Methodenartikel

Weefselspecifieke hoogwaardige protoplastisolatie voor enkelcellige analyses in Arabidopsis

DOI:

10.3791/69330

⸱

6 februari 2026

 ,  , 
1Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie presenteert een verbeterd protoplast-isolatieprotocol voor wortel-, blad-, stengel- en bloemweefsels van Arabidopsis thaliana. Het maakt gebruik van geoptimaliseerde enzymdigestie en zuiveringsstappen om cellulaire schade en puin te minimaliseren, waardoor de opbrengst wordt verhoogd en hoogwaardige protoplasten worden verkregen voor enkelcelmethoden, zoals single-cell RNA-sequencing.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Single-cell RNA-sequencing (scRNAseq) is een essentieel hulpmiddel geworden in de plantbiologie om hoogresolutie-informatie te verkrijgen over celtype-specifieke genexpressie, ontwikkelingsdynamiek en weefselspecifieke reacties op omgevingsfactoren. Een grote technische uitdaging bij het toepassen van scRNAseq op planten is de efficiënte en reproduceerbare isolatie van levensvatbare individuele cellen zonder celwanden, wat de heterogeniteit van plantweefsels weerspiegelt. Protoplastisolatie, waarbij de celwand enzymatisch wordt verwijderd om enkele, levende plantencellen te produceren, is een veelgebruikte methode voor dit doel. Succesvolle protoplastisolatie vereist echter zorgvuldige optimalisatie om de levensvatbaarheid van cellen te behouden en celtype-specifieke transcriptoomprofielen te behouden. Hier presenteren we een robuust en reproduceerbaar protocol voor het isoleren van hoogwaardige protoplasten uit meerdere Arabidopsis thaliana-weefsels , waaronder bovengronds (bladeren, stengels, bloemen) en wortelweefsels. Dit protocol houdt rekening met de unieke fysiologische eigenschappen van weefseltypen, optimaliseert enzymatische verteringscondities en zuiveringsstappen om een hoge opbrengst en brede vertegenwoordiging van diverse celtypen te waarborgen. De resulterende protoplasten zijn geschikt voor toepassingen zoals scRNAseq, flowcytometrie (FACS) en analyse van tijdelijke genexpressie. Het maakt de productie van single-cel suspenties mogelijk uit meerdere weefseltypen. De gepresenteerde methode ondersteunt de verkenning van cellulaire heterogeniteit en verbetert de betrouwbaarheid van single-cell benaderingen in plantonderzoek.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Single-cell RNA-sequencing (scRNAseq) heeft de plantbiologie gerevolutioneerd door de analyse van genexpressie met een ongekende resolutie mogelijk te maken. scRNAseq levert transcriptoominformatie over cellulaire heterogeniteit, ontwikkelingstrajecten en responsen op omgevingsstimuli bij celtype-specifieke resolutie 1,2,3.

In tegenstelling tot dierlijke systemen vormen de stijve plantcelwand en de structurele complexiteit van plantweefsels aanzienlijke barrières voor de efficiënte isolatie van individuele cellen voor transcriptomische analyse. Onder de beschikbare methoden is enzymatische verwijdering van de celwand om protoplasten te produceren een veelgebruikte methode geworden, die meer dan 60 jaar geleden is ontwikkeld 4,5,6. Ondanks het brede gebruik blijft protoplastisolatie een technisch veeleisende procedure die weefselspecifieke optimalisatie vereist om celopbrengst, levensvatbaarheid en een stabiel transcriptoom in balans te brengen. Alternatieve methoden, zoals single-nucleus RNA-sequencing (snRNA-seq), vermijden de noodzaak van celwandvertering door kernen7 te isoleren. Dit gaat echter ten koste van het verlies van informatie over volwassen transcripten die in het cytoplasma aanwezig zijn. Andere fysieke dissociatiemethoden, zoals mechanische en laserondersteunde microdissectie, vermijden enzymatische celwandvertering, maar zijn vaak gevoelig voor kruisbesmetting en kunnen leiden tot een lagere celluliteitsvatbaarheid en beperkte doorvoersnelheid 8,9,10.

