Methodenartikel

Epigenetische manipulatie van K562-cellen: dual-vector episomale strategie voor stabiele gerichte DNA-methylering met behulp van dCas9-DNMT3A en -HDAC1 fusie-eiwitten

DOI:

10.3791/69328

⸱

31 oktober 2025

 ,  ,  , 
1Biology Laboratory, School of Science and Technology, Hellenic Open University, 2Division of Pharmacology and Biosciences, Department of Pharmacy, School of Health Sciences, University of Patras

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft een niet-integratief, episomaal CRISPR/dCas9-gebaseerd systeem voor gerichte epigenetische bewerking in K562-cellen, waarbij dCas9-DNMT3A- en dCas9-HDAC1-effectoren worden gecombineerd met specifieke sgRNA's om locusspecifieke DNA-methylering met precisie te induceren en off-target-effecten te verminderen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het onderzoeken van de precieze rol van DNA-methylering in de regulatie van gentranscriptie en het ontwikkelen van therapieën gericht op specifieke genmethyleringspatronen brengt aanzienlijke uitdagingen met zich mee vanwege de schaarste aan veelzijdige hulpmiddelen die in staat zijn om plaatsspecifieke en langdurige epigenetische modificaties te induceren voor het moduleren van genexpressie. De studie was gericht op het ontwikkelen en valideren van een innovatief episomaal gebaseerd systeem om stabiele DNA-methylering op een gerichte genlocus te vergemakkelijken, mogelijk nuttig voor zowel fundamenteel epigenetisch onderzoek als therapeutische toepassingen. Om dit te bereiken, werd de K562-cellijn samen getransfecteerd met twee verschillende episomale vectoren. Beide vectortypen zijn ontworpen om gids-RNA's (gRNA's) tot expressie te brengen die gericht zijn op een niet-gemethyleerd gebied van 367 bp binnen het CpG-eiland 326, dat zich stroomopwaarts van het ZBTB7A-gen bevindt. Elke vector codeerde voor een gedeactiveerde vorm van endonuclease Cas9 (dood of dCas9) gefuseerd met ofwel het katalytische domein van DNA-methyltransferase DNMT3A (dCas-DNMT3A-CD) of het histondeacetylase HDAC1 (dCas-HDAC1) van volledige lengte. De dCas-sequentie bevatte twee nucleaire lokalisatiesignalen (NLS) om de nucleaire import van het eiwit te garanderen. Deze expressiecassette met dubbel systeem bevordert een chromatinetoestand die mogelijk bevorderlijk is voor epigenetische uitschakeling op lange termijn, en belooft robuuste en duurzame epigenetische resultaten. Deze interveniërende benadering van het epigenoom van de gastheer via het gebruik van zelfreplicerende episomale vectoren biedt verschillende voordelen: behoud en expressie van vectoren met een laag aantal kopieën gedurende meerdere celdelingen zonder integratie in het gastheergenoom, waardoor off-target effecten worden geminimaliseerd en de integriteit van het genoom behouden blijft. We rapporteren de precieze en significante toename van DNA-methylatie op het beoogde ZBTB7A CpG-eiland 326. De bevindingen bevestigen dat de gemanipuleerde episomale CRISPR/dCas-systemen duurzame, plaatsspecifieke DNA-methylering kunnen opwekken. Daarom is dit systeem een waardevol onderzoeksinstrument voor het evalueren van de functionele effecten van gerichte methyleringsveranderingen en een veelbelovend platform voor het ontwikkelen van toekomstige epigenetische behandelingen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Epigenetische regulatie, waaronder DNA-methylering en histonmodificaties, speelt een cruciale rol bij het beheersen van genexpressie, celdifferentiatie en genoomstabiliteit. Ontregeling van deze mechanismen is vaak betrokken - als oorzaak of gevolg - bij verschillende pathologische toestanden, met name bij kanker, neurologische aandoeningen en inprentingssyndromen 1,2,3. Met name door nauwkeurig in te grijpen in het epigenetische landschap op specifieke genomische loci met behulp van epigenoombewerking Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-technologie, kunnen genrepressieniveaus worden bereikt die vergelijkbaar zijn met die waargenomen in genknock-outmodellen, zonder de onderliggende DNA-sequentie te veranderen4. Als gevolg hiervan is gerichte epigenetische bewerking naar voren gekomen als een veelbelovende strategie voor het ontleden van genregulerende mechanismen en het ontwikkelen van precisietherapieën.

DNA-methyltransferase (DNMT)-remmers en histondeacetylase (HDAC)-remmers zijn epigenetische therapieën die momenteel zijn goedgekeurd voor klinisch gebruik. Deze middelen richten zich echter niet-selectief op epigenetische markers in het genoom, waardoor de globale chromatinetoestanden veranderen, wat off-target effecten en toxiciteit bij patiënten veroorzaakt5. Om de beperkingen van traditionele epigenetische veranderingsmiddelen aan te pakken, zijn programmeerbare epigenetische editorsontwikkeld op basis van katalytisch dood Cas9 (dCas9) gefuseerd met effectordomeinen, zoals DNA-methyltransferasen (bijv. DNMT3A), demethylasen (bijv. TET1), histonacetyltransferasen (bijv. p300) of deacetylasen (bijv. HDAC3), 6,7,8,9 . Het dCas9-effectorsysteem maakt locusspecifieke epigenoommodificatie mogelijk onder leiding van een klein RNA-molecuul, bekend als het single-guide RNA (sgRNA), zonder dubbelstrengs breuken op de doelsequentie te introduceren. Recente studies hebben hun gebruik aangetoond bij het wijzigen van genexpressie, het hermodelleren van de toegankelijkheid van chromatine en zelfs het herprogrammeren van cellulaire fenotypes 10,11,12.

Ondanks de snelle vooruitgang hebben op dCas9 gebaseerde epigenoomengineeringsystemen nog steeds te maken met enkele beperkingen. De meest voorkomende uitdaging zijn off-target effecten vanwege de niet-specificiteit van epigenetische effectordomeinen, vooral bij sterke of langdurige expressie van de dCas9-fusietools13,14. Bovendien brengt de grote omvang van dCas9-fusies aanzienlijke leveringsuitdagingen met zich mee. De grootte van de Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9)-sequentie is ongeveer 4,2 kb15, wat vergelijkbaar is met de maximale capaciteitsgrootte van Adeno-geassocieerd virus (AAV)-vectoren. Hoewel lentivirale vectoren een relatief grote capaciteit hebben (~12-1 kb), waardoor de volledige lengte SpCas9 gefuseerd met epigenetische effectoren kan worden toegediend, behouden ze nog steeds de mogelijkheid van willekeurige genomische integratie, waardoor insertionele mutagenese wordt geriskeerd en hun klinische toepassingen worden beperkt16. Aan de andere kant lijden niet-virale benaderingen zoals plasmidetransfectie aan een slechte retentie in delende cellen. Voorbijgaande of "hit-and-run"-toedieningsbenaderingen sluiten de mogelijkheid van genomische integratie uit, maar slagen er vaak niet in om methyleringsveranderingen in celdelingen te ondersteunen, tenzij ze worden gecombineerd met chromatine-remodelers of coöperatieve effectoren 17,18,19.

