Dit protocol stelt een objectieve definitie vast van grafttoetoegankelijkheid op basis van dagelijkse urine-output en serumnierfunctiepanelwaarden om reproduceerbaar en objectief te karakteriseren of het graft onafhankelijk in staat is homeostase te behouden zonder afhankelijk te zijn van dialyse binnen de eerste 7 dagen na transplantatie.
Methodenartikel
Een gestandaardiseerd autotransplantatieprotocol voor varkensniertransplantatie voor het bestuderen van vertraagde transplantatiefunctie
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Vertraagde transplantatiefunctie (DGF) wordt gewoonlijk gedefinieerd als de noodzaak om binnen 7 dagen na een niertransplantatie dialyse te ondergaan; Huidige definities zijn echter vaak gebaseerd op subjectief klinisch oordeel en missen gestandaardiseerde criteria die graft sufficiëntie nauwkeurig beschrijven. Deze inconsistentie belemmert diagnose- en onderzoeksvergelijkingen. Dit protocol stelt objectieve drempels voor DGF vast met behulp van kwantificeerbare urine-output en serum-nierfunctiewaarden om objectief de grafttoetoebehorigheid en het onafhankelijke vermogen om homeostase te behouden te beschrijven. Onderzoek naar varkensmodellen is uitdagend vanwege het ontbreken van consensus diagnostische eindpunten voor DGF en de moeilijkheid om dialyse langdurig uit te voeren. Om dit aan te pakken, introduceren we een duidelijk gedefinieerd protocol voor het definiëren en induceren van DGF bij autotransplantatie van varkensnieren na 30 minuten van geïsoleerde nierwarme ischemie, waarbij donor-na-circulatoire dood (DCD)-achtige inkoop wordt gesimuleerd. We beschrijven niet-invasieve Foley-katheterisatie, centrale veneuze toegang en arteriële lijnmonitoringmethoden bij vrouwelijke varkens, wat nauwkeurige urine-uitlaatmeting, dagelijkse bloedonderzoeken en intraoperatieve monitoring mogelijk maakt. Deze technieken worden gedetailleerd om transparantie en reproduceerbaarheid te waarborgen, waardoor een gestandaardiseerd eindpunt ontstaat voor DGF-studies bij varkens die het klinische fenotype recapituleren.
Inleiding
De wachtlijst voor niertransplantaties in de VS overschrijdt 90.000 patiënten. Door een tekort aan transplantaties worden jaarlijks minder dan 30.000 niertransplantaties uitgevoerd, terwijl een vergelijkbare groep nieuwe patiënten aan de wachtlijstwordt toegevoegd 1. Om dit verslechterende tekort aan te pakken, worden steeds vaker gekozen voor suboptimale door ischemie beschadigde DCD-nieren. Sinds 2023 komt zelfs 50% van de nieren die in de VS worden getransplanteerd van DCD-donoren. DCD-nieren worden geassocieerd met hoge percentages vertraagde graftfunctie (DGF). DGF wordt door de meesten gedefinieerd als een dialysevereiste binnen 7 dagen na een niertransplantatie. Hoewel DGF een tijdelijke graftinsufficiëntie is, wordt het geassocieerd met verhoogde snelheden van vroege en late graftafstoting en een kortere mediane overleving van 8-12 jaar2. Omdat het grotendeels een subjectieve klinische definitie is, is DGF lastig te bestuderen in varkensmodellen vanwege het ontbreken van een objectieve, gestandaardiseerde definitie en de uitdagingen van langdurige dialyse bij varkens. In dit werk ontwikkelden we een objectief, gestandaardiseerd protocol voor het definiëren van graftsufficiëntie en het induceren van DGF bij autotransplantatie van varkensnieren. Vanwege de door xenotransplantatie bewezen overeenkomsten in de functie van varkens- en menselijke nieren, is dit protocol vertaalbaar naar menselijke niertransplantatie. Voor dit model werd gekozen voor de autotransplantatie van varkensnieren vanwege de primaire reden om het effect van ischemie-reperfusieschade te isoleren als variabele die vroege graftinsufficiëntie reguleert en het neutraliseren van allo-immuniteit of immunosuppressietoxiciteit als confounders.
Definitie van vertraagde graftfunctie: Om de twee belangrijkste uitdagingen te overwinnen: 1) objectief de toereikendheid van de transplantatie te definiëren en 2) het tijdelijk karakter van het fenotype bij afwezigheid van dialyseondersteuning als brug naar functioneel herstel van het transplantaat, gebruikten we objectieve urine-output en nierfunctiepanelwaarden om de ziekte te definiëren. Door de volumereanimatie te standaardiseren, de criteria voor autotransplantatie en het ontbreken van anastomotische compromittering (arterie, vene of ureter) sluit een permanente, anatomische oorzaak van transplantaatinsufficiëntie uit. We definieerden vertraagde graftfunctie bij varkensautotransplantatie als: Vroege tijdelijke transplantatie-insufficiëntie door langdurige anurie (<100 mL/dag) van meer dan 3 dagen, wat leidt tot variabele niveaus van BUN, creatinine en kaliumaccumulatie tot het bereiken van een humane eindpunt van K ≥ 8 mEq/L (hoog risico op hartaritmie en een objectieve indicatie voor urgente/emergente dialyse) zonder anastomotische compromittering. Op basis van deze definitie produceert een functioneel transplantaat voldoende urineproductie om de elektrolytenbalans te behouden en een dalende BUN- en creatininebalans te behouden. Omgekeerd produceert een onvoldoende transplantatie niet genoeg urine om BUN en creatinine uit te scheiden en veroorzaakt het levensbedreigende hyperkalemie die dialyse (of humane euthanasie bij afwezigheid daarvan) vereist, vanwege omkeerbare parenchymale ischemie-reperfusieschade en niet door onomkeerbare anastomotische compromittering of afstoting.
