Method Article

Geoptimaliseerde kwantitatieve beoordeling van de stabiliteit van enhancer-RNA in muisembryonale stamcellen

DOI:

10.3791/69325

⸱

November 21st, 2025

 ,  ,  , 
1Department of Convergent Bioscience and Informatics, and Graduate School of Biological Sciences, Chungnam National University (CNU)

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol meet kwantitatief de stabiliteit en halveringstijd van intergene en intragenische enhancer-RNA's in muisembryonale stamcellen met behulp van Actinomycine D-behandeling, RT-qPCR en niet-lineaire regressieanalyse. Positie-specifieke normalisatiestrategieën worden geïntegreerd om eRNA-vervaldynamiek nauwkeurig te modelleren op een contextafhankelijke manier.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Enhancer-RNA's (eRNA's) zijn niet-coderende transcripten die worden geproduceerd uit transcriptie-actieve enhancer-regio's en worden steeds meer erkend als belangrijke regulatoren van genexpressie. Ondanks hun functionele belang blijven de stabiliteits- en degradatiedynamiek van eRNA slecht gekarakteriseerd, vooral in embryonale stamcellen (ESC's), waar transcriptieprogramma's zeer dynamisch en contextafhankelijk zijn. Dit protocol presenteert een kwantitatieve methode om de vervalkinetiek en de halfwaardetijd van intergene en intragenische eRNA's in muis-ESC's te beoordelen. Transcriptie wordt geremd met Actinomycine D, en het totale RNA wordt op meerdere gedefinieerde tijdstippen verzameld. cDNA wordt gesynthetiseerd met zowel willekeurige hexamer- als oligo(dT)-primers om detectie van zowel polyadenyleerde als niet-polyadenyleerde transcripten mogelijk te maken. Voor intergene eRNA's wordt normalisatie uitgevoerd met behulp van een housekeeping-gen of de Ct-waarde op tijd 0 min. Voor intragenische eRNA's wordt een duale normalisatiebenadering gebruikt om interferentie door overlappende pre-mRNA's te minimaliseren. De vervalcurves worden geanalyseerd met een eenfasig exponentiëel vervalmodel, waardoor een nauwkeurige schatting van de halfwaardetijd mogelijk is. Het protocol toont aan dat eRNA's in mESC's een snelle omzet vertonen, met een halveringstijd van ongeveer 2-3 minuten. Deze methodologie biedt een robuust en reproduceerbaar kader voor het bestuderen van eRNA-stabiliteit, en biedt inzicht in de activiteit van versterkers en RNA-dynamiek in pluripotente stamcelcontexten.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Enhancers zijn cis-regulerende elementen (CRE's) die weefsel- en stimulusspecifieke genexpressie reguleren door te dienen als bindende platforms voor transcriptiefactoren en co-regulatoren 1,2,3,4,5,6. Hoewel enhancers op afstand van hun doelgenen op lineair genoomniveau kunnen worden gelokaliseerd, maken chromatine-lusmechanismen ruimtelijke nabijheid tot promotoren mogelijk, wat de transcriptionele regulatie vergemakkelijkt. Actieve enhancers worden bidirectioneel getranscribeerd door RNA-polymerase II (Pol II), wat lange niet-coderende RNA's produceert, bekend als enhancer-RNA's (eRNA's), die doorgaans een mediane lengte hebben van ongeveer 1 kb 1,2,7,8,9. De expressie van eRNA's correleert sterk met de activatie van nabijgelegen doelgenen 10,11,12, en functionele studies hebben consequent aangetoond dat uitputting van eRNA's de transcriptie van hun doelgenen vermindert, wat suggereert dat eRNA's fungeren als functionele regulatoren in plaats van als transcriptionele bijproducten 13,14,15,16,17. Ondanks hun functionele belang blijven experimentele protocollen voor het betrouwbaar detecteren en kwantificeren van eRNA's beperkt.