Om deze uitdagingen aan te gaan, hebben we een niet-integratief, zelfreplicerend episomaal vectorsysteem (pEPI-S/MAR) gebruikt voor het leveren van dCas9-gefuseerde epigenetische effectoren. Deze vector blijft extrachromosomaal aanwezig in het delen van cellen met een laag aantal kopieën (~1-2 per cel), waardoor aanhoudende maar matige expressie mogelijk is, om ongewenste functies geassocieerd met overexpressie te minimaliseren 20,21. Het Scaffold/Matrix Attachment Region (S/MAR)-element van het episoom interageert met de nucleaire matrix en draagt bij aan het stabiele onderhoud van het episoom in de celkern tijdens de celdeling 22,23. Bovendien vermijdt het pEPI-vectorsysteem de risico's die gepaard gaan met virale integratie en maakt het de levering van constructies mogelijk zonder de verpakkingslimieten te overschrijden.

Recente studies hebben aangetoond dat promotorregio's die worden gekenmerkt door actieve histonmodificaties, met name H3K27-acetylering (H3K27ac), vaak resistent zijn tegen gemanipuleerde DNA-methylering. Van combinatorische benaderingen die histonmarkeringen verwijderen of toevoegen met behulp van histonmodificaties of -wissers en tegelijkertijd DNA-methylering introduceren via DNMT3A, is aangetoond dat ze de stabiliteit en persistentie van genonderdrukking verhogen, zelfs bij voorbijgaande benaderingen19,24. Op basis van deze inzichten veronderstelden we dat het gelijktijdig leveren van dCas9-HDAC1 en dCas9-DNMT3A en het richten op aangrenzende genetische gebieden de remodellering van chromatine zou bevorderen en een efficiëntere en duurzamere methylering op doelregulerende elementen zou vergemakkelijken.

In deze studie wilden we een systeem ontwerpen en bouwen dat in staat is om gerichte en stabiele DNA-methylering te leveren aan CpG-eiland 326 van ZBTB7A, een regio die wordt gekenmerkt door lage endogene methylering en afwijkende H3K27ac-markeringen in K562-cellen. Het doel van deze studie was om twee episomale constructen te leveren die coderen voor dCas9 gefuseerd met elk van de verschillende epigenetische effectoren, samen met sgRNA's, gericht op het CpG-rijke regulerende gebied stroomopwaarts van het ZBTB7A-gen met behulp van het stabiele, niet-integratieve pEPI-systeem met lage expressie. Zoals geïllustreerd in figuur 1, maakt co-transfectie van K562-cellen met deze episomen de dubbele rekrutering van de bewerkingscomplexen naar het CpG-eiland van interesse mogelijk, waar HDAC1 lokale histonacetylering verwijdert om daaropvolgende DNA-methylering door DNMT3A te vergemakkelijken, wat resulteert in gecoördineerde en plaatsspecifieke epigenetische modificatie.

Het hier beschreven systeem is geschikt voor toepassingen waarbij virale afgifte niet haalbaar is vanwege de grootte van de constructie, veiligheidsoverwegingen of kostenbeperkingen. Het ondersteunt modulair klonen van verschillende sgRNA's en effectorfusies, waardoor het kan worden aangepast aan een reeks doelloci. Het is momenteel het meest geschikt voor in vitro of preklinische studies in cellijnen die plasmidetransfectie en antibioticaselectie verdragen. In onze implementatie werd episomale toediening in K562-cellen bereikt met behulp van reagentia op basis van lipofectamine en gehandhaafd onder G-418-selectie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Ontwerp van sgRNA's

  1. Identificeer het gewenste CpG-eiland of regulerende CpG-sites binnen het promotorgebied van het gen van interesse met behulp van een genoombrowser (bijv. UCSC-genoombrowser). Hier is het ontwerp toegepast op het CpG-eiland 326 (GRCh38) van het ZBTB7A-gen .
  2. Ontwerp enkelvoudige gids-RNA's (sgRNA's) met behulp van een online CRISPR sgRNA-ontwerpplatform [bijv. CHOPCHOP-webtool (versie 3)]. Volg bij het ontwerpen van sgRNA's de onderstaande aanbevelingen om een hoge activiteit op het doel en minimale effecten buiten het doel te garanderen:
    1. Selecteer het SpCas9-eiwit als endonuclease, met behulp van 5'-NGG-3' als het protospacer-aangrenzende motief aan het 3'-uiteinde (PAM-3').
    2. Kies ervoor dat de sgRNA-lengte 20 bp is (naast de PAM-sequentie). Sta off-target matches toe met slechts drie mismatches in de protospacer-sequentie.
    3. Wanneer u ervoor kiest om u op een specifiek gebied van het gen te richten, kiest u de optie 'Promotor' en definieert u het stroomopwaartse bereik (bijv. van 1500 bp tot 3000 bp stroomopwaarts voor CpG-eiland 326) om de sgRNA's binnen het regulerende gebied te positioneren.
    4. Gebruik on-target efficiëntiescores zoals die ontwikkeld door Doench et al.25, om de sgRNA-activiteit te beoordelen.
  3. Houd bij het selecteren van sgRNA's voor experimenteel gebruik rekening met de volgende criteria:
    1. Rangschik alle kandidaat-sgRNA's op efficiëntie voor de doelregio. Kies sgRNA's in de top 10-20% van de voorspelde efficiëntie. Vermijd bij het kiezen sgRNA's met mismatches (MM0, MM1, MM2, MM3) op potentiële off-target sites.
    2. Kies sgRNA's die zich richten op oorspronkelijk niet-gemethyleerde of zwak gemethyleerde gebieden voor transcriptionele onderdrukking met behulp van dCas9-DNMT's. Voor transcriptionele repressie met behulp van dCas9-HDAC's, richt u zich op sterk geacetyleerde regio's voor meer efficiëntie. Gebruik online databases (bijv. ChIP-Atlas) om DNA-methylering en histonacetyleringsmarkeringen te bevestigen in K562-cellen op de doelloci.
    3. Gebruik meerdere sgRNA's om doelgebieden groter dan 100-200 bp26 te bestrijken.
      OPMERKING: Epigenetische modificaties (methylering en deacetylering) beïnvloeden regio's stroomopwaarts en stroomafwaarts van de sgRNA-bindingsplaats, en deze effecten kunnen beperkt zijn tot korte genomische spanwijdten.
    4. Kies voor sgRNA's met een GC-gehalte tussen de 40% en 80%.
      OPMERKING: Het GC-gehalte van het sgRNA is belangrijk, omdat een hoger GC-gehalte de RNA-stabiliteit en dCas-binding verbetert.
    5. Vermijd sgRNA's die stukken van vier of meer thymidines (Ts) bevatten en kies sgRNA's met adenine- of thyminenucleotiden die zich vier basen stroomopwaarts van de PAM-plaats bevinden.
      OPMERKING: Vier of meer T's kunnen leiden tot voortijdige beëindiging van de transcriptie. sgRNA's met A of T die zich vier basen stroomopwaarts van de PAM-plaats bevinden, kunnen een sterkere dCas-binding vertonen.
    6. Controleer en vermijd sgRNA's met hoge zelfcomplementariteit om het risico op secundaire structuurvorming te minimaliseren.
    7. Voltooi de selectie van enkele sgRNA-sequenties.
      OPMERKING: Er zijn vier sgRNA's ontworpen die zich uitstrekken over het CpG-eiland 326. De sgRNA1-4-doelsequenties en doelposities op CpG-eiland 326 worden weergegeven in aanvullende tabel 1.
  4. Transformeer de sgRNA-sequentie naar keuze (met uitzondering van het PAM-triplet) in zijn omgekeerde complement. Voeg GATCG toe aan het 5'-uiteinde van de voorwaartse reeks en G aan het 3'-uiteinde, en AAAAC aan het 5'-uiteinde van de omgekeerde complementaire reeks en C aan het 3'-einde. Bestel de twee laatste oligo's voor elk sgRNA bij een commerciële oligo-leverancier.

