Method Article

Visualisatie van ruimtelijke temporele dynamiek van somatosensorische cortexneuronen tijdens elektroacupunctuur met behulp van twee-foton in vivo beeldvorming

DOI:

10.3791/69340

⸱

January 16th, 2026

 ,  ,  , 
1Traditional Chinese Medicine, School of Medicine, Acupuncture Research Institute, Jianghan University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol integreert craniale vensters in Thy1-GCaMP6f transgene muizen, gestandaardiseerde elektroacupunctuur en twee-fotonbeeldvorming om millisecondeschaal corticale ensembledynamiek tijdens stimulatie te visualiseren, waardoor laagspecifieke plasticiteit wordt onthuld.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol stelt een uitgebreid experimenteel kader vast voor het onderzoeken van corticale circuitdynamiek tijdens EA (elektroacupunctuur) stimulatie. De methodologie integreert drie belangrijke componenten: chronische craniële vensterimplantatie bij Thy1-GCaMP6f transgene muizen, gestandaardiseerde EA-stimulatie bij het ST36-acupointuur met 2/100 Hz bifasische pulsen, en hoogresolutie twee-foton calciumbeeldvorming. Deze geïntegreerde benadering maakt realtime visualisatie van neurale ensemble-activiteit in de primaire somatosensorische (S1) cortex mogelijk met milliseconden-temporele precisie, waarbij voorheen ontoegankelijke details van netwerkniveau-reacties op neuromodulatie worden vastgelegd. De techniek onthult met succes duidelijke laagspecifieke activatiepatronen en longitudinale plasticiteitsveranderingen, wat cruciale inzichten biedt in de corticale mechanismen die ten grondslag liggen aan de effecten van EA. Door de fundamentele ruimtelijke beperkingen te overwinnen die inherent zijn aan conventionele fMRI- en elektrofysiologische technieken, biedt dit hoogresolutieplatform ongekende analytische mogelijkheden voor het in kaart brengen van dynamische neurale circuits. Het robuuste ontwerp en reproduceerbare resultaten van het protocol maken het bijzonder waardevol voor het optimaliseren van gerichte neuromodulatietherapieën en het vergroten van ons begrip van plasticiteit op circuitniveau als reactie op perifere stimulatie.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Elektroacupunctuur, een moderne aanpassing van traditionele acupunctuur waarbij gecontroleerde elektrische stromen worden toegepast via naalden bij specifieke acupunten, wordt erkend als het moduleren van neurale circuits die betrokken zijn bij pijnbehandeling, motorische controle en autonome functies. Men denkt dat de effecten complexe signaalcascades omvatten die worden geïnitieerd door perifere sensorische zenuwactivatie (voornamelijk Aδ- en C-vezels), wat leidt tot de afgifte van neurotransmitters (bijv. opioïden, serotonine, GABA) en daaropvolgende modulatie op wervelkolom-, hersenstam- en corticale niveaus 1,2. Belangrijke betrokken structuren zijn onder andere somatosensorische cortices. Binnen de S1-cortex, die tactiele en nociceptieve informatie verwerkt, beïnvloedt EA waarschijnlijk zowel lokale remmende-exciterende evenwichten als langeafstandsconnectiviteit 3,4. De precieze temporele sequentie van activatie/inhibitie tussen verschillende neuronale populaties (bijv. piramideneuronen, interneuronen) en lagen binnen S1 tijdens en direct na EA-stimulatie blijft echter grotendeels onbekend vanwege de eerder genoemde methodologische beperkingen 5,6. Het begrijpen van deze real-time dynamiek is cruciaal voor het optimaliseren van EA-parameters en het voorspellen van therapeutische uitkomsten.

