Monitoring van 2,4-dichlorfenoxyazijnzuur in bijenproducten door middel van vaste oppervlaktefluorescentie

Summary

Dit werk stelt de ontwikkeling voor van een nieuwe alternatieve methodologie voor traditionele technieken voor de controle en monitoring van 2,4-dichloorfenoxycarbonzuur in bijenproductmonsters uit centraal en noordelijk Argentinië.

Abstract

De gezondheid van bijen is essentieel voor honingproductie en bestuiving van gewassen. De honingproductie kan negatief worden beïnvloed door het gebruik van herbiciden, omdat bijen bij het verzamelen van nectar en stuifmeel van behandelde planten in contact kunnen komen met deze chemicaliën, wat kan leiden tot honingbesmetting met deze giftige residuen. Hoewel 2,4-dichlorofenoxyazijnzuur (2,4-D) is ontworpen om breedbladige onkruiden te bestrijden, kan het bloemen bereiken en de productie van bijen besmetten, wat mogelijk de gezondheid en levenskwaliteit van bijen beïnvloedt. Om deze redenen is het belangrijk om honing periodiek te analyseren om de aanwezigheid van herbicideresiduen te detecteren en, indien nodig, corrigerende maatregelen te nemen. Dit werk stelt de ontwikkeling voor van een nieuwe alternatieve methodologie voor traditionele technieken voor de controle en monitoring van 2,4-D in bijenproductmonsters uit centraal en noordelijk Argentinië. Monsters werden geconditioneerd bij pH = 7,0 in aanwezigheid van het anionische oppervlakteactieve stof natriumdodecylsulfaat (SDS), waarbij de systemen werden gefilterd door blauwbandfilterpapier als vaste steun voordat ze werden bepaald door vaste-fase fluorescentie. Onder optimale werkomstandigheden werden detectie- en kwantificatielimieten van respectievelijk 0,33 ng/L en 0,90 ng/L, en een lineariteitsbereik van 0,90 x 10³ ng/L tot 1,13 x 10³ ng/L bereikt. Tot de voordelen van de nieuwe methode behoren het gebruik van goedkope instrumenten en milieuvriendelijke oplosmiddelen, lage afvalproductie en daardoor het waarborgen van enkele principes van groene chemie.

Introduction

De gezondheid van bijen is essentieel voor honingproductie en bestuiving van gewassen. Een gezonde kolonie is afhankelijk van een uitgebreid gezondheidsbeheer dat goede voeding, hygiënemaatregelen en ziektepreventie en behandeling omvat. Honingproductie, mits verantwoord uitgevoerd, schaadt de bijen niet, aangezien imkers slechts een klein deel van de totale honing winnen, waardoor er^reserves overblijven voor de kolonie ^1,2.

De honingproductie kan negatief worden beïnvloed door het gebruik van herbiciden, omdat bijen bij het verzamelen van nectar en stuifmeel in contact kunnen komen met deze chemicaliën, wat kan leiden tot honingbesmetting met pesticidenresiduen. Bovendien kunnen sommige herbiciden, zoals glyfosaat, de ontwikkeling en het gedrag van bijen direct beïnvloeden, waardoor hun foerageervermogen en fysiologische^ontwikkeling afnemen^. Hoewel een herbicide 2,4-dichlorfenoxyazijnzuur (2,4-D) is ontworpen om breedbladige onkruiden te bestrijden, kan het bloemen bereiken en honing besmetten, wat mogelijk de gezondheid van bijen en de honingkwaliteit^kan beïnvloeden ^7,8,9.

De binnenlandse en internationale handel in honing en andere bijenproducten heeft de afgelopen jaren een aanzienlijke en aanhoudende groei laten zien, wat blijkt uit de verhoogde productie^{van 10, 11 en 12}. Volgens gegevens van de Voedsel- en Landbouworganisatie van de Verenigde Naties (FAO) zijn er vijf grote honingproducerende landen ter wereld: China, Argentinië, Turkije, de Verenigde Staten en¹³ Oekraïne. De productie van imkeren is van groot belang in Argentinië en groeit voortdurend door de exportmarktkansen die de afgelopen jaren zijn ontstaan. De milieuomstandigheden van Argentinië (klimaat, flora, enz.) en de technologie die in productie wordt geïnvesteerd, hebben het land in staat gesteld zich wereldwijd in een belangrijke positie te positioneren. Aan de andere kant vormt de aanwezigheid van xenobiotica een punt van zorg en vereist toezicht, net als in andere landen, omdat het zowel de verkoop van honing als de gezondheid van consumenten beïnvloedt door de toxische effecten ^14,15.

