Ubiquitinatie is een cruciale regulator van de functies van intracellulaire eiwitten. Hier beschrijven we twee cellysemethoden om substraatproteïneniveaus te detecteren in zoogdiercellen en vergelijken we hun effectiviteit bij het analyseren van ubiquitinatieniveaus. Eiwitoverexpressie in HEK293T cellen werd geïnduceerd door tijdelijke transfectie, en ubiquitinatieve eiwitten werden gedetecteerd door western blot-analyse.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Vergelijkende strategieën voor ubiquitinatiedetectie in zoogdiercellysaten met SMAD2/SMURF2 als model
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Ubiquitinatie, een post-translationele modificatie, is een cruciale regulator van de intracellulaire eiwitfunctie. Ubiquitinatie moduleert de eiwitfuncties door proteasomale afbraak te bevorderen of subcellulaire lokalisatie te veranderen via een ubiquitineketen-afhankelijke signalering. Hier beschrijven we twee cellysemethoden om SMAD2-ubiquitinatieniveaus in HEK293T cellen te detecteren en vergelijken we hun effectiviteit bij het analyseren van eiwitubiquitinatieniveaus. Eiwitoverexpressie in cellen werd geïnduceerd door tijdelijke transfectie. De plasmiden (HA-Ub, FLAG-SMAD2 en MYC-SMURF2) en transfectiereagentia werden afzonderlijk aan het basale medium toegevoegd, gemengd, en het mengsel werd aan de cellen toegevoegd. Voorafgaand aan de oogst werd MG132 toegevoegd om de proteasomale afbraak te remmen en de ubiquitinatie-ophoping van eiwitten te bevorderen. Het belangrijkste verschil tussen de twee experimentele benaderingen is hun cellysemethoden: de ijsbadmethode (uitgevoerd bij 4 °C) en de warmtebehandelingsmethode (waarbij incubatie bij 95 °C wordt toegepast), wat de efficiëntie van eiwitlyse aanzienlijk beïnvloedt. Na voltooiing van cellyse werden het cellysaat, agarosekralen en FLAG-antilichaam gemengd en 's nachts geïncubeerd bij 4 °C. Vervolgens werden ubiquitineerde eiwitten gedetecteerd door western blot-analyse. Voordat ubiquitinatie-eiwitten werden gedetecteerd, werd een lichte-keten antilichaam gebruikt voor secundaire antilichaam-incubatie. Daarna werden ubiquitinatiebanden gedetecteerd. De resultaten tonen aan dat zowel de ijsbadmethode als de warmtebehandelingsmethode kunnen worden gebruikt om ubiquitinatieniveaus te detecteren, terwijl de warmtebehandelingsmethode het mogelijk eenvoudiger maakt om ubiquitinatie van SMAD2 te detecteren. Deze studie onderscheidt en vergelijkt twee cellysemethoden voor het meten van ubiquitinatieniveaus in zoogdiercellen, met SMURF2/SMAD2 als model, om onderzoekers te helpen geschiktere methoden te selecteren voor het detecteren van de ubiquitinatieniveaus van substraateiwitten.
Inleiding
Ubiquitinatie, een onmisbare post-translationele modificatie, is een cruciale regulator van de functies van intracellulaire eiwitten1. Het ubiquitine-proteasoomsysteem (UPS), dat de afbraak van meer dan 80% van de eiwitten in eukaryoten bemiddelt, bestaat uit ubiquitine (Ub), E1-activerende enzymen, E2-conjugerende enzymen, E3-ligasen, deubiquitylerende enzymen (DUBs) en het 26S-proteasoom2. Dit systeem reguleert de eiwitomzet met hoge specificiteit, waardoor essentiële cellulaire processen zoals celcyclusprogressie3, signaaltransductie 4,5 en stressresponsen 6,7 worden gecontroleerd. Ubiquitinatie is een meerstaps enzymatisch proces. E1 hydrolyseert ATP om het C-terminus van Ub te adenyleren en vormt zo een Ub-AMP-intermediair. Vervolgens wordt de geactiveerde Ub overgedragen van E1 naar de actieve plaats cysteïne van een E2-conjugerend enzym, waarbij een thioesterbinding ontstaat. Ten slotte rekruteert een E3-ligase zowel het E2-Ub-complex als een doeleiwit, waardoor de overdracht van Ub van E2 naar een lysineresidu op substraat8 wordt gekatalyseerd.