Er zijn de afgelopen jaren veel plantcelatlassen ontwikkeld, met name voor Arabidopsis, die belangrijke inzichten bieden in de transcriptomische landschappen van verschillende weefsels 2,11,12,13,14,15,16,17,18 . Deze atlassen zijn echter voornamelijk gebaseerd op planten in de juveniele of zaailingsfase, met de nadruk op wortel- of bladweefsel. De protocollen die in deze studies worden gebruikt, vereisen optimalisatieprocessen voor oudere Arabidopsis-weefsels, zoals volwassen bladeren, bloemen en stengels. Bovendien waren tot het gebruik van celtype-specifieke sequencingstudies zoals scRNAseq of Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS) gecombineerd met RNA-sequencing, de transcriptoomveranderingen die de protoplastisolatie veroorzaakte niet volledig verklaard19.

De hier gepresenteerde methode bouwt voort op eerdere inspanningen en introduceert verschillende belangrijke verbeteringen: het houdt rekening met de fysiologische en anatomische variabiliteit tussen plantweefsels door bufferconcentraties te optimaliseren voor zowel wortel- als bovengrondse weefsels (bladeren, stengels, bloemen) en bevat zachte zuiveringsstappen om cellulaire schade te minimaliseren en de zuiverheid van de protoplasten te verbeteren. In vergelijking met nuclei-gebaseerde benaderingen heeft deze methode het potentieel om het transcriptoom van de hele cel te behouden, waardoor informatie met hogere resolutie van volwassen mRNA-moleculen in het cytosol mogelijk wordt. Belangrijk is dat de procedure een hoge levensvatbaarheid, heterogeniteit en reproduceerbare concentraties over weefsels heen oplevert, variërend van ongeveer 9,8 × 103 cellen/mg in bloemen tot 2,2 × 102 cellen/mg in bladeren.

Het algemene doel van de gepresenteerde methode is het presenteren van een robuust en reproduceerbaar protoplast-isolatieprotocol dat is afgestemd op meerdere weefsels van Arabidopsis thaliana, waarmee wordt voldaan aan een cruciale behoefte aan hoogwaardige input die diverse celtypen omvat voor planten-eencellige studies.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De reagentia en de gebruikte apparatuur voor deze studie zijn vermeld in de Materiaallijst.

1. Buffervoorbereiding

  1. Bereid de respectievelijke protoplast isolatiebuffer17,18 voor volgens Tabel 1 in een 15 mL centrifugebuis; Wortelprotoplast isolatiebuffer voor wortelweefsel of bloem/stengel/blad protoplast isolatiebuffer voor bovengrondse weefsels.
    OPMERKING: Geschatte hoeveelheid protoplast isolatiebuffer die nodig is voor vijf geoogste bloeiende planten van Arabidopsis thaliana (stadium 11-12 met gesloten bloemknoppen): Wortel (~ 375 mg): 7 mL, Blad (~930 mg): 5 mL, Stengel (~215 mg): 3 mL, Bloem (~10 mg): 2 mL.
  2. Voeg 2% (met v) cellulase RS en 1% (met v) Macerozyme R10 vers toe voordat je de wortel/blad-protoplast isolatiebuffer gebruikt. Meng goed door de protoplast isolatiebuffer op een rotator te plaatsen totdat het poeder volledig is opgelost (ongeveer 10 minuten bij 25 °C). Vermijd het creëren van luchtbellen en zorg ervoor dat er geen poederklonten meer in de buffer achterblijven.

2. Weefselvertering

  1. Filter de respectievelijke protoplast isolatiebuffer door een 0,2 μm filter voordat je het gebruikt. Gebruik een standaard petrischaal (100 mm x 15 mm) voor bladeren en wortels, en een kleine Petrischaal (30 mm x 15 mm) voor kleine hoeveelheden weefsels zoals bloemen. Voeg een paar druppels protoplast isolatiebuffer toe aan de petrischaal voordat je de weefsels overzet.
  2. Breng het betreffende weefsel over in de petrischaal en snijd het zo fijn en snel mogelijk in kleinere stukken met een scheermesje (Figuur 1A).
    OPMERKING: Gebruik altijd verschillende mesjes en pincetten voor elk monster om kruisbesmetting te voorkomen. Draag beschermende handschoenen bij het hanteren van het scheermesje.
  3. Voeg de resterende protoplast-isolatiebuffer toe aan de betreffende petrischaal om het gehakte weefsel onder te dompelen en incubeer bij 25 °C gedurende 1 uur. Houd de bovengrondse weefsels op de bank (zonder schudden) en breng de wortelweefsels over naar een orbitale shaker-platform (60 rpm).