Protocol
Deze studie werd goedgekeurd door de Duke University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Vrouwelijke uitsluitend (voor niet-invasieve Foley-katheter inbrenging) Yorkshire-varkens van 40-50 kg (voor handige nier- en urethrale ostiale diameters voor cannulation) worden in dit model gebruikt. Dit protocol kon worden uitgevoerd door een team van vier personeelsleden: een chirurg, een assistent, een orgaanperfusionist en een studiemanager (voor monsters, benodigdheden en data).
1. Postoperatieve dag (POD) -1 (nieraanschaf)
- Anesthesie
- Geef de dieren voorbehandeling met intramusculaire (IM) injecties van ketamine (22 mg/kg) en Midazolam (0,5 mg/kg).
OPMERKING: Beginnen met een relatief hogere dosis ketamine helpt om de intraoperatieve behoefte aan isofluraan veilig te verminderen. - Geef Isoflurane eerst via de snuitkegel bij 1-1,5% (maximaal 2,5%) totdat kaak en bovenste luchtweg ontspannen zijn om intubatie mogelijk te maken. Stel het getijdenvolume in op 7-7,5 mL/kg en de ventilatiesnelheid op 18-20 ademhalingen per minuut om de fysiologische zuurstofsaturatie en PCO2 te behouden. Breng voorzichtig oogzalf aan en/of plak de oogleden dicht ter bescherming tegen krassen of uitdrogen.
- Geef de dieren voorbehandeling met intramusculaire (IM) injecties van ketamine (22 mg/kg) en Midazolam (0,5 mg/kg).
- Plaatsing van centrale tunnellijnen
- Plaats een 9,6 Fr enkel lumen Hickman tunneled centrale lijn die uit de huid komt van de achterkant van het varken tussen de schouderbladen om pijnloze bloedafname op aanvraag mogelijk te maken, terwijl ze op hun zij kunnen liggen met minimale stress en met een laag risico op verstoring van de centrale lijn katheter (Figuur 1).
- Na het voorbereiden van de huid met een scalpel van 11 bladen voert u drie oppervlakkige incisies uit door de dermis naar de onderhuidige vetlaag, tussen de schouderbladen, in de nek en aan de rechtervoorkant van de hals.
- Gebruik de weefseltunneler om een subcutane tunnel te maken die de drie incisies verbindt. Terwijl je ligt, rijg je de katheter van tussen de schouderbladen naar de rechter voorste hals.
- Om de centrale lijnkatheter in de rechter externe halsslagader (EJ) in te brengen, draai je het varken naar de rugligging van de Trendelenburg en gebruik je een 18 G zoeknaald om de EJ te aspireren met behulp van de Flourney and Mani anatomische triangulatietechniek3. Rijg een draad in het lumen met Seldinger's techniek4, gebruik de peel-away introductor om het kanaal te verwijden, rijg de Hickman-katheter in het lumen van de EJ en zet de centrale lijn aan de achterkant vast. Na bevestiging van bloedterugvloei, sluit heparine de lijn en herhaal na elk gebruik5. Als het uitdagend is om de rechter EJ te bereiken, gebruik dan de tissue tunneler om de subcutane tunnel aan de voorkant van de luchtpijp uit te breiden en de katheter aan de linkerkant van de hals te brengen voor inbreng in de linker EJ.
- Plaats een 9,6 Fr enkel lumen Hickman tunneled centrale lijn die uit de huid komt van de achterkant van het varken tussen de schouderbladen om pijnloze bloedafname op aanvraag mogelijk te maken, terwijl ze op hun zij kunnen liggen met minimale stress en met een laag risico op verstoring van de centrale lijn katheter (Figuur 1).
- Foley-plaatsing (drie methoden om de invasieve invasieve positie te verhogen bij het falen van de inbrenging)
- Handmatige aanpak
- Leg het dier op rugligging op de operatietafel. Bereid de huid rond de vaginale vault voor met betadine en overspoel de vaginale vault met 10 ml betadine (om de microbiële belasting en het risico op urineweginfecties te verminderen).
OPMERKING: Zelfs als ze volledig opgeblazen zijn, glijden 5 ml ballonnen vaak uit. - Plaats een 12-14 Fr gesmeerde Foley-katheter die handmatig met een draad wordt verstevigd door 4-5 cm diep in de vaginale opening aan de voorste (ventrale) vaginale wand te voelen.
