serologische test voor de detectie van antilichaamresponsen op arbovirussen

1.5K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/69259

⸱

4 november 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Infectious Diseases Epidemiology and Analytics G5 Unit, Department of Global Health, Institut Pasteur, Université Paris-Cité, INSERM U1347, 2Laboratory for Urgent Response to Biological Threats (CIBU), Environment and Infectious Risks (ERI) Unit, Institut Pasteur, Université Paris Cité, 3Immunology of Infectious Diseases Unit, Institut Pasteur de Madagascar, 4MRC Centre for Infectious Disease Analysis and Modelling, School of Public Health, Imperial College London, 5Immunophysiopathology and Infectious Diseases Department, Institut Pasteur de Dakar, 6Pasteur Network, Institut Pasteur, 7Department of Immunology, Institut Pasteur

In dit artikel

Samenvatting

Multiplexfluorescentie-immunoassays worden een referentie voor serologische tests. Hun toepassing wordt echter beperkt door de complexiteit en tijdrovende processen voor het koppelen van kralen en analyten. Dit rapport presenteert een semi-automatisch, reproduceerbaar multiplex-protocol voor het koppelen van microbolletjes dat vergelijkbaar is met de standaardmethode, terwijl de tijd tot resultaten aanzienlijk wordt verkort.

Samenvatting

Door geleedpotigen overgedragen virussen (arbovirussen) zijn een groep door muggen overgedragen ziekteverwekkers die wereldwijd worden verspreid. Sinds de uitbraak van het Zika-virus (ZIKV) in 2016 in Noord- en Zuid-Amerika, waardoor deze infecties onder de aandacht van het publiek kwamen, blijven arbovirussen een aanzienlijke last voor de volksgezondheid vormen. Hun opkomst in voorheen niet-endemische regio's is een reden tot bezorgdheid voor de volksgezondheid. Het toezicht op en de bestrijding van arbovirale infecties is een huidige prioriteit voor de Wereldgezondheidsorganisatie (WHO), die in 2024 een wereldwijd strategisch plan heeft gelanceerd om arbovirale ziekten te bestrijden. De multiplextechnologie® heeft een revolutie teweeggebracht op het gebied van serologische surveillance, waardoor gelijktijdige meting van meerdere antilichamen mogelijk is terwijl een minimaal monstervolume nodig is. Voortbouwend op de expertise in de ontwikkeling van serologische multiplextests, werd een op kralen gebaseerde multiplextest ontwikkeld voor de detectie van antilichamen tegen arbovirusantigenen. De test omvat meerdere antigenen die specifiek zijn voor veel voorkomende arbovirussen, waaronder dengue (DENV), gele koorts (YFV), Zika en chikungunya (CHIKV) virussen. Een semi-geautomatiseerde methode werd gebruikt om antigenen covalent te binden aan microbolletjes. Dit nieuwe protocol is zeer effectief en maakt het mogelijk om tot 96 antigenen in één experiment te koppelen en tegelijkertijd reproduceerbare resultaten te garanderen. Mediane fluorescentie-intensiteit (MFI)-gegevens werden verkregen met behulp van een gebruiksvriendelijk fluorescentiebeeldvormingssysteem. Wanneer toegepast op menselijke serummonsters uit endemische landen, verwachten we dat deze test een krachtig hulpmiddel zal vormen voor serosurveillance-inspanningen.

Inleiding

Arbovirussen zijn samen verantwoordelijk voor duizenden doden per jaar. Deze virussen worden op mensen overgedragen via geïnfecteerde geleedpotigen, meestal muggen en teken. De ernst van arbovirale infecties is divers en varieert van asymptomatische infectie tot ernstige ziekte die tot de dood kan leiden. In 2024 registreerde de Wereldgezondheidsorganisatie (WHO) alleen al meer dan 10.000 sterfgevallen veroorzaakt door de vier serotypen van het denguevirus (DENV)1. In hetzelfde jaar besmette het virus meer dan 14 miljoen mensen, waaronder 50.000 ernstige gevallen1. Hoewel DENV het meest prominente arbovirus is, omvat de groep andere levensbedreigende ziekteverwekkers die verantwoordelijk zijn geweest voor meerdere uitbraken wereldwijd. Uit een recent samenvattend overzicht van arbovirale infecties in Afrika bleek dat deze virussen, waaronder DENV, het gelekoortsvirus (YFV), het chikungunyavirus (CHIKV), het Krim-Congo hemorragische koortsvirus (CCHFV), het Rift Valley-koortsvirus (RVFV), het West-Nijlvirus (WNV) en het Zika-virus (ZIKV), in 2023 ten minste 29 uitbraken over het hele continentveroorzaakten 2. In 2022 werd in een rapport van het Regionaal Bureau voor Afrika van de WHO de huidige beperkingen van de arbovirusbewaking in de hele regio benadrukt, waarbij de dringende noodzaak werd benadrukt om methoden te ontwikkelen voor de bewaking en bestrijding van arbovirussen3.

Klinische diagnose van arbovirale infecties is een uitdaging vanwege de overeenkomsten in symptomen, zoals koorts, artralgie en algemene malaise, die vaak voorkomen bij andere pathogenen die aanwezig zijn in endemische regio's4. Bovendien is het vanwege de co-circulatie en mogelijke co-infectie van de virussen moeilijk om onderscheid te maken tussen de etiologische ziekteverwekker5. Laboratoriumbevestiging is cruciaal voor differentiële diagnose. Er bestaan verschillende methoden voor de detectie van arborvirussen in menselijke monsters. Directe methoden, waaronder moleculaire diagnostische tests, detectie van virale antigen en virale isolatie, detecteren de aanwezigheid van de ziekteverwekker, terwijl indirecte methoden, zoals serologische diagnose, de immuunrespons op de virale infectie meten6.