In stamcellen speelt de activiteit van de versterker een cruciale rol bij het behouden van pluripotentie en het stimuleren van ontwikkelingsovergangen18,19. Enhancers kunnen zich in intergene regio's bevinden (intergene of extragene enhancers) of worden ingebed in genlichamen als intragenische enhancers8. Hoewel intergene enhancers uitgebreid zijn bestudeerd bij verschillende celtypen, blijven intragenische enhancers relatief onderbelicht vanwege technische uitdagingen, zoals transcriptionele overlap met gastheergenen pre-mRNA's en de aanwezigheid van histonmodificaties die geassocieerd worden met transcriptionele elongatie20,21. Desalniettemin hebben recente studies aangetoond dat zowel intergene als intragenische enhancers bijdragen aan genregulatienetwerken die betrokken zijn bij pluripotency22,23 en vroege differentiatie24 in ESC's. Opmerkelijk is dat bijna de helft van alle geannoteerde enhancers intragenischis 20,25, en hun activiteit varieert tussen ontwikkelingsstadia, vaak toenemend in gedifferentieerde weefsels 8,26,27,28. De prevalentie en functionele rol van intragenische enhancers in ESC's zijn echter nog onvolledig begrepen. In het bijzonder worden intergene eRNA's tussen genen getranscribeerd, terwijl intragenische eRNA's binnen genlichamen worden getranscribeerd en kunnen overlappen met pre-mRNA-transcripten. Dit positieverschil vereist verschillende analytische benaderingen bij het interpreteren en kwantificeren van intergene en intragenische eRNA's.

In tegenstelling tot mRNA's missen eRNA's doorgaans een 3′ poly(A) staart, wat resulteert in lage stabiliteit en snelle afbraak 1,2,7,8,9. Deze intrinsieke instabiliteit maakt het moeilijk om eRNA-expressie te analyseren, vooral in tijdverloopexperimenten. In neuronen is gerapporteerd dat eRNA's een halfwaardetijd vertonen van slechts 7,5 minutenen 17 minuten. Het blijft echter onduidelijk of deze instabiliteit consistent is tussen verschillende celtypen, met name in ESC's, waar zowel de activiteit van de enhancer als de transcriptie van eRNA sterk celtype-specifiek zijn 7,17,29,30. ESC's vertrouwen op dynamische genregulatieprogramma's om pluripotentie te behouden of differentiatie te initiëren, waardoor ze een uniek systeem zijn voor het onderzoeken van eRNA-omzet31,32. Gezien de snelle transcriptieverschuivingen in ESC's kan het begrijpen van eRNA-verval in deze context onthullen hoe de activiteit van enhancers tijdelijk wordt gereguleerd17. Bovendien vereisen verschillen tussen intergene en intragenische eRNA's, zoals overlap met transcripten van het gastheergen, verschillende analytische benaderingen20. Ondanks het belang van deze vragen bestaan er weinig gestandaardiseerde methoden om de halfwaardetijd van eRNA in ESC's te meten of om de vervaldynamiek van verschillende eRNA-typen te vergelijken.

Deze studie presenteert een kwantitatief protocol om de stabiliteit en halfwaardetijd te beoordelen van eRNA's die zijn getranscribeerd uit intergene en intragenische enhancers in mESC's. Transcriptionele inhibitie wordt bereikt met actinomycine D (ActD) op bepaalde tijdsintervallen, gevolgd door realtime kwantitatieve PCR (RT-qPCR) en niet-lineaire regressieanalyse om eRNA-verval te kwantificeren. Om de positionele verschillen tussen intergene en intragenische enhancers aan te pakken, bevat de methode verschillende normalisatiestrategieën, waardoor een systematische en nauwkeurige vergelijking van de dynamiek van eRNA-degradatie mogelijk is. Dit gestructureerde analytische kader biedt waardevolle inzichten in eRNA-omzet in pluripotente stamcellen.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle experimenten in deze studie werden uitgevoerd met muisembryonale stamcellen (mESC; E14Tg2A) die niet direct in ons laboratorium zijn gegenereerd, maar afkomstig zijn van een gevestigde cellijn, die ook commercieel verkrijgbaar is bij ATCC (CRL-1821). Daarom vereist het in dit artikel beschreven werk geen beoordeling door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) aan de Chungnam National University. De reagentia en de gebruikte apparatuur worden vermeld in de Materiaaltabel.

1. Celkweek van mESC's

  1. Precoat 6-put celkweekplaten met 0,1% gelatine (2 mL per put). Bred de platen 10 minuten uit bij 37 °C.
  2. Aspireer de gelatine en was elke keer goed met 1 ml PBS. Steriliseer de platen met UV-bestraling gedurende minstens 15 minuten.
  3. Zaad mESC's op de met gelatine gecoate platen met volledige 2 mL celkweekmedium (Tabel 1).
    OPMERKING: Voeg LIF vers toe aan het kweekmedium in de vereiste concentratie direct voor gebruik, gebaseerd op het totale medium dat nodig is voor het experiment.
OnderdelenEindconcentratieGebruikt volume
Glasgow's Minimum Essential Medium (GMEM)-500 mL
KnockOut™ Serum Vervanging (KOSR)10%50 mL
Penicilline-streptomycine0.50%2,5 mL
Foetaal runderenserum (FBS)1%5 mL
Natriumpyruvaat0,1 mM / 1 %5 mL
MEM niet-essentiële aminozuuroplossing (MnEA)0,1 mM/ 1 %5 mL
2-mercaptoethanol0,1 mM910 uL
Leukemie-remmende factor (LIF)1000 U/mL-

Tabel 1: Samenstelling van het mESC-kweekmedium. Componenten en hun uiteindelijke concentraties gebruikt om het mESC-kweekmedium te bereiden. Typische volumes worden vermeld per 500 mL van het totale medium.