Traditionele methoden voor het onderzoeken van de neuromodulerende effecten van EA (elektroacupunctuur) op corticale circuits, zoals gedragsstudies en post-mortem analyses, bieden waardevolle inzichten, maar kunnen geen realtime neurale activiteit vastleggen met een hoge ruimtelijke resolutie 7,8. Om deze beperkingen te overwinnen, komt in vivo twee-foton calciumbeeldvorming naar voren als een krachtig alternatief, waardoor directe visualisatie van neurale ensembledynamiek tijdens stimulatie 8,9 mogelijk is. Deze techniek biedt ongeëvenaarde voordelen voor chronische longitudinale studies, waardoor onderzoekers met cellulaire resolutie de snelle en verspreide activiteit over corticale lagen bij wakkere, gedragende dieren kunnen observeren. In tegenstelling tot acute elektrofysiologie, die een hoge temporele resolutie maar beperkte ruimtelijke dekking biedt, faciliteert tweefotonenbeeldvorming grootschalige monitoring van honderden tot duizenden neuronen gelijktijdig binnen een gedefinieerd gezichtsveld 9,10. Bovendien levert twee-foton calciumbeeldvorming in vergelijking met functionele magnetische resonantiebeeldvorming (fMRI), die uitblinkt in dekking van de hele hersenen maar werkt op langzamere temporele schalen en geen cellulaire specificiteit heeft, een fijnmazige detectie van activiteit uit specifieke neuronale populaties op een tijdschaal die relevant is voor synaptische en circuitniveauprocessen11,12. Daardoor is twee-fotonbeeldvorming uniek gepositioneerd om een cruciale kloof te overbruggen in ons begrip van hoe perifere EA-stimuli worden vertaald naar ruimtelijk temporeel precieze corticale activatiepatronen, met name in gebieden zoals de primaire somatosensorische cortex (S1). Als het primaire knooppunt voor somatosensorische verwerking (inclusief signalen van acupunten), en aangezien EA zijn activiteit robuust moduleert, vormt S1 een strategische toegangspoort voor het bestuderen van corticale circuitdynamiek geïnduceerd door elektroacupunctuur.

Tweefotonlaserscanning microscopie (2PLSM) gecombineerd met genetisch gecodeerde calciumindicatoren (GECI's), zoals GCaMP6, is een revolutionair hulpmiddel voor de neurowetenschap. Het maakt chronische, hoogresolutiebeeldvorming van neurale activiteit in vivo mogelijk met cellulaire en subcellulaire specificiteit13. GECI's fluoresceren in verhouding tot intracellulaire calciumtransienten en dienen als een betrouwbare proxy voor neuronale vuurkracht14. Cruciaal is dat het gebruik van nabij-infrarood excitatielicht in 2PLSM superieure dieptepenetratie (honderden micron) biedt vergeleken met conventionele microscopie, waardoor activiteit in oppervlakkige en zelfs diepere corticale lagen (bijv. L2/3, L4, L5) kan worden gevisualiseerd. De inherente optische doorsnede minimaliseert onscherpe fluorescentie en fotoschade, waardoor het ideaal is voor longitudinale studies over weken of maanden15, 16, 17. Deze technologie vertegenwoordigt een revolutionaire vooruitgang in EA-onderzoek, met het potentieel om ons begrip ervan fundamenteel te transformeren, en biedt het potentieel om de millisecondenschaal dynamiek van honderden tot duizenden individuele neuronen gelijktijdig binnen een bepaald corticaal volume tijdens stimulatie te volgen.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle experimenten maakten gebruik van 8-12 weken oude transgene Thy1-GCaMP6f muizenvan 18 jaar. Alle experimentele procedures en dierenverzorgingsprotocollen werden uitgevoerd in overeenstemming met de National Institutes of Health (NIH) Guide for the Care and Use of Laboratory Animals en werden goedgekeurd door het Huazhong University of Science and Technology Animal Care and Use Committee (IACUC; Protocolgoedkeuringsnummer: 3603). Er werd alles aan gedaan om het aantal gebruikte dieren en hun lijden te minimaliseren. Een schema van de experimentele opstelling is weergegeven in Figuur 1.