Er is een overvloed aan methoden ontwikkeld voor de detectie van antilichaamresponsen op arbovirussen. Deze omvatten enzymgekoppelde immunosorbentassays (ELISA's), complementfixatie, hemagglutinatieremming en microsfeerimmunoassays 6,7. Dit rapport presenteert een multiplex fluorescentie microsfeer-gebaseerde immunoassay (FMIA) voor de detectie van antilichaamresponsen op arbovirus-antigenen. Op microsferen gebaseerde assays8 worden veel gebruikt in de serologie en bieden verschillende voordelen, met name de mogelijkheid om meerdere analyten in een enkele reactie te detecteren met een minimaal monstervolume. Optisch gecodeerde microsferen (magnetische polystyreenkorrels) gecoat met interessante recombinante antigenen worden gebruikt in een indirecte serologische immunoassay. De gekoppelde kralen worden vervolgens geïncubeerd met monsters en antigeenspecifieke antilichamen worden gedetecteerd met behulp van een anti-humaan IgG secundair antilichaam geconjugeerd aan een Phycoerythrin (PE) fluorofoorreporter. Er zijn verschillende analysatoren beschikbaar voor de detectie van uitgezonden fluorescentie, die wordt gerapporteerd als MFI.

Het principe van de test wordt gedetailleerd beschreven in Angeloni et al.8. Kortom, de antigenen van belang zijn chemisch gebonden aan kleurgecodeerde microsferen. Hiervoor worden de korrels in eerste instantie behandeld met 1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl] Carbodiimide (EDC) en N-hydroxysulfosuccinimide (sulfo-NHS), die de carboxylgroep op het oppervlak van de korrels activeren, waardoor een amine-reactieve verbinding ontstaat. Deze tussenliggende semi-stabiele verbinding wordt vervolgens gemengd met het eiwit van belang, waarbij aminedelen van het eiwit covalent aan de kralen worden gebonden, waardoor stabiele microkorrels worden gegenereerd die aan het oppervlak zijn bedekt met het eiwit van belang. De antigeengebonden kralen worden geïncubeerd met monsters, waardoor antilichamen zich kunnen binden aan specifieke antigenen. Antigeengebonden antilichamen worden gedetecteerd met behulp van een secundair anti-immunoglobuline-antilichaam geconjugeerd aan een fluorescerende kleurstof. We gebruiken PE-gelabeld secundair antilichaam. MFI's worden gemeten met behulp van een lichtbeeldvormer (details van het instrument worden gegeven in de materiaaltabel). Het instrument maakt gebruik van twee LED-lampjes, een rode LED en een groene LED, die afzonderlijk de interne kleurstoffen van de kralen exciteren en een reporterfluorescentie op het oppervlak van de kralen9. Filters worden vervolgens gebruikt om kralen te classificeren op basis van de kleur en om de fluorescentie te kwantificeren die door de analyten wordt uitgezonden.

We hebben eerder de technologie toegepast voor de detectie van antilichaamresponsen op SARS-CoV-210 en door vaccinatie te voorkomen ziekten11 en hebben aangetoond dat multiplextesten een hulpmiddel van onschatbare waarde zijn voor seroprevalentie- en surveillancestudies. Het doel van dit project is om het gebruik van de FMIA uit te breiden tot de detectie van antilichaamresponsen op meerdere antigenen die behoren tot arbovirussen met als doel de test toe te passen op screeningsmonsters uit de Afrikaanse regio.

Arbovirus multiplex-assays met behulp van multiplextechnologie zijn elders beschreven met behulp van verschillende antigeendoelen zoals niet-structureel eiwit 1 (NS1)12,13 of envelopdomein III (EDIII)14. Een 50-plex-test, die 26 arbovirus-antigenen omvat (waaronder NS1, EDIII, viraalachtige deeltjes (VLP's) en meerdere andere antigenen om te testen op ziekteverwekkers die in de regio circuleren, wordt gepresenteerd. De test zal het mogelijk maken om de transmissie-intensiteit voor deze pathogenen te beoordelen. Tabel 1 bevat een overzicht van de recombinante antigenen die voor de ontwikkeling van de test zijn gebruikt.Het protocol dat in dit rapport wordt gepresenteerd, is ontwikkeld als aanvulling op een uitgebreide methodeontwikkelingsstudie gericht op het optimaliseren van de detectie van arbovirussen.

Gewoonlijk wordt de koppeling (of fixatie) van antigenen aan de microsfeerbolletjes uitgevoerd in enkele buizen8 (handmatige koppeling). Dit proces is tijdrovend, omslachtig en vatbaar voor reproduceerbaarheidsfouten. Dit artikel rapporteert een protocol met behulp van een geautomatiseerd instrument om de opeenvolgende stappen uit te voeren die betrokken zijn bij de chemische binding van antigenen aan de kralen. In dit manuscript rapporteren we de stappen die zijn ondernomen voor de validatie van het nieuwe protocol. De validatie van het nieuwe protocol werd uitgevoerd door IgG-responsen gemeten met een 50-plex FMIA te vergelijken met behulp van antigeengekoppelde kralen die waren bereid met de handmatige methode of het geautomatiseerde protocol. Verdere validatie van de methode werd uitgevoerd door menselijke serummonsters van Afrikaanse en Franse cohorten te analyseren.

Het geautomatiseerde protocol voor het koppelen van kralen is snel en maakt gelijktijdige koppeling van maximaal 96 analyten in één run mogelijk. Wat nog belangrijker is, de resultaten zijn vergelijkbaar met die verkregen met behulp van het vastgestelde handmatige protocol, met minder variatie van batch tot batch.