Ubiquitine kan diverse polyubiquitineketens vormen via koppeling bij zeven lysineresiduen (Lys6, Lys11, Lys27, Lys29, Lys33, Lys48, Lys63) of Met1(M1)4. Elk linkagetype bepaalt verschillende biologische uitkomsten: K48-gekoppelde ketens richten zich voornamelijk op eiwitten voor proteasomale afbraak9, K63-gekoppelde ketens reguleren signaaloverdracht en DNA-reparatie10,11, en M1-gekoppelde ketens zijn cruciaal voor aangeboren immuunresponsen12. Ubiquitinatie en deubiquitinatie zijn cruciale posttranslationele modificatieprocessen die diverse cellulaire gebeurtenissen aansturen, variërend van eiwitafbraak tot signaaltransductie. Zo leidt bij colorectale kanker abnormale activatie van MDM2-gemedieerde p53-ubiquitinatie tot overmatige afbraak van p53, waardoor het vermogen om celcyclusstilstand en apoptose te induceren wordt aangetast, wat tumorprogressie en chemoresistentieaanwakkert. Bij leverischemie-reperfusieschade stabiliseert OTUD1 NRF2 door de K48-gelinkte polyubiquitinatie te verwijderen, waardoor intracellulaire oxidatieve stressniveaus15,16 worden verminderd. Een reeks proteasoomremmers, zoals bortezomib, carfilzomib en ixazomib, is geleidelijk in de klinische praktijk gekomen voor ziekten zoals multipel myeloom 17,18,19.
Momenteel zijn er tal van methoden om ubiquitinatie-eiwitten te detecteren, waaronder western blotting, radioactiviteitsgebaseerde assays en fluorescentieassays20. In wetenschappelijk onderzoek blijft de western blot echter de voorkeursmethode voor het detecteren van eiwit-ubiquitinatie vanwege het relatief snelle en rechtlijnige protocol. Traditionele methoden om ubiquitinatieve eiwitten te detecteren lijken op co-immunoprecipitatie (co-IP) technologie: ze gebruiken een lysisbuffer om celpellets bij lage temperatuur te incuberen en te lyseren om eiwitten vrij te geven, en gebruiken vervolgens antilichamen om de ubiquitinatie van substraateiwitten te detecteren21,22. Dit experimentele protocol vereist echter vaak een groot aantal cellen. Bovendien vergroot de relatief milde lysismethode bij lage temperatuur de eiwitinteracties niet volledig kan verstoren, waardoor de kans op vals-positieven bij gedetecteerde ubiquitinatie toeneemt. Verhitting en het gebruik van SDS kunnen de eiwitstructuur aanzienlijk verstoren, waardoor hun volledige denaturatie wordt geïnduceerd en zo effectief vals-positieve resultaten veroorzaakt door eiwit-eiwitinteracties worden verminderd 23,24,25. Evenzo ondergaan cellen voldoende lysis bij verwarming en SDS-behandeling, waardoor meer eiwitten vrijkomen en daarmee het aantal benodigde cellen voor het experiment wordt verminderd. Samenvattend worden zowel de ijsbadmethode als de warmtebehandelingsmethode gelyseerd door cellen en de ubiquitinatieniveaus van substraateiwitten gedetecteerd via antistofincubatie. De verwarmingsmethode resulteert echter in een grotere cellyse en sterkere eiwitdenaturatie.
TGF-β speelt een dubbele rol in de pathofysiologische processen van verschillende ziekten 26,27. SMAD2 is een cruciale downstream transcriptiefactor van TGF-β. SMURF2-gemedieerde uziëntheid van SMAD2 richt zich op proteasomale afbraak, waardoor TGF-β signaalintensiteit28 wordt verfijnd. Deze studie onderscheidt en vergelijkt twee cellysemethoden om ubiquitinatieniveaus in zoogdiercellen te meten, met SMURF2/SMAD2 als model. Hier werd eiwitoverexpressie in HEK293T cellen geïnduceerd door tijdelijke transfectie met HA-Ub, FLAG-SMAD2 en MYC-SMURF2 plasmiden. De cellen werden gelyseerd met respectievelijk de ijsbadmethode en de warmtebehandelingsmethode. Ubiquitineerde eiwitten werden gedetecteerd door Western blot-analyse. We ontdekten dat zowel de ijsbadmethode als de warmtebehandelingsmethode kunnen worden gebruikt om ubiquitinatieniveaus te detecteren, en de warmtebehandelingsmethode kan het mogelijk vergemakkelijken om ubiquitinatie van SMAD2 te detecteren. Dit protocol biedt een nieuw alternatief voor het detecteren van ubiquitinatieve eiwitten. Bovendien zorgt de warmtebehandelingsmethode voor bepaalde substraateiwitten die sterk geassocieerd zijn met ubiquitinatie voor een betere eiwitlysie-efficiëntie, waardoor de detectie van ubiquitinatie eenvoudiger wordt.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Bereiding van lysisbuffer en reagentia
OPMERKING: Bereid alle buffers voor op de aangegeven concentraties. Volg de instructies van de fabrikant voor reagenspoeders om concentratieverschillen te voorkomen.