2. Klonen

OPMERKING: In dit gedeelte wordt het op maat maken van plasmide pEPI-1 beschreven om episomale vectoren te genereren die zowel de dCas-epigenetische effectorfusie- als de sgRNA-expressiecassettes dragen. Zie Afbeelding 2 voor een uitgebreid overzicht van de kloonworkflow en vectorarchitectuur. Alle hieronder beschreven restrictie-, spijsverterings- en ligatiereacties werden uitgevoerd volgens de door de fabrikant aanbevolen protocollen voor elk gebruikt enzym en reagens, en de reactiespecificaties worden in detail vermeld in aanvullende tabel 2.

  1. Verteer het pEPI-1-plasmide met behulp van AgeI en BspEI, die de eGFP-coderende sequentie (verbeterd groen fluorescerend eiwit) flankeren. Na restrictievertering worden de resulterende overhangen afgestompt met behulp van het Klenow-fragment van DNA-polymerase I. Ligate de botte plasmide-ruggengraat met behulp van T4 DNA-ligase om de eGFP-verwijderde vector te genereren.
    OPMERKING: Deletie van het eGFP-gen wordt uitgevoerd om de totale vectorgrootte te verkleinen. Een grotere vectorgrootte zou de stroomafwaartse kloon- en transfectiestappen kunnen beperken.
  2. Verkrijg de coderende sequenties voor het katalytische domein (CD) van het DNMT3A-gen en de volledige lengte van het HDAC1-gen . Voeg een stopcodon toe aan het 3' (stroomafwaarts) einde van elke coderingssequentie. Voeg restrictieplaatsen BglII (5') en AseI (3') toe aan de flank van de sequenties.
  3. Verteer de eGFP-gedeleteerde pEPI-1-vector met BglII en AseI. Verteer de bereide DNMT3A(CD) en HDAC1-coderende sequenties afzonderlijk met dezelfde enzymen. Voer twee onafhankelijke ligatiereacties uit:
    1. Ligate het DNMT3A(CD)-fragment in de verteerde vector om het pEPI-1-DNMT3A-construct te genereren.
    2. Ligate het HDAC1-fragment in de verteerde vector om het pEPI-1-HDAC1-construct te genereren.
      OPMERKING: BglII- en AseI-sites plaatsen de inserts stroomafwaarts van de pCMV-promotor en stroomopwaarts van het S/MAR-element voor optimale expressie.
  4. Transformeer chemisch competente Escherichia coli (bijv. NEB 5-alpha Competent E. coli, High Efficiency) met de ligatieproducten van elke vector afzonderlijk. Leg de getransformeerde cellen op een plaat met kanamycine (50 μg/ml) LB-agar en incubeer een nacht bij 37 °C. Selecteer positieve kolonies en isoleer plasmide-DNA met behulp van de snel kokende miniprep-methode27,28.
  5. Verkrijg de sequentie die codeert voor de katalytisch dode SpCas9 (dCas9). Introduceer de volgende elementen in de opgegeven volgorde:
    1. Aan het 5'-einde: AscI-beperkingssite, Kozak-consensussequentie en startcodon (ATG).
    2. Aan het 3' einde: NLS, optioneel een HA-tag, gevolgd door een BamHI restriction site.
  6. Verteer zowel pEPI-1-DNMT3A- als pEPI-1-HDAC1-vectoren met AscI en BamHI. Voer dezelfde digestie uit op de dCas9-inzethaard. Ligate het dCas9-fragment in elke respectievelijke vector.
    OPMERKING: De AscI/BamHI-sites zorgen ervoor dat dCas9 stroomopwaarts van DNMT3A of HDAC1 wordt ingevoegd, direct stroomafwaarts van de pCMV-promotor. Zorg ervoor dat er een korte linker of een paar nucleotiden aanwezig zijn tussen dCas9 en de epigenetische effector om het juiste leeskader te behouden.
  7. Transformeer de uiteindelijke ligatieproducten in zeer efficiënte competente E. coli-stammen met een strikte controle van de plasmide-expressie (bijv. NEB 5-alfa F'Iq Competente E. coli, hoge efficiëntie). Selecteer transformatoren op kanamycineplaten. Bereid hoogwaardig plasmide-DNA van positieve klonen met behulp van de snel kokende miniprep-methode.
  8. Sequentie van de uiteindelijke plasmideconstructies (pEPI-1-dCas9-DNMT3A en pEPI-1-dCas9-HDAC1) met behulp van nanopore-sequencing om de juiste assemblage van alle componenten te bevestigen, verifieer het leesframe met behulp van een online vertaaltool (bijv. Expasy translate tool 3.0) en controleer op mogelijke mutaties of recombinatiegebeurtenissen met behulp van een online uitlijningstool (bijv. BLAST-uitlijningstool).
    OPMERKING: Grote vectoren zijn vatbaarder voor recombinatie en kunnen mutaties accumuleren. Daarom is een grondige sequentievalidatie essentieel.
  9. Fosforyleer de 5'-hydroxylgroepen van zowel voorwaartse als achterwaartse sgRNA-oligonucleotiden met behulp van T4-polynucleotidekinase. Hybridiseer de twee complementaire strengen door het mengsel gedurende enkele minuten tot 90 °C te verhitten om secundaire structuren te denatureren, en laat vervolgens 's nachts geleidelijk afkoelen tot kamertemperatuur voor volledig gloeien tot dubbelstrengs DNA.
  10. Verteer de geselecteerde pGuide sgRNA-expressievector met BamHI en Esp3I. Ligate het gegloeide dubbelstrengs sgRNA-fragment in de gelineariseerde vector met behulp van T4 DNA-ligase.
  11. Gebruik specifieke PCR-primers (aanvullende tabel 3) om de volledige gRNA-expressiecassette te amplificeren, bestaande uit (1) U6-promotor, (2) gekloonde sgRNA-sequentie en (3) sgRNA-scaffold. Gebruik een high-fidelity DNA-polymerase dat geen 3'-overhangs genereert (d.w.z. een proefleespolymerase) om schone, stompe PCR-producten te garanderen die geschikt zijn voor stroomafwaarts klonen.
  12. Herhaal stap 2.9-2.11 voor elk individueel gRNA dat in sectie 1 is ontworpen. Zorg ervoor dat elke gRNA-cassette afzonderlijk wordt voorbereid en geamplificeerd om de specificiteit van het doelwit te behouden.
  13. Verwerk de vectoren pEPI-1-dCas9-DNMT3A en pEPI-1-dCas9-HDAC1 met SacII. Maak de kleverige uiteinden bot met behulp van het Klenow-fragment van DNA-polymerase I. Kloon de eerder geamplificeerde U6-promotor-sgRNA-steigercassettes in deze vectoren met behulp van T4-ligase.
    OPMERKING: Tijdens de experimentele fase werden verschillende gRNA-epigenetische effectorcombinaties (bijv. sgRNA1-dCas9-DNMT3A, sgRNA2-dCas9-HDAC1, enz.) geconstrueerd. Slechts twee geselecteerde combinaties werden echter overgedragen voor de experimenten die in de volgende paragrafen werden gepresenteerd.
  14. Transformeer de uiteindelijke ligatieproducten in zeer efficiënte competente E. coli-stammen met een strikte controle van de plasmide-expressie. Selecteer transformatoren op kanamycineplaten. Bereid hoogwaardig plasmide-DNA van positieve klonen met behulp van de snel kokende miniprep-methode.
  15. Sequentie van de uiteindelijke plasmideconstructies met behulp van nanopore-sequencing, verifieer het leesframe en controleer op mogelijke mutaties of recombinatiegebeurtenissen.