Protocol

Voor het gebruik van menselijke monsters werd de juiste ethische goedkeuring verkregen. Monsters waren geanonimiseerde reststoffen van eerdere studies. Het protocol voor het gebruik van "standard pool" ORPAL-monsters is goedgekeurd door de Nationale Ethische Raad van Suriname (CMWO (Commissie voor Mensgebonden Wetenschappelijk Onderzoek), adviesnummer VG 25-17). Het gebruik van monsters uit Madagaskar werd goedgekeurd als onderdeel van het PvSTATEM-project door het Ethisch Comité van de London School of Hygiene & Tropical Medicine (28541) en het Madagascar Comité d'Éthique de la Recherche Biomédicale (135MSANP/SG/AMM/CERBM), terwijl het gebruik van Senegalese monsters werd goedgekeurd als onderdeel van het lopende Dielmo- en Ndiop-project door het Senegalese National Health Research Ethics Committee (CNERS Sénégal). De goedkeuring voor het meten van antilichamen tegen NTD's in deze monsters werd verleend door CNERS Sénégal (N 00000007 MSAS/CNERS/Sec). Niet-endemische Franse monsters werden afgeleid van routinematige medische tests in Franse ziekenhuislaboratoria en verwerkt in overeenstemming met de bestaande voorschriften en richtlijnen van de Franse Commissie voor Gegevensbescherming (Commission Nationale de l'Informatique et des Libertes). Menselijke serummonsters werden verkregen van proefpersonen uit regio's met een hoge prevalentie van arbovirussen en uit een naïeve Franse populatie. Serummonsters werden vóór gebruik door incubatie bij 56 °C gedurende 30 minuten door hitte geïnactiveerd. Als monsters niet worden geïnactiveerd, manipuleer ze dan onder een veiligheidskast. De meeste recombinante antigenen werden commercieel verkregen, met uitzondering van EDIII-recombinante eiwitten, die intern werden gesynthetiseerd. Een op beeldvorming gebaseerd analyse-instrument9 werd gebruikt voor gegevensverzameling. De gebruikte reagentia en apparatuur staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Bepaal optimale antigeenconcentraties voor koppeling

OPMERKING: Om fotobleken te voorkomen, minimaliseert u de blootstelling van microbolletjes aan licht tijdens de procedure. Optimaliseer voorafgaand aan bulkkoppeling de koppelingsconcentraties voor elk antigeen met behulp van een handmatig koppelingsprotocol. Het protocol is een bewerking van Angeloni et al.8. Buffers en oplossingen worden beschreven in aanvullende tabel 1.

  1. Selecteer de kraalgebieden die u wilt gebruiken voor het koppelen. Grondig vortex gedurende 20 s. Sonificeer de buis gedurende minimaal 60 s.
  2. Breng 200 μL (2,5 M kralen) kralen over in een tube van 1,5 ml.
  3. Was de korrels met 200 μL 100 mM Monobasisch natriumfosfaat/0,125x Triton.
    1. Plaats de buis gedurende 60 s op een magnetische buisscheider. Verwijder het bovenstaande voorzichtig zonder de kralen aan te raken.
    2. Voeg de monobasisch natriumfosfaatbuffer toe. Laat 60 s op het magnetische rek staan. Verwijder de supernatant.
  4. Activeer de korrels met een buffer die 80 μL 100 mM monobasisch natriumfosfaat, 0,125x Triton, 10 μL sulfo-NHS en 10 μL EDC bevat.
    1. Voeg monobasisch natriumfosfaat -sulfo-NHS-EDC toe aan buisjes. Incubeer in het donker gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur op een roller.
    2. Was de kralen in 250 μL PBS (1x) en 0,125x Triton. Herhaal het wassen drie keer.
  5. Bind de antigenen.
    1. Bereid de verschillende concentraties (seriële verdunningen) van antigenen voor in een totaal volume van 1 ml 1x PBS en 0,125x Triton. Test ten minste twee concentraties antigenen.
    2. Voeg antigeenoplossingen toe aan geactiveerde kralen. Incubeer in het donker 2 uur bij kamertemperatuur of een nacht bij 4 °C op een roller.
  6. Was gekoppelde parels in 500 μL PBS-TBN en 0,125x Triton. Herhaal de wasbeurt drie keer.
  7. Resuspendeer de gekoppelde kralen in 1 ml PBS-TBN en 0,125x Triton.
    OPMERKING: Bewaar de gekoppelde kralen voor gebruik minimaal 24 uur bij 4 °C. Gekoppelde kralen vertoonden variabiliteit in MFI's wanneer ze onmiddellijk na koppeling werden getest in vergelijking met testen na 24 uur.
  8. Selecteer een optimale concentratie om te gebruiken bij daaropvolgende grootschalige koppeling. Gebruik verschillende gekoppelde kralen voor de immunoassay op een standaardpool. Selecteer de laagste concentratie waarbij een lineaire standaardcurve is verkregen.
    OPMERKING: Een voorbeeld van de lineariteit van de antilichaamrespons op een standaardpool wordt gegeven in het resultatengedeelte, figuur 1.