- Bereid een lysisbuffer voor met 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 50 mM NaCl, 1 mM EDTA (pH 8,0) en 1% Triton X-100. Pas de NaCl-concentratie aan tussen 50-150 mM indien nodig. Bereid alle buffers voor met dubbel gedestilleerd H₂O.
- Bereid een werkoplossing voor door de lysisbuffer aan te vullen met een proteaseremmercocktail van 1% (zonder EDTA). Meng goed en laat ze op ijs staan tot gebruik.
- Maak 10% SDS door 1 g SDS-poeder op te lossen in 10 mL PBS. Meng tot het volledig is opgelost. Bewaar op kamertemperatuur.
- Bereid 5× eiwitlaadbuffer voor met 250 mM Tris-HCl (pH 6,8), 10% SDS, 50% glycerol, 0,5% bromofenolblauw en 5% β-mercaptoethanol. Los de componenten op in dubbel gedestilleerd H2O. Meng grondig voor gebruik.
OPMERKING: Hanteer SDS en β-mercaptoethanol in een dampkap terwijl je de juiste beschermingsmiddelen draagt. Voer besmette materialen af volgens de institutionele richtlijnen voor chemisch afval.
2. Bereiding van cellen
- Behoud HEK293T cellen in een hoogglucose DMEM, aangevuld met 10% FBS en 1% penicilline-streptomycine. Incubeer bij 37 °C met 5% CO₂ onder steriele omstandigheden. Doorgangscellen zijn ongeveer 90% confluentie.
- Zaadcellen in 6-wellplaten met 5 × 10⁵ cellen per put. Verzamel cellen uit twee putten om één monster te genereren.
- Bereid transfectiemengsels voor om 10% van het totale kweekvolume te vertegenwoordigen en gebruik SMAD2-ubiquitinatie als experimenteel model. Combineer 1 μg HA-Ub plasmide, 1 μg FLAG-SMAD2 plasmide en 0,5 μg lege vector of MYC-SMURF2 plasmide in 100 μL serumvrij DMEM. In een aparte buis verdun je 3,75 μL transfectiereagens in 100 μL serumvrije DMEM. Voeg het reagensmengsel druppelgewijs toe aan de plasmidoplossing, incubeer 15 minuten bij kamertemperatuur en verdeel gelijkmatig over de cellen.
- Vervang het transfectiemedium na 6-8 uur door 2 ml verse complete DMEM per put. Incubeer cellen gedurende 48 uur.
- Behandel cellen met 5 μM MG132 gedurende 12 uur voordat je oogst.
OPMERKING: Hanteer MG132 in een bioveiligheidskast terwijl je handschoenen draagt. Verwijder besmette materialen volgens de institutionele veiligheidsprocedures.
3. Celverzameling
- Oogst cellen bij 90-100% confluentie (~3 × 10⁶ cellen). Aspiraat medium en was elke keer goed met 1 ml voorgekoelde PBS. Verwijder PBS helemaal.
- Voeg 1 ml PBS toe aan elke put en laat de cellen voorzichtig opnieuw schorsen. Breng de vering over naar een 1,5 mL buis en leg het op ijs.
- Centrifugeer op 380 × g gedurende 5 minuten op 4 °C. Verwijder het supernatant en bewaar het pelletje.
4. Voorbereiding van agarosekralen
- Breng 50 μL eiwit A/G agarose-parels per monster over in een nieuwe buis. Was de kralen 3x met 1 ml lysisbuffer. Centrifugeer op 100 × g gedurende 1 minuut bij 4 °C tussen de wasbeurten.
- Verwijder de resterende buffer zonder de pellet te verstoren. Voeg 100 μL werkoplossing en 5 μL anti-FLAG antilichaam toe. Incubeer 6 uur op 4 °C met zachte rotatie.