3. Celcultuur en transfectie

  1. Houd de K562-cellen in T-75-kweekkolven bij 37 °C, onder 5% CO2 en vochtigheidsomstandigheden. Gebruik Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 10% Foetaal Bovine Serum (FBS), 1× Penicilline/Streptomycine oplossing (Pen/Strep).
  2. Bereid plasmiden voor transfectie voor:
    1. Gebruik 8 μg totaal plasmide-DNA per transfectie, dus 4 μg van elk plasmide voor een co-transfectie van twee plasmiden. Kwantificeer het DNA met behulp van absorptie bij 260 nm en verdun vervolgens de vereiste hoeveelheid in 90 μL ultrazuiver water.
    2. Voeg 10 μL 3 M natriumacetaatoplossing en 2,5 volumes 100% ethanol toe aan het verdunde DNA.
    3. Meng grondig en incubeer een nacht bij -20 °C om het DNA neer te slaan.
      OPMERKING: Bij het co-transfecteren van twee plasmiden met verschillende gRNA-epigenetische effectorcombinaties (bijv. gRNA1-dCas9-DNMT3A en gRNA2-dCas9-HDAC1), wordt aanbevolen om beide plasmiden in dezelfde precipitatiebuis te combineren om de hantering voor stroomafwaartse procedures te vereenvoudigen.
    4. De volgende dag centrifugeren we de DNA-precipitatiebuisjes bij 11.000 × g gedurende 15 minuten bij 4 °C.
      OPMERKING: Voer alle volgende stappen uit onder steriele omstandigheden in een bioveiligheidskast, aangezien in deze fase ook levende cellen worden gehanteerd.
    5. Gooi het bovenstaande voorzichtig weg. Voeg 500 μL 70 % ethanol toe om de pellet te wassen. Centrifugeer bij 11.000 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
    6. Verwijder het ethanol supernatans volledig. Laat de pellet aan de lucht drogen totdat er geen zichtbare ethanol meer over is.
    7. Resuspendeer de gedroogde DNA-pellet grondig in 50 μL DMEM. Bewaar de plasmide-DMEM-oplossing tot gebruik bij 4 °C.
    8. Stel 400 ng van het voorbereide episomale DNA (ongeveer 2,5 μL van de geresuspendeerde oplossing) op een 1% agarosegel in werking om het succes van DNA-zuivering en integriteit voorafgaand aan transfectie te verifiëren.
  3. Cellen voorbereiden:
    1. Oogst K562-cellen uit een T-75-kolf wanneer culturen een samenvloeiing van 50-60% bereiken om de efficiëntie van transfectie te garanderen.
    2. Tel cellen met behulp van een hemocytometer. Breng een volume met 2 × 105 cellen over in een kweekschaaltje van 35 mm met 900 μl DMEM zonder FBS of antibiotica.
      OPMERKING: Gebruik serum-vrije DMEM voor alle stappen in de transfectieprocedure. Hervat de volledige medium cultuuromstandigheden pas nadat de incubatieperiode van de transfectie-incubatie is voltooid.
    3. Plaats de schaal in de broedmachine (37 °C, 5% CO2) om de cellen klaar te houden voor transfectie.
  4. Gebruik een op Lipofectamine gebaseerde transfectiekit voor plasmideafgifte. Volg de instructies van de fabrikant voor de specifieke kit die wordt gebruikt en pas indien nodig de volumes aan.
    1. Voeg 3 μL P3000-reagens (geleverd in de transfectietit) toe aan de bereide plasmide-DMEM-oplossing. Meng voorzichtig en incubeer het plasmide-P3000-reagensmengsel gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
    2. Voeg 5 μL Lipofectamine 3000 Reagens (meegeleverd in de transfectietit) samen met voldoende DMEM toe om een totaal reactievolume van 100 μL te bereiken. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 min.
    3. Voeg het volledige transfectiemengsel van 100 μL toe aan de schaal van 35 mm met cellen. Schud de plaat voorzichtig om het mengsel te verspreiden en plaats de schaal terug in de broedmachine.
  5. Voeg 24 uur na transfectie 3 ml volledig medium (DMEM aangevuld met 10% FBS en 1× Pen/Strep) toe aan elke schotel van 35 mm om de proliferatie van getransfecteerde cellen op gang te brengen. 72 uren na transfectie, begin de selectieprocedure door G-418 antibioticum aan een definitieve concentratie van 1 mg/ml toe te voegen.
  6. Zodra de selectie voldoende is vastgesteld en het totale aantal cellen meer dan 1 × 106 bedraagt, gaat u verder met het isoleren van afzonderlijke klonen (Figuur 3A) met behulp van fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS):
    1. Oogst de cellen door centrifugeren bij 300 × g gedurende 6 minuten bij 25 °C. Eenmaal wassen met 1× steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS, pH ~7,4) en opnieuw centrifugeren onder dezelfde omstandigheden.
    2. Resuspendeer de celpellet in 1× PBS en bepaal de celconcentratie met behulp van een hemocytometer. Verdun de suspensie tot 1 × 106 cellen/ml en zorg voor een grondige resuspensie.
    3. Stel FCS korter in tot eencellige modus (zorgt voor 1 cel per druppel), met behulp van een met weefselkweek behandelde plaat met 96 putjes als opvangapparaat. Pas de software-instellingen indien nodig aan, afhankelijk van het gebruikte instrument (Afbeelding 3B).