  1. Houd de cellen onder standaard kweekomstandigheden op 37 °C in een bevochtigde broedmachine met 5% CO2 (Figuur 1A).

figure-protocol-1
Figuur 1: Experimenteel ontwerp voor eRNA-stabiliteitsanalyse. (A) Schema van het transcriptie-arrestatie-experiment. Cellen werden geplateerd op 0,1% gelatine-gecoate 6-well platen en behandeld met actD (eindconcentratie: 5 μg/mL) op de aangegeven tijdstippen (0 min, 5 min, 10 min, 15 min, 20 min en 30 min) na oogst. (B) RT-qPCR assay-indeling. Totaal RNA werd omgekeerd getranscribeerd met behulp van willekeurige hexamer- of oligo(dT)-primers. cDNA-monsters van elk tijdstip werden geanalyseerd met RT-qPCR voor de aangegeven doelwitten: Tbp_mRNA, intergene eRNA en intragenisch eRNA. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

2. Actinomycine D (ActD) behandeling

  1. Los actD op in DMSO om een voorraadoplossing te maken bij een concentratie van 1 mg/mL33.
    OPMERKING: Hoewel Actinomycine D hier wordt gebruikt voor kortdurende transcriptieinhibitie, kunnen alternatieve remmers zoals triptolide ook worden ingezet om transcriptie-initiatie in toekomstige studies te blokkeren. Omdat zowel Actinomycine D als DMSO lichtgevoelig zijn, bereid je de standaardoplossing in amberkleurige microbuisjes, bescherm het tegen licht en bewaar het bij -20 °C tot gebruik.
  2. Twee dagen na celzaaien (of op de oogstdag) voeg je de actD-bouillonoplossing toe aan het kweekmedium tot een uiteindelijke concentratie van 5 μg/mL33. Verzamel monsters op 0 minuten, 5 minuten, 10 minuten, 15 minuten, 20 en 30 minuten na de behandeling (Figuur 1A).
    OPMERKING: Hoewel de meeste eRNA's een snelle verval vertonen binnen het bereik van 0-30 minuten, kunnen sommige eRNA's een langere halfwaardetijd vertonen. Afhankelijk van de kenmerken van de doellocus kan extra bemonstering op langere tijdstippen (bijv. 1 uur, 3 uur of 6 uur) worden opgenomen om de vervalkinetiek nauwkeuriger vast te leggen. In deze studie werd Actinomycine D gebruikt bij een concentratie van 5 μg/mL voor kortdurende (≤30 min) transcriptieblokkade; echter, voor langere incubaties (>1 uur) wordt aanbevolen de concentratie te verlagen tot 1-2 μg/mL om cellulaire stressreacties te minimaliseren. Omdat DMSO zelf de transcriptieactiviteit kan beïnvloeden, moet ook een DMSO-only controle worden opgenomen.