- Leg het dier op rugligging op de operatietafel. Bereid de huid rond de vaginale vault voor met betadine en overspoel de vaginale vault met 10 ml betadine (om de microbiële belasting en het risico op urineweginfecties te verminderen).
- Speculumbenadering: Als de handmatige aanpak faalt, gebruik dan een gesmeerd speculum om de urethrale opening in de vagina te visualiseren. Gebruik de lange DeBakey-tang met steriel gaas om de Betadine voorzichtig droog te deppen en plaats de 12-14 Fr, 10 mL ballon-Foley-katheter met of zonder verstevigingsdraad onder directe visualisatie. Blaas de ballon alleen op nadat je de urine hebt gecontroleerd.
- Chirurgische aanpak: Als de speculumbenadering (stap 1.3.2) ook faalt, plaats je de Foley-katheter chirurgisch over een draad. Na de laparotomie steek je een naald van 18 G in de blaas, steek je een draad van ongeveer 1,035" in de plasbuis door de blaas, rijg je de Foley-katheter eroverheen naar de blaas en blaas je de ballon op. Trek de draad door de vagina (om buikbesmetting te voorkomen) en sluit het kleine naaldgaatje in de blaas met een enkellaagse 6-0 Prolene achtvormige afsluiting. Naai het lichaam van de Foley en een 1 L urinezak aan de huid van het varken (Figuur 1).
- Handmatige aanpak
- Precisiemedicatie
- Dien de eerste van de dagelijkse anti-trompjedruppels aspirine 81 mg oraal toe in het wangzakje, gevolgd door ceftiofur depot IM-antibioticum, 1 g cefazolin IV via centrale lijn voor SSI-preventie, IM Buprenorfine (0,005-0,01 mg/kg) voor pijnbestrijding, en start in totaal 1 L gebalanceerde elektrolytoplossing met een constante infusie van 250 mL/u.
2. Levensondersteunende porcine DCD niertransplantatie
- Nierverwerving
- Bereid de huid van de buik voor en drapeer. Voer een midline laparotomie uit van de xyphoid naar de pubis.
OPMERKING: Er zijn 1-2 grote aderen die subcutaan de middenlijn kruisen nabij de pubis en hevig bloeden als ze worden doorgesneden, maar gemakkelijk onder controle kunnen worden gebracht met elektrocauterisatie. - Stel een Bookwalter-retractor (of twee Balfour-retractoren op 90°) in met vier lichaamswandbladen die beide zijden van de buikwand omhoog houden om te voorkomen dat de dunne darm uit de buik loopt met daaropvolgende veneuze en lymfatische compressie en zwelling van de darm.
- Met twee warme, met zoutoplossing bevochtigde chirurgische handdoeken wordt de darm teruggetrokken naar de linkerkant van de buik en de retractoren erboven vervangen om voorzichtig het rechter retroperitoneum met de rechternier bloot te leggen.
OPMERKING: Een zekere mate van Trendelenburg (hoofd omlaag) positie kan ook helpen bij darmretractie. - Open het achterste peritoneum aan de laterale zijde van de nier (om schade aan de rechter ureter te voorkomen voordat je het visualiseert). Ontleed de rechter ureter van het achterste peritoneum en van de rechter nierslagader en verdeel deze tussen twee 2-0 zijden banden aan de onderste pool van de rechter nier. Laat een langere hechtdraad op de resterende urineleider zitten voor gemakkelijke identificatie tijdens de implantatie (24 uur later). Laat de rest van de ureter bedekt onder het peritoneale slijmvlies om littekenvorming en de noodzaak van uitgebreide dissectie bij de tweede implantaatoperatie te verminderen.
OPMERKING: Let goed op dat je de twee lumbale venen die direct onder de start van de rechter nierslagader vanuit de aorta (varkensspecifieke anatomie, anders dan de retro-peritoneale anatomie van de mens) bij de IVC aansluiten, niet beschadigt. Het binden en delen van die lumbale aders is ook een veilige optie. - Dissecteer de nierslagader weg van de niervena en langs haar verloop onder de IVC naar de aorta-oorsprong om maximale beschikbare arteriële lengte te bereiken. Druk de IVC kort samen en rol deze naar het linker retroperitoneum om de oorsprong van de rechter nierslagader die eronder loopt na het vertrek uit de abdominale aorta bloot te leggen.
OPMERKING: Bij varkens zijn er meestal 1-2 lymfeklieren die geassocieerd zijn met de nierslagader die deze verbergen; echter, de nierslagader wordt goed geskeletteerd nadat deze klieren zijn ontleed en verwijderd. - Dissecteer de rechter nierader weg van de rechterbijnier van de hersenschijf. Om een paar millimeter ruimte te verkrijgen tussen de rechter nierader en de bijnier, tilt u voorzichtig de achterste peritoneale bekleding van de rechter nierader totdat de grotere bijnierdrainerende venen zichtbaar zijn die de IVC binnenkomen.