1. Chronische craniële vensterimplantatie

  1. Anesthesie-inductie en stereotaxische stabilisatie
    1. Start de narcose door de 8-12 weken oude Thy1-GCaMP6f-muis in een inductiekamer te plaatsen die wordt voorzien van 4-5% isofluraan (vol/vol) in 100% medische zuurstof met een debiet van 1 L/min.
    2. Bij verlies van de rechtstaande reflex (meestal binnen 2-3 minuten) plaats je het dier in een thermostatisch geregelde verwarmingsmat (gehouden op 37 °C) geïntegreerd in een digitaal stereotaxisch frame.
    3. Zet de muis vast met een neuskegel die 1,5-2,0% isofluraan levert voor chirurgisch onderhoud. Breng oogzalf (bijv. Puralube Vet Salf) aan op beide ogen om uitdroging van het hoornvlies te voorkomen.
    4. Breng niet-traumatische oorspijlen voorzichtig in de externe gehoormeatus, zodat je symmetrisch positioneert zonder overmatige druk die weefselschade of trommelvliesscheuren kan veroorzaken19.
    5. Zet het maxillaire gehemelte vast met de neusklem, zodat luchtwegobstructie wordt voorkomen.
    6. Bevestig diepe verdoving door het ontbreken van de terugtrekkingsreflex van het pedaal, tot een stevige teenknijp en een stabiele, trage ademhalingsfrequentie (80-120 ademhalingen/min). Houd de kerntemperatuur van je lichaam continu bij via een rectale sonde en pas het verwarmingskussen daarop aan.
    7. Geef subcutane (s.c.) preventieve analgesie (bijv. Carprofen, 5 mg/kg) en vochtondersteuning (steriele zoutoplossing, 0,5-1 mL s.c.). Controleer stabiele fysiologische parameters (SpO₂ > 95%, ademhalingsregelmatigheid) gedurende de hele opstelling.
  2. Chirurgische blootstelling van de schedel
    1. Scheer de dorsale hoofdhuid zorgvuldig met een elektrische knipper, gevolgd door het aanbrengen van een chemische onthaaringscrème voor volledige ontharing. Spoel grondig af met steriele zoutoplossing.
    2. Voer sequentiële antisepsis uit: Schrob de blootgestelde huid drie keer, afwisselend povidonjodium (10%) en 70% isopropylalcohol-swabs, en eindig met een oplossing van chloorhexidine gluconaat (2%).
    3. Met steriele micro-dissectiescharen en fijne pincetten (Dumont #5) maakt u een sagittale incisie (~15-20 mm lang) door de huid en het onderliggende bindweefsel, beginnend ~2 mm achter de ogen en doorlopend tot de interparietale-occipitale overgang.
    4. Gebruik micro-hemostatische pincet of bipolaire cauterisatie (lage instelling) om capillaire bloeding langs de incisieranden te beheersen. Trek de huidflappen voorzichtig zijwaarts in met gebogen micro-retraktoren of 5-0 zijden hechtingen die aan de omliggende draperie zijn bevestigd.
    5. Ontbloot het gehele dorsale calvarium, inclusief frontale, pariëtale en interpariëtale botten. Met een microcurette (#00) schraapt je zorgvuldig het periost weg – een vezelig vaatmembraan dat aan het botoppervlak hecht – onder hoge vergroting (chirurgische microscoop).
    6. Breng zachte, tangentiële strelingen toe om te voorkomen dat de schedel wordt beschadigd of hechtingen beschadigd raakt (bregma, lambda, sagittal, coronal). Bereik een glad, avasculair botoppervlak dat essentieel is voor een nauwkeurige craniotomie en daaropvolgende hechting.
    7. Spoel het veld regelmatig met steriele, warme (37 °C) 0,9% zoutoplossing om botstof te verwijderen en de hydratatie van het weefsel te behouden.
  3. Stereotaxische targeting van het S1-achterpootgebied
    1. Met behulp van een hoogprecisie stereotaxische manipulatorarm plaatst u de punt van een fijne chirurgische markerpen of microboorbit direct boven het anatomische referentiepunt bregma (het snijpunt van de coronale en sagittale hechtingen). Bevestig coördinaten onder microscoopvisualisatie (10x).
    2. Stel de manipulator zo in dat de marker precies anteroposterior (AP) -1,5 mm (achter bregma) en mediolateraal (ML) +2,0 mm (rechterhersenhelft) ten opzichte van de middenlijn (sagittale hechting) wordt verplaatst.
      OPMERKING: Deze locatie komt overeen met het primaire somatosensorische cortex (S1) achterpootrepresentatiegebied (S1HL).
    3. Graven licht een klein kruiskruis (<0,5 mm) op het blootgestelde pariëtale botoppervlak op deze coördinat, zodat je zichtbaar bent zonder het bot te doorboren.
    4. Controleer de afwezigheid van een grote oppervlaktevaatuur die de gemarkeerde locatie doorkruist; als er significante vaten aanwezig zijn, pas ML-coördinaten minimaal aan (±0,1-0,2 mm) om ze te vermijden, aangezien durale vaten hevig kunnen bloeden bij doorbraak en de optische helderheid belemmeren.
    5. Documenteer de laatste aangepaste coördinaten.
  4. Precieze uitvoering van een craniotomie
    1. Centreer een steriele, wegwerpbiopsiepunch van 3 mm diameter precies boven de gemarkeerde S1HL-coördinaat. Oefen stevige, constante neerwaartse druk uit terwijl je de punch zachtjes draait om de buitenste corticale botlaag volledig rond de omtrek te snijden. Verwijder de punch.