3. RNA-extractie en cDNA-synthese

  1. Verwijder het celkweekmedium door afzuiging en voeg 1 ml Trizol-reagens toe aan elke put. Incubeer de platen op een shaker gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur (RT)34,35, en breng het lysaat vervolgens over naar een nieuwe 1,5 mL buis.
    OPMERKING: Na de behandeling met TRIzol kunnen monsters tot een week worden bewaard bij -80 °C voorafgaand aan RNA-extractie. Omdat het trizolreagens fenol en guanidiniumisothiocyanaat bevat, die zeer giftig en corrosief zijn, moet je het met grote zorg behandelen. Al het TRIzolafval moet worden verzameld in een aangewezen container voor organisch oplosmiddelen voor correcte verwijdering.
  2. Voeg 500 μL chloroform toe aan elk monster. Schud de buizen krachtig en incubeer 3 minuten bij RT.
  3. Centrifugeer de monsters op 13.500 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
  4. Breng voorzichtig de waterige fase over naar een nieuwe 1,5 mL buis met een gelijk volume isopropanol. Incubeer het mengsel 10 minuten bij RT om de RNA-precipitatie te verbeteren.
    OPMERKING: Geef zorgvuldig alleen de heldere bovenste waterige fase om besmetting met de interfase te voorkomen. Voor een verhoogde RNA-opbrengst incubeer je monsters bij -20 °C gedurende 1 uur tot een nacht (O/N) na toevoeging van isopropanol. Voor monsters met lage input voeg je glycogeen toe (laatste 10-20 μg/mL) of GlycoBlue vlak voordat je isopropanol toevoegt om de zichtbaarheid van RNA-pellets en de herstelefficiëntie te verbeteren. Isopropanol is zeer brandbaar en potentieel schadelijk voor de menselijke gezondheid; Inademing van dampen of contact met huid of ogen kan irritatie, hoofdpijn, duizeligheid of depressie van het centrale zenuwstelsel veroorzaken. Behandel het met voorzichtigheid en verzamel alle resterende oplossingen in een goedgekeurde container voor organisch oplosmiddelafval voor correcte verwijdering.
  5. Centrifugeer de monsters opnieuw op 13.500 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C en gooi het supernatant weg.
  6. Was de resulterende RNA-pellet met 1 mL 75% ethanol. Centrifugeer op 6.800 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
    OPMERKING: Draai de buis voorzichtig om na het toevoegen van ethanol om de pellet op te tillen.
  7. Verwijder het supernatant voorzichtig en laat de pellet 10 minuten aan de lucht drogen bij 42 °C. Suspendeer de gedroogde pellet opnieuw in RNase-vrij water en incubeer bij 55 °C gedurende 10 minuten.
    OPMERKING: Wanneer de RNA-zuiverheid hoog is, kan de witte pellet doorschijnend worden tijdens het luchtdrogen. Vermijd het overdrogen van de pellet gedurende meer dan 10 minuten, omdat overmatig drogen de efficiëntie van de opknapping kan verminderen.
  8. Meet de RNA-concentratie en zuiverheid met een NanoDrop-spectrofotometer.
  9. Synthetiseer cDNA uit μg RNA met behulp van de M-MLV cDNA Synthesis Kit, volgens de instructies van de fabrikant (Tabel 2).
OnderdelenGebruikt volume 
10X M-MLV RT buffer2 uL
dNTP2 uL
Primer (Random / Olido dT)1uL
M-MLV RT1uL
Rnase-inhibitor0,5 uL
RNA-monster2ug (Volume aangepast op basis van RNA-monsterconcentratie)
DWVolume aangepast afhankelijk van de RNA-monsterconcentratie (om het uiteindelijke volume te vormen)
Totaal volume20 uL

Tabel 2: Samenstelling van de cDNA-synthesereactie (M-MLV reverse transcriptase). Gedetailleerde volumes en reagentia gebruikt voor reverse transcriptie van 2 μg totaal RNA met behulp van de M-MLV cDNA Synthesis Kit. Het volume van het RNA-monster werd aangepast op basis van de concentratie, en nucleasevrije DW werd toegevoegd om het uiteindelijke reactievolume op 20 μL te brengen.

  1. Incubeer de cDNA-reactie bij 37 °C gedurende 2 uur, en inactiveer het enzym vervolgens bij 85 °C gedurende 5 minuten met hitte-inactivatie.
    OPMERKING: Bewaar gesynthetiseerd cDNA bij -20 °C. De typische cDNA-concentratie is ongeveer 100 ng/μL. Om intragenische eRNA's te detecteren, synthetiseer cDNA uit hetzelfde RNA-monster met zowel willekeurige hexamerprimers als oligo(dT)primers.

4. Real-time kwantitatieve polymerasekettingreactie (RT-qPCR)

  1. Bereid een reactiemengsel van 10 μL voor met 15 ng cDNA, 5 μL Power SYBR Green PCR mastermix, 5 pmol van elke primer en gedestilleerd water (DW).
    OPMERKING: eRNA-loci bevatten vaak of liggen ernaast repetitieve sequenties, wat zorgvuldig primerontwerp vereist. Gebruik herhaaldelijk gemaskeerde sequenties om kandidaatgebieden te beperken en primer-paarspecificiteit over het hele genoom te verifiëren met behulp van BLAST. Sluit indien mogelijk nabijgelegen controlegebieden op om niet-specifieke amplificatie36 uit te sluiten.
  2. Voer versterking uit met een realtime PCR-systeem met de volgende thermische cyclusvoorwaarde: een initiële activatie- en denaturatiestap bij 50 °C gedurende 2 minuten en 95 °C gedurende 10 minuten, gevolgd door 40 denaturatiecycli bij 95 °C gedurende 15 seconden, en meting van nezelen, extensie en fluorescentie bij 60 °C voor 1 minuut34, 37 (Tabel 3).
PodiumStapTemperatuur (°C)TijdCyclus
WachtfaseOmgekeerde transcriptie502 min1
Initiële denaturatie9510 min1
PCR-faseDenaturatie9515 s40
Gloeien/Uitbreiding601 min40
SmeltcurvestadiumDenaturatie9515 s1
Annealing601 min1
Dissociatie (smeltcurve)9515 s1

