Methodenartikel

Beeldvorming van levende cellen van endocytisch transport met behulp van gefunctionaliseerde nanobodies in gekweekte cellen

DOI:

10.3791/69284

⸱

17 oktober 2025

 ,  ,  , 
1Biozentrum, University of Basel

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Endocytisch en retrograde transport van eiwitten van het plasmamembraan naar het trans-Golgi-netwerk is essentieel voor het handhaven van de membraanhomeostase en het reguleren van signalering. Hier beschrijven we een methode om endocytisch transport van transmembraan ladingeiwitten in beeld te brengen en te kwantificeren door middel van live-cel microscopie met behulp van afgeleide anti-GFP nanobodies in HeLa-cellen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Endocytose van receptoren en andere transmembraaneiwitten van het celoppervlak tot endosomen en verder is van cruciaal belang voor homeostase, fysiologie en functie. Om endocytische opname en retrograde eiwittransport te onderzoeken, hebben we een veelzijdige toolkit ontwikkeld met gefunctionaliseerde nanobodies om het transport van het celoppervlak naar het trans-Golgi-netwerk (TGN) te monitoren door middel van beeldvorming van vaste en levende cellen, elektronenmicroscopie en gelelektroforese in combinatie met autoradiografie. We ontwikkelden afgeleide nanobodies gericht tegen groen fluorescerend eiwit (GFP) of mCherry - monomeer, niet-verknopende, hoge-affiniteit eiwitbinders - die kunnen worden toegevoegd aan cellijnen die interessante membraaneiwitten tot expressie brengen met de overeenkomstige extracellulaire fluorescentielabels. Bij binding aan GFP- of mCherry-gelabelde transmembraanreporters, worden de nanobodies specifiek geïnternaliseerd en verhandeld parallel met de endogene sorteerroutes van de reporters. Deze nanobodies werden gefunctionaliseerd met geselecteerde fluoroforen om retrograde transport te volgen door middel van fluorescentiemicroscopie en live beeldvorming, met ascorbaatperoxidase 2 (APEX2) om ultrastructurele lokalisatie door elektronenmicroscopie op te lossen, en met tyrosinesulfatatiemotieven om de aankomstkinetiek van TGN kwantitatief te beoordelen. In deze methodologische studie beschrijven we het algemene protocol voor bacteriële expressie en zuivering van gefunctionaliseerde nanobodies, evenals het genereren van stabiele GFP-reportercellijnen. We illustreren het nut van deze benadering voor beeldvorming van levende cellen door gebruik te maken van een mCherry-gemodificeerde anti-GFP nanobody (VHH-mCherry) om de endocytische opname van de transferrinereceptor (TfR) en de kationafhankelijke mannose-6-fosfaatreceptor (CDMPR) te analyseren.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Endocytose van receptoren en andere transmembraan (TM) eiwitten van het plasmamembraan naar verschillende intracellulaire compartimenten is belangrijk voor het behoud van membraanhomeostase 1,2. Na internalisatie door clathrine-afhankelijke of -onafhankelijke endocytose, bevolken eiwitladingen eerst vroege endosomen van waaruit ze verder worden gesorteerd langs het endo-lysosomale systeem, gerecycled naar het plasmamembraan of retrograde verscheept naar het trans-Golgi-netwerk (TGN)3,4,5. Recycling van endosomen en/of het celoppervlak naar de TGN maakt deel uit van de functionele cyclus van een aantal transmembraan ladingreceptoren, zoals de kationafhankelijke en kationonafhankelijke mannose-6-fosfaatreceptoren (CDMPR en CIMPR), die nieuw gesynthetiseerde lysosomale hydrolasen van de TGN leveren aan late endosomen en lysosomen 6,7,8, Wntless (WLS) transporteert Wnt-liganden naar het celoppervlak9, 10,11,12 of TGN46 die oplosbare secretoire ladingseiwitten, waaronder pancreas-opgereguleerde factor (PAUF) en andere CARTS-vracht, begeleidt van de TGN13,14,15,16. Terwijl al deze vrachtreceptoren door de TGN pendelen voor het verzamelen van nieuwe client-eiwitten, is de transferrinereceptor (TfR) die ijzergebonden transferrine internaliseert, uitgesloten van de Golgi-retour 17,18,19,20,21.

Om endocytisch en retrograde verkeer te onderzoeken, hebben we eerder een op nanobody gebaseerde toolkit opgesteld die is ontworpen om vrachteiwitten te labelen en te traceren van het celoppervlak tot intracellulaire compartimenten17. Nanobodies vormen een nieuwe klasse van eiwitbinders afgeleid van homodimere antilichamen met alleen zware ketens (hcAbs) die van nature voorkomen in kameelachtigen en kraakbeenvissen22,23. Ze vertegenwoordigen het variabele heavy-chain domein (VHH) van hcAbs en bieden tal van voordelen ten opzichte van conventionele antilichamen (bijv. IgG's): ze zijn monomeer, klein (~15 kDa), zeer oplosbaar, hebben geen disulfidebindingen, kunnen bacterieel tot expressie worden gebracht en zijn vatbaar voor selectie voor binding met hoge affiniteit24. Om de veelzijdigheid en brede toepasbaarheid van deze nanobody-toolkit te vergroten, hebben we gefunctionaliseerde anti-GFP-nanobodies gebruikt om eiwitten die gelabeld zijn met GFP-tags op hun extracellulaire of lumenale domeinen te labelen en te volgen. Door recombinante conjugatie van nanobodies met mCherry-, ascorbaatperoxidase 2 (APEX2) of tyrosinesulfatiesequenties, kan het retrograde transport van bonafide transmembraanladingeiwitten worden geanalyseerd door middel van fluorescentiemicroscopie met vaste en levende cellen, elektronenmicroscopie of biochemische assays met behulp van autoradiografie. Aangezien tyrosinesulfatering, gekatalyseerd door tyrosyleiwitsulfotransferasen TPST1 en TPST2, een posttranslationele modificatie is die beperkt is tot de trans-Golgi/TGN, maakt deze strategie een directe beoordeling mogelijk van de transportdynamiek en kinetiek van het celoppervlak naar het Golgi-compartiment 25,26,27. Meer recent hebben we dit repertoire van gefunctionaliseerde eiwitbinders uitgebreid met afgeleide anti-mCherry nanobodies. Deze reagentia hebben bewezen een belangrijke rol te spelen bij het ontleden van machine-afhankelijke transportroutes van MPR's, met name van de CDMPR17,28, naar de TGN door middel van biochemische analyses.

Terwijl de vorige studie zich voornamelijk richtte op de toepassing van nanobodies gemodificeerd met tyrosinesulfatiesequenties om de TGN-aankomst biochemisch te beoordelen door middel van autoradiografie19, beschrijft dit artikel de generatie van fluorescerend gelabelde, gefunctionaliseerde nanobodies (VHH-mCherry) en reportercellijnen voor live-cell beeldvorming van endocytisch transport. In combinatie met een extra Golgi-resident fluorescerend reporter-eiwit kan dit protocol verder worden aangepast om te dienen als een robuuste workflow voor het kwantitatief analyseren van live-cell beeldvorming van endosoom-naar-TGN-transport van geselecteerde vrachteiwitten.

Alvorens dit protocol toe te passen, moeten onderzoekers ervoor zorgen dat het doeleiwit tot expressie wordt gebracht als een GFP-gelabeld fusieconstruct, meestal gegenereerd door standaard moleculaire kloneringsbenaderingen. Gefunctionaliseerde nanobodies kunnen gemakkelijk in bacteriën worden geproduceerd met een opbrengst die voldoende is voor experimenten met oppervlaktelabeling, waarbij werkconcentraties in het lage nanomolaire bereik geschikt zijn voor de meeste beeldvormingstests met levende cellen. Gebruikers moeten er ook rekening mee houden dat de transportkinetiek kan variëren tussen ladingeiwitten, waardoor de labelduur of beeldvormingsfrequentie moet worden aangepast voor een optimale visualisatie van endocytische of endosoom-naar-TGN-transport.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Bacteriële transformatie met VHH-mCherry

OPMERKING: Dit protocol is geoptimaliseerd voor de expressie, zuivering en analyse van gefunctionaliseerde anti-GFP-nanobodies zoals eerder beschreven17. De volgende stappen zijn aangepast voor VHH-mCherry en komen overeen met het eerdere methodologische rapport19.