3. Filtratie

  1. Wortelmonster na de incubatie:
    1. Met een Pasteur-pipet worden de protoplasten van de petrischaal overgebracht naar een 40 μm celzeef die bovenop een voorgekoelde open 50 mL centrifugebuis wordt geplaatst.
    2. Om de resterende protoplasten te oogsten, voeg exact hetzelfde volume W5-oplossing (2 mM MES pH 5,7, 154 mM NaCl, 125 mM CaCl2, 5 mM KCl) toe aan dezelfde Petrischaal om de protoplasten te verzamelen die aan de basis van de petrischaal zijn vastgekleefd. Overbreng de protoplasten die opnieuw in de W5-oplossing worden opgehangen naar dezelfde 40 μm celfilter die bovenop een voorgekoelde open 50 mL centrifugebuis wordt geplaatst.
    3. Voer het een tweede keer door een nieuwe 40 μm celfilter in een nieuwe voorgekoelde 50 mL centrifugebuis. Vanaf nu houd je de monsters op ijs en wees je heel voorzichtig met de protoplasten.
  2. Bovengrondse monsters na de incubatie:
    1. Met een Pasteur-pipet worden de protoplasten van de petrischaal overgebracht naar een 70 μm celzeef die bovenop een voorgekoelde open 50 mL centrifugebuis wordt geplaatst.
    2. Om de resterende protoplasten te oogsten, voeg je exact hetzelfde volume W5-oplossing (2 mM MES pH 5,7, 154 mM NaCl, 125 mM CaCl2, 5 mM KCl) toe aan dezelfde petrischaal om de protoplasten te verzamelen die aan de basis van de petrischaal zijn vastgekleefd. Breng de protoplasten die in de W5-oplossing worden opgehangen over naar dezelfde 70 μm celzeef die bovenop een voorgekoelde open 50 mL centrifugebuis wordt geplaatst. Vanaf nu houd je de monsters op ijs en wees heel voorzichtig met de protoplasten.

4. Wassen en Ficoll-zuivering

  1. Koel de centrifuge voor tot 4 °C en verzamel (pellet) de protoplasten gedurende 5 minuten op 500 × g met nul remstand van de centrifuge.
  2. Wortelmonster na centrifugatie:
    1. Gooi het supernatant weg zonder de protoplast pellet te verstoren.
    2. Suspensie de protoplasten zeer voorzichtig in voorgekoelde (4 °C) 600-700 μL wortelresuspendiebuffer (gelijke delen wortelprotoplast isolatiebuffer (zonder enzymen) en W5-oplossing) met een Pasteur-pipet of 1 mL Gilson-pipet met een gesneden punt om afschuiving te voorkomen.
    3. Breng de vering over naar 1,5 mL voorgekoelde (4 °C) buizen.
  3. Bovengrondse monsters na centrifugatie:
    1. Gooi het supernatant weg zonder het pellet te verstoren.
    2. Suspendeer de pellet heel voorzichtig opnieuw in een voorgekoelde (4 °C) 600-700 μL bloem/stengel/blad resuspendiebuffer (gelijke delen bloem/stengel/blad protoplast isolatiebuffer (zonder enzymen) en W5-oplossing) met een Pasteur-pipet of 1 mL Gilson-pipet met een gesneden punt om afschering te voorkomen.
    3. Breng de vering over naar 1,5 mL voorgekoelde (4 °C) buizen.
    4. Bereid 300 μL van 13,3% (w/v) Ficoll PM 400-oplossing voor in een 1,5 mL buis. Meng en laat het op ijs.
    5. Voeg het opnieuw suspendeerde protoplastmonster (600-700 μL) langzaam toe bovenop de voorbereide Ficoll-oplossing zonder de Ficolllaag aan te raken of te mengen.
    6. Centrifugeer op 4 °C gedurende 5 minuten op 700 × g met nul-break instelling van de centrifuge.
    7. Verzamel de protoplasten die aanwezig zijn in de middelste laag (interface) samen met de bovenste fase (eerste laag) (Figuur 1B). Wees voorzichtig dat je de onderste derde laag, die Ficoll en het gescheiden puin bevat, niet verzamelt. Bewaar op 4 °C tot verder gebruik.