    2. Met een hogesnelheids microchirurgische boor (bijvoorbeeld met 0,5-0,8 mm carbid braaksel) bevestigd aan een stereotaxische arm onder constante 0,9% zoutwaterspoeling (koeling en verwijdering van vuil), wordt het bot binnen de gescoord cirkel zorgvuldig verdund.
    3. Boor in korte bursts met een lichte, tangentiële freesbeweging, waarbij je systematisch van de periferie naar het midden beweegt. Houd bottranslucentie nauwlettend in de gaten onder vergroting.
    4. Stop onmiddellijk met boren zodra je een subtiel "blozende" uitstraling van de onderliggende dura mater waarneemt, wat wijst op minimale botdikte (<50 μm). Schakel over op fijne micropincetten (Dumont #5/45) en microscharen om de resterende dunne botfragmenten zorgvuldig op te tillen en te verwijderen, terwijl je radiaal naar buiten werkt vanaf het midden.
    5. Behoud de dura mater intact - zorg dat deze doorschijnend en glanzend lijkt zonder scheuren of aanzienlijke bloedingen. Beheers elke lichte durale bloeding onmiddellijk door zachte druk uit te oefenen met een steriele, gecomprimeerde schuim pledget die is doordrenkt met 0,9% zoutoplossing of trombine.
    6. Spoel de blootgestelde dura royaal royaal met warm, steriel kunstmatig hersenvocht (aCSF) of 0,9% zoutoplossing om alle botresten te verwijderen. Vermijd uitdroging17,20.
  5. Chronische schedelraamimplantatie en fixatie op de head-bar
    1. Bereid een steriele glazen deklaag van 3 mm diameter en een dikte van #1 (ca. 150 μm) voor. Bedek optioneel het binnenoppervlak met een dunne laag siliconenelastomeer voor optische helderheid en verminderde hechting.
    2. Plaats de deklaag precies boven de craniotomie met fijne pincetten. Bereid een snel uithardende, licht uitgehardde tandcement voor (bijv. Metabond of Charisma) volgens de instructies van de fabrikant.
    3. Werk snel (<90 seconden werktijd) en breng een dun laagje cement aan rond de omtrek van de dekmantel, direct op het droge, schone schedeloppervlak. Zorg ervoor dat het cement de afdekkingsrand volledig afdicht, maar niet onder de dura doortrekt.
    4. Hard het cement direct uit met een tandheelkundig uithardingslicht (blauw licht, 450 nm) gedurende 20-30 seconden per kwadrant. Versterk de afdichting met meerdere lagen langzamer uithardende, 5 mL zelfuithardende acryl tandcement (bijv. Jet Repair Acrylic of Paladur), en bouw een robuuste, laagprofiel (<2 mm hoogte) cementkap die enkele millimeters voorbij de kraniotomie-rand uitsteekt op de omliggende schedel.
    5. Inbed een lichtgewicht, op maat gemaakte roestvrijstalen of titanium kopbalk (bijvoorbeeld 15-20 mm lang met centrale opening) in de cementkap tijdens de initiële uithardingsfase.
    6. Zorg ervoor dat de kopstaaf parallel aan de sagittale hechting is geplaatst en gecentreerd boven het raam, zodat stijve, gebalanceerde fixatiepunten ontstaan voor toekomstige hoofdsteun onder de microscoop zonder optische toegang te belemmeren.
    7. Laat het cement volledig uitharden (≥15 min). Controleer volledige hemostase en vensterhelderheid21.
  6. Postoperatief herstel en monitoring
    1. Na het uitharden van cement maak je de muis voorzichtig los van de oorbenen en neusklem. Stop met isoflurane en geef 100% zuurstof totdat de spontane ademhaling volledig is hersteld.
    2. Dien buprenorfine HCl (0,05-0,1 mg/kg s.c.) direct na de operatie toe voor pijnstiller. Breng het dier over in een voorverwarmde (30-32 °C), zuurstofaangevuld herstelkamer bekleed met schoon papieren beddengoed.
    3. Houd continu in de gaten totdat de stertale ligpositie en volledige loopbeweging zijn hersteld (meestal 30-60 minuten). Geef 24 uur na de operatie een tweede dosis carprofen (5 mg/kg s.c.). Bied verwarmde, gelakteerde Ringer's oplossing (1 ml s.c.) voor hydratatie indien nodig.
    4. Houd de muis afzonderlijk in een standaard kooi die is verrijkt met nesmateriaal om te voorkomen dat kooigenoten het hoofdimplantaat beschadigen. Handhaaf de omgevingsomstandigheden (22-24 °C, 40-60% luchtvochtigheid, 12:12 uur licht/donker cyclus) met ad libitum toegang tot voedsel en hydrogel.
    5. Houd de muis minstens twee keer per dag gedurende 7 dagen na de operatie in de gaten op tekenen van pijn/onrust (gebogen houding, pilo-erectie, verminderde activiteit, gewichtsverlies >15%), infectie (purulente afscheiding, zwelling, roodheid), neurologisch deficiëntie of losser worden van de hoofdbeugel.
    6. Stel een minimale herstelperiode van ≥7 dagen in voordat experimentele procedures (beeldvorming of EA) worden gestart om te zorgen voor het oplossen van acute chirurgische ontsteking, herstel van normaal gedrag en glymfatische clearance, en stabilisatie van de basiscorticale activiteit. Weeg het dier dagelijks om het herstelbij te houden.