2. Grootschalige geautomatiseerde kraalkoppeling

  1. Bereid Pro Magnetic COOH-kralen voor.
    1. Bereken de benodigde kralen: Met 500 kralen/monster zijn 2,5 miljoen kralen voldoende voor 5000 monsters.
    2. Bereid de kraalgebieden voor om te gebruiken voor koppeling, zoals eerder beschreven.
    3. Breng het gewenste volume kralen over naar de toegewezen putjes. Voor 2,5 miljoen werd 200 μL parels (standaard Luminex-concentratie is 1,25e7 kralen/ml) gebruikt.
  2. Bereid de antigenen voor. Dit is een cruciale stap om nauwkeurige hoeveelheden antigenen te garanderen.
    1. Bereken de hoeveelheden van het benodigde antigeen, na optimalisatie. De concentraties die voor elk antigeen worden gebruikt, worden beschreven in tabel 1.
    2. Meng in een microcentrifugebuisje van 1,5 ml grondig een voldoende hoeveelheid antigenen van belang met 1x PBS /0,125x Triton tot een totaal van 1 ml.
  3. Bereid platen voor met reagentia. Bereid platen met 96 diepe putjes als volgt voor. De volumes zijn per put en berekend voor 2,5 miljoen kralenkoppeling.
    1. Plaat 1 (Puntkammen): laad de kammen met de punt.
    2. Plaat 2 (Kralen): Voeg 8 μL 0,125x Triton en 200 μL van de kralengebieden van belang toe.
    3. Plaat 3 (Wash 1): Voeg 200 μL 100 mM Monobasisch natriumfosfaat / 0,125x Triton toe.
    4. Plaat 4 (Activering): Voeg 80 μL 100 mM Monobasisch natriumfosfaat / 0,125x Triton + 10 μL sulfo-NHS + 10 μL EDC toe.
    5. Plaat 5 (Wash2): Voeg 250 μL 1x PBS /0.125x Triton toe.
    6. Plaat 6 (koppeling): Breng 1 ml antigeenoplossing over naar het toegewezen putje.
    7. Plaat 7 (Wash3): Voeg 500 μL PBS-TBN/0.125x Triton toe.
    8. Plaat 8 (Eindplaat, bevat gekoppelde kralen): Voeg 1 ml PBS-TBN + 0,125x Triton toe.
  4. Stel de koppelingscyclus in die wordt uitgevoerd in de geautomatiseerde processor.
    1. Volg de instructies van de fabrikant om de machine in te schakelen en het protocol in te stellen. De benodigde software kan worden gedownload op de PC15. Run-specifieke parameters worden gedetailleerd beschreven in aanvullende tabel 2.
    2. Laadplaten in de daarvoor bestemde gleuf op de machine. Selecteer het protocol. Start de cyclus. De geschatte tijd om het programma te voltooien is 2:50 uur.
  5. Einde van de cyclus
    1. Volg de instructies van de fabrikant om de machine uit te schakelen. Laadplaten lossen volgens de instructies. Controleer visueel of plaat 8 de kralen (bruine korrel) bevat. Bovendien wordt een runrapport geëxporteerd van de instrumenten.
    2. Breng gekoppelde kralen van plaat 8 over naar individuele buizen van 1,5 ml voor opslag. Bewaar gekoppelde kralen tot gebruik bij 4 °C.
  6. Tel de kralen.
    OPMERKING: Er is een cellenteller gebruikt. Raadpleeg voor handmatig tellen met behulp van een hemacytometer de Luminex kookboekhandleiding 8.
    1. Grondig vortex gekoppelde kralen. Breng 10 μL over naar een telkamer. Volg de instructies van de fabrikant om het aantal kralen per ml af te lezen.
    2. Controleer de aggregatie door de afbeelding op de cellenteller te visualiseren. Zie aanvullende figuur 1 voor een representatief beeld van niet-geaggregeerde kralen.
    3. Als er aggregaten aanwezig zijn, moet u gedurende ten minste 5 minuten grondig vortex en sonicaat. Herhaal tellen
      OPMERKING: Na het tellen van de kralen werd de koppelingsefficiëntie geëvalueerd door een immunoassay van gekoppelde kralen op een standaardpool uit te voeren om de lineariteit van de antilichaamrespons te beoordelen.

Tabel 1: Panel van antigenen opgenomen in de 50-plex. De test omvat meerdere antigenen voor de detectie van arbovirale infecties en co-circulerende pathogenen. Er worden hoeveelheden antigenen verstrekt die zijn gebruikt voor de koppeling van 1,25 miljoen kralen. Klik hier om deze tabel te downloaden.

3. Multiplex immunoassay

OPMERKING: Gedetailleerde stappen van het protocol voor het meten van MFI worden gegeven in de respectievelijke handleiding9. Om de blootstelling van de kralen aan licht en het risico op fotobleken tot een minimum te beperken, worden alle oplossingen en monsters bereid voordat de kralen uit de koelkast worden gehaald.

  1. Stel de plaatlay-out in. Er werden platen met 96 putjes gebruikt en deze bevatten seriële verdunningen van een standaardpool en een blanco (alleen buffer) in de eerste rij.
  2. Verdun monsters en standaard in PBT-buffer in een aparte niet-bindende plaat. Voor de monsters werd een verdunning van 1:200 (eindconcentratie van 1:400) gebruikt. Voor de standaardcurve werd een verdunning van 1:50 van de standaard serumpool (resulterend in een eindconcentratie van 1:100) en tien 2-voudige seriële verdunningen gebruikt.
  3. Bepaal de hoeveelheid gekoppelde kralen die moet worden gebruikt in een totaal volume van 50 μL/putje. 500 kralen van elke kraal per putje werden gebruikt en aangepast aan het volume met PBT-buffer.
  4. Draai de gekoppelde kralen gedurende 30 s grondig door. Sonificeer gedurende minstens 60 s.
  5. Bereken het volume van elke gekoppelde kraal die aan de multiplex-premix moet worden toegevoegd om gelijke kralen voor elke analyt te garanderen. De hoeveelheid kralen werd als volgt berekend: Hoeveelheid kralen per putje = aantal kralen per putje/aantal kralen.
    OPMERKING: Een voorbeeld voor de berekening van korrels en buffervolumes die nodig zijn voor het voormengsel wordt geïllustreerd in aanvullende tabel 3.
  6. Breng voldoende hoeveelheden parelantigeen over in een centrifugebuis.
  7. Pas het volume aan met PBT.
  8. Meng het voormengsel grondig.
  9. Verdeel 50 μL van het voormengsel over de microplaat voor beeldvorming (bijv. ps, f-bodemplaten).
  10. Voeg 50 μL van de verdunde monsters toe aan de korrels.
  11. Mix op een plate shaker gedurende 30 minuten op kamertemperatuur, 700 tpm.
  12. Was de borden driemaal als volgt (handmatig wassen).
    1. Plaats de plaat 60 s op een magnetisch rek bij kamertemperatuur. Houd de plaat stevig op het rek en gooi de supernatant weg.
    2. Voeg 100 μL PBT-buffer toe. Laat 60 s op het magnetische rek staan. Herhaal de wasbeurten
      OPMERKING: Als alternatief kan een platenwasmachine16 worden gebruikt. De wasmachine werd als volgt ingesteld: 1 cyclus weken, gevolgd door 3 cycli (aspiratie, dosering en weken) en een laatste cyclus aspireren.
  13. Gooi het bovenstaande weg en voeg 50 μl verdund secundair antilichaam toe.
    1. Volg de instructies van de leverancier om een voorraadoplossing van het secundaire antilichaam te bereiden. Er werd een 1/120 verdunningsoplossing van secundair antilichaam gebruikt. De volumes secundair antilichaam werden als volgt berekend: volume secundair antilichaam = totaal volume/verdunningsfactor.
    2. Meng het secundaire antilichaam met een voldoende hoeveelheid PBT-buffer. Meng grondig. Voeg 50 μL verdund secundair antilichaam toe aan de gewassen korrels.
  14. Incubeer op een shaker gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur, 700 tpm.
  15. Voer drie wasbeurten uit zoals eerder beschreven.
  16. Resuspendeer de parels in een PBT-buffer van 150 μl.
  17. Incubeer op een shaker gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur, 700 tpm. Volg de instructies van de fabrikant om de instrumenten in te stellen9.
    OPMERKING: De xPONENT software17 die bij het imager-instrument werd geleverd, werd gebruikt. De instellingen voor de fluorescentiemeting werden als volgt ingesteld: het opvangvolume werd ingesteld op 50 μL, met een minimummaat van 50 kralen, zonder XY-verwarmer, en het analysetype als geen.