5. Tellen en kwaliteitscontrole

  1. Gebruik 10 μL van de protoplastoplossing om het aantal geïsoleerde protoplasten te tellen met een Neubauer-hemocytometer.
    OPTIONEEL: 1% (met v/v) Evans Blue-kleurstof kan worden toegevoegd om de levensvatbaarheid van de protoplasten te evalueren (Figuur 1C).
  2. Verdun de protoplastoplossing tot de vereiste concentratie protoplasten/mL met behulp van voorgekoelde (4 °C) resuspendeerbuffer (uitgelegd in stap 4.2.2 voor wortel en stap 4.3.2 voor bovengrondse weefsels) van het respectievelijke weefsel.
  3. Ga zo snel mogelijk door met het beoogde experiment, bijvoorbeeld single-cell RNA-sequencing en/of FACS15,19.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De geïmplementeerde protoplast-isolatieprotocollen voor bovengrondse en wortelweefsels maken een efficiënte vertering van de celwand mogelijk en de afgifte van intacte enkele cellen uit alle Arabidopsis thaliana-weefsels. Over de geteste weefseltypen, waaronder bloemen, stengels, bladeren en wortels, produceerde het enzymatische verteringsproces goed gescheiden protoplasten met minimale aantallen onverteerde celgroepen (Figuur 2A-D). Evans Blue-kleurstofassays bevestigden dat de protoplasten die bolvormige morfologie vertoonden met gladde plasmamembraangrenzen levensvatbare cellen zijn (Figuur 1C). Voor elk weefseltype werden bolvormige protoplasten geteld. Bloemen bevatten gemiddeld 97.875 ± 7.531 (9.788 cellen/mg, n = 3), stengels 119.025 ± 22.508 (550 cellen/mg, n = 4), bladeren 210.483 ± 15.572 (225 cellen/mg, n = 3) en wortels 225.363 ± 52.561 (599 cellen/mg, n = 4).

De protoplast-suspenties vertoonden een brede verdeling van celgroottes en de aanwezigheid van groene of bleke plastiden, wat de heterogene cellulaire samenstelling van elk geoogst weefsel weerspiegelt (Figuur 3A-D). Om dit te bevestigen werd een protoplast-isolatie uitgevoerd met een transgene companion cell-specifieke YFP-rapportagelijn, en de suspension bevatte levensvatbare kleine protoplasten met een YFP-signaal dat de companion-cellen vertegenwoordigt (Figuur 3E). Dit benadrukt dat het gebruikte protoplast-isolatieprotocol geschikt is voor moeilijk te isoleren vaatcellen met stijve celwanden.

Met de gepresenteerde geoptimaliseerde methode kan men een groot aantal levensvatbare protoplasten isoleren met een minimale hoeveelheid afval uit verschillende weefsels van volwassen planten. Om de zuivering van bovengrondse monsters te verbeteren, hebben we een Ficoll-kussenreinigingsstap toegevoegd om vrijgekomen organellen en ander celafval uit de verteerde monsters te verwijderen, terwijl de transcriptoomkwaliteit behouden blijft (Figuur 4).

In de scRNAseq cDNA-bibliotheken die uit de protoplasten worden gegenereerd, werden sterk tot expressie gebrachte huishoudelijke transcripten zoals ACTIN2 en zeldzame/laag-expressieve transcripties zoals de homeodomeintranscriptiefactor KNAT1, een marker specifiek voor cambiale en meristematische cellen, evenals de companion celmarkers SUC2 en PARCL1, gedetecteerd door specifieke cDNA PCR-assays15 (Figuur 5). Dit wijst op een brede celtyperepresentatie en heterogeniteit van de verkregen protoplastpopulatie, wat verder werd bevestigd door de analyse van de scRNAseq-gegevens die met deze methode15 werden geproduceerd.