2,4-D is een veelgebruikt, selectief systemisch herbicide dat breedbladige onkruiden effectief bestrijdt door als synthetische auxine te werken, wat hun ongecontroleerde groei en dood veroorzaakt. Het wordt gebruikt in de landbouw, tuinbouw en bosbouw, en is vooral nuttig voor het bestrijden van onkruid in gewassen zoals tarwe, maïs en rijst, omdat het geen kwaad doet voor gras of granen^. 2,4-D kan ook worden gebruikt als groeiregulator voor planten en is verkrijgbaar in verschillende formuleringen, waaronder amine- en esterzouten, om aan diverse toepassingen te voldoen. De functies van 2,4-D worden beïnvloed door de toegediende dosis en de vatbaarheid van bepaalde soorten en weefseltypen ^17,18. Zo is 2,4-D contact in verband gebracht met nadelige voortplantingsuitkomsten en significante genetische veranderingen bij muizen, wat wijst op een opvallend genotoxisch effect¹⁹.

Honingbijen, als belangrijke bestuivers en modelorganismen voor het bestuderen van eusocialiteit, leren en geheugen, zijn zeer kwetsbaar voor directe vergiftiging door agrochemicaliën die in velden^{worden gebruikt 20}. Luchttoepassing van herbiciden en insecticiden tijdens bloei kan leiden tot aanzienlijke sterfte onder honingbijen en de honingproductie drastisch verminderen. Pesticidemengsels kunnen, zelfs bij subdotale doses, foerageerbijen desoriënteren, hun geheugen aantasten en de foerageerefficiëntie verminderen. Dit verzwakt op zijn beurt kolonies door de verzameling van stuifmeel en nectar te verminderen, wat leidt tot voedingstekorten. Daarnaast is 2,4-D aangetroffen in honingmonsters, en besmet stuifmeel en nectar kunnen worden verspreid onder de bijengenoten²¹.

Het is belangrijk om honing periodiek te analyseren op de aanwezigheid van herbicideresiduen en, indien nodig, corrigerende maatregelen te nemen. Voor de detectie en kwantificering van voedselverontreinigingen zoals herbiciden, in dit specifieke geval 2,4-D, zijn de meest gebruikte instrumentele methoden chromatografie, namelijk high-performance vloeistofchromatografie (HPLC), vloeistofchromatografie tandem massaspectrometrie (LC-MS/MS) en gaschromatografie tandem massaspectrometrie (GC-MS/MS) 22,23,24,25,26. Onderzoekers presenteren echter periodiek nieuwe monitoringsmethoden voor 2,4-D die voordelen bieden ten opzichte van conventionele kwantificatiemethoden 27,28,29, bijvoorbeeld: het gebruik van goedkopere instrumenten, operationele eenvoud, het gebruik van minder oplosmiddelen, toepassing op complexere monsters en andere.

Vaste-fase fluorescentie is een veelzijdige techniek die, door moleculaire fluorescentie te combineren met vaste-fase extractiemethoden, de al hoge gevoeligheid van fluorescentieinstrumentatie versterkt. Het verbetert ook het lineariteitsbereik en de selectiviteit door matrixeffecten te verminderen of te elimineren^30,31.

In dit onderzoek wordt een nieuwe analytische methodologie voorgesteld voor het monitoren en kwantificeren van 2,4-D en toegepast op honing en andere bijenmonsters uit centraal en noordelijk Argentinië. De monsters bevatten onbekende hoeveelheden 2,4-D. Wat bekend is, zijn de concentraties van de supertoegevoegde niveaus, die de concentratie zijn die door het monster wordt geleverd plus de toegevoegde concentratie 2,4-D. Deze laatste waarde is bekend en stelt ons in staat het herstel te berekenen. De nieuwe methodologie is gebaseerd op de directe bepaling van het analyt met behulp van vaste fase fluorescentie, wat meerdere voordelen aantoont op het gebied van instrumentatiebesparing, lagere operationele kosten en verhoogde milieubescherming.

Protocol

Dit manuscript bevat geen studies met menselijke deelnemers of dieren uitgevoerd door een van de auteurs.

Gebruikte apparatuur
Spectrofluorimetrische metingen werden uitgevoerd met een pc-gebaseerde spectrofluorometer uitgerust met een 150 W xenonlamp. Een monsterhouder werd gebruikt voor metingen van solide oppervlaktefluorescentie (SSF). De parameters die werden gebruikt voor de kwantificatie van 2,4-D waren als volgt: λ_em = 580 nm, met λ_ext= 555 nm (Spleet 3-3), met een vaste monsterhouder.