- Om het DCD-inkoopproces te simuleren, geef je 500 U/kg heparine via de centrale lijn en laat je het 5 minuten circuleren, bind dan de nierslagader dubbel vast en vervolgens de nierader bij hun oorsprong (voor maximale lengte) met 2-0 zijden banden of groter (3-0 zijden banden zijn te dun en bros voor dit meegaande weefsel en glijden vaak) en start je een stopwatch voor 30 minuten in-situ Geïsoleerde renale warme ischemische tijd. Tijdens de warme ischemische periode gebruik je tenotomie-schaar of elektrocauterie op de snijinstelling om de nierslagader en ader van elkaar te scheiden voor latere vergemakkelijking van implantatie.
OPMERKING: Het skeletteren van de vaten ter plaatse tijdens de warme ischemische periode maakt gebruik van de vasculaire controle om bloedverlies bij vasculair letsel te voorkomen, terwijl de met bloed gevulde vaten kleine vasculaire lekken kunnen blootleggen die door bloedingen uit de geïsoleerde niercirculatie die voor simulatie van ischemisch letsel worden afgesloten, kunnen worden hersteld. - Aan het einde van de warme ischemische tijd verdeel je de vaten en de ureter en cannuleer je de nierslagader met een 3 mm rechte canule en geef je 250 ml ijskoude oplossing van de Belzer University of Wisconsin via de nierslagader.
OPMERKING: Een 5 mm rechte canule is te groot en kan leiden tot intime schade en flapvorming. - Bewaar het transplantaat via een hypothermische perfusie zonder zuurstofapparatuur gedurende 24 uur. Spoel de buik met 1 L gebalanceerde elektrolytoplossing en sluit de fascia met continue 1-0 Prolene lushechtingen. Spoel de wond en sluit de huid met nietjes.
- Extubeer het varken en keer terug naar het verblijf en herstel 24 uur van de narcose. Voor pijnbestrijding geef je Bupivacaïne (gewichtsgebaseerde dosering) subcutaan in de wondringen en geef je intramoeze intraveneuze afgifte Buprenorfine (gewichtsgebaseerde dosering).
OPMERKING: Paracetamol kan ook worden toegediend zonder effect op GFR (in tegenstelling tot NSAID's).
- Bereid de huid van de buik voor en drapeer. Voer een midline laparotomie uit van de xyphoid naar de pubis.
- Nierimplantatie
OPMERKING: Nierimplantatie vindt intraperitoneaal plaats volgens de aangepaste Starzl-benadering van een nierimplantaat direct op de abdominale aorta en IVC met ureter-ureter anastomose6. De rechternier wordt geëpplanteerd en opnieuw geïmplanteerd in een lagere positie, omgekeerd in het rechter retroperitoneum, volgens de Simforoosh-techniek7. De implantaatoperatietijd varieert tussen 3 en 5 uur, en de naaitijd tussen de 20 en 40 minuten, afhankelijk van het niveau van training of expertise en de complexiteit van de anatomie.- Na 24 uur herstel wordt het varkensbuikje opnieuw in de OK behandeld, geïntubbert, voorbereid en opnieuw bedekt (Figuur 2).
- Plaatsing van arteriële lijnen (drie methoden bij het falen van de inbrenging)
- Auriculaire arteriële lijn: Om de hemodynamica intraoperatief te monitoren en de reanimatie van vloeistof en pressor te begeleiden, vooral na reperfusie om het dier te ondersteunen tijdens het reperfusiesyndroom en geen secundaire low-flow acute nierbeschadiging (AKI) te veroorzaken, plaats een 22 G angiocath arteriële lijn in de auriculaire arterie door palpatie van de puls van de auriculaire arterie aan de achterzijde van beide oren van het varken.
- Halsslagaderlijn: Als de auriculaire insertie faalt, maak je anders een middenlijnincisie in de hals tot aan de luchtpijp. Ontleed het bindweefsel naast de luchtpijp en trek het terug met een Weitlaner of een Gelpi zelfhoudende retractor. Eenmaal gevisualiseerd, omsluit je de halsslagader met een 2-0 zijden band. Plaats een percutane 4 Fr Cordis-halsslagader via de Seldinger-techniek zonder dat arteriële dilatatie nodig is. Bind het distale uiteinde van de halsslagader af en laat een 2-0 zijden band achter om het proximale uiteinde af te binden aan het einde van de operatie nadat de arteriële lijn is verwijderd, gevolgd door een nietgemaakte huidsluiting.
- Femorale arteriële lijn. Alternatief kan een femorale lijn percutaan worden ingebracht of via een cutdown.
OPMERKING: Een femorale lijn zal tijdelijk niet functioneren tijdens het klemmen van de aorta voor de arteriële anastomose tijdens de implantatie.
- Plaatsing van arteriële lijnen (drie methoden bij het falen van de inbrenging)
- Precisiemedicatie
- Dien de tweede dosis dagelijkse anti-trombocyten toe, aspirine 81 mg oraal in het wangzakje, gevolgd door 1 g cefazolin via centrale lijn voor SSI-preventie, IM Buprenorfine (0,005-0,01 mg/kg) voor pijnbestrijding, en start in totaal 4 L gebalanceerde elektrolytenoplossing met een constante infusie van 250 mL/u.