    4. Gate de primaire populatie op basis van verwachte grootte (FSC) en granulariteit (SSC). Sluit vuil uit (laag FSC/SSC) en zeer korrelig of dood materiaal (hoog SSC). Gebruik FSC-A vs. FSC-H of SSC-A vs. SSC-H dot plots om singlets te poorten.
    5. Vul de plaat met 96 putjes voor met 100 μL vol medium met 1 mg/ml G-418 per putje. Verwarm de plaat in de broedmachine voor het sorteren.
    6. Voer de sortering uit in de modus met één cel, waarbij de sorteersnelheid lager is dan 300 gebeurtenissen per seconde om de sorteernauwkeurigheid te verbeteren.
    7. Inspecteer na het sorteren de putjes onder een microscoop om één cel per putje te bevestigen. Plaats de plaat in een broedmachine van 37 °C met 5% CO2.
  7. Laat eencellige klonen individueel uitzetten in de plaat met 96 putjes. Zodra de klonale groei is vastgesteld, verlaagt u de G-418-concentratie tot 400 μg/ml om de selectie te behouden.
  8. Breng goed groeiende klonen achtereenvolgens over naar platen met 12 putjes, vervolgens naar T-25 en ten slotte T-75 kolven indien nodig, totdat elke kloon ~1 × 106 cellen bereikt.
  9. Verzamel met regelmatige tussenpozen dubbelcellige pellets. Bewaar een pellet bij -20 °C voor genomische DNA-extractie. Bewaar bovendien een pellet die is gehomogeniseerd in 500 μL Trizol-reagens bij -20 °C voor RNA-extractie en cDNA-synthese.
    LET OP: Trizol-reagens moet met voorzichtigheid worden behandeld vanwege de toxiciteit en bijtende aard in een chemische zuurkast terwijl u persoonlijke beschermingsmiddelen draagt, en verontreinigde materialen moeten worden geëtiketteerd voor de verwijdering van gevaarlijk afval.
  10. Extraheer genomisch DNA uit geselecteerde klonen met behulp van traditionele fenol-chloroform-extractie, gevolgd door ethanolprecipitatie.
    LET OP: Fenol:chloroform is giftig en bijtend en moet worden gehanteerd in een chemische zuurkast terwijl u persoonlijke beschermingsmiddelen draagt. Gooi fenol- en chloroformhoudend afval weg als gevaarlijk chemisch afval.
  11. Zorg ervoor dat het DNA volledig is geresuspendeerd in nucleasevrij water of TE-buffer. Meet de DNA-concentratie en -zuiverheid met behulp van een spectrofotometer voordat u overgaat tot downstream-toepassingen.
    OPMERKING: Dit DNA zal worden gebruikt in stroomafwaartse experimenten zoals PCR en pyrosequencing om de efficiëntie van epigenetische bewerking te beoordelen.
  12. Extraheer totaal RNA uit celpellets met behulp van trizolreagens, gevolgd door isopropanolprecipitatie29. Ga voorzichtig om met RNA-monsters door te zorgen voor RNase-vrije reagentia en wegwerpartikelen en door monsters tijdens de procedure op 4 °C te houden.
    OPMERKING: Totaal RNA zal worden gebruikt voor cDNA-synthese met behulp van een reverse transcriptiekit.

4. PCR om de aanwezigheid van beide episomen in klonen te bevestigen

  1. Oogst ongeveer 5 × 105 cellen van elke cultuurkloon, na grondig resuspensie van de cellen. Centrifugeren bij 7.000 x g gedurende 3 minuten bij 25 °C. Gooi het bovenstaande medium weg.
  2. Was de cel door opnieuw te suspenderen in 1× PBS. Centrifugeer opnieuw onder dezelfde omstandigheden.
  3. Gooi het bovenstaande weg en laat een klein volume over, net boven het pelletniveau. Gebruik 1 μL van de celsuspensie direct als sjabloon voor PCR.
  4. Als alternatief, gebruik 200 ng gezuiverd genoom-DNA dat uit de getransfecteerde klonen wordt geëxtraheerd.
    OPMERKING: Directe PCR van gewassen cellen biedt een snelle screeningsmethode, maar kan variabele resultaten opleveren. Gebruik voor een hogere specificiteit en gevoeligheid gezuiverd genomisch DNA als sjabloon.
  5. Bereid de PCR-mastermix volgens tabel 1.
  6. Gebruik twee sets primers, met een gemeenschappelijke voorwaartse primer gericht op de dCas9-sequentie en afzonderlijke omgekeerde primers die specifiek zijn voor elke epigenetische effectorvector (aanvullende tabel 3).
  7. Volg de fietsomstandigheden in tabel 2.
  8. Voer PCR-producten uit op agarosegel of analyseer met capillaire elektroforese om de productgroottes te verifiëren: 230 bp voor de DNMT3A-bevattende vector en 205 bp voor de HDAC1-bevattende vector (Figuur 3C). Voeg een positieve controle toe (meng beide plasmiden in een concentratie van 10-20 ng) om de verwachte bandgroottes te bevestigen en de PCR-efficiëntie te valideren. Voeg een besturingselement zonder sjabloon (NTC) toe.
ReagensUiteindelijke concentratie/hoeveelheid
10× Buffer1×
Voorwaartse primer1 μΜ
Omgekeerde primers0,5 μM
DNA200 ng
Polymerase1.25 U
dNTP's200 μM per stuk
Water, nucleasevrijtot 50 μL

Tabel 1: PCR-reactiemix voor verificatie van de episomen.