4. Gegevensanalyse

  1. Validatie uitvoeren
    1. Controleer of het minimale aantal kralen is bereikt. Ten minste 35 kralen per putje worden aanbevolen om een statistisch geldige MFI8 te verkrijgen.
    2. Controleer of de MFI-waarden van de blanco en negatieve controlemonster minimaal zijn.
    3. Controleer MFI-waarden op normen door een standaardcurve uit te zetten. Deze zijn hoger dan de blanco en/of negatieve controlesteekproef.
  2. Analyse van voorbeeldgegevens
    1. Exporteer de gegevens als CSV-bestanden en analyseer ze extern met behulp van R-software.

Resultaten

Om het proces te illustreren dat wordt gevolgd voor de validatie van het protocol, hebben we drie antigenen geselecteerd die drie families van arbovirussen vertegenwoordigen: Flavivirussen (DENV1 NS1-eiwit), Alfavirussen (CHIKV VLP-eiwit) en Bunyavirussen (RVFV NP). De antigenen werden getest op een standaardpool van een pre-blootgestelde populatie (ORPAL), Franse (niet-blootgestelde) populatiesera en twee cohorten uit Afrika (Senegal en Madagaskar).

Verdunningslineariteit van antilichaamrespons
De concentratie van antigenen voor gebruik voor kraalkoppeling werd bepaald met behulp van seriële verdunningen van de ORPAL-pool. De optimale concentratie werd geselecteerd als de laagste concentratie waarbij een lineaire standaardcurve werd verkregen (gegevens niet weergegeven). Figuur 1 toont de lineariteit van geselecteerde arbovirusantigenen bij optimale concentratie voor elk antigeen. Voor de kwaliteitscontrole van de koppeling werd elke batch gekoppelde korrels getest op verdunningslineariteit op de ORPAL-standaardpool met behulp van de vooraf geselecteerde concentratie.

Vergelijkbaarheid met de standaard handmatige koppelingstest
Om de vergelijkbaarheid te beoordelen van gegevens die zijn verkregen met behulp van het nieuwe geautomatiseerde protocol met de gevestigde handmatige koppeling, hebben we standaardcurven vergeleken die zijn gegenereerd op basis van resultaten verkregen met handmatige versus geautomatiseerde koppeling. Figuur 2 toont de parallelle lineariteit voor beide testen. MFI-waarden variëren per antigeen.

Batchvariatie voor kraalkoppeling
De variatie in de koppelingsbatch, waarbij de reproduceerbaarheid van tests van dezelfde koppelingsbatch werd beoordeeld, werd beoordeeld aan de hand van de Levey-Jennings-grafiek18. De representatieve antigenen en BSA-gekoppelde controlekorrels werden gebruikt en getest op de ORPAL-standaardpool. Figuur 3 toont MFI's van 19 verschillende platen, getest op verschillende dagen voor elk antigeen. De resulterende MFI's vallen binnen het bereik van het gemiddelde ± 3 SD voor de drie antigenen en de controle.

Effect van multiplexing op MFI
Om de prestaties van de test verder te beoordelen, hebben we getest of multiplexing van verschillende antigenen de gemeten antilichaamrespons beïnvloedde. De respons werd vergeleken met een enkel antigeen (of single-plex bead) met behulp van de ORPAL-standaardpool. Figuur 4 toont een sterke correlatie (R = 0,99, p < 2,2e-16) tussen de resultaten die werden verkregen wanneer MFI's werden gemeten op enkelvoudige antigenen of van een premix die 50 antigenen bevatte.