figure-results-1
Figuur 1: Werkwijze van protoplast-isolatiestappen. Zes hoofdstappen worden getoond: (1) buffervoorbereiding, (2) weefselvertering, (3) filtratie, (4) wash en Ficoll-zuivering, (5) tellen en kwaliteitscontrole, en (6) doorgaan met downstream experimenten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Afbeeldingen van de voorbereidingsstappen van de protoplast . (A) Representatieve afbeelding van de kapfase van het bladmonster (Stap 2.1). De bovenste afbeelding toont het geoogste weefsel met een paar druppels buffer in een standaard petrischaal en een scheermesje om te hakken. De afbeelding hieronder, links, toont het weefsel na enkele verticale slagen met het scheermesje (zie pijl). De afbeelding hieronder, rechts, stelt het gehakte monster weer voor, klaar voor de volgende stap. (B) Afbeelding van een Ficoll-kussen na centrifugatie in een 1,5 mL buis (Stap 4.3.7). De witte pijl geeft de middelste laag aan, die protoplasten bevat. (C) Representatief microscoopbeeld van bladprotoplasten geïncubeerd in Evans Blue-kleurstof. Schaalbalk: 250 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Microscoopbeelden van gegenereerde protoplasten. Protoplastafbeeldingen van elk weefseltype worden weergegeven. (a) bloem, (b) stengel, (c) blad, (d) wortel. Schaalbalk: 250 μm. (E) Confocale microscoopbeelden van een begeleidende cel-specifieke YFP-reporterlijn. De eerste afbeelding (links) toont de expressie van de YFP-companion cell-reporter in de bladvaaten (groene kleur). De tweede afbeelding (rechts) toont protoplasten van cellen die de YFP-reporter (groen signaal) uitdrukken. De kleur paars/blauw staat voor chloroplastautofluorescentie. Schaalbalk 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Microscoopbeelden van bladprotoplasten vóór (A) en na (B) het reinigen van het Ficoll-kussen .Schaalbalken: 250 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5: Kwaliteitscontrole-PCR's van scRNAseq-bibliotheken. Representatieve gelbeelden van kwaliteitscontrole-PCR's van wortel- en bovengronds weefsel enkelcellige RNAseq-bibliotheken. Geteste genenSUC2, PARCL, KNAT1, ACT2 (respectievelijk A tot D), en voor elk weefsel: bloem, stengel, blad, wortel van links naar rechts. cDNA (+) wordt gebruikt als positieve controle, en water als negatieve controle. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Wortel Protoplasting BufferBloem/Stengel/Blad Protopblijvende Buffer
600 mM Mannitol400 mM Mannitol
2 mM MgCl2-
0,1% BSA0,1% BSA
2 mM CaCl210 mM CaCl2
2 mM MES pH 5,720 mM MES pH 5,7
10 mM KCl20 mM KCl
Stel de pH indien nodig aan naar 5,5 met een 1M Tris BaseStel de pH indien nodig aan naar 5,5 met een 1M Tris Base

Tabel 1: Samenstellingen van protoplastisolatiebuffers. Protoplast isolatiebufferrecepten voor wortel- en bovengrondse (bloem, stengel, blad) weefsels worden verstrekt.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit geoptimaliseerde protocol voor het isoleren van protoplasten uit verschillende Arabidopsis-weefsels was op maat gemaakt voor scRNAseq-toepassingen, waarbij het gehele transcriptoom in het cytoplasma en de kernen werd geanalyseerd. Weefselspecifieke optimalisatie van de buffers en extra stappen voor vertering en zuivering resulteerden in robuuste en reproduceerbare opbrengsten over verschillende weefsels. Specifiek hadden bloemprotoplasten gemiddeld ~98.000 cellen per monster (~9.788 cellen per mg weefsel), stamprotoplasten ~119.000 cellen (~550 cellen per mg), bladprotoplasten ~210.500 cellen (~225 cellen per mg) en wortelprotoplasten ~225.000 cellen (~599 cellen per mg), wat de structurele en fysiologische diversiteit van deze weefsels weerspiegelt.