  1. Ontdooi chemocompetente bacteriën (50-100 μL) die geschikt zijn voor eiwitexpressie (bijv. Escherichia coli Rosetta BL21 (DE3)-cellen) door ze op ijs te leggen.
    OPMERKING: Bereid chemocompetente bacteriële cellen voor volgens de standaard laboratoriumprotocollen. Hiervoor kunnen in de handel verkrijgbare BL21 (DE3) cellen van NEB worden gebruikt.
  2. Voeg 50 ng van een plasmide toe dat codeert voor het gefunctionaliseerde VHH-mCherry-construct (Addgene #109421). Om een efficiënte plaatsspecifieke biotinylering van de nanobody-reporter tijdens bacteriële expressie te garanderen, co-transformeert u met een drievoudige overmaat (150 ng) van een plasmide dat codeert voor het bacteriële biotineligase BirA (Addgene #109424). Beweeg de buis voorzichtig 4x-5x om cellen en plasmide-DNA te mengen.
    OPMERKING: Co-transformatie met het BirA-coderende plasmide is niet nodig als biotinylering door het biotine-acceptorpeptide (BAP) niet nodig is.
  3. Incubeer het mengsel 30 minuten op ijs. Vermijd agitatie tijdens deze stap.
  4. Heat-shock bacteriële cellen door ze precies 20 s bij 42 °C in een waterbad of een verwarmingsblok te plaatsen.
  5. Voeg 1 ml Luria-bouillon (LB) op kamertemperatuur (RT) toe en incubeer de getransformeerde bacteriën in een thermoshaker (250-500 rpm) gedurende 1 uur bij 37 °C om fenotypische expressie van antibioticaresistentiegenen mogelijk te maken.
    OPMERKING: Om 1 L LB medium te bereiden, voeg 5 g gistextract, 10 g trypton, 10 g NaCl toe en vul het volume aan met water, en steriliseer door autoclaveren.
  6. Pellet de bacteriën door centrifugeren bij 11.000 x g gedurende 1 minuut en suspendeer de pellet opnieuw in 100 μL vers LB-medium. Meng grondig door te pipetteren.
  7. Plaats de zwevende bacteriën op voorverwarmde LB-platen die de juiste antibiotica bevatten (bijv. met 50 μg/ml kanamycine; indien gelijktijdig getransformeerd met BirA, ook 50 μg/ml carbenicilline, zie stap 1.2).
  8. Incubeer de met antibiotica gesupplementeerde LB-platen ondersteboven bij 37 °C gedurende 13-15 uur.
    OPMERKING: Het protocol kan hier worden gepauzeerd. Platen met volgroeide volken kunnen bij 4 °C worden bewaard en afgesloten met doorlatende folie om uitdroging te voorkomen.

2. Bacteriële vloeistofcultuur en inductie van VHH-mCherry-expressie

  1. Selecteer een enkele bacteriekolonie uit de transformatieplaat en inoculeer deze in een erlenmeyer met 20 ml LB-medium aangevuld met antibiotica. Incubeer de cultuur in een schudbroedmachine gedurende 13-15 uur bij 37 °C (zie ook stap 1.7 over selectie antibiotica).
  2. Verdun de volgende dag de nachtelijke bacteriecultuur van 20 ml in een verse kolf met 1 L LB-medium met de bijbehorende selectieantibiotica.
  3. Ga door met incuberen bij 37 °C totdat de cultuur een optische dichtheid bereikt bij 600 nm (OD600) van 0,6-0,7.
    OPMERKING: Laat de cultuur afkoelen tot RT of tot 16 °C voordat de eiwitexpressie wordt geïnduceerd.
  4. Induceer expressie van VHH-mCherry (en BirA, indien co-expressie) door 1 ml 1 M isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) toe te voegen om een uiteindelijke concentratie van 1 mM van de inductor te bereiken (verdunning 1:1000). Als co-transformatie met het BirA-expressieplasmide werd uitgevoerd, vul de cultuur dan ook aan met 10 ml van een 20 mM D-biotinestockoplossing, wat een uiteindelijke concentratie van 200 μM D-biotine in het groeimedium oplevert. Dit vergemakkelijkt in vivo biotinylering van het biotine-acceptor (BAP)-epitoop dat aanwezig is in het VHH-mCherry-construct.
    OPMERKING: Bereid de D-biotinevoorraad voor in ddH2O en los deze op door geleidelijke toevoeging van 500 mM NaH2PO4.
  5. Incubeer de IPTG-geïnduceerde 1 L-cultuur gedurende 13-15 uur bij 16 °C om een optimale eiwitvouwing en opbrengst te bevorderen.
    OPMERKING: Expressiecondities voor nieuw ontworpen nanobody-constructies met andere fluorescerende tags kunnen empirische optimalisatie door de onderzoeker vereisen.
  6. Breng de cultuur over in een centrifugeerfles van 1 l en oogst de cellen door centrifugatie bij 5.000 x g bij 4 °C gedurende 45 minuten. Gooi het bovenstaande weg in het juiste vloeibare bioafval en ga verder met de zuiveringsstappen.
    OPMERKING: Het protocol kan op dit punt worden gepauzeerd door de bacteriekorrel bij -80 °C te bewaren. De VHH-mCherry-pellet lijkt meestal roze, wat wijst op de juiste vouwing van het fluorescerende fusie-eiwit.

3. Zuivering van VHH-mCherry op basis van iMac

  1. Ontdooi de bevroren bacteriekorrel indien nodig op ijs (zie ook stap 2.6).
  2. Voeg 30 ml ijskoude bindingsbuffer (20 mM imidazool in 1x PBS) toe aan de bacteriële celpellet en suspendeer grondig door op en neer te pipetteren. Breng de suspensie over in een geëtiketteerde centrifugebuis van 50 ml.
  3. Vul de geresuspendeerde cellen aan met 200 μg/ml lysozym, 20 μg/ml DNase I, 1 mM MgCl2 en 1 mM fenylmethylsulfonylfluoride (PMSF). Incubeer het mengsel gedurende 10 minuten bij RT, gevolgd door 1 uur bij 4 °C op een end-over-end rotator.
    OPMERKING: PMSF is giftig. Bereid en hanteer voorraadoplossingen in een chemische zuurkast met handschoenen, een laboratoriumjas en oogbescherming; gooi PMSF-houdend afval weg in gehalogeneerde organische afvalcontainers. Voor experimenten werd een stockoplossing van 0,1 M gebruikt en verder verdund.
  4. Verstoor de bacteriecellen mechanisch met behulp van een tip-sonicator die rechtstreeks in de suspensie wordt ingebracht. Pas constant drie sonicatiepulsen van 1 minuut toe, met een afkoelinterval van 1 minuut tussen elke puls met gespecificeerde sonicatorinstellingen (grootte sondepunt: 6 mm, massieve punt; Amplitude 40%; Inschakelduur (pulsmodus): 1 s AAN/1 s UIT)
  5. Klar het lysaat door centrifugeren bij 15.000 x g bij 4 °C gedurende 45 minuten om bacteriële celresten en intacte bacteriën te pelleteren.
    OPMERKING: Het lysaat kan worden overgebracht naar een centrifugefles of worden verdeeld in buisjes van 5 ml voor centrifugeren op een werkblad.
  6. Breng het resulterende supernatans voorzichtig over in een nieuwe buis van 50 ml en gooi de pellet weg in het juiste bioafval.
  7. Houd het geklaarde lysaat op ijs terwijl u zich voorbereidt op geïmmobiliseerde metaalaffiniteitschromatografie (IMAC). Gebruik voor de isolatie van histidine-gelabelde nanobodies voorverpakte His-tag-zuiveringskolommen voor eenmalig gebruik die zijn geoptimaliseerd voor zwaartekrachtstroomwerking.
  8. Bevestig Ni-NTA (nikkel-nitrilotriazijnzuur) kolommen op een metalen standaard of een geschikte kolomhouder.
    1. Tap de opslagbuffer uit de kolommen en breng in evenwicht met 10 ml bindingsbuffer (20 mM imidazool in 1x PBS).
    2. Laat de buffer door de zwaartekracht passeren; Gooi de doorstroom weg als bioafval.
  9. Breng geleidelijk het geklaarde bacteriële lysaat (~30 ml) aan op de kolom. Laat het door de zwaartekracht doorstromen en gooi het weg.
  10. Was de kolom met twee opeenvolgende volumes van 10 ml bindingsbuffer (20 mM imidazool in 1x PBS).
  11. Eluteer de gebonden nanobodies met 2 ml elutiebuffer (500 mM imidazool in 1x PBS) in een microcentrifugebuis van 2 ml.
  12. Voer een bufferwissel uit.
    1. Breng een ontziltingskolom in een 50 ml buisadapter in evenwicht door 5x te spoelen met 5 ml 1x PBS.
    2. Laat de buffer volledig in de verpakte hars komen; Gooi de doorstroom weg. Na de laatste PBS-wasbeurt centrifugeert u de kolom gedurende 2 minuten op 1.000 x g .
    3. Gooi de doorstroom weg. Plaats de kolom met de adapter op een nieuwe buis van 50 ml. Laad 2 ml geëlueerde gefunctionaliseerde nanobody (uit stap 3.11) op de PBS-gebalanceerde ontziltingskolom en draai gedurende 2 minuten op 1.000 x g en verzamel het eluaat.
      OPMERKING: Dialyse kan ook worden gebruikt voor het vervangen van buffers.
  13. Kwantificeer de concentratie van het gezuiverde VHH-mCherry-eiwit met behulp van een bicinchoninezuur (BCA) of Bradford-test volgens de protocollen van de fabrikant.
    OPMERKING: Voor een efficiënte opname van nanobody in beeldvormingstoepassingen met levende cellen wordt een uiteindelijke voorraadconcentratie van 5-10 mg/ml aanbevolen.