Antilichaamresponsen van menselijke serummonsters in Afrikaanse populaties
Om de toepasbaarheid van de test op monsters uit verschillende cohorten te evalueren, vergeleken we antilichaamresponsen in menselijke serummonsters van Afrikaanse populaties, die een grote kans hebben op blootstelling aan arbovirussen, met die van een Frans cohort dat vermoedelijk een lagere blootstelling aan deze virussen heeft. In totaal werden 1.596 monsters getest voor Madagaskar, 1.428 voor Senegal en 84 uit het Franse cohort. Figuur 5 toont dichtheidsgrafieken voor de verschillende cohorten. Voor het Senegalese cohort wordt een duidelijke bimodale verdeling van gegevens waargenomen voor de responsen op CHIKV VLP, wat wijst op twee verschillende responsen op CHIKV in de populatie. Een subtiele bimodale staart wordt ook waargenomen voor DENV1 NS1 en RVFV NP in het Senegalese cohort, terwijl er geen verschil is tussen de Franse en Madagaskar cohorten.

figure-results-1
Figuur 1: Lineariteit van de antilichaamrespons getest op de ORPAL-standaardpool. Geselecteerde arbovirusantigenen worden als voorbeeld getoond. Mediane fluorescentie-intensiteiten (MFI) worden weergegeven op de y-as (logschaal) en seriële verdunning van de standaardpool op de x-as. Alle antigenen in het panel werden vooraf getest op de standaardpool voorafgaand aan bulktests op monsters. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Parallelle lineariteit van de antilichaamrespons door koppelingsmethoden. Log van MFI (y-as) van representatieve antigenen (facet) getest op seriële verdunningen van de ORPAL-standaardpool (x-as). De kleuren staan voor verschillende koppelingsmethoden: automatisering (rood, groen, blauw) en handmatig (paars). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Variatie van plaat tot bord. Levey_Jennings grafieken voor BSA, gekoppelde kraal (controle), DENV1, NS1, CHIKV VLP en RVFV worden weergegeven voor ORPAL-standaardpool met een concentratie van 1:400. De resultaten vertegenwoordigen 19 platen die op verschillende dagen worden uitgevoerd. MFI's worden weergegeven op de y-as, het aantal tests staat op de x-as. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Correlatie van de antilichaamrespons op mono- en multiplextest. Het standaardbad werd verdund tot een eindconcentratie van 1:400 en getest op een voormengsel dat de 50-plex-antigenen bevatte, parallel aan enkelvoudig antigeen-gecoate kralen. Pearson-correlatie werd gebruikt voor analyse. Als voorbeeld worden drie representatieve antigenen getoond. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5: Toepassing van de test op het endemische en niet-endemische cohort van monsters. De test werd getest op monsters uit Madagaskar (groen), Senegal (blauw) en Frankrijk (rood). De monsters werden verdund tot een eindconcentratie van 1:400. De X-as vertegenwoordigt genormaliseerde MFI's (nMFI's), berekend als een verhouding van voorbeeld-MFI tot standaardpool-MFI bij dezelfde concentratie (1:400). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende figuur 1: Voorbeeld representatief beeld van kralenaggregatie. Paneel (A) toont niet-geaggregeerde kralen en paneel (B) toont kralenaggregaten. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende tabel 1: Tabel met buffers. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende tabel 2: KingFisher Apex kralen koppelingsprotocolinstellingen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende tabel 3: Voorbeeld voor de berekening van het parelvolume voor voormengsels. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

Het gebruik van FMIA heeft het landschap van serologische tests veranderd. De kracht van de tests ligt in het vermogen om antilichaamresponsen op meerdere antigenen in één reactie te evalueren, waardoor de tijd tot resultaten wordt verkort en de testkosten worden verlaagd. Dit is vooral belangrijk bij serologische surveillance. Het routinematige gebruik van FMIA-assays wordt echter belemmerd door de arbeidsintensieve, tijdrovende handmatige kraalkoppelingsstap, waarbij één antigenen per reactie moeten worden gehanteerd. Dit rapport presenteert een geautomatiseerde methode voor chemische koppeling van antigenen aan kralen. De automatisering maakt gelijktijdige koppeling van maximaal 96 antigenen in één keer mogelijk, waardoor de tijd die nodig is voor antigeenkoppeling met hoge doorvoer aanzienlijk wordt verkort.

Figuur 1 laat zien dat de antigenen met succes aan de kralen werden gebonden. De resultaten tonen ook een sterke parallelliteit tussen het nieuwe geautomatiseerde protocol en het gevestigde handmatige protocol (Figuur 2), wat wijst op een niet-inferieure nauwkeurigheid bij het detecteren van IgG-responsen op de geëvalueerde antigenen. Resultaten van batchvariatie van plaat tot plaat (Figuur 3) en van de kraalkoppeling (Figuur 2) tonen de vergelijkbaarheid van de gegevens bij gebruik van de geautomatiseerde koppelingsmethode. Hoge correlatie tussen multiplex en singleplex MFI's (Figuur 4) laat zien dat het multiplexen van een groot aantal antigenen geen invloed heeft op de antilichaamrespons op de set individuele antigenen die in deze test worden gebruikt.

Voor de validatie van de test werden monsters van zowel endemische als niet-endemische cohorten getest (Figuur 5). Hoewel seroprevalentiestudies van arbovirussen nog steeds schaars zijn in Afrika, suggereren de beschikbare gegevens 19,20,21,22 een genuanceerd beeld met variabele IgG-seroprevalenties tussen en binnen individuele landen. Met name suggereren de bestaande gegevens een hogere prevalentie van de drie virussen (chikungunya, dengue en Rift Valley) in Senegal in vergelijking met Madagaskar, bijvoorbeeld19. Deze prevalenties komen overeen met de observatie in dit rapport, die een duidelijke, duidelijke respons op de verschillende antigenen in Senegal liet zien in vergelijking met de andere cohorten. Dit ondersteunt het vermogen van de test om antilichaamprofielen te onderscheiden in de context van relatief hoge seroprevalentie. De waargenomen gegevens voor het cohort van Madagaskar kunnen worden verklaard door de gerapporteerde lage prevalentie van de virussen op de monsterafnameplaats22, terwijl de vergelijkbaarheid van de gegevens met het niet-endemische cohort gedeeltelijk kan worden verklaard door de kleine steekproefomvang van het Franse cohort. Bovendien kan de gerapporteerde variabiliteit tussen regio's de verschillen verklaren die in de datasets zijn waargenomen. Een uitgebreide studie om de seroprevalentie van IgG te evalueren is noodzakelijk; de gegevens die in dit rapport worden gepresenteerd, tonen echter aan dat de ontwikkelde test specifiek is voor het detecteren van IgG-responsen op de geëvalueerde arbovirus-antigenen, waarbij gegevens worden onderscheiden van endemische regio's en genuanceerde, verschillende reacties binnen dezelfde populatie.