Een belangrijke verfijning in dit protocol was het gebruik van een Ficoll-gebaseerde kussen in plaats van de meer gangbare sucrose-gebaseerde gradaties/kussens voor zuivering. In tegenstelling tot sucrose, dat door cellen wordt opgenomen en een grote invloed heeft op het transcriptoom 13,20,21, is Ficoll osmotisch inert en membraanimpermeabel, waardoor RNA-integriteit tijdens isolatie 22 behouden blijft. Deze stap verminderde ook het aantal vrije organellen, zoals chloroplasten, uit gebroken cellen en celresten in de suspensie. De aanwezigheid van dergelijk afval kan de vorming van druppels belemmeren door de kanalen van microfluïdische apparaten te verstoppen of te resulteren in de aanwezigheid van meer dan één cel in gevormde druppels, wat bijdraagt aan de vervuiling van omgevings-RNA. Al deze factoren kunnen leiden tot verkeerde conclusies of biases in de analyse van scRNA-seq-gegevens.

Er werd aangetoond dat protoplastisolatie het transcriptoom van plantcellenkan veranderen 2,15,16,19. Een belangrijke strategie in dit protocol om dit artefact te minimaliseren is het behouden van protoplasten op 4 °C (op ijs) na enzymatische vertering, wat de metabole en transcriptieactiviteit vertraagt en daarmee transcriptieveranderingen vermindert die bekend zijn om geassocieerd te zijn met protoplastisolatie. Daarnaast is het cruciaal om de weefseloogsttijd consistent te houden tussen replicaten en deze af te stemmen op het studiedoel, aangezien variaties in timing zijn aangetoond zowel protoplast-geïnduceerde genen als circadiaan-gereguleerde transcripten die zijn gedetecteerd in scRNA-seq datasets15.

Bij deze methode was, naast het produceren van enkele cellen met minimale resten, een ander heel belangrijk punt het behouden van de heterogeniteit van de weefsels om mogelijk alle celtypen te vertegenwoordigen. De diversiteit in de protoplast-suspensies werd bevestigd door de detectie van verschillende morfologieën van protoplasten, waaronder diverse groottes en de aanwezigheid van signalen van cell-type-specifieke reporterlijnen binnen de verkregen populatie (Figuur 2). Daarnaast werd de protoplastpopulatie geëvalueerd door zeldzame en celtype-specifieke en huishoudelijke transcripties te detecteren in scRNA-seq cDNA-bibliotheken met behulp van PCR (Figuur 4). Deze omvatten zeldzame markergenen van de shoot apicale meristem en markers van companion cells15. Het succesvol vastleggen van deze transcripten bevestigt dat de gepresenteerde methode het mogelijk maakt om diverse celtypen met hoge integriteit te isoleren, waardoor het een waardevol hulpmiddel is voor het bevorderen van enkelcelonderzoek in planten. Naast scRNAseq kan deze methode ook worden gebruikt voor flowcytometrie, analyse van tijdelijke genexpressie en plantregeneratie-assays.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaarden geen belangenconflict.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit artikel maakt deel uit van een project dat financiering heeft ontvangen van de European Research Council (ERC) onder het Horizon 2020-onderzoeks- en innovatieprogramma van de Europese Unie (Grant Agreement No. 810131).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Cellulase RS Duchefa BiochemieC8003
Centrifuge 5810R modelEppendorf5810000010
Ficoll PM 400 Sigma-Aldrich26873-85-8
Macerozyme R10Duchefa BiochemieM8002
Microcentrifuge 5417R modelEppendorfdiscontinued
Puradisc 30 Sterile Syringe Filter, 0.2 µmCytiva10462200Referred as 0.2 µm filter in het protocol
Sterile Cell Strainer 40 µm Nylon Mesh Fisherbrand22363547
Sterile Cell Strainer 70 µm Nylon Mesh Fisherbrand22363548