- Start een constante niet-titratable dopamine-infusie via de centrale lijn bij 2 μg∙kg-1∙min-1 en noradrenaline-infusie titraerbaar tot maximaal 0,4 μg∙kg-1∙min-1 voor een doel-MAP van 80-100 mmHg.
OPMERKING: De snelheid van vochttoediening kan tijdelijk worden verhoogd tot 1 L/u of hoger via een drukzak direct voor de reperfusie om betere hemodynamische ondersteuning te bieden als hypotensie tijdens het reperfusiesyndroom bijzonder uitdagend is.
- Open de buik opnieuw door de huidnietjes te verwijderen en de fasciale hechtingen door te knippen, en introduceer de Bookwalter-retractor opnieuw.
- Ontleed de afdalende peritoneale bedekking van de dikke darm op de middenlijn boven de aorta en IVC (bij varkens is de dalende colon via een kortere peritoneale bedekking verbonden met de middenlijn boven de aorta en IVC van de linker niervaten naar de arteria inferieur mesenterica om de aorta en IVC in het retroperitoneum (plaats van niertransplantaat) te onthullen.
OPMERKING: Let goed op dat alleen de peritoneale aanhechting van de dikke darm direct boven de grote vaten wordt gescheiden en de dalende dikke darm niet wordt gedevasculariseerd door de gebogen arteria superior en inferior mesenterica die dichter bij de dikke darmwand lopen, te scheiden.
Er werd geen interne hernia waargenomen bij deze manoeuvre, zoals blijkt uit necropsieën, waaruit bleek dat deze ruimte al was getekend en spontaan gesloten op dag 7 na de operatie. - Snijd de aorta en IVC van hun laterale peritoneale aanhechting aan de psoasspieren aan beide zijde. Daarna disseceer je de aorta en IVC van elkaar af totdat de lumbale slagaders en aderen zichtbaar zijn. Optioneel: zorg voor maximale elevatie en lumenblootstelling van de aorta in de Satinsky-klem tijdens het naaien, ontleed, bind en verdeel de 1-2 wervelslagaders en venen die gewoonlijk in dat segment van de grote vaten (van linker niervaten tot de onderste mesenteriale arterie) in dat segment van de lumbale aorta tussen 2-0 zijden banden zitten. Skelettiseer het lumbale gedeelte van de aorta vanuit de zware adventitiële bedekking om het voor te bereiden op implantatie.
OPMERKING: Er werden geen complicaties aan de wervelkolom waargenomen bij deze manoeuvre. - Geef systemisch 100 U/kg heparine via de centrale lijn en laat het 5 minuten circuleren. Tegelijkertijd vraagt u het anesthesieteam om de snelheid van de infusie van een gebalanceerde elektrolytoplossing tijdelijk te verhogen van 250 mL/u naar 1 L/u en te beginnen met het titreren van noradrenaline naar behoefte tot maximaal 0,4 μg∙kg-1∙min-1 om een MAP van 80-100 mmHg te bereiken ter voorbereiding op het reperfusiesyndroom.
- Klem de IVC af met een zijbijtende Satinsky-klem die caudaal is geplaatst (om de handen van de naaiende chirurg aan de linkerkant van het varken niet te hinderen) en maak een venotomie en zuig/spoel de binnenkant van de IVC.
- Haal de nier uit het ijs of uit de machineperfusie en spoel deze door met 250 mL ijskoude, gebalanceerde elektrolytoplossing en breng deze naar het operatieveld, waarmee het begin van de tweede warme ischemische (naai-)tijd wordt gemarkeerd.
- Draai de rechternierautograft ondersteboven (Simforoosh-techniek) zodat de urineleider naar boven wijst, de arteria mediaal, en de ader lateraal en geplaatst wordt aan de rechterkant van de buik met de gezicht naar de infrarenale aorta 7,9.
- Veneuze anastomose: Gebruik twee dubbelarmige 6-0 Prolene-hechtingen om een lopende veneuze anastomose uit te voeren. Plaats een bulldogklem op de nierader en verwijder de Satinsky-klem. Ongeacht het tijdstip van het naaien van de ader, houd de Satinsky-klem op de IVC gedurende een gestandaardiseerde 25 minuten om gestandaardiseerde naai-ischemische schade aan het transplantaat mogelijk te maken.
- Arteriële anastomose: Na de 25 minuten IVC-klem en 5 minuten houden tussen de vaten, gebruik opnieuw de Satinsky-klem om de aorta volledig af te klemmen. Maak een spleetinsnijding en verbreed deze met een 4,0 mm ronde punch om een schone opening te bevestigen. Gebruik een dubbelarmige 6-0 Prolene hechting om een parachute- of heal-to-teen arteriële anastomose uit te voeren. Evenzo, ongeacht de snelheid waarmee de arteriële anastomose is voltooid, houd de Satinksy-klem 25 minuten op de aorta om een totale naaitijd van 55 minuten te standaardiseren.