StapTemperatuur, °CTijdAantal cycli
Initiële denaturatie953 minuten1
Denaturatie95jaren 3030
Annealing58jaren 30
Extensie721 minuut
Laatste verlenging725 minuten1

Tabel 2: PCR-cyclusomstandigheden voor episoomverificatie.

5. Gerichte pyrosequencing-analyse

  1. Behandel gDNA (1,5 μg) geëxtraheerd uit getransfecteerde klonen met een bisulfietconversiekit volgens de instructies van de fabrikant.
  2. Ontwerp primers die de CpG-sites flankeren binnen de regelgevende regio waarop de constructies zich richten. Gebruik een speciale ontwerptool voor bisulfietprimers. Volg deze ontwerprichtlijnen:
    1. Converteer het CpG-eiland of de regelgevende regio van de CpG-site naar de bisulfietgeconverteerde versie.
    2. Ontwerp een voorwaartse en achterwaartse primer voor PCR-amplificatie van bisulfiet-geconverteerd DNA. Voeg een biotine-etiket toe aan één primer (meestal de achterkant) voor immobilisatie op met streptavidine beklede kralen.
    3. Ontwerp een sequencing-primer (18-25 bp) intern van het PCR-product, stroomopwaarts van de eerste CpG van belang. Selecteer als doelgebied een venster van 100 bp stroomopwaarts of stroomafwaarts van de sgRNA-bindingsplaats om mogelijke lokale epigenetische modificaties te beoordelen.
    4. Vermijd CpG-plaatsen in primersequenties om een onbevooroordeelde versterking te garanderen.
    5. Kies een primerpaar met een Assay Design-softwarescore van meer dan 75 % en een kwaliteitsbeoordeling van 'hoog' (blauw), wat aangeeft dat de software-analyse geen problemen of zorgen aan het licht heeft gebracht.
      OPMERKING: Voor primersequenties die zijn ontworpen om CpG-eiland 326 te targeten, raadpleeg aanvullende tabel 3. De primers zijn ontworpen om te binden in regio's die de sgRNA1- en sgRNA2-bindingsplaatsen flankeren, waardoor sequentiebepaling van CpG-plaatsen rond de beoogde loci mogelijk is.
  3. Zet een PCR-reactie op met behulp van een high-fidelity hot-start DNA-polymerase dat is geoptimaliseerd voor bisulfietsjablonen.
  4. Pyrosequencing-procedure:
    1. Bind gebiotinyleerde PCR-producten aan met streptavidine beklede sepharosekorrels en isoleer enkelstrengs DNA met behulp van een pyrosequencing-werkstation.
    2. Voeg de sequencing-primer toe aan het enkelstrengs DNA in de gloeibuffer. Verwarm het mengsel gedurende 2 minuten tot 80 °C en laat het vervolgens geleidelijk afkoelen tot kamertemperatuur.
    3. Voer sequentiereacties uit met behulp van het pyrosequencing-instrument en de dispensatievolgorde die tijdens het ontwerp van de primer is gedefinieerd.
  5. Gegevensanalyse:
    1. Gebruik speciale pyrosequencing-software om het methyleringspercentage op elke CpG-locatie te kwantificeren.
    2. Vergelijk methyleringsniveaus tussen getransfecteerde en niet-getransfecteerde klonen. Beoordeel de efficiëntie van de bewerking (Figuur 3D). Overweeg om een tweezijdige ongepaarde t-test uit te voeren om methylatieniveaus tussen onbehandelde controles en elke getransfecteerde kloon op elke individuele CpG-plaats te vergelijken.

6. cDNA-synthese en digitale PCR voor analyse van dCas-expressie

  1. Bereid totaal RNA (1.100 ng per reactie) geëxtraheerd uit getransfecteerde klonen in 12 μL RNase-vrij water. Bewaar monsters op ijs.
  2. Stel de genomische DNA-eliminatiemix op ijs samen: meng 2 μL gDNA-vernietigingsbuffer, RNA-monster met 1.100 ng totaal RNA en RNase-vrij water tot een eindvolume van 14 μL. Incubeer gedurende 2 minuten bij 42 °C en plaats het vervolgens op ijs.
  3. Bereid de reverse transcription mastermix op ijs: Meng 4 μL RT Buffer met 1 μL RT primers en voeg 1 μL reverse transcriptase toe.
  4. Combineer 14 μl genomische DNA-eliminatiemix met 6 μl reverse transcription mastermix tot een totaal reactievolume van 20 μl. Meng voorzichtig en incubeer gedurende 15 minuten bij 42 °C. Inactiveer de reverse transcriptase door gedurende 3 minuten te verhitten op 95 °C.
    OPMERKING: Bewaar cDNA bij -20 °C tot verder gebruik.
  5. Verdun cDNA van alle monsters 1:1 met nucleasevrij water. Gebruik het verdunde cDNA voor downstream digitale PCR-analyse, met behulp van een digitaal PCR-systeem met dCas-specifieke primers (aanvullende tabel 3):
    1. Bereid de 4× Master-mix en de Reaction-mix volgens tabel 3. Voeg verdund cDNA toe aan het mengsel en pipetteer voorzichtig om een grondige menging te garanderen.
      OPMERKING: Stel reacties in ten minste duplicaten in voor alle klonen. Voeg een negatieve controle (cDNA van onbehandelde K562-cellen) en een NTC toe.
    2. Laad 9 μL van het reactiemengsel in elk putje van de PCR-plaat. Stel het PCR-systeem in met behulp van de cyclusomstandigheden die worden weergegeven in tabel 4.
    3. Selecteer het FAM-kleurstofkanaal voor detectie en start de run.
    4. Haal na voltooiing de monsters op en analyseer de gegevens.
      OPMERKING: Digitale PCR rapporteert resultaten als kopieën per μL reactie.
    5. Vermenigvuldig de gerapporteerde waarde (kopieën/μL) met het reactievolume (10 μL) om het totale aantal kopieën per reactie te verkrijgen. Deel deze waarde door de hoeveelheid cDNA in de reactie om kopieën per ng cDNA te verkrijgen (gelijk aan ng RNA-input).
      OPMERKING: Als het exacte protocol wordt gevolgd, begint elk monster met 1.100 ng RNA in een 20 μL RT-reactie (55 ng/μL). Na 1:1 verdunning is de werkconcentratie 27,5 ng/μL, en aangezien aan elke PCR-reactie 1 μL wordt toegevoegd, komt dit overeen met 27,5 ng cDNA (RNA-equivalent) per reactie.
Master mix (4×)
ReagensUiteindelijke concentratie/hoeveelheid
25× SYBR Groene kleurstof2×
5× Digitale PCR-mix4×
Water, nucleasevrijtot 100 μL
Reactie mix
ReagensUiteindelijke concentratie/hoeveelheid
4× Master mix1×
Voorwaartse primer1 μΜ
Omgekeerde primer1 μΜ
cDNA (verdund)1 μL
Water, nucleasevrijtot 10 μL