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Macosko, E. Z., et al. Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
  2. Denyer, T., et al. Spatiotemporal developmental trajectories in the Arabidopsis root revealed using high-throughput single-cell RNA sequencing. Dev Cell. 48 (6), 840-852.e5 (2019).
  3. Tenorio Berrío, R., et al. Dual and spatially resolved drought responses in the Arabidopsis leaf mesophyll revealed by single-cell transcriptomics. New Phytol. 246 (3), 840-858 (2025).
  4. Cocking, E. C. A Method for the Isolation of Plant Protoplasts and Vacuoles. Nature. 187 (4741), 962-963 (1960).
  5. Zhai, Z., Jung, H., Vatamaniuk, O. K. Isolation of protoplasts from tissues of 14-day-old seedlings of Arabidopsis thaliana. J Vis Exp. (30), e1149(2009).
  6. Adedeji, O. S., Naing, A. H., Kim, C. K. Protoplast isolation and shoot regeneration from protoplast-derived calli of Chrysanthemum cv. White ND. Plant Cell Tissue Organ Cult. 141 (3), 571-581 (2020).
  7. Wang, K., et al. An optimized FACS-free single-nucleus RNA sequencing (snRNA-seq) method for plant science research. Plant Sci. 326, 111535(2023).
  8. Kerk, N. M., Ceserani, T., Tausta, S. L., Sussex, I. M., Nelson, T. M. Laser capture microdissection of cells from plant tissues. Plant Physiol. 132 (1), 27-35 (2003).
  9. Brandt, S., Walz, C., Schad, M., Pavlovic, N., Kehr, J. A simple, chisel-assisted mechanical microdissection system for harvesting homogenous plant tissue suitable for the analysis of nucleic acids and proteins. Plant Mol Biol Report. 21 (4), 417-427 (2003).
  10. Berkowitz, O., et al. RNA-seq analysis of laser microdissected Arabidopsis thaliana leaf epidermis, mesophyll and vasculature defines tissue-specific transcriptional responses to multiple stress treatments. Plant J. 107 (3), 938-955 (2021).
  11. Jean-Baptiste, K., et al. Dynamics of gene expression in single root cells of Arabidopsis thaliana. Plant Cell. 31 (5), 993-1011 (2019).
  12. Ryu, K. H., Huang, L., Kang, H. M., Schiefelbein, J. Single-cell RNA sequencing resolves molecular relationships among individual plant cells. Plant Physiol. 179 (4), 1444-1456 (2019).
  13. Shulse, C. N., et al. High-throughput single-cell transcriptome profiling of plant cell types. Cell Rep. 27 (7), 2241-2247.e4 (2019).
  14. Wendrich, J. R., et al. Vascular transcription factors guide plant epidermal responses to limiting phosphate conditions. Science. 370 (6518), eaay4970(2020).
  15. Apelt, F., et al. Shoot and root single-cell sequencing reveals tissue- and daytime-specific transcriptome profiles. Plant Physiol. kiab537. , (2021).
  16. Kim, J. -Y., et al. Distinct identities of leaf phloem cells revealed by single-cell transcriptomics. Plant Cell. 33 (3), 511-530 (2021).
  17. Zhang, T. -Q., Chen, Y., Wang, J. -W. A single-cell analysis of the Arabidopsis vegetative shoot apex. Developmental Cell. 56 (7), 1056-1074.e8 (2021).
  18. Shahan, R., et al. A single-cell Arabidopsis root atlas reveals developmental trajectories in wild-type and cell identity mutants. Dev Cell. 57 (4), 543-560.e9 (2022).
  19. Birnbaum, K., et al. A gene expression map of the Arabidopsis root. Science. 302 (5652), 1956-1960 (2003).
  20. Aghdasi, M., Smeekens, S., Schluepman, H. Microarray analysis of gene expression patterns in Arabidopsis seedlings under trehalose, sucrose and sorbitol treatment. Int J Plant Prod. 2 (4), 309-320 (2008).
  21. Nakayama, Y., Kusano, M., Kobayashi, M., Manabe, R., Watanabe, M. Catabolic reprogramming of Brassica rapa leaf mesophyll protoplasts during the isolation procedure. Plant Growth Regul. 99 (2), 337-357 (2023).
  22. Grgac, R., Rozsypal, J., Des Marteaux, L., Štětina, T., Koštál, V. Stabilization of insect cell membranes and soluble enzymes by accumulated cryoprotectants during freezing stress. Proc Natl Acad Sci USA. 119 (41), e2211744119(2022).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Analyse van individuele cellenArabidopsis thalianasingle cell RNA seqweefselspecifieke isolatieenzymatische digestiecelviabiliteitflowcytometriegenexpressieanalyseplantencelsuspensie

Gerelateerde artikelen