4. Validatie van VHH-mCherry-expressie en zuiverheid (Coomassie-kleuring)

  1. Bereid een 10% natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegel (SDS-PAGE) volgens vastgestelde laboratoriumprotocollen.
    OPMERKING: Als alternatief kunnen in de handel verkrijgbare geprefabriceerde gradiëntgels van Bio-Rad worden gebruikt voor gemak en reproduceerbaarheid.
  2. Verdeel 20 μg gezuiverd VHH-mCherry in een microcentrifugebuis van 1,5 ml en denatureer door deze gedurende 5 minuten in de monsterbuffer bij 95 °C te koken.
  3. Laad het gedenatureerde nanobody-monster op de SDS-polyacrylamidegel en voer elektroforese uit volgens de standaard PAGE-procedures totdat de volgkleurstof (bijv. broomfenolblauw) de bodem van de oplossende gel bereikt.
  4. Ga verder met het kleuren en kleuren van de gel door Coomassie.
    1. Verwijder de gel voorzichtig uit de cassette en dompel deze onder in Coomassie kleuroplossing (5% van een 10 g/L Coomassie Brilliant Blue bouillon in 10% azijnzuur en 45% methanol in ddH2O) gedurende 20-30 minuten bij RT op een zacht schuddend platform. Zorg ervoor dat de gel volledig is ondergedompeld in de kleuroplossing.
    2. Vlek de gel met een kleuroplossing (7,5% azijnzuur en 15% methanol in ddH2O) en voer 2-3 opeenvolgende wasbeurten van elk 1 uur uit bij RT. Voor een optimale vermindering van de achtergrond laat u de gel 13-15 uur in een verse vlekkenoplossing intrekken.
      OPMERKING: Overtollige kleurstof kan effectief worden geabsorbeerd door tijdens het kleuringsproces huishoudelijke papieren handdoeken rond de gel te leggen. Kleurings-/kleuringsoplossingen bevatten ontvlambare methanol en irriterend azijnzuur. Gebruik in een zuurkast, draag handschoenen en een veiligheidsbril en verzamel gebruikte oplossingen in daarvoor bestemde containers voor brandbaar vloeibaar afval.
  5. Visualiseer de gel met behulp van een geldocumentatiesysteem of camera naar keuze.
    OPMERKING: Voor aanvullende bevestiging van nanobody-expressie kan immunoblotting met behulp van epitoopspecifieke antilichamen worden uitgevoerd (zie ook Figuur 1C).

5. Genereren van GFP-gelabelde reporter HeLa-cellijnen met behulp van retrovirale transductie

OPMERKING: Verschillende GFP-reporter HeLa α Kyoto-cellijnen (hier eenvoudigweg HeLa of HeLa α genoemd) zijn eerder gegenereerd17. Voor het demonstreren van de live-cell beeldvormingstest worden GFP-gelabelde CDMPR of TfR, als representatieve vrachteiwitten, gebruikt. Terwijl TM-eiwitten met type I-topologie GFP-gelabeld zijn aan het uiterste N-eindpunt, vereisen TM-eiwitten met type II-topologie C-terminale GFP-fusie.

  1. De genen die coderen voor EGFP-CDMPR (Addgene #182642) of TfR-EGFP (#243763) zijn eerder gesubkloneerd in de retrovirale vector pQCXIP met behulp van standaard restrictie-enzymkloontechnieken17. Bereid na transformatie in chemocompetente E. coli plasmide-DNA met een hoge zuiverheid met behulp van midi-prepkits (bijv. van Macherey-Nagel).
    OPMERKING: Chemocompetente bacteriële cellen moeten worden bereid volgens de standaard laboratoriumprotocollen. NEB 5-alpha Competente E. coli van NEB kan worden gebruikt voor klonering en plasmidezuivering.
  2. Om stabiele GFP-reporter HeLa-cellijnen te genereren, worden retrovirale deeltjes geproduceerd door transfectie van de verpakkingscellijn Phoenix ampho. Al het celkweekwerk wordt uitgevoerd onder BSL2 laminaire stromingsomstandigheden.
    1. De dag voorafgaand aan transfectie, zaad 2.0-3.0 x 106 Phoenix amphoencellen in een schaal van 10 cm in 10 ml van middel om 60%-80% samenvloeiing tegen de volgende dag te bereiken. Phoenix-amfo's worden gehandhaafd in DMEM high-glucose GlutaMAX-I met 10% foetaal runderserum (FBS), 100 eenheden/ml penicilline/streptomycine en 1 mM natriumpyruvaat.
    2. Op de dag van transfectie, vervang het middel met 10 ml vers volledig middel.
    3. Meng in een microcentrifugebuis van 1,5 ml 1 ml serum- en supplementvrije DMEM high-glucose GlutaMAX-I met 10 μg pQCXIP-EGFP-CDMPR of pQCXIP-TfR-EGFP en 30 μl FuGENE HD-transfectiereagens. Meng grondig door te pipetteren.
    4. Incubeer het mengsel gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur om de vorming van DNA-reagenscomplexen mogelijk te maken.
    5. Voeg het volledige transfectiemengsel druppelsgewijs toe aan de amphoenixcultuur. Draai de plaat voorzichtig rond om de complexen gelijkmatig te verdelen.
    6. Incubeer getransfecteerde Phoenix amfocellen gedurende 13-15 uur bij 37 °C met 5% CO2.
      OPMERKING: Alternatieve verpakkingscellijnen kunnen worden gebruikt, op voorwaarde dat ze compatibel zijn met het Retro-X Q-vectorsysteem.
  3. De volgende dag, gooi het transfectiemiddel weg en vervang het door 7 ml vers volledig middel om virale productie te verbeteren.
  4. Verzamel 48 uur en optioneel 72 uur na transfectie het kweeksupernatans (~7 ml) dat virale deeltjes bevat met behulp van een pipethulpmiddel. Bewaak de GFP-expressie in getransfecteerde Phoenix-amfocellen met behulp van een fluorescentiemicroscoop of beeldvormingssysteem (bijv. Bio-Rad ZOE).
    OPMERKING: Nogmaals, retrovirale manipulaties vereisen BSL-2-inperking. Voer alle werkzaamheden uit in een gecertificeerde bioveiligheidskast, draag handschoenen, een laboratoriumjas en oogbescherming en ontsmet oppervlakken met 1% hexaquart gevolgd door 70% ethanol voordat u het afval via een autoclaaf afvoert.
  5. Filter het verzamelde virale supernatans door een filter van 0,45 μm. Het gefilterde supernatans kan onmiddellijk worden gebruikt (zie stap 5.7) of worden bewaard bij 4 °C voor kortdurend gebruik of bij -80 °C voor langdurige opslag. Houd er rekening mee dat virale titers kunnen afnemen bij bevriezing.
  6. Om stabiele GFP-reporter HeLa-cellen te creëren, gaat u verder met retrovirale transductie met behulp van de gefilterde virale supernatant. Alle procedures moeten worden uitgevoerd onder BSL2-omstandigheden.
    1. Zaai een dag voor de transductie ongeveer 2,0-3,0 x 106 HeLa-α cellen in een schaal van 10 cm met 10 ml medium om de volgende dag 60%-80% samenvloeiing te bereiken. Cultuur HeLa α cellen worden gekweekt in DMEM high-glucose GlutaMAX-I aangevuld met 10% FBS en 100 E/ml penicilline/streptomycine.
    2. Meng gefilterd viraal supernatans met 15 μg/ml polybreen (hexadimethrinebromide) om de infectie-efficiëntie te verbeteren.
      OPMERKING: Polybrene is irriterend - behandel tijdens de voorbereiding van de bouillon met handschoenen en oogbescherming, vermijd de vorming van aërosolen en gooi Polybrene-houdende oplossingen weg als gevaarlijk chemisch afval.
    3. Vervang de volgende dag het standaard groeimedium door onverdund viraal supernatans dat Polybreen bevat en zorg ervoor dat het hele oppervlak van het schaaltje bedekt is.
    4. Incubeer HeLa-α cellen onder transductie gedurende 13-15 uur bij 37 °C met 5% CO2.
      OPMERKING: Om de virale titer te bepalen, kunnen seriële verdunnings- en infectietests op HeLa-α cellen worden uitgevoerd. Titeren is in dit geval optioneel, omdat retrovirussen alleen delende cellen infecteren.
  7. Gooi de dag na de transductie het virale medium weg bij het BSL2-afval en vervang het door 10 ml vers compleet HeLa-α medium. Incubeer gedurende 13-15 uur bij 37 °C met 5% CO2.
  8. Begin de volgende dag met de selectie door het medium te vervangen door een volledig medium dat 1,5 μg/ml puromycine bevat.
  9. Handhaaf de selectiedruk gedurende 2-3 weken en passeer cellen indien nodig. Voordat genetisch gemodificeerde cellen naar een BSL1-omgeving worden overgebracht, moet u ervoor zorgen dat ze vrij zijn van replicatiecompetente virale deeltjes.
  10. Om een homogene populatie te verkrijgen, gebruikt u klonale isolatie met behulp van kloonringen of cilinders, of fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS). FACS kan worden uitgevoerd op getransduceerde HeLa-α cellen met behulp van FACSAria III of Fusion (BD Biosciences) om te verrijken voor een populatie met uniforme GFP-expressie op basis van fluorescentie-intensiteit.
    OPMERKING: Expressie van de GFP-reporter in HeLa-α cellen kan verder worden gevalideerd door middel van fixe-cel fluorescentiemicroscopie of immunoblotting met anti-GFP-antilichamen (zie ook figuur 2C).

6. Opname van VHH-mCherry door gekweekte cellen voor beeldvorming van levende cellen

OPMERKING: Alle celkweekprocedures worden uitgevoerd onder steriele omstandigheden in een laminaire stromingskap voorafgaand aan live-celmicroscopie.