Tabel 3: Thermische cycluscondities voor RT-qPCR. Samengevat van temperatuur-, tijd- en cycluscondities voor reverse transcriptie, 40-cycli qPCR (10 μL reactie) en standaard smeltcurveanalyse.

  1. Voor intragenische eRNA-kwantificatie analyseer je zowel Tbp (of ander huishoudelijk/controlegen) als het intragenische enhancer-gebied met cDNA gesynthetiseerd met oligo(dT)-primers. Voor intergene eRNA's wordt alleen cDNA gebruikt dat is gesynthetiseerd met willekeurige hexamerprimers (Tabel 4 en Figuur 1B).
    OPMERKING: Voer elk monster uit in technische duplicaten (twee putten) om gemiddeling tijdens data-analyse mogelijk te maken.
GennaamPrimerprobeSequentie (1,50-90 cm)Amplicongroottes 
TbpVoorwaartsTGACTCCTGGAATTCCCATC122 basispunten
OmkerenTTGCTGCTGCTGTGTTTGTT
Nsun2_mRNAVoorwaartsGGATGAAGCAGTGATCGCAG93 BP
OmkerenATCCACTTCAGTCCTGGCAA
Pou5f1_mRNAVoorwaartsTCCCTACAGCAGATCACTCAC80 basispunten
OmkerenCGCCGGTTACAGAACCATAC
Sox2_mRNAVoorwaartsACAGATGCAACCGATGCACC105 basispunten
OmkerenTGGAGTTGTACTGCAGGGCG
Nsun2_eRNAVoorwaartsCCTGAGAGGTGTTTTTGCTTTGT110 bp
OmkerenAGGTTAACACATCAGCCCA
Pou5f1_eRNAVoorwaartsCACTTCTCTGGGGGGTCTGG107 bp
OmkerenCCAGGACAAGACAGCCATTG
Sox2_eRNAVoorwaartsAGTCAGCTACATGGGCAGAG119 bp
OmkerenCCCCTCTCTCTCACCGTAĄG
Nsun2_negative controleVoorwaartsCCCCGTGTTTAAGAGGAATGA88 bp
OmkerenACTGAGAACAACCCACTAGCA

Tabel 4: Primersequenties voor RT-qPCR-analyse. Voor- en achteruit-primersequenties gebruikt voor specifieke amplificatie van elk doelgen in RT-qPCR-experimenten. Deze primers werden geoptimaliseerd om een nauwkeurige kwantificering van mRNA- en eRNA-expressie te waarborgen.