OPMERKING: De totale warme ischemische tijd (30 minuten simulerende donatie en 55 minuten simulatie van implantaatmanipulatie) leidde tot de inductie van DGF. - Graftreperfusie: Na de totale gestandaardiseerde 55 minuten naaien van warme ischemische tijd verwijder je eerst de bulldogklem op de nierader, gevolgd door de Satinksy-klem op de aorta, en controleer je op graftreperfusie en hemostase. Houd een agressieve reanimatie van vocht en noradrenaline aan om een MAP van 80-100 mmHg te bereiken gedurende ongeveer 1 uur na reperfusie om het dier te ondersteunen tijdens het reperfusiesyndroom.
OPMERKING: Vergeet niet om eventuele 18 G naaldbiopsieplaatsen - indien uitgevoerd - met druk en hoge coagulatieve oppervlakte-elektrocautatie te controleren. - Ureteranastomose: Skelettiseer de resterende en de graftureters door 1 cm van het omliggende vetweefsel te strippen. Spatuleer 1 cm van de transplantatieureter en de resterende rechter ureter. Gebruik twee dubbelarmige 6-0 Prolene (PDS bij het plannen van langere overleving om het risico op steenvorming te verkleinen) om deze te benaderen. Rijg een 7F x 24 cm dubbel-J ureterale stent over de verse anastomose en voltooi de anastomose met lopende hechtingen.
- Contralaterale nefrectomie
- Om de getransplanteerde nier de levensondersteunende nier te laten zijn, verwijder je de contralaterale (linker) nier.
- Buiksluiting
- Na controle op hemostase en tellingen, spoel je de buik met 1 L gebalanceerde elektrolytoplossing en sluit je de fascia met 1-0 lus Prolene, gevolgd door huidspoeling en sluiting met een nietmachine. Geef 0,25% bupivacaïne in de hechtdraad om lokale verdoving te bieden en spuit SQ verlengde afgifte voor pijnbestrijding. Extubeer het varken en breng het terug naar hun aparte verblijf via glazen of plastic barrières om te voorkomen dat ze elkaars centrale lijnen en foleykatheters bijten.
- Na 24 uur herstel wordt het varkensbuikje opnieuw in de OK behandeld, geïntubbert, voorbereid en opnieuw bedekt (Figuur 2).
- Dagelijkse postoperatieve zorg
- Controleer de varkens tijdens rondes QID, vooral om te controleren of de urineafzuigzak niet overvol raakt, wat leidt tot iatrogene postrenale obstructie en blaas- of ureterrupturen.
- Geef 's ochtends orale anti-trombocyten 81 mg aspirine, neem een bloedmonster van de centrale lijn en doe het met een hep-lock, meet de urine-output in de urinezak en neem een monster.
OPMERKING: Geen verdere intraveneuze vloeistoffen of medicatie zijn geïndiceerd, omdat de varkens meestal hun eetlust en darmfunctie terugkrijgen door POD1.
- Offer
- Aan het einde van de studie naar POD7, of eerder voor een humane eindpunt, plaats je het varken opnieuw onder algemene endotracheale anesthesie en onderzoek je het transplantat met echografie op anastomotische integriteit, gevolgd door het opnieuw openen van de buik zoals eerder beschreven.
- Onderzoek het transplantaat op tekenen van perfusie en bekijk de drie anastomosen op patentie. Verwijder het transplantaat met de drie anastomosen intact en spatuleer ze langs hun lengte om hun interne integriteit en openheid te controleren.
- Biopsie van het nierparenchym met een biopsiepistool van 18 G.
Resultaten
Directe versus vertraagde transplantatiefunctie. We voerden n = 5 porcine 30 minuten DCD niertransplantaties uit na 24 uur hypothermische onoxygenatiemachineconservering met (MAP = 40 mmHg) en volgden het fenotype van graftherstel en functie in de eerste week na transplantatie, met dagelijkse bloedmonsters en totale urineproductie. We observeerden twee fenotypes van herstel na transplantatie. Het eerste fenotype was van onmiddellijke/vroege transplantaatherstel/sufficientie. Drie van de vijf varkens die werden geïmplanteerd met de gesimuleerde DCD-grafts (60%) hadden een terugkeer van urineproductie (dagelijkse urineproductie > 500 mL/dag) via POD 2-3, waardoor continue elektrolytenhomeostase zonder interventie mogelijk was (dialyse, kaliumchelatie of insuline-gemedieerde intracellulaire verschuiving) (Figuur 3). Het tweede fenotype was vertraagde graftfunctie (DGF), gekenmerkt door aanhoudende anurie na POD 3, geassocieerd met de ophoping van serum BUN, creatinine en de ontwikkeling van hyponatriëmie en hyperkalemie, wat een objectieve klinische indicatie voor dialyse zou zijn. Anurie en hyperkaliëmie verergerden en veroorzaakten ECG-veranderingen (piek in T-golven) rond K ≥ 8 mEq/L. Dit was een dringende indicatie voor dialyse en werd daarom als een humaan eindpunt behandeld. Zodra dit eindpunt was bereikt, werd euthanasie onder algehele narcose uitgevoerd om andere oorzaken van transplantaatinsufficiëntie/falen door anastomotische compromittering of andere chirurgische complicaties uit te sluiten. Met deze definitie van DGF ontwikkelden varkensnieren van DCD met 30 minuten in-situ warme ischemie, gevolgd door 24 uur onderkoelde onzuurstofhoudende machineconservatie en 55 minuten naaien van warme ischemische tijd DGF met een snelheid van 40% (twee van de vijf varkens). Deze DGF-snelheid herhaalt het gerapporteerde percentage bij humane DCD-niertransplantatie1.