  1. 6.1Zaai onder steriele laminaire stroming ongeveer 50.000 tot 110.000 HeLa-cellen die stabiel GFP-gelabelde CDMPR- of TfR-reporterconstructies tot expressie brengen in elk putje van een μ-slide ibiTreat-kamerdia met 4 putjes. Gebruik 700 μL compleet kweekmedium met antibiotica (DMEM hoge glucose, fenol roodvrij), aangevuld met 10% FBS, 100 E/ml penicilline/streptomycine, 2 mM l-glutamine en 1,5 μg/ml puromycine.
  2. Incubeer de cellen gedurende 13-15 uur bij 37 °C in een bevochtigde incubator met 5% CO2 voor een goede hechting en proliferatie. Cellen zouden de volgende dag ongeveer 80% samenvloeiing moeten bereiken.
  3. Vervang op de dag van de beeldvorming, vlak voor het experiment, het medium in elk putje voorzichtig door 350 μL vers fenolroodvrij compleet medium.
  4. Bereid tegelijkertijd een VHH-mCherry-werkoplossing met een eindconcentratie van 2,5 μg/ml (ongeveer 50 nM) in voorverwarmd, fenolroodvrij medium. Houd de oplossing tot gebruik op 37 °C.
  5. Na het initialiseren van het geautomatiseerde live-cell beeldvormingssysteem (bijv. FEI MORE of Nikon Ti2 X-Light V3), verwarmt u de incubatiekamer van de microscoop voor op 37 °C met 5% CO2 voordat u de ibidi-microscopiekamer op de microscoop overbrengt en de acquisitie-instellingen als volgt configureert.
    1. Kies de U PlanS Apo 100x NA 1.4 en voeg de ibidi-microscopiekamer toe aan de microscooptafel.
    2. Stel twee kanalen in met de juiste excitatiegolflengte en single-band doorlaat-emissiefilters voor EGFP (bijv. 470/20 nm, em: 517/20 nm) en mCherry (bijv. 550/15 nm, em: 590/20 nm).
    3. Kies een korte belichtingstijd en een lage verlichtingsintensiteit om fotobleken te voorkomen (bijv. 50 ms en 5% vermogen voor EGFP, 160 ms en 25% voor mCherry). Het is belangrijk dat de gekozen waarden bij alle experimenten constant worden gehouden.
    4. Sla per voorwaarde (=goed) de coördinaten van 10 verschillende gezichtsvelden met 3-4 cellen in focus op in een puntenlijst.
    5. Afbeelding van elke positie in deze puntlijst één keer met een enkele momentopname. Dit zijn de referentiebeelden vóór de toevoeging van VHH-mCherry.
    6. Om de endocytische opname op gang te brengen, voegt u voorzichtig 350 μL van de voorverwarmde VHH-mCherry-oplossing toe aan elk putje, waarbij u zorgt voor een minimale verstoring van de celmonolaag. Ga verder met de incubatie bij 37 °C met 5% CO2.
    7. Beeld elk punt in de puntenlijst herhaaldelijk af in een time-lapse-experiment voor 100 frames met een vertraging van 36 s tussen frames bij 37 °C met 5% CO2.
    8. Om fotobleken te verminderen, geeft u opdracht tot de acquisitie van de kanalen om eerst mCherry en vervolgens EGFP in beeld te brengen.
    9. Om de doorvoer te verhogen, geeft u de opdracht aan de acquisitie om eerst alle posities opeenvolgend te verwerven en herhaalt u dit voor elk tijdstip.

7. Beeldanalyse van VHH-mCherry endocytische opname

  1. Voorverwerking van beelden en gegevensextractie na acquisitie in Fiji.
    1. Laad de time-lapse-afbeelding met behulp van de Bio-Formats-importeur-plug-in met de optie voor gesplitste kanalen geactiveerd.
    2. Corrigeer laterale drift met behulp van de MultiStackReg-plug-in. Gebruik het EGFP-kanaal als referentie en pas de transformatie ook toe op het mCherry-kanaal.
    3. Teken per cel een interessegebied (ROI) met de polygoontool (bijvoorbeeld rond het perinucleaire gebied) en voeg dit toe aan de ROI-manager.
    4. Meet voor beide kanalen de gemiddelde intensiteit in alle ROI's en tijdstippen met behulp van de Multi-measure-functie van de ROI-manager en sla de resulterende tabel op als tekstbestand.
    5. Open de bijbehorende referentieafbeelding en herhaal de meting voor elke ROI.
  2. Gegevensanalyse om endocytische opnamecurves te bepalen
    1. Open het tekstbestand en trek elk framenummer af van 1 zodat ze bij 0 beginnen, en vermenigvuldig vervolgens elk framenummer met de vertraging tussen frames in s (d.w.z. 36).
    2. Trek voor elke ROI de gemiddelde intensiteit in het VHH-mCherry-kanaal van het referentiebeeld af van elk frame van het bijbehorende time-lapse-beeld in het VHH-mCherry-kanaal om autofluorescentie en achtergrond te verwijderen.
    3. Deel voor elk frame en ROI de op de achtergrond afgetrokken VHH-mCherry-intensiteit door de gemiddelde intensiteit van de EGFP-kanalen om rekening te houden met intensiteitsfluctuaties binnen de ROI anders dan VHH-mCherry, bijvoorbeeld door Golgi-beweging, celcontractie, z-drift of verlichtingsinstabiliteiten.
    4. Normaliseer de resulterende curve naar zijn eigen maximum.
    5. Selecteer een reeks frames om artefacten aan het begin (d.w.z. media-toevoeging) of einde (d.w.z. drift, verbleking) van de time-lapse uit te sluiten.
    6. Pas de curvegegevens aan met een enkele exponentiële vervalfunctie die een kinetisch proces van de eerste orde modelleert:
      figure-protocol-1
      waarbij I(t) de genormaliseerde intensiteit op tijdstip t is, en t0 de tijdsvertraging tussen de VHH-mCherry-toevoeging en het begin van de opname verklaart. Bereken uit de snelheidsconstante k de halfwaardetijd τ1/2 van het proces als:
      figure-protocol-2
      OPMERKING: Bij het uitvoeren van een experiment met meerdere vervolgens afgebeelde gezichtsvelden (FOV) per tijdstip, kan elke corresponderende t0 enigszins verschillen, maar deze moet van het ene gezichtsveld naar het andere toenemen naar hogere waarden.
    7. Herhaal de procedure voor alle datasets en rapporteer de halfwaardetijden in boxplots.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om het retrograde eiwittransport naar verschillende intracellulaire compartimenten te onderzoeken, hebben we onlangs een op anti-GFP nanobody gebaseerd hulpmiddel ontwikkeld voor het labelen en volgen van recombinante fusie-eiwitten van het celoppervlak17. Hier beschrijven we de bacteriële productie van dergelijke afgeleide nanobodies en tonen we hun nut aan bij het monitoren van endocytische opname door beeldvorming van levende cellen. In combinatie met een fluorescerende reporter die in Golgi woont, biedt dit protocol een robuust platform om het retrograde transport van geselecteerde vrachteiwitten naar het trans-Golgi-netwerk (TGN) in realtime kwantitatief te bestuderen.

We hebben een verzameling van verschillende gefunctionaliseerde anti-GFP-nanobodies gegenereerd die een gemeenschappelijke modulaire architectuur delen, met behulp van standaard moleculaire kloneringstechnieken17. Hoewel de huidige studie zich richt op de fluorescerende variant VHH-mCherry, nemen we ook extra afgeleide nanobodies op om de veelzijdigheid van deze toolset te illustreren en hun potentieel voor toekomstige toepassingen te benadrukken. Ons meest basale construct, VHH-std (std voor standaard), omvat het VHH-domein, T7- en HA-epitopen voor op antilichamen gebaseerde detectie, een C-terminaal hexahistidine (His6)-label voor zuivering en een biotine-acceptorpeptide (BAP)-sequentie om enzymatische biotinylering en op streptavidine gebaseerde pulldown-assays met hoge affiniteit mogelijk te maken (Figuur 1A). Op basis van dit kernontwerp werden verschillende nanobody-derivaten ontwikkeld om de studie van endocytisch en retrograde transport te vergemakkelijken door middel van biochemische analyse, beeldvorming van vaste en levende cellen en elektronenmicroscopie.

Voor live-cell beeldvorming van endocytisch transport hebben we een fluorescerende anti-GFP nanobody ontwikkeld met een fluorofoor met excitatie- en emissiespectra die verschillen van die van GFP, waardoor een optimale spectrale scheiding tijdens fluorescentiemicroscopie wordt gegarandeerd. Op basis van de superieure vouweigenschappen in IPTG-geïnduceerde E. coli en de goed gekarakteriseerde fotofysische eigenschappen, hebben we mCherry geselecteerd als de fluorescerende tag bij uitstek. Andere roodverschoven fluoroforen, zoals monomeer rood fluorescerend eiwit (mRFP), zouden in principe ook geschikte alternatieven zijn, maar mCherry bleek bijzonder robuust en effectief in dit systeem.

Wat is het potentieel van andere gefunctionaliseerde nanobodies dan VHH-mCherry? Om het eiwittransport van het plasmamembraan naar het trans-Golgi-netwerk (TGN) te onderzoeken, hebben we gebruik gemaakt van de compartimentspecifieke lokalisatie van TPST's, die zich uitsluitend in de TGN- en trans-Golgi-cisternae bevinden. Daartoe hebben we VHH-std gemodificeerd met een tandemtyrosinesulfateringsmotief (2xTS) afgeleid van procholecystokinine29 van de rat, waardoor een biochemische uitlezing van de aankomst van de lading in deze compartimenten mogelijk is. Terwijl fusie van VHH-std naar mCherry directe visualisatie van retrograde transport mogelijk maakt door beeldvorming van vaste of levende cellen, maakt functionalisering met peroxidasen zoals APEX230 ultrastructurele lokalisatie mogelijk door elektronenmicroscopie, gerichte cytochemische ablatie of op nabijheid gebaseerde biotinyleringstesten. Bovendien biedt de incorporatie van een protease-splitsingsplaats van het tabaksetsvirus (TEV) in de nanobody-steiger een biochemisch middel om onderscheid te maken tussen geïnternaliseerde en oppervlaktegebonden nanobodies (Figuur 1A). Eerder gebruikten we het VHH-tev-construct om de recyclagekinetiek van nanobody-gebonden EGFP-CDMPR en TfR-EGFP17 te monitoren. Het opnieuw verschijnen van nanobody-gelabelde receptoren op het celoppervlak kan gemakkelijk worden gedetecteerd door recombinant TEV-protease extracellulair toe te passen, wat resulteert in een specifiek verlies van de C-terminale epitoopcassette van het nanobody. Analoog aan de opname van een TEV-splitsingsplaats in de hier gepresenteerde mCherry-gefunctionaliseerde nanobody VHH-mCherry maakt een dynamische beoordeling van de recycling van EGFP-reporters mogelijk door middel van beeldvorming van levende cellen. Functionalisering met alternatieve eiwitdomeinen - zoals extra fluoroforen, enzymatische tags of sequentiemotieven voor posttranslationele modificatie - kan gemakkelijk worden bereikt door de gewenste inserts in de VHH-std-ruggengraat te subkloneren via de SpeI- en EcoRI-restrictieplaatsen. Alle gefunctionaliseerde anti-GFP nanobody-constructies die in de oorspronkelijke studie17 werden gebruikt, zijn gedeponeerd bij Addgene voor openbare verspreiding.