5. Cellyse
- IJsbadmethode
- Voeg 500 μL voorgekoelde werkoplossing toe aan de pellet. Bred 30 minuten op ijs.
- Sonicate op 2 W met 4 s aan/4 s uit cycli voor vijf herhalingen. Houd monsters op ijs tijdens de sonicatie. Steek de monsters terug in het ijs voor de rest van de incubatie.
OPMERKING: Voor zwakke eiwitinteracties verlaag je de NaCl-concentratie tot 50-75 mM en laat de sonicatie weg.
- Warmtebehandelingsmethode
- Voeg 45 μL werkoplossing toe aan de pellet. Voeg 5 μL van 10% SDS toe terwijl je continu mengt.
- Vortex kort en verwarmen tot 95 °C totdat de suspensie transparant en volledig vloeibaar wordt. Keer af en toe om een uniforme denaturatie te garanderen.
- Voeg 450 μL werkoplossing toe. Sonicate op 2 W met 4 s aan/4 s uit cycli voor vijf herhalingen terwijl je samples op ijs houdt.
OPMERKING: Zorg ervoor dat de uiteindelijke SDS-concentratie <0,1% blijft. Bevestig volledige lysis door te controleren of de zichtbare pellet verdwijnt en de helderheid van de uniforme oplossing is.
6. Detectie van immunoprecipitatie en ubiquitinatie
- Centrifugelysaten op 13.680 × g gedurende 15 minuten bij 4 °C. Overbreng supernatant naar een nieuwe buis.
- Reserveer 60 μL lysaat en voeg 15 μL 5× laadbuffer toe. Verwarm op 95 °C gedurende 15 minuten en label als input.
- Voeg 100 μL antilichaamgekoppelde kralen toe aan het resterende lysaat (eindvolume 540 μL). Incubeer bij 4 °C gedurende 8-12 uur met rotatie.
- Centrifugeer kralen op 100 × g gedurende 1 minuut bij 4 °C en gooi supernatant weg. Was kralen 3x met lysisbuffer. Voeg 75 μL van 1× SDS laadbuffer toe en verwarm op 95 °C gedurende 15 minuten om eiwitten te elueren. Label als intellectueel eigendom.
- Detectie van ubiquitinatieve eiwitten met western blot volgens een standaard JoVE-protocol.
OPMERKING: Raadpleeg het western blot-protocol29 voor gedetailleerde overdrachts- en detectieprocedures. Volledige lengte, niet-cropped vlekken met molecuulgewichtmarkers zijn verstrekt in Supplemental File 1.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Als een "moleculaire boodschapper" in de TGF-β signaalroute vormt SMAD2, nadat het is gefosforyleerd door TGF-β receptoren, een complex met SMAD3 en SMAD4, transloceert naar de kern en start de transcriptie van downstream doelgenen30. Het is dus een sleutelmolecuul dat extracellulaire signalen verbindt met intracellulaire genexpressie. De afbraak wordt gemedieerd door SMURF2, een E3-ubiquitineligase die de polyubiquitinatie van het doeleiwit katalyseert en het zo ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Deze studie presenteert en vergelijkt twee gedetailleerde eiwitlyseprotocollen die specifiek geoptimaliseerd zijn voor het detecteren van E3-ligase-gemedieerde substraat-ubiquitinatie. Om detecteerbaarheid te waarborgen, gebruikten we plasmide-gebaseerde overexpressie (bijvoorbeeld getagd SMAD2, SMURF2 of Ub) in cellen, wat voldoende eiwitniveaus leverde om specifieke ubiquitinatiesignalen te visualiseren, cruciaal voor het valideren van E3-ligase-substraatinteracties in deze studie. Voo...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hoeven geen belangenconflicten aan te geven.