Bemonstering en monsterbehandeling
Deze studie naar de productie van honingmonsters die in 2025 zijn geproduceerd, is uitgevoerd in de provincies San Luis, San Juan, Jujuy en Salta in de noord-centrale regio van Argentinië. De geanalyseerde monsters waren: vier multibloemige honingen, twee propolishoningen, pure honingsnoepjes en snoepjes gemaakt van een mengsel van honing, coca en propolis, gekocht bij imkers in de regio. De bestudeerde honingen waren vers, binnen minder dan een week na productie uit de kasten gehaald, om mogelijke afbraak van 2,4-D door verschillende mechanismen te voorkomen. Alle monsters werden verzameld in nieuwe, steriele vaten en onmiddellijk naar het laboratorium gebracht. Ze werden opgeslagen bij 4-8 °C in een donkere plek tot analyse. De massieve karamel werd gehomogeniseerd met een vijzel en stamper; de inhoud werd verdund in 5 mL ultrazuiver water, en 0,5 μL werd uit die oplossing gewonnen.

Methodologie
Aliquot van 0,5 μL of 1 μL van 2,4-D (1,23 ng/L en 3,49 ng/L), 100 μL monster, 250 μL SDS (1 x ^10-4 mol/L) en 100 μL fosfaatbuffer (1 x ^10-4 mol/L, pH=7) werden toegevoegd, en het mengvolume werd tot 3 mL gebracht door dubbel gedestilleerd water toe te voegen. Het mengsel werd gefilterd door de vaste steun (papierfilter; zie Materiaaltabel voor details). Vaste steunen werden gedroogd bij kamertemperatuur, waarna vaste oppervlaktefluorescentie (SSF) werd gemeten op λ_em = 580 nm, met λ_ext= 555 nm (Spleten 3-3) met een vaste monsterhouder.

Bovenstaande beschrijft de algemene procedure van de ontwikkelde methodologie, waarbij elke parameter werd bestudeerd en geoptimaliseerd, zoals getoond in de sectie Resultaten.

Effect van pH en buffer
pH-optimalisatie werd uitgevoerd door de systemen aan te passen aan de onderzochte pH met gebruik van zoutzuur of natriumhydroxide om ze op de vereiste waarde te brengen (bereik getest pH 5-7). Vervolgens werd, zodra het meest geschikte pH-bereik was verkregen om een geschikt analytisch signaal te bereiken, de te gebruiken buffer gekozen.

De geteste buffers waren fosfaat, Tris en borax, die werden bereid bij een concentratie van 1 x ^10-4 mol/L. Hun volume werd gevarieerd om het beste fluorescentieintensiteitssignaal te verkrijgen. De resultaten voor het enige bufferfosfaat dat de fluorescentieintensiteit verbeterde, worden getoond, samen met de respectievelijke optimale concentratie. Hier was de geselecteerde buffer fosfaat, en de pH = 7.

Oppervlakteactieve concentratie
Het gebruik van verschillende oppervlakteactieve stoffen in moleculaire fluorescentie biedt voordelen die de bepaling van de bestudeerde analyt verbeteren. Micellaire media worden gebruikt om intermoleculaire interacties tussen de analyte en de componenten van de monstermatrix te minimaliseren. Bovendien kunnen de fotofysische eigenschappen van fluorescerende opgeloste stoffen in het micellaire medium worden aangepast, waardoor de fluorescentiegevoeligheid verbetert. Het effect van verschillende oppervlakteactieve stoffen (SDS en HTAB) op de kwantificering van 2,4-D met behulp van vaste oppervlaktefluorescentie (SSF) werd bestudeerd. Er werd vastgesteld dat het anionische tensidant SDS, bij een concentratie van 8,3 x 10⁻⁶ mol/L, de fluorescentieintensiteit van het onderzochte herbicide verhoogde.

Solide ondersteuning
Aangezien de vlakke configuratie energetisch wordt geprefereerd in de aangeslagen fluorescentietoestand, werd het vasthouden van het herbicide op vaste steunen onderzocht. De systemen werden gefilterd door verschillende soorten membranen, waaronder nylon, celluloseacetaat, gemengde esters en Blue-Ribbon filterpapier. De gefilterde oplossingen werden verzameld in aparte, schone containers en de membranen werden bij kamertemperatuur gedroogd. Vervolgens werden de membranen in een vaste monsterhouder geplaatst en werd vaste-fase fluorescentie (SSF) geregistreerd. Voldoende en selectief behoud werd waargenomen op filterpapier, dus deze steun werd geselecteerd voor de vaste-fase fluorescentiebepaling. De gefilterde oplossingen werden ook geanalyseerd door moleculaire fluorescentie. De afwezigheid van het 2,4-D-complex was duidelijk, wat de vasthoudende herbicide op het filterpapier aantoonde.