Met behulp van het hierboven beschreven protocol werden alle hier geïllustreerde nanobody-varianten gezuiverd tot een hoge opbrengst en zuiverheid (Figuur 1B). Alleen de mCherry-fusie vertoonde een kleine proteolytische clipping van eiwitdomeinen na zuivering (Figuur 1B, baan 5). De twee waargenomen afbraakproducten komen hoogstwaarschijnlijk overeen met de individuele VHH- en mCherry-domeinen, zoals afgeleid uit hun schijnbare molecuulgewichten en geverifieerd door epitoopspecifieke immunoblotdetectie (Figuur 1C). Bij afwezigheid van co-tot expressie gebrachte BirA herstelde VHH-mCherry zich doorgaans bij opbrengsten van ongeveer 20 mg per preparaat. Op basis van onze ervaring vermindert co-expressie van BirA consequent de nanobody-opbrengst met ongeveer 1/3 tot 1 /2. De biotinylering was redelijk volledig omdat de nanobodies van een 1:1 mengsel met BSA volledig werden teruggewonnen door streptavidine-agarose (Figuur 1D).

Om de geschiktheid van deze nanobody-toolkit voor het bestuderen van endocytisch transport te evalueren, hebben we stabiele HeLa-cellijnen gegenereerd die EGFP-gelabelde oppervlaktereceptoreiwitten tot expressie brengen met verschillende intracellulaire transportroutes. Deze omvatten TfR, dat cycli tussen het plasmamembraan en vroege (sorteren en recyclen) endosomen maakt; TGN46, dat tussen het plasmamembraan en de TGN verkeert door vroege endosomen; en beide MPR's, die pendelen tussen de TGN, het plasmamembraan en zowel vroege als late endosomen17. EGFP werd gefuseerd met het extracellulaire domein van elke receptor - met name ingevoegd tussen het signaalpeptide en de receptorsequentie voor CDMPR, CIMPR en TGN46 - en met de C-terminus van TfR. Dit ontwerp behield de oorspronkelijke cytoplasmatische domeinen, waardoor alle bekende sorteersignalen intact bleven en de EGFP-tag toegankelijk was voor binding door extracellulaire anti-GFP-nanobodies (Figuur 1E). Voor CIMPR, waarvan het extracellulaire domein ongewoon groot is, werd een ingekorte versie gebruikt, in overeenstemming met eerdere studies die aantoonden dat een dergelijke afkapping het normale handelsgedrag in stand houdt31,32.

Stabiele cellijnen werden tot stand gebracht door retrovirale transductie, gevolgd door fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) om homogene celpopulaties met matige en vergelijkbare expressieniveaus te isoleren. Merk op dat EGFP-CDMPR consequent verscheen als een dubbele band in immunoblots, vergelijkbaar met zijn endogene tegenhanger33, wat wijst op heterogene glycosylering. Om te beoordelen of de EGFP-fusie-eiwitten de steady-state lokalisatie- en expressiepatronen van de endogene eiwitten recapituleren, werden de stabiel tot expressie brengende cellen samen gekweekt met ouderlijke HeLa-cellen en geanalyseerd door middel van confocale fluorescentiemicroscopie (Figuur 2B). Het EGFP-signaal weerspiegelde getrouw de verdeling van de corresponderende endogene eiwitten. Zoals verwacht zijn CDMPR, CIMPR en hun EGFP-gelabelde versies voornamelijk gelokaliseerd in het perinucleaire gebied - als gevolg van TGN en late endosomale compartimenten - met aanvullende labeling in perifere endosomen. Zowel endogene als EGFP-gelabelde TGN46 werden bijna uitsluitend gevonden in de perinucleaire TGN, terwijl TfR en TfR-EGFP de karakteristieke vroege endosoomverdeling vertoonden, met prominente perifere sortering en perinucleaire recyclingendosomen. Hoewel de gebruikte antilichamen zowel de endogene als de EGFP-gelabelde vorm detecteerden (behalve CIMPR), was de algehele kleuringsintensiteit niet duidelijk verhoogd in cellen die de fusie-eiwitten tot expressie brachten, wat suggereert dat de EGFP-constructen niet substantieel tot overexpressie werden gebracht. We hebben EGFP-TGN46 en EGFP-CIMPR opgenomen in figuur 2B voor directe vergelijking met EGFP-CDMPR en TfR-EGFP. De protocollen die worden gebruikt voor celfixatie en beeldvorming met fluorescentiemicroscopie zijn uiteengezet in eerdere studies17,19.

Met behulp van VHH-mCherry kan endocytisch transport van EGFP-gelabelde reportereiwitten worden gevolgd door middel van beeldvorming van levende cellen. Hiervoor hebben we als voorbeeld cellen gebruikt die EGFP-CDMPR en TfR-EGFP tot expressie brengen. De cellen werden in de loop van de tijd in beeld gebracht met een omgekeerde breedveld fluorescerende microscoop na toevoeging van VHH-mCherry aan het medium (Video 1 en Video 2). Stilstaande beelden op verschillende tijdstippen worden weergegeven in figuur 3. De opname werd gekwantificeerd door het signaal in het mCherry-kanaal te meten, de autofluorescentieachtergrond af te trekken en te normaliseren naar het EGFP-signaal om fluctuaties als gevolg van de beweging van gelabelde compartimenten of mogelijke kleine verschuivingen in het brandvlak te elimineren. De fluorescentie van VHH-mCherry in het medium bij 25 nM was verwaarloosbaar en had geen invloed op de metingen. Analyse van het transport van de reporters van het celoppervlak naar hun intracellulaire compartimenten, naar de steady-state verdeling, leverde dezelfde kinetische resultaten op als de biochemische experimenten getoond in figuur 2 van de vorige publicatie17, met schijnbare halfwaardetijden van opname van ~9 min voor EGFP-CDMPR en ~4 min voor TfR-EGFP, en verzadiging na ~43 min en ~20 min, respectievelijk. Deze waarden waren vergelijkbaar met de waarden die werden verkregen uit biochemische opname-experimenten met behulp van immunoblotting-assays17. In principe kan ook de kinetiek van retrograde transport naar subcellulaire gebieden van belang, zoals het perinucleaire gebied met de hoogste concentratie MPR's, worden geanalyseerd. Het perinucleaire gebied bevat echter niet alleen Golgi/TGN, maar is ook verrijkt met late endosomen en recycling-endosomen. De kinetiek van de opname van nanobody in het perinucleaire gebied is niet voldoende specifiek om retrograde transport naar een gedefinieerd organel te analyseren. Om het plasmamembraan-naar-TGN-transport betrouwbaarder te beoordelen, moet een ander fluorescerend eiwit, een TGN-residentie transmembraaneiwit, stabiel tot expressie worden gebracht samen met het GFP-reportereiwit, op een manier dat er geen spectrale overlap van fluorofooreigenschappen is. Het gebruik van deze extra marker maakt de detectie mogelijk van door verslaggevers geïmporteerde VHH-mCherry, analoog aan tyrosinesulfatering gemedieerd door TPST's, zoals eerder gedocumenteerd19.

