Dit artikel beschrijft het gebruik van confocale microscopie en ImageJ om de dynamiek van mitochondriale splijting/fusie te beoordelen via Dendra2 fotoschakelende fluorescentie.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Beoordeling van mitochondriale splijting/fusiedynamiek in proximale tubulaire cellen van de nier
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Mitochondriën worden het best erkend voor hun rol in ATP-synthese en dienen als belangrijke regulatoren van het cellulaire metabolisme. Mitochondriale dynamiek omvat de intracellulaire en intercellulaire beweging van mitochondriën, evenals de processen van splijting/fusie. Deze gebeurtenissen zijn van fundamenteel belang voor het behoud van de mitochondriale functie door het handhaven van cellulaire homeostase, morfologie, bio-energetica, kwaliteitscontrole en stressreacties. Aan de andere kant beïnvloedt ontregeling van de mitochondriale dynamiek de cellulaire morfologie en functie. Nauwkeurige meting van mitochondriën splijting/fusie kan een indicatie zijn van cellulaire gezondheid. De huidige methodologieën om de dynamiek van mitochondriën te meten, maken gebruik van geavanceerde beeldvorming zoals superresolutiemicroscopie, fluorescentietechnieken (Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP)) voor connectiviteit en optogenetische hulpmiddelen voor spatiotemporele controle. Kwantitatieve analyse maakt gebruik van computationele hulpmiddelen om parameters zoals lengte, aantal en vertakking te meten, die de balans tussen splijting/fusie aangeven. Deze methoden vereisen echter vaardigheden en geavanceerde instrumenten. In dit artikel beschrijven we het gebruik van confocale microscopie in combinatie met gratis te gebruiken tools in ImageJ (Fiji) om splijtings-/fusiegebeurtenissen te bestuderen met behulp van de foto-schakelende eigenschap van het dendra2-eiwit, gelabeld met mitochondriaal cytochroom c.
Inleiding
Mitochondriën zijn een dynamisch organel dat een cruciale rol speelt bij de productie van energie, celdood en signaaltransductie1. Mitochondriale morfologie verwijst naar de grootte en vorm van mitochondriale compartimenten, die zeer goed reageren op intracellulaire en extracellulaire aandoeningen en cruciaal zijn voor het behoud van de cellulaire gezondheid2. De morfologie van mitochondriën kan belangrijke inzichten verschaffen in hun functie, maar veranderingen in de mitochondriale vorm kunnen het cellulaire metabolisme en de algehele gezondheid beïnvloeden3. Ve....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Al het dierenwerk werd uitgevoerd in overeenstemming met de protocollen die zijn goedgekeurd door de Temple University Institutional Animal Care and Use Committee, Temple University (Animal Protocol-5183). De Pham-muizen, die mitochondriën hebben die Dendra2-eiwit tot expressie brengen, werden gekocht.
1. Bereiding van celkweekmedium
- Isoleer proximale tubulaire cellen van de nier volgens het protocol nadat ze zijn gescheiden van glomerulaire endotheelcellen met behulp van kralen24 (Figuur 1A). Bouchareb et al., ontwikkelden e....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Primaire buisvormige epitheelcellen werden geïsoleerd uit de nier van de muis door enzymatische vertering en gekweekt in DMF-12 aangevuld met 5% FBS, 1% penicilline-streptomycine bij 37 °C onder 5% CO2. Bij het bereiken van 80% confluentie werden cellen getrypsiniseerd (0,25% trypsine-EDTA) en met een dichtheid van 5 × 104 cellen per putje gezaaid in kweekplaten met glazen bodem, voorgecoat met collageen.
Het kweekmedium bevatte cisplatin.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Mitochondriale splijting/fusie zijn cruciale dynamische processen die de mitochondriale homeostase en cellulaire levensvatbaarheid in stand houden26. Een goede beoordeling van deze processen vereist geavanceerde beeldvormingstechnieken om de mitochondriale morfologie, dynamiek en functie te visualiseren en te kwantificeren27,28. Er zijn verschillende technieken gebruikt voor het meten van mitochondriale sp.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat ze niets te onthullen hebben.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door onderzoeksbeurzen van het National Institute of Health subsidienummer 5R01DK135470-03, ISAC-NIH-subsidie 5U24DK128851-03 en een postdoctorale beurs van de American Heart Association.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
```html
```
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Celcultuur | |||
| DMEM/F12 | Basismedium | (Gibco/Cat. Nr.11320033 ) | Proximale tubulaire celcultuur |
| Foetaal Runderserum (FBS) | 5-10% suppletie | (Biowest/Cat. Nr.S181B) | Verrijking van cultuurmedium |
| Penicilline-Streptomycine | 100X | (Gibco/Cat. Nr.15140122) | Antibioticabescherming |
| Collagene IV | coating | ( Sigma-C5533-5M) | Ibidi plaatcoating |
| Trypsine-EDTA | 0,25% oplossing | (Gibco/Cat. Nr.25200056) | Celdetachering |
| Fosfaat-Gebufferd Saline (PBS) | (Gibco/Cat. Nr.10010023 ) | Celwassing | |
| Behandelingen | |||
| Cisplatin | 2 µM werkconcentratie | (Selleck Chemicals/Cat. Nr.S1166) | Stressinductie |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | voertuigcontrole | (Fisher Scientific/Cat. Nr.D1391) | Cisplatin solvent controle |
| Beeldvorming | |||
| Fenol Rood-Vrij Medium | Live beeldvorming | (Gibco/Cat. Nr.21041025) | Verminderde achtergrondfluorescentie |
| Moleculair Biologie | |||
| TRIzol® | RNA extractie | (Gibco/Cat. Nr.15596018) | Totale RNA isolatie |
| SYBR Green Master Mix | qPCR chemie | (Thermo Scientific/Cat. Nr.K0221) | Mitochondriale dynamic genexpressie (DNM1L, FIS1, MFN1, MFN2, OPA1) |
| Fluorescente Hulpmiddelen | |||
| Dendra2 | Mitochondriale matrix tag | Jacson Laboratory(PhAMverwijderd) | Foto-wisselaar reporter (405nm omzetting, 488/561nm beeldvorming) |
| Microscopen | |||
| Confocale Microscoop | Leica DMi8 | Live-cel beeldvorming en FRAP | 405nm/488nm/561nm lasers |
| Image J | https://imagej.net/software/fiji/downloads | ||
| RGB Profiler Plugin | https://imagej.net/ij/plugins/rgb-profiler.html. | Fusiegebeurtenis analyse (rood/groen signaaloverlappend) |
Referenties
- Liesa, M., Palacin, M., Zorzano, A. Mitochondrial dynamics in mammalian health and disease. Physiol Rev. 89 (3), 799-845 (2009).
- Chen, Z., Berquez, M., Luciani, A. Mitochondria, mitophagy, and metabolic disease: towards assembling the puzzle. Cell Stress. 4
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