2. Elektroacupunctuurstimulatie

  1. Nauwkeurige anatomische lokalisatie van ST36-acupointuur
    1. Richt je op het ST36 ("Zusanli") acupointuur, gebaseerd op vastgestelde anatomische herkenningspunten in de achterpoot van de muis. Voordat de naald wordt geplaatst, palpeer je het proximale voorste scheenbeen om de tibiale tuberositeit te identificeren – de opvallende botprominentie die zich net distaal bevindt van het kniegewricht waar het patellaire ligament zich inzet.
    2. Meet met fijne remklauwen of een steriele marker 2 mm lateraal (richting de fibula) en 2 mm caudaal (posterior) ten opzichte van het centrum van de tibiale tuberositeit. Deze locatie komt overeen met de buik van de buikspier tibialis, oppervlakkig ten opzichte van de diepe peroneale zenuwtak en proximaal van de bifurcatie van de arteria anterior tibia.
    3. Controleer indien nodig de afwezigheid van grote oppervlakkige bloedvaten op de locatie via transilluminatie.
      OPMERKING: Nauwkeurigheid is cruciaal, omdat lichte afwijkingen (>0,5 mm) de gestimuleerde neurale structuren en daaropvolgende corticale responsen in S1 aanzienlijk kunnen veranderen. Identificatie van monumenten moet consequent worden uitgevoerd door getraind personeel om de variabiliteit tussen operators te minimaliseren23,24.
      OPMERKING: Methoden om de stabiliteit van de naald te waarborgen zijn: (i) Na het inbrengen en fixeren van de naald wordt een aanpassingsperiode toegestaan zodat de muis kan acclimatiseren en het initiële worstelen kan verminderen. (ii) De trillingsfrequentie die door de elektroacupunctuurstimulator wordt gegenereerd (bijv. 2 Hz) is van nature laag in amplitude. Bovendien bezitten de fijne naalden die worden gebruikt (bijv. Φ0,16 mm) voldoende stijfheid om deze minimale trilling effectief te weerstaan. (iii) Gedurende het hele experiment houdt de operator continu de positie van de naaldpunt in de gaten. Proefgegevens worden uitgesloten als er significante verplaatsing door dierbeweging wordt waargenomen.
  2. Steriele naaldinvoegtechniek
    1. Na huiddesinfectie (afwisselend 70% ethanol en chloorhexidinescrub), steekt u een steriele, eenmalige roestvrijstalen acupunctuurnaald (nominale diameter: 0,18 mm, gelijk aan 36 gauge; lengte: 13 mm) loodrecht in de huid op de gemarkeerde ST36-coördinat.
    2. Beweeg de naald gestaag door de huid, het subcutane weefsel en in de onderliggende tibialis anterior spier met een soepele roterende beweging om weefseltrauma te minimaliseren.
      OPMERKING: De inzetdiepte van het doel is 3 mm vanaf het huidoppervlak. Deze diepte zorgt voor optimale betrokkenheid van type II/III spierafferenten (Aδ-vezels) en mogelijk somatische vezels met een kleine diameter zonder het risico te lopen contact te lopen met het onderliggende scheenbeen of diepe neurovasculaire bundels.
    3. Zet de naaldnaaf stevig vast met een klein steriel lijmkussentje of een speciaal clip om loskomen tijdens latere elektrische stimulatie en mogelijke subtiele bewegingen van ledematen te voorkomen.
    4. Controleer een stabiele plaatsing van de naald door een lichte, tijdelijke lokale spierfasciculatie te observeren bij het plaatsen - een fysiologische indicator van de juiste intramusculaire positionering.
    5. Handhaaf een strikte aseptische techniek gedurende de hele tijd om infectie te voorkomen, vooral bij chronische stimulatieparadigma's23.
  3. Elektroacupunctuurstimulatie, parametrisatie en afgifte