figure-results-1
Figuur 1: Ontwerp en productie van afgeleide nanobodies voor het volgen van EGFP-gelabelde celoppervlakte-eiwitten. (A) Schematisch overzicht van de afgeleide nanobodies. Het standaard nanobody-construct bestaat uit een GFP-specifiek VHH-domein, T7- en HA-epitooptags, een biotine-acceptorpeptide (BAP) en een C-terminaal hexahistidine (His6)-tag voor zuivering. Aanvullende nanobody-varianten zijn modificaties met tandemtyrosinesulfateringsplaatsen (2xTS), het gemanipuleerde peroxidase APEX2 of het fluorescerende eiwit mCherry. Schaalbalk geeft de lengte van aminozuren (aa) aan. (B) Bacterieel tot expressie gebrachte en affiniteit-gezuiverde nanobodies (20-50 μg) werden geanalyseerd met gradiënt SDS-PAGE en gevisualiseerd door Coomassie kleuring. Aan de linkerkant zijn de molecuulgewichtsstandaarden (in kDa) aangegeven. Kleine proteolytische clipping werd alleen waargenomen voor VHH-mCherry, waarschijnlijk optredend tussen de VHH- en mCherry-domeinen. (C) Immunoblotanalyse van nanobody-preparaten (10 ng) met behulp van antilichamen gericht tegen T7-, HA- of His 6-epitopen, of gedetecteerd door streptavidine-HRP (SA-HRP) voor biotinylatiebeoordeling. (D) De mate van nanobody-biotinylering werd geëvalueerd door nanobodies te incuberen in een verhouding van 1:1 met BSA, gevolgd door streptavidine-agarose pulldown, pelleteren en wassen van de kralen. Gelijke volumes van het bovenstaande (S) en het kralengebonden materiaal (B) werden vervolgens geanalyseerd door middel van SDS-PAGE en Coomassie kleuring. Kwantitatief herstel van de nanobody in de kraalgebonden fractie wijst op volledige biotinylering. De aanwezigheid van zowel VHH- als mCherry-fragmenten in de gebonden fractie suggereert gedeeltelijke degradatie, waarschijnlijk optredend tijdens de monstervoorbereiding voor SDS-PAGE-analyse. De witte lijn tussen rijstroken 2 en 3 geeft de schrapping van twee niet-gerelateerde rijstroken aan. Dit cijfer is gewijzigd van17. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Expressie en intracellulaire lokalisatie van fluorescerend gelabelde EGFP-gelabelde vrachtreceptoren. (A) Schematische weergave van de EGFP-fusieconstructen. Sequenties afgeleid van secretoire transmembraaneiwitten zijn afgebeeld in zwart, met N-terminale signaalpeptiden en interne transmembraandomeinen geel gemarkeerd. Het EGFP-gedeelte is in groen geïllustreerd. Er werden constructies van volledige lengte gegenereerd voor CDMPR, TfR en TGN46, terwijl een goed gekarakteriseerde afgekapte variant werd gebruikt voor CIMPR om normaal handelsgedrag te behouden. Schaalbalk geeft de lengte van aminozuren (aa) aan. EGFP-CDMPR en TfR-EGFP zijn eerder beschreven17. (B) Om subcellulaire lokalisatie te beoordelen, werden HeLa-cellen die stabiel EGFP-fusie-eiwitten tot expressie brengen, samen gekweekt met ouderlijke HeLa-cellen en geanalyseerd door middel van fluorescentiemicroscopie. Schaalbalk staat voor 10 μm. (C) HeLa-cellen die stabiel EGFP-gelabelde reportereiwitten tot expressie brengen, werden gelyseerd en eiwitextracten werden onderworpen aan SDS-PAGE, gevolgd door immunoblotting met behulp van antilichamen tegen GFP en actine. Aan de rechterkant zijn moleculair gewichtsmarkers (in kDa) aangegeven. Dit cijfer is gewijzigd van17. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Beeldvorming van nanobody-endocytische opnamekinetiek gemedieerd door EGFP-CDMPR en TfR-EGFP. Beeldvorming van levende cellen werd uitgevoerd na toevoeging van 25 nM VHH-mCherry aan HeLa-cellen die stabiel (A) EGFP-CDMPR of (B) TfR-EGFP tot expressie brengen in fenolroodvrij compleet medium bij 37 °C. Cellen werden afgebeeld in de GFP- en mCherry-kanalen met behulp van een semi-automatische breedveldfluorescentiemicroscoop met intervallen van 36 s. Representatieve samengevoegde stilstaande beelden worden getoond, vergezeld van vergrote weergaven van het perinucleaire gebied (vergroting: 2,2x) in individuele kanalen eronder. (Schaalbalken, 10 μm.) Zie ook Video 1 en Video 2. Kwantitatieve analyse van de kinetiek van de nanobody-opname in (C) EGFP-CDMPR en (D) TfR-EGFP werd uitgevoerd met behulp van gegevens van drie onafhankelijke experimenten, die elk ongeveer 40 individuele cellen bevatten. Om rekening te houden met de beweging van organellen en de variabiliteit van het brandvlak werd de mCherry-fluorescentie-intensiteit genormaliseerd (norm) naar het GFP-signaal en uitgezet als het gemiddelde ± SD over alle cellen van de drie experimenten. Het gemiddelde maximale opnamesignaal werd genormaliseerd naar 1. De opnamekinetiek voor elke cel werd afzonderlijk aangepast met behulp van een kinetisch model van de eerste orde. De uitgezette lijnen geven de gemiddelde curven weer die zijn afgeleid van het gemiddelde van de corresponderende snelheidsconstanten. Dit cijfer is gewijzigd van17. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Video 1: Live-cell beeldvorming van de opname van mCherry-nanobody door EGFP-CDMPR. HeLa-cellen die EGFP-CDMPR stabiel tot expressie brengen, werden geïncubeerd bij 37 °C in een volledig medium dat 25 nM VHH-mCherry bevatte en met tussenpozen van 36 s in beeld gebracht in zowel de EGFP- als de mCherry-fluorescentiekanalen. De film werd gerenderd met een afspeelsnelheid van 5 frames/s, wat overeenkomt met een real-time compressie van 3 min/s. Deze film is aangepast van17. Klik hier om deze video te downloaden.

Video 2: Live-cell beeldvorming van de opname van mCherry-nanobody door TfR-EGFP. HeLa-cellen die stabiel TfR-EGFP tot expressie brengen, werden geïncubeerd bij 37 °C in volledig medium, aangevuld met 25 nM VHH-mCherry en afgebeeld voor EGFP- en mCherry-fluorescentie met intervallen van 36 s. De film werd gerenderd met 5 frames/s, wat neerkomt op een time-lapse-snelheid van 3 min/s. Deze film is aangepast van17. Klik hier om deze video te downloaden.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nanobodies vertegenwoordigen een snel opkomende klasse van eiwitbindende scaffolds die tal van voordelen bieden ten opzichte van conventionele antilichamen: ze zijn klein, zeer stabiel, monomeer, niet-verknopend, hebben geen disulfidebindingen en kunnen worden geselecteerd voor binding met hoge affiniteit24. In onze vorige studie ontwikkelden en pasten we gefunctionaliseerde nanobodies geproduceerd door bacteriële expressie toe om aan het oppervlak blootgestelde eiwitten te labelen en hun intracellulair transport naar verschillende compartimenten te monitoren, met een bijzondere focus op retrograde transport naar het trans-Golgi-netwerk (TGN)17. We gebruikten een anti-GFP nanobody om veelzijdigheid te garanderen, waardoor we ons kunnen richten op fusie-eiwitten die zijn gelabeld met extracellulaire GFP, YFP of mCerulean - fluorescerende tags die op grote schaal beschikbaar zijn en vaak al gekarakteriseerd zijn. Functionalisering van de anti-GFP-nanobody met mCherry-, APEX2- of tyrosinesulfateringsmotieven stelde ons in staat om de opname van vracht te visualiseren door middel van beeldvorming met vaste cellen en levende cellen, retrograde transportcompartimenten op ultrastructureel niveau te lokaliseren, gerichte compartimentablatie uit te voeren en de transportkinetiek naar de TGN kwantitatief te beoordelen. Een beperking van deze benadering is de voorwaarde voor genetische modificatie van de doelwitcellijnen - hetzij door stabiele overexpressie of endogene tagging - voordat gefunctionaliseerde anti-GFP-nanobodies effectief kunnen worden gebruikt. Deze strategie kan echter gemakkelijk worden aangepast aan het groeiende repertoire van nanobodies gericht tegen niet-gelabelde, endogene doelwiteiwitten die worden gegenereerd door immunisatie van dieren of in vitro selectie uit synthetische VHH-bibliotheken met behulp van ribosoom- of faagweergavetechnologieën34. Daarnaast zijn er de afgelopen jaren nanobodies ontwikkeld die gericht zijn op veelgebruikte epitooptags, zoals mCherry, V5 of ALFA 35,36,37. Met name hebben we onlangs een sulfatatie-competente anti-mCherry nanobody gebruikt om retrograde handel van CDMPR in GGA2-verarmde HeLa-cellen te onderzoeken door middel van snelle functionele inactivatie28. Kleine epitooplabels bieden het voordeel dat ze de oorspronkelijke conformatie en functie van het doeleiwit behouden, omdat ze minder snel interfereren met kritieke structurele domeinen. Nanobodies die deze compacte epitopen herkennen (bv. ALFA, V5) kunnen naadloos geïntegreerd worden in de functionele nanobody-toolkit om het nut ervan bij het bestuderen van endocytische en retrograde transportmechanismen uit te breiden.

In de huidige studie demonstreren we de toepassing van VHH-mCherry in experimenten met live-cell beeldvorming. Door EGFP-CDMPR en TfR-EGFP als reporter-eiwitten te gebruiken, waren we in staat om receptorspecifieke endocytische opname en hun progressie naar steady-state distributie te visualiseren. Kwantitatieve analyse van het transport van deze reporters van het plasmamembraan naar hun respectievelijke intracellulaire compartimenten onthulde een kinetiek die consistent was met die verkregen door middel van biochemische assays gepresenteerd in figuur 2 van een eerdere studie17. We ontdekten dat de schijnbare halfwaardetijd aanzienlijk langer was voor EGFP-CDMPR (~9 min) dan voor TfR-EGFP (~4 min), waarbij de signalen respectievelijk na ongeveer 43 minuten en 20 minuten verzadigd raakten. Deze kwantitatieve bevindingen sluiten goed aan bij eerder gepubliceerde gegevens over de dynamiek van MPR- en TfR-handel 38,39,40. Met name het VHH-mCherry-construct heeft veel aandacht gekregen van de onderzoeksgemeenschap, zoals blijkt uit talrijke Addgene-distributieverzoeken, en is al met succes geïmplementeerd in verschillende onafhankelijke studies 28,41,42,43,44.