5. eRNA-stabiliteitsgegevens Analyse 22

  1. Analyseer alle gegevens met behulp van de ΔCt-methode en normaliseer de relatieve eRNA-niveaus tot Tbp_mRNA (Aanvullend Bestand 1 en Figuur 2A).
    OPMERKING: Als het verschil in Ct-waarde tussen twee technische replicaten meer dan 0,5 bedraagt, sluit de data dan uit van verdere analyse. Bereken de relatieve genexpressieniveaus met de ΔCt-methode door de Ct-waarde van het controlegen (bijv. Tbp_mRNA) af te trekken van die van het doelgen (ΔCt = Control_Ct - Target_Ct). De relatieve expressie kan dan worden berekend als 2^-ΔCt (Aanvullend Bestand 2B).
  2. Voor intragenische eRNA-kwantificatie normaliseert u expressiewaarden door de waarden uit cDNA dat met willekeurige hexamers is gesynthetiseerd, te delen door die uit cDNA gesynthetiseerd met oligo(dT)-primers.
    OPMERKING: Voer alle qPCR-reacties uit met drie onafhankelijke biologische replicaten (n = 3).
  3. Normaliseer het expressieniveau van elk tijdspunt (verkregen viade ΔCt-methode) naar de 0 min-waarde en plot de vervalcurve.
    OPMERKING: Hoewel dit protocol een korte behandeling met Actinomycine D toepast, kan langdurige blootstelling aan transcriptie-remmers (bijv. ActD) ook de genexpressie in de huishouding verminderen. Voor kwantificatie met hogere precisie raden we aan om een exogeen spike-in RNA (bijv. ERCC) toe te voegen bij de cellysestap om variaties in RNA-extractie-efficiëntie, reverse-transcriptie-efficiëntie en pipettennauwkeurigheid te corrigeren, waardoor consistentere normalisatie over monsters38,39 mogelijk wordt.
  4. Plot genormaliseerde eRNA-niveaus in de loop van de tijd en pas deze aan met een niet-lineair regressiemodel (éénfasige exponentiële verval) in GraphPad Prism (Supplementair Bestand 3).
  5. Schat de halfwaardetijd van eRNA uit individuele biologische replicaten.
    1. Open GraphPad Prism en selecteer Create > XY (Opties: X = Nummers; Y = Voer in en teken voor elk punt één Y-waarde uit).
    2. Voer de tijdspunten (0, 5, 10, 15, 20 en 30 minuten) in als X-as waarden.
    3. Vermeld de voorbeeldnamen op de Y-as (Groep) en voer de overeenkomstige enkele datawaarde in voor elk tijdspunt.
    4. Selecteer Analyzeer > regressie en krommen > niet-lineaire regressie (curvefit).
    5. Selecteer in het tabblad Exponentiële het éénfase-vervalmodel .
    6. In het Table to Results-blad berekent u het gemiddelde en de standaarddeviatie van de halfwaardewaarden voor elk monster met Excel of vergelijkbare software. Plot de resulterende waarden.
  6. Fit decay-curves met 95% betrouwbaarheidsintervallen
    1. Open GraphPad Prism en selecteer Create > XY (Opties: X = Nummers; Y = Voer 3 replicatiewaarden in naast elkaar geplaatste subkolommen).
    2. Voer de tijdspunten (0, 5, 10, 15, 20 en 30 minuten) in als X-as waarden.
    3. Vermeld de namen van het monster op de Y-as (Groep) en voer de drie replicatieve waarden van elk eRNA-monster in het bijbehorende datablad.
    4. Selecteer Analyzeer > regressie en krommen > niet-lineaire regressie (curvefit).
    5. Selecteer in het tabblad Exponentiële het éénfase-vervalmodel voor analyse.
    6. In het Table to Results-blad haalt u de 95% betrouwbaarheidsintervalwaarden (BI) uit die zijn verkregen uit de analyse van de driedubbele monsters.
      OPMERKING: Gebruik de volgende vervalvergelijking: Y = (Y0 - Plateau) • e-kt + Plateau, waarbij Y het relatieve eRNA-niveau is op tijdstip t, Y0 het initiële eRNA-niveau en k de vervalconstante. Fixeer het plateau niet op nul tijdens eRNA-curvefitting, aangezien eerdere studies aantonen dat eRNA kan blijven bestaan en niet volledig afbreken over de tijd 17,40. Vaststel echter het plateau op nul bij het analyseren van mRNA-verval, volgens eerdere mRNA-protocollen 41,42. Laat GraphPad Prism automatisch de eRNA-halfwaardetijd (t₁/₂) berekenen met de formule: t1/2 = In(2)/ k. Voer tijd in in min; Rapporteer de resulterende halfwaardetijdwaarden in min.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om de RNA-stabiliteit na transcriptiestop te beoordelen, werden mESC's behandeld met actD, en werd het totale RNA verzameld op bepaalde tijdstippen (0 min, 5 min, 10 min, 15 min, 20 min en 30 min). Na cDNA-synthese werd RT-qPCR uitgevoerd om het intragenische eRNA van Nsun2 en Sox2, het intergene eRNA van Pou5f1 en hun bijbehorende mRNA's te kwantificeren. Deze gegevens werden gebruikt om tijdsafhankelijke degradatiecurves te ge...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft een betrouwbare en reproduceerbare methode om eRNA-stabiliteit in mESC's te meten. Kritieke experimentele stappen, waaronder celkweek, actinomycine D-behandeling, RNA-extractie en RT-qPCR-kwantificatie, worden duidelijk geïllustreerd in de figuren en aanvullende bestanden om gebruikers door de workflow te loodsen. Daarnaast zijn gedetailleerde analytische procedures zoals niet-lineaire regressiemodellering en interpretatie van betrouwbaarheidsintervallen opgenomen...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen belangenconflicten om te melden.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie werd ondersteund door het onderzoeksfonds van de Chungnam National University [2024-0991-01 (S.-K.K.)]; het Basiswetenschappelijk Onderzoeksprogramma [RS-2023-00209842 (S.-K.K.)] en het Bio&Medische Technologieontwikkelingsprogramma [RS-2025-02305916 (S.-K.K.)] van de National Research Foundation (NRF), gefinancierd door de Koreaanse overheid (MSIT).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2-mercaptoethanolGibco21985023
Actinomycin DSigma-AldrichA9415
chloroformDaejung chemicals2548-4105
DMSOGenDEPOTD2680
Fetaal bovien serum (FBS)Sigma-AldrichF0392
GelatineSigma-AldrichG1890-100G
Glasgow’s Minimum Essential Medium (GMEM)Gibco11710035
GraphPad Prism (versie 9)GraphPad Software
isopropanolDaejung chemicals5035-4105
KnockOut Serum Replacement (KOSR)Gibco, 10828028
Leukemie-remmende factor (LIF)MerckESG1106
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (MnEA)WelgeneLS005
M-MLV cDNA Synthesis Kit EnzynomicsEZ006S
OPTIZEN NanoQ Plus KLAB01-QI685-M-16-C
Penicillin-streptomycineWelgeneLS202-02
Power SYBR-Green PCR master mix Applied Biosystems4368708
QuanStudio1 Real-Time PCR-systeem Applied BiosystemsA40425
NatriumpyrovacinaatWelgeneLS013
TRIzol Invitrogen15596018