    1. Verbind het geïsoleerde handvat van de ingebrachte naald met het uitgangskanaal van de anode (+) van een programmeerbare elektroacupunctuurstimulator (bijv. HANS Acupoint Nerve Stimulator, model LH202).
    2. Plaats een referentiekathode (-) elektrode, meestal een kleine roestvrijstalen plaat of clip-elektrode bedekt met geleidende gel, op de ipsilaterale achterpoot (bijvoorbeeld plantaire oppervlak nabij de hiel).
    3. Zorg voor veilig contact en een lage impedantie (<5 kΩ) op beide locaties. Programmeer de stimulator om bifasische vierkante golfpulsen (gebalanceerde positieve/negatieve fasen) af te geven om elektrodepolarisatie en weefselschade te minimaliseren.
    4. Stel het stimulatieparadigma in op dichte-disperse modus: afwisselende bursts van 2 Hz (lage frequentie) voor 3 s, gevolgd door 100 Hz (hoge frequentie) voor 3 s.
      OPMERKING: Dit gecombineerde frequentiepatroon (vaak aangeduid als 2/100 Hz) is empirisch aangetoond dat het de afgifte van endogene opioïden (bijv. β-endorfine, enkephaline) en monoamine (bijv. serotonine, noradrenaline) in het CZS effectiever vergroot dan alleen enkele frequenties.
    5. Pas de huidige intensiteit geleidelijk aan vanaf 0,1 mA totdat er een milde, ritmische pootbeweging (buiging van vingers of enkel) visueel wordt waargenomen – meestal bereikt tussen 1,0 mA bij volwassen muizen onder lichte anesthesie. Deze twitch-drempel duidt op voldoende rekrutering van motorische efferenten en bijbehorende afferenten met een grote diameter (Aβ-vezels), wat fysiologische activatie bevestigt zonder stress of hevig worstelen te veroorzaken. Houd deze gekalibreerde intensiteit aan gedurende de 20 minuten durende stimulatiesessie25,26.
  4. Kritieke procedurele controles en fysiologische monitoring
    1. Stimulatie-artefactbeperking
      1. Fysiek scheid EA-kabels van beeldapparatuur/headstage.
      2. Voer robuuste aarding uit: Verbind de aardingsterminal van de stimulator met een speciale aarding en zorg ervoor dat het microscoopframe en het verwarmingskussen van het dier een gemeenschappelijk aardpunt delen.
      3. Synchroniseer stimulatiepulsen in de tijd met het blankingsignaal van de microscoop indien beschikbaar, of gebruik post-hoc signaalverwerking om resterende elektrische artefacten uit calciumsporen te verwijderen.
    2. Fysiologische stabiliteit
      1. Houd de kerntemperatuur van het lichaam continu in de gaten (gehandhaafd op 37,0 ± 0,5 °C via een door feedback gecontroleerde verwarmingskussen), ademhalingsfrequentie (80-120 ademhalingen/min) en SpO₂ (>95%) gedurende de 20-minuten durende EA-sessie.
      2. Houd lichte isoflurane anesthesie (1,0-1,5%) voor immobiliteit tijdens gecombineerde beeldvorming/stimulatie. Observeer voortdurend de opgewekte poottrekking; als deze afneemt of stopt, controleer dan het contact en de impedantie van de naald en pas de intensiteit licht aan (≤0,1 mA) om een consistente, milde motoractivatie te behouden.
      3. Stop onmiddellijk met stimulatie als er tekenen van stress optreden (bijv. tachypnoe, hevig worstelen).
    3. Reproduceerbaarheid
      1. Gebruik identiek naaldtype, inzetdiepte, stimulatormodel en kalibratiemethode (poot twitch-drempel) voor alle dieren en sessies. Documenteer de uiteindelijke stimulatie-intensiteit die voor elke proefpersoon wordt gebruikt.
      2. Geef minimaal 5 minuten na stimulatie een herstelperiode na stimulatie voordat de narcose wordt beëindigd of aanvullende procedures wordt uitgevoerd27,28.