Afhankelijk van de microscoopconfiguratie of experimentele vereisten zijn mCherry-gelabelde anti-GFP-nanobodies niet altijd optimaal. In dergelijke gevallen kunnen alternatieve fluoroforen of fluorescerende eiwitvarianten geschiktere spectrale eigenschappen bieden wanneer ze worden gebruikt in combinatie met GFP-reportercellijnen. Om dit aan te pakken, hebben we een bibliotheek van gefunctionaliseerde nanobodies opgezet met een breed scala aan fluorescerende eiwitten, waaronder mTagBFP2, mNeptune2.5, mCardinal2, TagRFP657 en iRFP670 (243764-68). Deze extra nanobody-constructies zullen beschikbaar worden gesteld via Addgene. Het gebruik van spectraal verschillende fluoroforen maakt een duidelijke scheiding van excitatie- en emissiesignalen mogelijk, waardoor een optimale live, real-time beeldvorming van maximaal drie fluorescentiekanalen met minimale spectrale overlap mogelijk wordt.

Hoewel het monitoren van de endocytische opname naar steady state eenvoudig lijkt, vormt het volgen van retrograde transport van eiwitten naar de TGN een grotere experimentele uitdaging. Naast VHH-mCherry en een GFP-gelabeld reportereiwit is een extra fluorescerende of kleurstofconjugeerbare TGN-residente marker nodig voor visualisatie en kwantificering. Bepaalde Golgi-residente eiwitten vertonen echter gedeeltelijke lekkage naar het celoppervlak, wat verder kan worden verergerd door verstoringen van intracellulaire transportroutes, zoals die worden geïntroduceerd door experimentele manipulatie van onderdelen van transportmachines. TGN46 wordt bijvoorbeeld vaak gebruikt als een Golgi-residente marker, ondanks zijn functionele rol als vrachtreceptor die TGN-naar-cel oppervlaktetransport van bepaalde secretoire ladingen bemiddelt16,45. Evenzo zijn glycosyltransferasen zoals β-1,4-galactosyltransferase ook gedetecteerd op het plasmamembraan41. Hoewel deze eiwitten naar de oppervlakte kunnen fietsen, blijft hun overheersende steady-state lokalisatie binnen de TGN. Het labelen van dergelijke markers met een spectraal verschillend fluorescerend eiwit of een kleurstof-compatibele tag (bijv. SNAP, Halo, enz.) en ze stabiel tot expressie brengen met een GFP-gelabelde transmembraanreporter zou kwantitatieve beeldvorming van levende cellen van TGN-aankomst mogelijk maken. Dit kan analoog worden gemeten aan de hierboven beschreven workflow, met kwantificering op basis van de accumulatie van het mCherry-signaal in het fluorescentiekanaal dat overeenkomt met het Golgi-residente fusie-eiwit. Huidige strategieën voor het onderzoeken van retrograde handel in vaste of levende cellen zijn vaak gebaseerd op chimere receptorconstructen in combinatie met IgG-antilichamen (bijv. CD8)46,47. Het inherente risico van verknoping als gevolg van de bivalentie van conventionele IgG's tijdens oppervlaktelabeling kan echter het intracellulaire lot van het gelabelde eiwit aanzienlijk veranderen, waardoor het na endocytose vaak wordt omgeleid naar lysosomale afbraak48,49. Daarentegen induceren nanobodies, vanwege hun monovalente aard en 1:1-bindende stoichiometrie, geen verknoping, waardoor de fysiologische transportroutes van het doeleiwit behouden blijven. Dit maakt op nanobodies gebaseerde benaderingen bijzonder waardevol voor het bestuderen van authentieke retrograde transportdynamica zonder kunstmatige routeringsartefacten te introduceren.

Optimale prestaties van dit protocol voor beeldvorming van levende cellen vereisen een zorgvuldige titratie van de nanobodyconcentratie, aangezien overmatige hoeveelheden leiden tot verhoogde achtergrondfluorescentie van ongebonden nanobody in het medium. Bovendien moet tijdens de titratie rekening worden gehouden met verschillen in expressieniveaus van GFP-reportercellijnen om een nauwkeurige kwantitatieve vergelijking te garanderen. Voor de productie van nanobody's is inductie bij lage temperatuur in E. coli van cruciaal belang om een goede vouwing van het mCherry-domein te bevorderen. Hogere inductietemperaturen resulteren meestal in verkeerd gevouwen of afgebroken eiwit en worden daarom niet aanbevolen.

Het succes van dit protocol hangt in belangrijke mate af van drie belangrijke aspecten: ten eerste de hoge rendabiliteit en zuiverheid van functionele nanobody-constructies om consistente etikettering en minimale achtergrond te garanderen; ten tweede, het gebruik van goed gekarakteriseerde cellijnen die GFP-gelabelde reportereiwitten stabiel tot expressie brengen met lokalisatie van het celoppervlak om fysiologische transportroutes samen te vatten; en ten derde, optimale behandeling en configuratie van de fluorescentiemicroscopie-opstelling, inclusief beeldvormingsparameters en spectrale scheiding, om een nauwkeurige kwantitatieve en kwalitatieve analyse van de dynamiek van het vrachtvervoer mogelijk te maken.

De hier gepresenteerde methode en het protocol, gericht op het gebruik van mCherry-gelabelde anti-GFP-nanobodies, maken zowel kwantitatieve als kwalitatieve tracking van ladingeiwitten mogelijk van het celoppervlak tot endocytische compartimenten in gekweekte zoogdiercellen. Wanneer deze benadering samen met een fluorescerend gelabelde Golgi-residente marker tot expressie komt, maakt deze benadering de analyse van retrograde transportroutes verder mogelijk. Als zodanig biedt deze tool een krachtige strategie om het intracellulaire transport van transmembraaneiwitten en receptoren op het celoppervlak te monitoren die voorheen niet toegankelijk waren voor labeling vanwege de afwezigheid van specifieke liganden of compatibele monomere bindende reagentia.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door de Universiteit van Basel. Wij danken Prof. em. Dr. Martin Spiess voor het maken en indelen van figuren, de Imaging Core Facility (IMCF) van het Biozentrum voor ondersteuning en PNAS voor toestemming voor herdruk.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Anti-GFP antilichaam Sigma-Aldrich118144600001Product wordt gedistribueerd door Sigma-Aldrich, maar geproduceerd door Roche
100-mm celkweekschalenTPPTPP93100
Anti-actin antilichaamEMD Millipore MAB1501
Anti-HA antilichaamvan labgemaakt van 12CA5 hybridoma
Anti-His6 antilichaamBethyl Laboratories A190-114A
Anti-T7 antilichaam Bethyl Laboratories A190-117A
BL21(DE3) Competent E. coliNEBC2527H
Calciumchloride dihydraatMerck Millipore102382opgelost in steriel water, stock is 1 M
Carbenicilline dinatriumzoutApplichemA1491opgelost in steriel water, stock is 100 mg/mL
Coomassie-R (Brilliant Blue)Sigma-AldrichB-0149
D-biotineSigma-AldrichB4501opgelost in steriel 500 mM NaH2PO4 of DMSO
Wegwerp PD10 ontzoutingskolommenGE HealthcareGE17-0851-01
DMEM GlutaMAX-IThermo Fisher Scientific61965026
DMEM, hoge glucose, geen glutamine, geen fenol roodThermo Fisher Scientific31053028
DNase IApplichemA3778opgelost in steriel water
Dulbecco’s fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS) zonder Ca2+/Mg2+Sigma-AldrichD8537
Foetaal runderserum (FBS)Thermo Fisher ScientificA5256701
Filtropur S, PES, porengrootte: 0,45 µmSarstedt83.1826
FuGENE HD transfectie reagensPromega E2311
Glazen dekplekjes (nr. 1.5H)VWR631-0153
Geit anti-muis HRPSigma-AldrichA-0168
Geit anti-konijn HRPSigma-AldrichA-0545
His buffer kitCytvia11003400
His GraviTrap kolommenCytvia11003399
ibidi µ-Slide 4 well, ibiTreat80426-IBIibidi
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG)ApplichemA1008opgelost in steriel water, stock is 1 M
Kanamycin sulfaatApplichemA1493opgelost in steriel water, stock is 100 mg/mL
L-glutamineApplichemA3704
Lysozym Sigma-Aldrich18037059001Product wordt gedistribueerd door Sigma-Aldrich, maar geproduceerd door Roche
Magnesiumchloride hexahydraatMerck Millipore105833opgelost in steriel water, stock is 1 M
Mini-Protean TGX gels, 4-20%, 15-wellBio-Rad4561096
Gemodificeerd HeLa Kyotovan lab
NEB5-alpha Competent E. coliNEBC2987U
NucleoBond Xtra Midi Plus, 10 prepsMacherey-Nagel 740412.1
Penicilline/StreptomycineBioconcept 4-01F00-H
Fenylmethylsulfonylfluoride (PMSF)ApplichemA0999.0025opgelost in 40% DMSO 60% isopropanol, stock in 500 mM
Phoenix ampho cellijnNolan lab
Polybreen (hexadimethrine bromide)Sigma-AldrichH9268
PuromycineInvivogenant-pr-1
Natriumchloride Merck Millipore106404opgelost in steriel water, stock is 5 M
Natriumpyrovaat Thermo Fisher Scientific11360039
Trans-Blot Turbo Pack, miniBio-Rad1704158
TryptoneApplichemA1553
Gistextract ApplichemA1552