De belangrijkste technische uitdagingen waren onder meer het bereiken van homogene antigeenoplossingen ondanks het gebruik ervan in zeer kleine hoeveelheden, het zorgen voor een equimolaire vertegenwoordiging van parelgebieden in de premix en het minimaliseren van kralenaggregatie. Om de moeilijkheid te overwinnen om een homogene oplossing in de plaat met 96 putjes te bereiken, werd een stap geïmplementeerd waarbij alle antigene oplossingen grondig werden voorgemengd in een buis van 1,5 ml voordat ze in de plaat werden verdeeld. Daarnaast is er een stap toegevoegd om de gekoppelde kralen te tellen en de volumes aan te passen om ervoor te zorgen dat een gelijk aantal kralengebieden aan de premix worden toegevoegd. Er werd ook een sonicatiestap opgenomen om het mengen van kralen te vergemakkelijken en aggregatie in de premix te minimaliseren.

In deze beperkte studie werden de stabiliteit van de gekoppelde kralen en hun impact op de testprestaties niet geëvalueerd, aangezien alle monsters binnen een maand na het koppelen van de kralen werden getest. Deze evaluatie viel buiten het bestek van dit rapport en zal in toekomstige studies worden beoordeeld. Ondanks deze beperkingen presenteert dit rapport een snelle en betrouwbare methode voor het detecteren van antilichaamreacties op een verscheidenheid aan ziekteverwekkers, waaronder arbovirussen. Serologische surveillance van arbovirale infecties is cruciaal voor het beheersen van de ziekten, en de beschikbaarheid van een reproduceerbare, snelle methode voor het detecteren van antilichaamresponsen op deze virussen vertegenwoordigt een aanzienlijke vooruitgang in de wereldwijde inspanningen om heterogeniteiten in overdracht te beoordelen en interventies te richten om de last van deze infecties te verlichten. Hoewel de focus van dit rapport op arbovirussen ligt, is dit protocol bovendien breed toepasbaar op een breed scala aan antigenen en betekent het een aanzienlijke vooruitgang in het veld.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat ze geen belangenconflict hebben.

Dankbetuigingen

De auteurs danken oprecht de deelnemers aan de studie en gezondheidswerkers in de gemeenschap in elk van de onderzoekslocaties. We zijn ook dankbaar voor alle laboratorium- en veldmedewerkers voor hun toegewijde inspanningen op het gebied van monsterverzameling, gegevensverzameling en laboratoriumanalyses. Dit werk werd ondersteund door de Reconstructing the transmission intensity of arboviruses across Africa and the impact of interventions in a changing climate (xSTAR) subsidie van de Wellcome Trust [228185/Z/23/Z]. Met het oog op open access hebben de auteurs een CC BY publieke auteursrechtlicentie toegepast op elke door de auteur geaccepteerde manuscriptversie die voortvloeit uit deze inzending. We danken ook de volgende personen voor de toestemming om monsters te gebruiken: Rob Van Der Pluijm (Infectious Diseases Epidemiology and Analytics, Institut Pasteur, Parijs) en Maylis Douine en Alice Sanna (Centre d'Investigation Clinique Antilles-Guyane, Centre Hospitalier de Cayenne, Cayenne).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1.5 mL Microcentrifuge tubes -Algemene labverbruiksartikelen
1000 mL filter units 0.2 umThermo fisher Scientific567-0020
25 mL reservoirs Thermo scientific95128095
50 mLFalcon tubes-Algemene labverbruiksartikelen
96 deep well plates - KingFisher DWThermo scientific10373480
Automated plate washer (optioneel)TECANHydroFlex Plus microplate washer
B pertussis FHANative antigen BP-FHA-50
Balance-Algemene laboratoriumapparatuur
Bench Centrifuge  - Algemene laboratoriumapparatuur
BioPlex Pro Magnetic COOH Beads LuminexMC10xxx  (x=beads region)
Bovine Serum Albumin, BSASigmaA7906
Branson Ultrasonics Bransonic Ultrasonic Cleaner Model B200Fisher scientific15-337-22
BSASigma AldrichA7906
CCHF GPNative antigenREC31639-100
Cell counter/HemacytometerBiorad/MerckTC20 /Z359629
CHIKV E2Native antigenREC31617-100
CHIKV VLPNative antigenCHIKV-VLP-100
Clear Flat-Bottom Immuno Nonsterile 96-Well PlatesThermo scientific3455
cmv-particlesNative antigenCMV-HP-100
Counting slides, dual chamber for cell counter BioradL003662 A
cp23Native antigenproduction prot
CT694Native antigenproduction prot
CtxB
DENV1 EDIII + SNAPIn-house productie-
DENV1 NS1Native antigenDENV1-NS1-100
DENV1 VLPNative antigenDENVX4-VLP-100
DENV2 EDIII + SNAPIn-house productie-
DENV2 NS1Native antigenDENV2-NS1-100
DENV2 VLPNative antigenDENVX4-VLP-100
DENV3 EDIII + SNAPIn-house productie-
DENV3 NS1Native antigenDENV3-NS1-100
DENV3 VLPNative antigenDENVX4-VLP-100
DENV4 EDIII + SNAPIn-house productie-
DENV4 NS1Native antigenDENV4-NS1-100
DENV4 VLPNative antigenDENVX4-VLP-100
diphteria ToxNative antigen DIP-TNL-100
ebv-gp125Native antigenREC31601-100
EDC Sigma03449
Ethanol 100% -Algemene lab 
Film aluminum sealing non-sterile -Algemeen
Fluorescence Imaging instrument- MAGPIX SystemLuminex MAGPIX-XPON4.1-CEIVD
Handheld magnet for plates - Magnetic 96-well separatorLuminexCN-0269-01
hev-ORF2Native antigen REC31653-100
Inaba OSPBoston_MGH -
Kingfisher DeepWell 96-well tip combThermo scientific17170069
Leishmania K28ClinisciencesMBS3040095
Luminex MAGPIX Calibration KitLuminexMPX-CAL-K25
Luminex MAGPIX Verification KitLuminexMPX-PVER-K25
Magnetic tube separatorInvitrogenDynaMag
MAGPIX Drive Fluid PlusLuminex40-50030
measles NPNative antigenREC31796
Microplate shaker Randox
MICROPLATE, 96 WELL, PS, F-BOTTOM (CHIMNEY WELL)Greiner-Bio one655096
MiliQ H20 -Algemene lab 
Multichannel pipettes 10, 300SARTORIUS
NIENative antigenproduction prot
Ogawa OSPBoston_MGH -
ONNV E2ClinisciencesIT-022-006Ep
Particule processor instrumentThermo scientificThermo Scientific KingFisher Flex
PBS 10x PH~7.0EUROMEDEXET330
PE-conjugated anti-human IgG Fc secondary antibodyJackson Immuno research709-116-098
PfAMA1In-house productie-
PfMSP1Native antigenREC32013-100
pgp3Native antigenproduction prot
Pipette tips (supplier) 10 µL, 200 µL, 1000 µL -Algemene labverbruiksartikelen
Pm MSP1ClinisciencesCUST-PRT-31102024-1B
Po MSP1ClinisciencesCUST-PRT-31102024-1A
PvMSP1Native antigenREC31724-100
R software R4.4.1--
RVFV NPNative antigenREC31640-100
Single channel pipettes 10p, 20p, 200p, 1000pEppendorf
SNAPIn-house productie-
S-NHS Sigma56485
Sodium azideSigmaS2002