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bulger, M., Groudine, M. Functional and mechanistic diversity of distal transcription enhancers. Cell. 144 (3), 327-339 (2011).
  2. Gorbovytska, V., et al. Enhancer RNAs stimulate Pol II pause release by harnessing multivalent interactions to NELF. Nat Commun. 13 (1), 2429(2022).
  3. Joo, J. -Y., Schaukowitch, K., Farbiak, L., Kilaru, G., Kim, T. -K. Stimulus-specific combinatorial functionality of neuronal c-fos enhancers. Nat Neurosci. 19 (1), 75-83 (2016).
  4. Levine, M. Transcriptional enhancers in animal development anfd evolution. Curr Biol. 20 (17), R754-R763 (2010).
  5. Nord, A. S., et al. Rapid and pervasive changes in genome-wide enhancer usage during mammalian development. Cell. 155 (7), 1521-1531 (2013).
  6. Schwalb, B., et al. TT-seq maps the human transient transcriptome. Science. 352 (6290), 1225-1228 (2016).
  7. De Santa, F., et al. A large fraction of extragenic RNA pol II transcription sites overlap enhancers. PLoS Biol. 8 (5), e1000384(2010).
  8. Kim, T. -K., et al. Widespread transcription at neuronal activity-regulated enhancers. Nature. 465 (7295), 182-187 (2010).
  9. Songyue, G., et al. The roles of enhancer, especially super-enhancer-driven genes in tumor metabolism and immunity. Int J Biol Macromol. 308 (1), 142414(2025).
  10. Kim, S. H., et al. Epigenetic regulation of IFITM1 expression in lipopolysaccharide-stimulated human mesenchymal stromal cells. Stem Cell Res Ther. 11, 1-12 (2020).
  11. Li, W., Notani, D., Rosenfeld, M. G. Enhancers as non-coding RNA transcription units: Recent insights and future perspectives. Nat Rev Genet. 17 (4), 207-223 (2016).
  12. Sartorelli, V., Lauberth, S. M. Enhancer RNAs are an important regulatory layer of the epigenome. Nat Struct Mol Biol. 27 (6), 521-528 (2020).
  13. Lam, M. T., et al. Rev-Erbs repress macrophage gene expression by inhibiting enhancer-directed transcription. Nature. 498 (7455), 511-515 (2013).
  14. Li, W., et al. Functional roles of enhancer RNAs for oestrogen-dependent transcriptional activation. Nature. 498 (7455), 516-520 (2013).
  15. Melo, C. A., et al. eRNAs are required for p53-dependent enhancer activity and gene transcription. Mol Cell. 49 (3), 524-535 (2013).
  16. Mousavi, K., et al. eRNAs promote transcription by establishing chromatin accessibility at defined genomic loci. Mol Cell. 51 (5), 606-617 (2013).
  17. Schaukowitch, K., et al. Enhancer RNA facilitates NELF release from immediate early genes. Mol Cell. 56 (1), 29-42 (2014).
  18. Göttgens, B., et al. Establishing the transcriptional programme for blood: The SCL stem cell enhancer is regulated by a multiprotein complex containing Ets and GATA factors. The EMBO J. 21 (12), 3039-3050 (2002).
  19. Wang, H. F., et al. Defining essential enhancers for pluripotent stem cells using a features-oriented CRISPR-Cas9 screen. Cell Rep. 33 (4), 108309(2020).
  20. Cinghu, S., et al. Intragenic enhancers attenuate host gene expression. Mol Cell. 68 (1), 104-117.e106 (2017).
  21. Hobson, D. J., Wei, W., Steinmetz, L. M., Svejstrup, J. Q. RNA polymerase II collision interrupts convergent transcription. Mol Cell. 48 (3), 365-374 (2012).
  22. Moon, J., et al. Embryonic stem cell-specific intragenic enhancer RNA essential for NSUN2-mediated stem cell fate regulation. Int J Biol Macromol. 319, 145470(2025).
  23. Tata, P. R., Tata, N. R., Kühl, M., Sirbu, I. O. Identification of a novel epigenetic regulatory region within the pluripotency associated microRNA cluster, EEmiRC. Nucleic Acids Res. 39 (9), 3574-3581 (2011).