Tabel 3: 4× Mastermix en reactiemix voor digitale PCR-analyse van dCas-expressie.

StapTemperatuur, °CTijdAantal cycli
Initiële denaturatie9610 minuten1
Denaturatie965 seconden40
Gloeien/Uitbreiding6015 s

Tabel 4: Cyclusomstandigheden voor digitale PCR.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om te onderzoeken of onze gerichte epigenetische bewerkingstools plaatsspecifieke DNA-methylatieveranderingen op het ZBTB7A CpG-eiland 326 kunnen induceren, hebben we eerst episomale vectoren gegenereerd die coderen voor dCas9 gefuseerd met DNMT3A(CD) of HDAC1, samen met verschillende sgRNA's die zijn ontworpen met doellocaties binnen CpG-eiland 326. We hebben aanvankelijk K562-cellen geco-getransfecteerd met combinaties van deze plasmiden om te evalueren of gelijktijdige toedie...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een van de meest kritische stappen in dit protocol is het ontwerp van zeer specifieke sgRNA's. Off-target effecten zijn een bekende beperking van op CRISPR gebaseerde epigenetische bewerkingssystemen, die vaak kunnen voortkomen uit dCas9-bindende ontrouw, evenals de niet-specifieke activiteit van de effectordomeinen. Om dit te minimaliseren, moeten sgRNA's worden ontworpen met behulp van bio-informaticatools die optimaliseren voor hoge on-target activiteit en minimale off-target binding<...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële of niet-financiële belangen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Irene Dereki en Vasiliki Chondrou worden ondersteund door een driejarige fellowship (Grant No. 80706) van de Special Account of Research Funds (ELKE) van de Hellenic Open University.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Absolute Q DNA Digital PCR Master Mix (5x)Applied BiosystemsA52490
AgeI-HF NEBR3552
AscINEBR0558
AseINEBR0526
BamHI-HFNEBR3136
BD FACS Melody Cell SorterBD
BglllNEBR0144
BspEINEBR0540
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix (10 mM each)NEBN0447
DMEM High Glucose w/stable Glutamine, w/Sodium Pyruvate mediumBiowestL0103
DNA Polymerase I, Large (Klenow) FragmentNEBM0210
DNMT3A (CD), HDAC1 sequencesIDT
DreamTaq DNA Polymerase Thermo ScientificEP0712
EpiTectQiagen59104Bisulfite conversion kit 
Epitect Bisulfite kitQiagen59104
Esp3INEBR0734
Fetal Bovine SerumGibcoA5256701
Geneticin selective antibiotic (G418 sulfate)Gibco11811031
Lipofectamine 3000 transfection kitInvitrogenL3000015
NEB® 5-alpha Competent E. coli (High Efficiency)NEBC2987I
NEB® 5-alpha F'Iq Competent E. coli (High Efficiency)NEBC2992H
Nucleospin Tissue Macherey-Nagel740952.50
PBS, 10x solution pH 7.4LonzaBE17-517Q
Penicillin-Streptomycin solution 100xBiowestL0022
pGuide vectorOriGene TechnologiesGE100042
Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol 25:24:1 Saturated with 10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTASigma-AldrichP2069
Primers, sgRNAs Eurofins
PyroMark Assay Design QiagenVersion 2.0Bisulfite primer design tool 
PyroMark Gold Q24 ReagentsQiagen970802
PyroMark PCR kit Qiagen978703
PyroMark Q24 MDxQiagenPyrosequencing workstation 
PyroMark Q24 Software Qiagenv2.0.8Pyrosequencing software 
Q5® High-Fidelity DNA PolymeraseNEBM0491
QuantiTect Reverse Transcription KitQiagen205311
QuantStudio Absolute Q MAP16 Plate KitApplied BiosystemsA52865Digital PCR system 
SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain, 10,000x concentrate in DMSOInvitrogenS7563
T4 DNA LigaseNEBM0202
T4 Polynucleotide KinaseNEBM0201
TRIzol ReagentInvitrogen15596026