Figuur 1: Getunnelde centrale lijn en plaatsing van de katheter van de Foley. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Levensondersteunende porcine DCD niertransplantatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Vertraagde transplantatiefunctie in het porcine model. Het verschil in (A) urineproductie tussen transplantaten met onmiddellijke en vertraagde functie; (B) kaliumwaarden tussen de transplantatie met onmiddellijke en vertraagde functie; (C) dagelijkse serumcreatinineniveaus tussen onmiddellijke en vertraagde functie-transplantaten. Alle figuren worden weergegeven als Gemiddelde + SEM met waarden gerapporteerd als LOCF en geanalyseerd met gemengde modelanalyse. Afkorting: LOCF = laatste observatie voortgezet. N=5 varkens per arm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussie
Vertraagde transplantatiefunctie beïnvloedt het klinische verloop na een niertransplantatie negatief. In de vroege posttransplantatie-setting gaat het gepaard met langdurige ziekenhuisopnames, een hoger aantal invasieve ingrepen en een verhoogd risico op afstoting. Op de langere termijn wordt DGF ook geassocieerd met een kortere overleving van transplantaties. DGF is een manifestatie van ernstige ischemie-reperfusieschade (I/RI), zoals blijkt uit de hogere prevalentie bij DCD-transplantaties vergeleken met DBD of levende donorniertransplantaties. Acute nierbeschadiging (AKI) is secundair aan acute tububulaire necrose veroorzaakt door I/RI en wordt beschouwd als de meest voorkomende reden waarom een allograft onmiddellijk niet meer werkt. Klinisch wordt DGF gedefinieerd door de noodzaak van dialyse binnen de eerste week na de transplantatie. In grote diermodellen is DGF lastig te definiëren en te bestuderen vanwege het ontbreken van een gestandaardiseerde definitie van graft sufficiency en het onvermogen om dialyse uit te voeren om de tijdelijke aard van de aandoening vast te stellen, waarbij dialyse als brug naar het functionele herstel van het graft wordt vastgesteld.
In dit protocol werd een varkensmodel gekozen omdat het algemeen wordt aangenomen dat het nauw parallel loopt aan de menselijke nierfysiologie (zoals bewezen door recent succesvolle xenotransplantatie)10,11. Autotransplantatie werd gekozen om de allo-immuunrespons, afstoting en de noodzaak van en verstorende toxische effecten van calcineurinremmers te elimineren. De definitie van DGF is gebaseerd op langdurige anurie (<100 mL urine per dag) na POD3, wat leidt tot ernstige hyperkalemie-gerelateerde EKG-veranderingen. Foley-katheterisatie maakt nauwkeurige urineafname mogelijk, wat de definitie van vertraagde transplantaatfunctie en -voldoendeheid verankert aan het functionele resultaat van urinekwaliteit en -hoeveelheid. Dagelijkse bloedafname maakt dagelijkse monitoring van traditionele nierfunctiepanelparameters mogelijk, wat een volledig beeld van de elektrolytenhomeostase geeft.
Het opzetten van een betrouwbaar en reproduceerbaar diermodel van vertraagde transplantatiefunctie, denken wij, zou de studie van effectieve therapieën voor vertraagde transplantatiefunctie versnellen en uiteindelijk leiden tot verbeterde niertransplantatieresultaten. Samenvattend stelt dit protocol een reproduceerbaar autotransplantatiemodel van varkensnieren vast, dat objectieve karakterisering van vertraagde transplantatiefunctie mogelijk maakt met behulp van kwantificeerbare urine-output en serumbiochemische parameters na gecontroleerde warme ischemische schade. Door gestandaardiseerde chirurgische aandoeningen, niet-invasieve urineafname en seriële laboratoriummonitoring te integreren, biedt deze aanpak een praktisch kader voor het bestuderen van DGF in afwezigheid van dialyse en vergemakkelijkt het de vergelijking met klinisch relevante fenotypen van post-transplantatie-graftdysfunctie 12,13,14,15.
Openbaarmakingen
De auteurs hoeven geen belangenconflicten aan te geven.