Referenties

  1. Global dengue surveillance. , World Health Organization. https://worldhealthorg.shinyapps.io/dengue_global (2025).
  2. Bangoura, S. T., et al. Arbovirus epidemics as global health imperative, Africa, 2023. Emerg Infect Dis. 31 (2), e240754(2024).
  3. World Health Organization. Surveillance and control of arboviral diseases in the WHO African Region: assessment of country capacities. , WHO. (2022).
  4. Starolis, M. W., Perez, O., Powell, E. A. Clinical features and laboratory diagnosis of emerging arthropod-transmitted viruses. J Clin Virol. 132, 104651(2020).
  5. Alves, R. P. D. S., Amorim, J. H. Editorial: Arboviruses: Co-circulation, co-transmission, and co-infection. Front Microbiol. 14, 1321166(2023).
  6. Pan American Health Organization. Recommendations for laboratory detection and diagnosis of arbovirus infections in the region of the Americas. , PAHO. (2023).
  7. Fischer, C., et al. Challenges towards serologic diagnostics of emerging arboviruses. Clin Microbiol Infect. 27 (9), 1221-1229 (2021).
  8. Angeloni, S., Das, S., De Jager, W., Dunbar, S. xMAP cookbook: A collection of methods and protocols for developing multiplex assays with xMAP technology. Luminex. , https://info.diasorin.com/en-us/research/download-the-xmap-cookbook (2025).
  9. Luminex MAGPIX user manual. , Luminex Corporation. (2023).
  10. Rosado, J., et al. Multiplex assays for the identification of serological signatures of SARS-CoV-2 infection: An antibody-based diagnostic and machine learning study. Lancet Microbe. 2 (2), e60-e69 (2021).
  11. Bloch, E., et al. Investigation of the sero-epidemiology of vaccine preventable diseases and common viral infections in French populations using a multiplex serological assay. medRXiv. , (2024).
  12. Venkateswaran, N., Sarwar, J., Nelson, W., Venkateswaran, K. Determination of IgG antibody profile to arboviruses using a multiplex serology panel. , (2024).
  13. Lawford, H. L. S., et al. Integrated serological surveillance for neglected tropical diseases, vaccine-preventable diseases, and arboviruses in Samoa, 2018. Sci Rep. 15 (1), 12667(2025).
  14. Bailly, S., et al. Spatial distribution and burden of emerging arboviruses in French Guiana. Viruses. 13 (7), 1299(2021).
  15. KingFisher Apex purification system: User guide. , Thermo Fisher Scientific Inc. https://documents.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/MAN0018970_kingfisher_apex_UG.pdf (2025).
  16. Instructions for use for HydroFlex Plus. , Tecan. (2025).
  17. XPONENT 4.3 installation instructions. , Luminex Corporation. https://us.diasorin.com/sites/default/files/products-documentation-tool/89-30000-00-759.pdf (2025).
  18. Van Den Hoogen, L. L., et al. Quality control of multiplex antibody detection in samples from large-scale surveys: the example of malaria in Haiti. Sci Rep. 10 (1), 1135(2020).
  19. Bangoura, S. T., et al. Seroprevalence of seven arboviruses of public health importance in sub-Saharan Africa: a systematic review and meta-analysis. BMJ Glob Health. 9 (10), e016589(2024).
  20. Awuah, A. A., et al. Seroprevalence of dengue in the Democratic Republic of Congo, Ghana and Senegal: results of the SERODEN study. Int J Infect Dis. 152, 107428(2025).
  21. Mhamadi, M., et al. Human and livestock surveillance revealed the circulation of Rift Valley Fever virus in Agnam, Northern Senegal, 2021. Trop Med Infect Dis. 8 (2), 87(2023).
  22. Broban, A., et al. Seroprevalence of IgG antibodies directed against dengue, chikungunya and West Nile viruses and associated risk factors in Madagascar, 2011 to 2013. Viruses. 15 (8), 1707(2023).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Detectie van arbovirus antilichamenkraalgebaseerde multiplexingfluorescentie imagingantigeenkoppelingmediane fluorescentie intensiteitdoor muggen overgedragen virussenmenselijke serummonstersmeting van antilichaamresponsserovigilantie

Gerelateerde artikelen