Dankbetuigingen
Deze onderzoeksstudie werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China, nr. 82370647 (W.H.), nr. 82170642 (J-X. Z), nr. 81801923 (X-F. Z), nr. 81670575 (J-X. Z), nrs. 81570570 (W.H.) en nrs. 81070355 (J-X. Z), en het programma van HUST Academic Frontier Youth Team, Huazhong University of Science and Technology (2018QYTD02). De Open Foundation van Hubei Sleutellaboratorium voor Regeneratieve Geneeskunde en Multidisciplinair Translationeel Onderzoek (2022zsyx003). Het Nationaal Sleutelonderzoeks- en Ontwikkelingsprogramma van China (2024YFA1107601).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 1.5 mL microtube | Servicebio | EP-150-M | |
| 100 mm TC-treated cultured dish | Servicebio | CCD-100 | |
| 6-well disk | Servicebio | CCP-6H | |
| Anti-FLAG antibodies | Proteintech | 20543-1-AP | dilutie gebruikt 1:200 voor IP 1:10000 voor WB |
| Anti-GAPDH antibodies | Proteintech | MA5-15738 | dilutie gebruikt 1:10000 |
| Anti-HA antibodies | Proteintech | 51064-2-AP | dilutie gebruikt 1:10000 |
| Anti-IgG antibodies | CST | #3900 | dilutie gebruikt 1:200 voor IP |
| Anti-MYC antibodies | Proteintech | 60003-2-Ig | dilutie gebruikt 1:10000 |
| Anti-SMAD2 antibodies | CST | #5339 | dilutie gebruikt 1:200 voor IP 1:2000 voor WB |
| Bromofenolblauw | Servicebio | GC307006-5g | |
| EDTA (pH=8.0) | Servicebio | G1207-1L | |
| FBS | ABW | ||
| Glycerol | Sinopharm | 10010618 | |
| Verwarming/Koelende droge bad | Guocheng | ||
| HEK293T cellen | ATCC | CRL-3216 | |
| Hoge-glucose DMEM | Servicebio | G4515-500ML | |
| HRP-geconjugeerd Geit anti-Muis IgG Lichte Ketens | Abclonal | AS062 | dilutie gebruikt 1:5000 |
| HRP-geconjugeerd Muis anti-Konijn IgG Lichte Ketens | Abclonal | AS061 | dilutie gebruikt 1:10000 |
| Lipo8000 | Beyotime | C0533 | |
| MG132 | Aladdin | M421264 | |
| Microcentrifuge | Labgic | CF1524R | |
| NaCl poeder | Servicebio | GC102004 | |
| PBS | Servicebio | G4202-500ML | |
| pCMV-FLAG-SMAD2 | Voor zoogdier expressie | ||
| pCMV-HA-Ub | Voor zoogdier expressie | ||
| pCMV-MYC | Voor zoogdier expressie | ||
| pCMV-MYC-SMURF2 | Voor zoogdier expressie | ||
| Penicilline-streptomycine | Servicebio | G4003-100ML | |
| Protease inhibitor cocktail zonder EDTA | TargetMol | C0001 | |
| Protein A/G agarose kralen | Beyotime | P2017 | |
| PVDF membraan | Vayzme | E801 | |
| SDS poeder | Solarbio | S8010-500g | |
| SDS-PAGE systeem | Aervicebio | BVE4-BVT4 | |
| Sonics | Uibra cel | ||
| Tris-HCl poeder | Biotopped | HST-0372 | |
| Triton X-100 | Servicebio | GC204003-100ml | |
| Trypsine | Servicebio | G4021-100ML | |
| Vortex mixer | Vriendelijk gedoneerd door Vayzme | ||
| β-mercaptoethanol | Aladdin | M301573 |
Referenties
- Popovic, D., Vucic, D., Dikic, I. Ubiquitination in disease pathogenesis and treatment. Nat Med. 20 (11), 1242-1253 (2014).
- Han, D., Wang, L., Jiang, S., Yang, Q. The ubiquitin-proteasome system in breast cancer. Trends Mol Med. 29 (8), 599-621 (2023).
- Fulcher, L. J., Batley, C., Sobajima, T., Barr, F. A. Time as a danger signal promoting G1 arrest after mitosis. Trends Cell Biol. 36 (2), 142-153 (2025).
- Gao, L., et al. The mechanism of linear ubiquitination in regulating cell death and correlative diseases. Cell Death Dis. 14 (10), 659(2023).
- Serratore, V., Lucibello, M., Malanga, D., Viglietto, G., De Marco, C. Akt and DUBs: A bidirectional relationship. Cell Mol Biol Lett. 30 (1), 77(2025).
- Kwon, Y. T., Ciechanover, A. The ubiquitin code in the ubiquitin-proteasome system and autophagy. Trends Biochem Sci. 42 (11), 873-886 (2017).
- Liu, J. Z., et al. BDH2 triggers ROS-induced cell death and autophagy by promoting NRF2 ubiquitination in gastric cancer. J Exp Clin Cancer Res. 39 (1), 123(2020).
- Cappadocia, L., Lima, C. D. Ubiquitin-like protein conjugation: Structures, chemistry, and mechanism. Chem Rev. 118 (3), 889-918 (2018).