  24. Sohni, A., et al. Dynamic switching of active promoter and enhancer domains regulates Tet1 and Tet2 expression during cell state transitions between pluripotency and differentiation. Mol Cell Biol. 35 (6), 1026-1042 (2015).
  25. Borsari, B., et al. Enhancers with tissue-specific activity are enriched in intronic regions. Genome Res. 31 (8), 1325-1336 (2021).
  26. Bressin, A., et al. High-sensitive nascent transcript sequencing reveals BRD4-specific control of widespread enhancer and target gene transcription. Nat Commun. 14 (1), 4971(2023).
  27. Heintzman, N. D., et al. Distinct and predictive chromatin signatures of transcriptional promoters and enhancers in the human genome. Nat Genet. 39 (3), 311-318 (2007).
  28. Pérez-Molina, R., et al. An intronic Alu element attenuates the transcription of a long non-coding RNA in human cell lines. Front Genet. 11, 928(2020).
  29. Djebali, S., et al. Landscape of transcription in human cells. Nature. 489 (7414), 101-108 (2012).
  30. Rada-Iglesias, A., et al. A unique chromatin signature uncovers early developmental enhancers in humans. Nature. 470 (7333), 279-283 (2011).
  31. Atlasi, Y., Stunnenberg, H. G. The interplay of epigenetic marks during stem cell differentiation and development. Nat Rev Genet. 18 (11), 643-658 (2017).
  32. Young, R. A. Control of the embryonic stem cell state. Cell. 144 (6), 940-954 (2011).
  33. Ratnadiwakara, M., Änkö, M. -L. mRNA stability assay using transcription inhibition by actinomycin D in mouse pluripotent stem cells. Bio Protoc. 8 (21), e3072-e3072 (2018).
  34. Kim, S. -K., et al. Functional coordination of BET family proteins underlies altered transcription associated with memory impairment in fragile X syndrome. Sci Adv. 7 (21), eabf7346(2021).
  35. Peterson, S. M., Freeman, J. L. RNA Isolation from Embryonic Zebrafish and cDNA Synthesis for Gene Expression Analysis. J Vis Exp. (30), e1470(2009).
  36. Ye, J., et al. Primer-BLAST: A tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC Bioinformatics. 13 (1), 134(2012).
  37. Kim, S. -K., et al. SET7/9 methylation of the pluripotency factor LIN28A is a nucleolar localization mechanism that blocks let-7 biogenesis in human ESCs. Cell Stem Cell. 15 (6), 735-749 (2014).
  38. Lugowski, A., Nicholson, B., Rissland, O. S. DRUID: A pipeline for transcriptome-wide measurements of mRNA stability. RNA. 24 (5), 623-632 (2018).
  39. Lugowski, A., Nicholson, B., Rissland, O. S. Determining mRNA half-lives on a transcriptome-wide scale. Methods. 137, 90-98 (2018).
  40. Tsai, P. F., et al. A muscle-specific enhancer rna mediates cohesin recruitment and regulates transcription in trans. Mol Cell. 71 (1), 129-141.e128 (2018).
  41. Woolley, C. R., et al. Full-length mRNA sequencing resolves novel variation in 5' UTR length for genes expressed during human CD4 T-cell activation. Immunogenetics. 77 (1), 14(2025).
  42. Zhang, H., et al. Algorithm for optimized mRNA design improves stability and immunogenicity. Nature. 621 (7978), 396-403 (2023).
  43. Kim, T. -K., Shiekhattar, R. Architectural and functional commonalities between enhancers and promoters. Cell. 162 (5), 948-959 (2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Enhancer RNAsRNA StabilityMouse Embryonic Stem CellseRNA DecayActinomycin DRT qPCRIntergenic Enhancer RNAIntragenic Enhancer RNARNA Half LifeTranscriptional Arrest

Related Articles