Dankbetuigingen
Wij danken het Toronto organ perfusion lab (Top lab) voor het delen van hun expertise tijdens de training over porcine niertransplantatie. We danken ook Michelle Mendiola Pla voor het delen van haar expertise over het plaatsen van niet-invasieve porcine Foley.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Supine Foley Insertion | |||
| 12 Fr Foley | Urine collectie | ||
| Surgical lube | foley inbrenging | ||
| 1 L urine zak | urine collectie | ||
| 2-0 Nylon naald | foley en centrale lijn beveiliging | ||
| Speculum & lange debakey & licht | foley inbrenging | ||
| Urinemonsterbuizen (50 ml conische) | urinemonster | ||
| CG8 + Chem 8 + Piccolo cartridges | dagelijkse laboratoriumtests | ||
| Prone-to-supine Central line inbrenging | |||
| 9.6 Fr Single lumen Hickman katheter tray | dagelijkse laboratoriumtests | ||
| 10 mes | stabsneden voor CVC inbrenging | ||
| Central line neddeloze luer-lock dop | |||
| Hep-saline zak (1L saline + 10 Heparine Flessen) | heplock CVC | ||
| Explant | |||
| Laparotomie pakket | |||
| Bovie | |||
| Steriele licht handgrepen | |||
| Spons pakket | |||
| OR handdoeken - wit 17X23 inch (4 per pak) | |||
| 2-0 Zijde stropdassen | vasculaire controle | ||
| 1 L Plasmalyte | gebalanceerde elektrolytoplossing | ||
| Steriele algemene laparotomie instrumenten tray | |||
| Warm normaal saline voor natte darm handdoeken | darmverwerking | ||
| naald management box | |||
| Bookwalter retractor | |||
| Backtable | |||
| Steriele orgaan zakken - 2 per nier | |||
| 1 L kristalloïde zak voor slushy | |||
| UW oplossing - 250ml per nier | |||
| Flush slang | |||
| 14 gauge angiocath | |||
| Machine drape | |||
| orgaan gewicht (Weegschaal + kom + Steriele orgaan zak) | |||
| Machine perfusie | |||
| Perfusie machine | Lifeport Nier transporter | ||
| Weggebruikbare orgaan kamer | Lifeport Nier transporter | ||
| Perfusie oplossing | KPS-1 oplossing | ||
| Implant | |||
| Zuigslang | |||
| Yankauer zuigtip | |||
| Zuigcanule | |||
| Rubber shods | |||
| 4 mm Aorta pons | arteriële anastomose | ||
| Microchirurgie instrumenten + klem | |||
| Ureter gidsdraad | |||
| Ureter stent - 4.8 fr X 12 mm | ureter anastomose | ||
| Abdominale sluiting | |||
| 1 looped prolene | |||
| Bupivacaine | |||
| Huid hechtapparaten | |||
| Steekproeven | |||
| Steekproeven tray | |||
| 14 G Biopsie pistool | |||
| NBF biopsie potten | |||
| Eppendorf buisjes | |||
| Groen top bloedbuisjes | |||
| 15 mL conische | |||
| Meds | |||
| Norepinefrine fles | |||
| Dopamine fles | |||
| 1 L plasmalyte | gebalanceerde elektrolytoplossing | ||
| Aspirine 81 mg po qd tabletten | |||
| Cefazoline fles | |||
| Exceed | |||
| Heparine 10K eenheden |
Referenties
- Lentine, K. L., et al. OPTN/SRTR 2023 annual data report: kidney. Am J Transplant. 25 (2 Suppl 1), S22-S137 (2025).
- Zwaini, Z., et al. Comparative analysis of risk factors in declined kidneys from donation after brain death and circulatory death. Medicina (Kaunas). 56, (2020).
- Flournoy, W. S., Mani, S. Percutaneous external jugular vein catheterization in piglets using a triangulation technique. Lab Anim. 43, 344-349 (2009).
- Seldinger, S. I. Catheter replacement of the needle in percutaneous arteriography: a new technique. Acta Radiol. 39, 368-376 (1953).
- Abraham, N., et al. Subnormothermic oxygenated machine perfusion (24 h) in DCD kidney transplantation. Transplant Direct. 10 (6), e1633(2024).
- Starzl, T. E., Marchioro, T. L., Morgan, W. W., Waddell, W. R. A technique for use of adult renal homografts in children. Surg Gynecol Obstet. 119, 106-108 (1964).
- Simforoosh, N., et al. Right laparoscopic donor nephrectomy and the use of inverted kidney transplantation: an alternative technique. BJU Int. 100, 1347-1350 (2007).
- Abraham, N., et al. Orthotopic transplantation of the full-length porcine intestine after normothermic machine perfusion. Transplant Direct. 8, e1390(2022).
- Kawamura, M., et al. Normothermic ex vivo kidney perfusion preserves mitochondrial and graft function after warm ischemia and is further enhanced by AP39. Nat Commun. 15, 8086(2024).
- Kawai, T., et al. Xenotransplantation of a porcine kidney for end-stage kidney disease. N Engl J Med. 392, 1933-1940 (2025).
- Montgomery, R. A., et al. Results of two cases of pig-to-human kidney xenotransplantation. N Engl J Med. 386, 1889-1898 (2022).
- Siedlecki, A., Irish, W., Brennan, D. C. Delayed graft function in the kidney transplant. Am J Transplant. 11, 2279-2296 (2011).
- Mannon, R. B. Delayed graft function: the AKI of kidney transplantation. Nephron. 140, 94-98 (2018).
- Kim, D. W., et al. Financial impact of delayed graft function in kidney transplantation. Clin Transplant. 34, e14022(2020).
- Schröppel, B., et al. Peritransplant eculizumab does not prevent delayed graft function in deceased donor kidney transplant recipients: results of two randomized controlled pilot trials. Am J Transplant. 20, 564-572 (2020).
Herprints en machtigingen