- Li, J., et al. ATRA upregulates OTUD6B to recruit CD8+ T cells to suppress colorectal liver metastasis by stabilizing DDX5/STAT3/CXCL11 axis. Cell Death Dis. 16 (1), 521(2025).
- Niu, K., et al. USP33 deubiquitinates PRKN/Parkin and antagonizes its role in mitophagy. Autophagy. 16 (4), 724-734 (2020).
- Yan, K., et al. The role of K63-linked polyubiquitination in cardiac hypertrophy. J Cell Mol Med. 22 (10), 4558-4567 (2018).
- Guo, Y., Zhao, Y., Cong, Y. S. Met1-linked ubiquitination in cell signaling regulation. Biophys Rep. 10 (4), 230-240 (2024).
- Di, Y., et al. The c-Myc-WDR43 signalling axis promotes chemoresistance and tumour growth in colorectal cancer by inhibiting p53 activity. Drug Resist Updat. 66, 100909(2023).
- Liebl, M. C., Hofmann, T. G. The role of p53 signaling in colorectal cancer. Cancers (Basel). 13 (9), 2125(2021).
- Oikawa, D., et al. OTUD1 deubiquitinase regulates NF-κB- and KEAP1-mediated inflammatory responses and reactive oxygen species-associated cell death pathways. Cell Death Dis. 13 (8), 694(2022).
- Zhang, Q., et al. The deubiquitinase OTUD1 stabilizes NRF2 to alleviate hepatic ischemia/reperfusion injury. Redox Biol. 75, 103287(2024).
- Moreau, P., et al. Oral ixazomib, lenalidomide, and dexamethasone for multiple myeloma. N Engl J Med. 374 (17), 1621-1634 (2016).
- Stewart, A. K., et al. Carfilzomib, lenalidomide, and dexamethasone for relapsed multiple myeloma. N Engl J Med. 372 (2), 142-152 (2015).
- Zhu, Y., et al. Targeting gut microbial nitrogen recycling and cellular uptake of ammonium to improve bortezomib resistance in multiple myeloma. Cell Metab. 36 (1), 159-175.e8 (2024).
- De Silva, A. R. I., Page, R. C. Ubiquitination detection techniques. Exp Biol Med (Maywood). 248 (15), 1333-1346 (2023).
- Choo, Y. S., Zhang, Z. Detection of protein ubiquitination. J Vis Exp. (30), e1293(2009).
- Worboys, J. D., Palazón-Riquelme, P., López-Castejón, G. Method to measure ubiquitination of NLRs. Methods Mol Biol. 2696, 105-114 (2023).
- DeCaprio, J., Kohl, T. O. Denaturing lysis of cells for immunoprecipitation. Cold Spring Harb Protoc. 2020 (2), 098616(2020).
- Bass, J. J., et al. An overview of technical considerations for western blotting applications to physiological research. Scand J Med Sci Sports. 27 (1), 4-25 (2017).
- Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: Technique, theory, and troubleshooting. N Am J Med Sci. 4 (9), 429-434 (2012).
- Crane, J. L., Cao, X. Bone marrow mesenchymal stem cells and TGF-β signaling in bone remodeling. J Clin Invest. 124 (2), 466-472 (2014).
- Gough, N. R., Xiang, X., Mishra, L. TGF-β signaling in liver, pancreas, and gastrointestinal diseases and cancer. Gastroenterology. 161 (2), 434-452.e15 (2021).
- Tzavlaki, K., Moustakas, A. TGF-β signaling. Biomolecules. 10 (3), 487(2020).
- The western blot. J vis exp. , e5065(2025).
- Wu, M., Chen, G., Li, Y. P. TGF-β and BMP signaling in osteoblast, skeletal development, and bone formation, homeostasis and disease. Bone Res. 4, 16009(2016).
- Jeon, S., et al. The miR-15b-SMURF2-HSP27 axis promotes pulmonary fibrosis. J Biomed Sci. 30 (1), 2(2023).
- Zhang, W., et al. SMURF2 predisposes cancer cell toward ferroptosis in GPX4-independent manners by promoting GSTP1 degradation. Mol Cell. 83 (23), 4352-4369.e8 (2023).
- Pi, Y., et al. Loss of SMURF2 expression enhances RACK1 stability and promotes ovarian cancer progression. Cell Death Differ. 30 (11), 2382-2392 (2023).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