Herstelstudie
2,4-D werd toegevoegd aan een passend volume van elk bestudeerd monster (0,5 μL werd gebruikt voor de honingmonsters en 1 μL voor de andere geanalyseerde monsters), waarbij de concentratie geleidelijk toenam tot 1,23 ng/L en 3,49 ng/L. De analytenconcentraties werden bepaald met behulp van de methodologie, als het gemiddelde van zes replicaten (n = 6).

Precisiestudie
Methodeherhaalbaarheid en intradagprecisie werden bestudeerd door herhaald testen van monsters (n = 6) met 1,23 ng/L en 3,49 ng/L van 2,4-D en het bepalen van de analytische inhoud met behulp van de methodologie. Daarnaast werd de reproduceerbaarheid van inter-day precisie over 7 dagen geëvalueerd voor dezelfde systemen.

Interferentiestudie
Verschillende hoeveelheden gemeenschappelijke ionen werden toegevoegd aan de testoplossing met 3,49 ng/L van 2,4-D, en de methodologie werd toegepast. De volgende potentiële interferenties werden getest:

Concentratie van interferentie/2,4-D molverhouding = 1000:1:00 voor Na⁺, K⁺, Cl^-, Fe³⁺, Cu²⁺, Cd²⁺, Sb³⁺, Mn²⁺, As³⁺, CO^{3 2-}, SO₄^2-, Ca²⁺, Mg²⁺, NO^3-, Ni²⁺, fructose, glucose, sucrose, maltose, 2,4,5-T, sulfometuron-methyl, glyfosaat en atrazine.

Concentratie van interferentie/2,4-D molverhouding = 500:1:00 voor Zn²⁺, Co²⁺, Al³⁺, chloorsulfuron, bensulfuron-methyl en triasulfuron.

Berekening van analytische kwaliteitsparameters
De analytische kwaliteitsparameters zijn de detectiegrens (LOD) en de kwantificatiegrens (LOQ). Deze werden berekend door de volgende stappen toe te passen. De achtergrondruis werd gemeten door de respons van 15 lege samples (samples zonder de analyte) te meten om een dataset van achtergrondruis te verkrijgen. De standaarddeviatie van het geluid werd berekend. Dit wordt geaccepteerd als een LOD-waarde. De detectielimieten zijn gebaseerd op 3,3 keer de standaardafwijkingen van de leegte (N = 15). De kwantificatielimieten zijn gebaseerd op 10x de standaarddeviaties van de blanco (N = 15).

Results

De hieronder gepresenteerde resultaten geven aan hoe de studie van elk van de variabelen die de algemene procedure beïnvloeden, de optimalisatie en de optimale werkomstandigheden die werden bereikt, stap voor stap werd aangepakt.

2,4-D spectrum karakterisering
2,4-D karakterisering werd uitgevoerd met UV-Vis spectroscopie en moleculaire fluorescentie, waarbij fluorescentieintensiteitsmaxima werden waargenomen bij λ_em = 580 nm, me...

Discussion

Het intensieve gebruik van herbiciden is exponentieel toegenomen in Argentinië en de rest van de wereld vanwege de noodzaak om te voldoen aan de voedselvraag van een groeiende bevolking. Als het gebruik van dergelijke producten op de juiste manier, rationeel en periodiek wordt gemonitord, zou dit de verwachte voordelen niet aantasten of negatieve effecten op het milieu als geheel hebben. 2,4-D wordt wereldwijd veel gebruikt, en veel studies hebben aangetoond dat dit herbicide verandering...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,4-D	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	49083
Acetic acid/acetate	Mallinckrodt Chemical Works
Blue Ribbon filter papers	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	WHA1001929	2-5 μm pore size en 12,5 cm diameter
Cellulose acetate membrane	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA		0,45 μm pore size en 47 mm
Hexadecyltrimethylammonium bromide (HTAB)	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	H5882
hydrochloric acid	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	1.09063
Immobilon (+) membranes	Millipore, Sao Paulo, Brazil	HATF04700	0,45 μm pore size en 47 mm
Mixed esters membranes	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA		0,45 μm pore size en 47 mm
Nylon membranes	Millipore, Sao Paulo, Brazil	Z290793	0,45 μm pore size en 47 mm diameter
pHmeter (Orion Expandable Ion Analyzer, )	Orion Research, Cambridge, MA, USA	Model EA 94.
Potassium dihydrophosphate	Biopack, Buenos Aires, Argentina	2000168900
Potassium phthalate acid	Merk &Co., Inc
Sodium Dodecyl Sulfate	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	11667289001
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	S2770
Sodium tetraborate	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	221732
Spectrofluorimetric	Shimadzu	RF-5301	uitgerust met een 150 W Xenon lamp en 1,00 cm kwarts cellen
Tris-(hydroxymethyl)-aminomethane	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	77-86-1