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Johannes, L., Popoff, V. Tracing the retrograde route in protein trafficking. Cell. 135 (7), 1175-1187 (2008).
  2. Bonifacino, J. S., Rojas, R. Retrograde transport from endosomes to the trans-Golgi network. Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (8), 568-579 (2006).
  3. Boucrot, E., et al. Endophilin marks and controls a clathrin-independent endocytic pathway. Nature. 517 (7535), 460-465 (2015).
  4. Renard, H. F., et al. Endophilin-A2 functions in membrane scission in clathrin-independent endocytosis. Nature. 517 (7535), 493-496 (2015).
  5. Rioux, D. J., Prosser, D. C. A CIE change in our understanding of endocytic mechanisms. Front Cell Dev Biol. 11, 1334798(2023).
  6. Duncan, J. R., Kornfeld, S. Intracellular movement of two mannose 6-phosphate receptors: return to the Golgi apparatus. J Cell Biol. 106 (3), 617-628 (1988).
  7. Ghosh, P., Dahms, N. M., Kornfeld, S. Mannose 6-phosphate receptors: new twists in the tale. Nat Rev Mol Cell Biol. 4 (3), 202-212 (2003).
  8. Doray, B., Ghosh, P., Griffith, J., Geuze, H. J., Kornfeld, S. Cooperation of GGAs and AP-1 in packaging MPRs at the trans-Golgi network. Science. 297 (5587), 1700-1703 (2002).
  9. Yu, J., et al. WLS retrograde transport to the endoplasmic reticulum during Wnt secretion. Dev Cell. 29 (3), 277-291 (2014).
  10. Harterink, M., et al. A SNX3-dependent retromer pathway mediates retrograde transport of the Wnt sorting receptor Wntless and is required for Wnt secretion. Nat Cell Biol. 13 (8), 914-923 (2011).
  11. Port, F., et al. Wingless secretion promotes and requires retromer-dependent cycling of Wntless. Nat Cell Biol. 10 (2), 178-185 (2008).
  12. McGough, I. J., et al. SNX3-retromer requires an evolutionary conserved MON2:DOPEY2:ATP9A complex to mediate Wntless sorting and Wnt secretion. Nat Commun. 9 (1), 3737(2018).
  13. Banting, G., Ponnambalam, S. TGN38 and its orthologues: roles in post-TGN vesicle formation and maintenance of TGN morphology. Biochim Biophys Acta. 1355 (3), 209-217 (1997).
  14. Banting, G., Maile, R., Roquemore, E. P. The steady state distribution of humTGN46 is not significantly altered in cells defective in clathrin-mediated endocytosis. J Cell Sci. 111 (Pt 23), 3451-3458 (1998).
  15. Ponnambalam, S., Rabouille, C., Luzio, J. P., Nilsson, T., Warren, G. The TGN38 glycoprotein contains two non-overlapping signals that mediate localization to the trans-Golgi network. J Cell Biol. 125 (2), 253-268 (1994).
  16. Lujan, P., et al. Sorting of secretory proteins at the trans-Golgi network by human TGN46. Elife. 12, 91708(2024).
  17. Buser, D. P., Schleicher, K. D., Prescianotto-Baschong, C., Spiess, M. A versatile nanobody-based toolkit to analyze retrograde transport from the cell surface. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (27), E6227-E6236 (2018).
  18. Buser, D. P., Spang, A. Protein sorting from endosomes to the TGN. Front Cell Dev Biol. 11, 1140605(2023).
  19. Buser, D. P., Spiess, M. Analysis of Endocytic Uptake and Retrograde Transport to the Trans-Golgi Network Using Functionalized Nanobodies in Cultured Cells. J Vis Exp. (144), e59111(2019).
  20. Snider, M. D., Rogers, O. C. Intracellular movement of cell surface receptors after endocytosis: resialylation of asialo-transferrin receptor in human erythroleukemia cells. J Cell Biol. 100 (3), 826-834 (1985).
  21. Shi, G., et al. SNAP-tag based proteomics approach for the study of the retrograde route. Traffic. 13 (7), 914-925 (2012).
  22. Hamers-Casterman, C., et al. Naturally occurring antibodies devoid of light chains. Nature. 363 (6428), 446-448 (1993).
  23. Greenberg, A. S., et al. A new antigen receptor gene family that undergoes rearrangement and extensive somatic diversification in sharks. Nature. 374 (6518), 168-173 (1995).
  24. Schnider, S. T., Vigano, M. A., Affolter, M., Aguilar, G. Functionalized Protein Binders in Developmental Biology. Annu Rev Cell Dev Biol. 40 (1), 119-142 (2024).
  25. Huttner, W. B. Tyrosine sulfation and the secretory pathway. Annu Rev Physiol. 50, 363-376 (1988).
  26. Baeuerle, P. A., Huttner, W. B. Tyrosine sulfation is a trans-Golgi-specific protein modification. J Cell Biol. 105 (6 Pt 1), 2655-2664 (1987).
  27. Stone, M. J., Chuang, S., Hou, X., Shoham, M., Zhu, J. Z. Tyrosine sulfation: an increasingly recognised post-translational modification of secreted proteins. New Biotech. 25 (5), 299-317 (2009).
  28. Buser, D. P., Bader, G., Spiess, M. Retrograde transport of CDMPR depends on several machineries as analyzed by sulfatable nanobodies. Life Sci Allianc. 5 (7), 202101269(2022).
  29. Leitinger, B., Brown, J. L., Spiess, M. Tagging secretory and membrane proteins with a tyrosine sulfation site. Tyrosine sulfation precedes galactosylation and sialylation in COS-7 cells. J Biol Chem. 269 (11), 8115-8121 (1994).
  30. Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nat Meth. 12 (1), 51-54 (2015).
  31. Waguri, S., et al. Visualization of TGN to endosome trafficking through fluorescently labeled MPR and AP-1 in living cells. Mol Biol Cell. 14 (1), 142-155 (2003).
  32. Anitei, M., et al. A high-throughput siRNA screen identifies genes that regulate mannose 6-phosphate receptor trafficking. J Cell Sci. 127 (Pt 23), 5079-5092 (2014).
  33. Hoflack, B., Kornfeld, S. Purification and characterization of a cation-dependent mannose 6-phosphate receptor from murine P388D1 macrophages and bovine liver. J Biol Chem. 260 (22), 12008-12014 (1985).
  34. Fridy, P. C., et al. A robust pipeline for rapid production of versatile nanobody repertoires. Nat Meth. 11 (12), 1253-1260 (2014).
  35. Götzke, H., et al. The ALFA-tag is a highly versatile tool for nanobody-based bioscience applications. Nat Commun. 10 (1), 4403(2019).
  36. Zeghal, M., et al. Development of a V5-tag-directed nanobody and its implementation as an intracellular biosensor of GPCR signaling. J Biol Chem. 299 (9), 105107(2023).
  37. Katoh, Y., et al. Overall Architecture of the Intraflagellar Transport (IFT)-B Complex Containing Cluap1/IFT38 as an Essential Component of the IFT-B Peripheral Subcomplex. J Biol Chem. 291 (21), 10962-10975 (2016).
  38. Hirschmann, D. T., Kasper, C. A., Spiess, M. Quantitative analysis of transferrin cycling by automated fluorescence microscopy. Methods Mol Biol. 1270, 365-378 (2015).
  39. Ciechanover, A., Schwartz, A. L., Dautry-Varsat, A., Lodish, H. F. Kinetics of internalization and recycling of transferrin and the transferrin receptor in a human hepatoma cell line. Effect of lysosomotropic agents. J Biol Chem. 258 (16), 9681-9689 (1983).
  40. Hirst, J., Futter, C. E., Hopkins, C. R. The kinetics of mannose 6-phosphate receptor trafficking in the endocytic pathway in HEp-2 cells: the receptor enters and rapidly leaves multivesicular endosomes without accumulating in a prelysosomal compartment. Mol Biol Cell. 9 (4), 809-816 (1998).
  41. Sun, X., Mahajan, D., Chen, B., Song, Z., Lu, L. A quantitative study of the Golgi retention of glycosyltransferases. J Cell Sci. 134 (20), 258564(2021).
  42. Pereira, C., et al. The exocyst complex is an essential component of the mammalian constitutive secretory pathway. J Cell Biol. 222 (5), 202205137(2023).
  43. Podinovskaia, M., Prescianotto-Baschong, C., Buser, D. P., Spang, A. A novel live-cell imaging assay reveals regulation of endosome maturation. Elife. 10, 70982(2021).
  44. Reck, J., Beuret, N., Demirci, E., Prescianotto-Baschong, C., Spiess, M. Small disulfide loops in peptide hormones mediate self-aggregation and secretory granule sorting. Life Sci Alliance. 5 (5), 202101279(2022).
  45. Wakana, Y., et al. A new class of carriers that transport selective cargo from the trans Golgi network to the cell surface. EMBO J. 31 (20), 3976-3990 (2012).
  46. Rawat, S., Sharma, M. CD8alpha-CI-M6PR Particle Motility Assay to Study the Retrograde Motion of CI-M6PR Receptors in Cultured Living Cells. Bio Protoc. 14 (9), e4979(2024).
  47. Breusegem, S. Y., Seaman, M. N. Image-based and biochemical assays to investigate endosomal protein sorting. Methods Enzymol. 534, 155-178 (2014).
  48. Niewoehner, J., et al. Increased brain penetration and potency of a therapeutic antibody using a monovalent molecular shuttle. Neuron. 81 (1), 49-60 (2014).
  49. Villasenor, R., Schilling, M., Sundaresan, J., Lutz, Y., Collin, L. Sorting Tubules Regulate Blood-Brain Barrier Transcytosis. Cell Rep. 21 (11), 3256-3270 (2017).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Retrograde transportfluorescentiemicroscopietransmembraaneiwittennanobody zuiveringEGFP taggingtime lapse imagingtransferrinereceptor

Gerelateerde artikelen