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Firdaus, Z., Li, X. Epigenetic explorations of neurological disorders, the identification methods, and therapeutic avenues. Int J Mol Sci. 25 (21), 11658(2024).
  2. Yu, X., et al. Cancer epigenetics: from laboratory studies and clinical trials to precision medicine. Cell Death Discov. 10 (1), 1-12 (2024).
  3. Wang, S. E., Jiang, Y. -H. Novel epigenetic molecular therapies for imprinting disorders. Mol Psychiatry. 28 (8), 3182-3193 (2023).
  4. Gilbert, L. A., et al. Genome-scale CRISPR-mediated control of gene repression and activation. Cell. 159 (3), 647-661 (2014).
  5. Ptak, C., Petronis, A. Epigenetics and complex disease: from etiology to new therapeutics. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 48 (1), 257-276 (2008).
  6. Stepper, P., et al. Efficient targeted DNA methylation with chimeric dCas9-Dnmt3a-Dnmt3L methyltransferase. Nucleic Acids Res. 45 (4), 1703-1713 (2017).
  7. Sapozhnikov, D. M., Szyf, M. Unraveling the functional role of DNA demethylation at specific promoters by targeted steric blockage of DNA methyltransferase with CRISPR/dCas9. Nat Commun. 12 (1), 5711(2021).
  8. Kwon, D. Y., Zhao, Y. -T., Lamonica, J. M., Zhou, Z. Locus-specific histone deacetylation using a synthetic CRISPR-Cas9-based HDAC. Nat Commun. 8 (1), 15315(2017).
  9. Vojta, A., et al. Repurposing the CRISPR-Cas9 system for targeted DNA methylation. Nucleic Acids Res. 44 (12), 5615-5628 (2016).
  10. Giehrl-Schwab, J., et al. Parkinson's disease motor symptoms rescue by CRISPRa-reprogramming astrocytes into GABAergic neurons. EMBO Mol Med. 14 (5), e14797(2022).
  11. Moreno, A. M., et al. In situ gene therapy via AAV-CRISPR-Cas9-mediated targeted gene regulation. Mol Ther. 28 (8), 1931(2020).
  12. Sokka, J., et al. CRISPR activation enables high-fidelity reprogramming into human pluripotent stem cells. Stem Cell Rep. 17 (2), 413-426 (2022).
  13. Galonska, C., et al. Genome-wide tracking of dCas9-methyltransferase footprints. Nat Commun. 9 (1), 1-9 (2018).
  14. Lin, L., et al. Genome-wide determination of on-target and off-target characteristics for RNA-guided DNA methylation by dCas9 methyltransferases. GigaScience. 7 (3), 1-19 (2018).
  15. Kennedy, M. E., Cullen, R. B. Bacterial CRISPR/Cas DNA endonucleases: a revolutionary technology that could dramatically impact viral research and treatment. Virology. 479 - 480, 213-220 (2015).
  16. Rothe, M., Modlich, U., Schambach, A. Biosafety challenges for use of lentiviral vectors in gene therapy. Curr Gene Ther. 13 (6), 453-468 (2013).
  17. Cappelluti, M. A., et al. Durable and efficient gene silencing in vivo by hit-and-run epigenome editing. Nature. 627 (8003), 416-423 (2024).
  18. Hanzawa, N., et al. Targeted DNA demethylation of the Fgf21 promoter by CRISPR/dCas9-mediated epigenome editing. Sci Rep. 10 (1), 1-14 (2020).
  19. O'Geen, H., Tomkova, M., Combs, J. A., Tilley, E. K., Segal, D. J. Determinants of heritable gene silencing for KRAB-dCas9 + DNMT3 and Ezh2-dCas9 + DNMT3 hit-and-run epigenome editing. Nucleic Acids Res. 50 (6), 3239-3253 (2022).
  20. Sgourou, A., Routledge, S., Spathas, D., Athanassiadou, A., Antoniou, M. N. Physiological levels of HBB transgene expression from S/MAR element-based replicating episomal vectors. J Biotechnol. 143 (2), 85-94 (2009).
  21. Lazaris, V. M., et al. Non-viral episomal vector mediates efficient gene transfer of the β-globin gene into K562 and human haematopoietic progenitor cells. Genes. 14 (9), 1774(2023).
  22. Mulia, G. E., Picanço-Castro, V., Stavrou, E. F., Athanassiadou, A., Figueiredo, M. L. Advances in the development and the applications of nonviral, episomal vectors for gene therapy. Hum Gene Ther. 32 (19-20), 1076-1095 (2021).
  23. Piechaczek, C., Fetzer, C., Baiker, A., Bode, J., Lipps, H. J. A vector based on the SV40 origin of replication and chromosomal S/MARs replicates episomally in CHO cells. Nucleic Acids Res. 27 (2), 426-428 (1999).
  24. Nuñez, J. K., et al. Genome-wide programmable transcriptional memory by CRISPR-based epigenome editing. Cell. 184 (9), 2503-2519.e17 (2021).
  25. Doench, J. G., et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nat Biotechnol. 34 (2), 184-191 (2016).
  26. Brezgin, S., Kostyusheva, A., Kostyushev, D., Chulanov, V. Dead Cas systems: types, principles, and applications. Int J Mol Sci. 20 (23), 6041(2019).
  27. Holmes, D. S., Quigley, M. A rapid boiling method for the preparation of bacterial plasmids. Anal Biochem. 114 (1), 193-197 (1981).
  28. Harwood, A. J. The rapid boiling method for small-scale preparation of plasmid DNA. Methods Mol Biol. 58, 265-367 (1996).
  29. Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Purification of RNA using TRIzol (TRI reagent). Cold Spring Harb Protoc. 2010 (6), (2010).
  30. Labuhn, M., et al. Refined sgRNA efficacy prediction improves large- and small-scale CRISPR-Cas9 applications. Nucleic Acids Res. 46 (3), 1375-1385 (2018).
  31. Hofacker, D., et al. Engineering of effector domains for targeted DNA methylation with reduced off-target effects. Int J Mol Sci. 21 (2), 502(2020).
  32. Yang, Q., et al. EpiCas-DL: predicting sgRNA activity for CRISPR-mediated epigenome editing by deep learning. Comput Struct Biotechnol J. 21, 202-211 (2023).
  33. Mu, W., et al. Machine learning methods for predicting guide RNA effects in CRISPR epigenome editing experiments. bioRxiv. , (2024).
  34. Batra, S. S., et al. Predicting the effect of CRISPR-Cas9-based epigenome editing. bioRxiv. , (2025).
  35. Stavrou, E. F., et al. Episomal vectors based on S/MAR and the β-globin replicator, encoding a synthetic transcriptional activator, mediate efficient γ-globin activation in haematopoietic cells. Sci Rep. 9 (1), 19765(2019).
  36. Stavrou, E. F., et al. The β-globin replicator greatly enhances the potential of S/MAR based episomal vectors for gene transfer into human haematopoietic progenitor cells. Sci Rep. 7 (1), 40673(2017).
  37. Hagedorn, C., Antoniou, M. N., Lipps, H. J. Genomic cis-acting sequences improve expression and establishment of a nonviral vector. Mol Ther Nucleic Acids. 2 (8), e118(2013).
  38. Stehle, I. M., Rupprecht, S., Cremer, T., Jackson, D. A., Lipps, H. J. Establishment and mitotic stability of an extra-chromosomal mammalian replicon. BMC Cell Biol. 8, 33(2007).
  39. Lufino, M. M. P., Manservigi, R., Wade-Martins, R. An S/MAR-based infectious episomal genomic DNA expression vector provides long-term regulated functional complementation of LDLR deficiency. Nucleic Acids Res. 35 (15), e98(2007).
  40. Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nat Biotechnol. 31 (9), 827-832 (2013).
  41. Fu, Y., et al. High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells. Nat Biotechnol. 31 (9), 822-826 (2013).
  42. Ewaisha, R., Anderson, K. S. Immunogenicity of CRISPR therapeutics-critical considerations for clinical translation. Front Bioeng Biotechnol. 11, 1138596(2023).
  43. Raghavan, R., et al. Rational engineering of minimally immunogenic nucleases for gene therapy. Nat Commun. 16 (1), 105(2025).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

dCas9 HDAC1episomale vectorengerichte methyleringCRISPR epigeneticaflowcytometriegenregulatie

Gerelateerde artikelen