3. Twee-fotonbeeldvorming tijdens EA

  1. Diervoorbereiding, kopfixatie en fysiologisch onderhoud
    1. Na ≥7 dagen herstel na de operatie, word de Thy1-GCaMP6f-muis met de geïmplanteerde hoofdbeugel vastgezet in een speciaal ontworpen, trillingdempend fixatieapparaat gemonteerd op een gemotoriseerd XY-stadium.
    2. Plaats het dier comfortabel op een wrijvingsarme, luchtgesmeerde cilindrische loopband, zodat de achterpoot onbelemmerd kan bewegen. Houd lichte chirurgische anesthesie door middel van een neuskegeltoediening van 0,5-0,8% isoflurane in 100% O₂. Dit verlaagde isofluraneniveau minimaliseert onderdrukking van neurale activiteit terwijl het zorgt voor onbeweeglijkheid die voldoende is voor beeldvorming met hoge resolutie.
    3. Monitor en registreer continu de kerntemperatuur (gehandhaafd op 37,0 ± 0,2 °C via een door feedback gecontroleerde warmtemat), ademhalingsfrequentie (100-140 ademhalingen/min) en perifere zuurstofsaturatie (SpO₂ > 95%).
    4. Breng oogheelgel aan om hoornvliesdrooging tijdens langdurige beeldvorming te voorkomen. Zorg ervoor dat het achterpoot ipsilateral van het S1HL craniale venster toegankelijk is voor EA-naaldinvoeging bij ST36.
    5. Houd 15-20 minuten voor fysiologische stabilisatie na hoofdfixatie voordat je met beeldvormingstart 29.
  2. Optische targeting en optimalisatie voor laag II/III-beeldvorming
    1. Bepaal precies het focale vlak om hoogwaardige neuronale signalen te ontvangen. Volg deze verificatieprocedure.
      1. Verlaag het laservermogen tot een laag niveau (meestal 10-20% van het beeldvormingsvermogen, bijvoorbeeld 5-10 mW) om onnodige fotobleaching en fotoschade tijdens de locatie van het vliegtuig te voorkomen.
      2. Met behulp van de Z-as aandrijving van de twee-fotonmicroscoop beweeg je het objectief langzaam in micronstappen. Begin bij het oppervlak van het schedelvenster en ga dieper het hersenweefsel in.
      3. In de live preview-modus identificeer je het brandpuntsvlak met behulp van deze visuele indicatoren zoals beschreven in stappen 3.2.1.4 en 3.2.1.5.
      4. Voor het juiste focale vlak op een neuronale somalaag: Bevestig dat de afbeelding heldere, heldere, gepuncteerde structuren (neuronale somata) rond of ovaal toont met een goed achtergrondcontrast. Zorg ervoor dat celgrenzen scherp zijn en een duidelijk "zout-en-peper" uiterlijk vertonen.
      5. Voor een verkeerd brandpuntsvlak: Als het beeld wazig of homogeen lijkt zonder goed gedefinieerde puntstructuren, herken dan dat de focus zich in een gebied zonder somata bevindt. Als grote, donkere, ongestructureerde vaatschaduwen zichtbaar zijn, identificeer dit dan als de bloedvatlaag.
    2. Verificatie van de geschikte fluorescentiebaseline
      1. Bevestig een gezonde en stabiele fluorescentiebaseline voordat je een experimentele stimulus toepast om een valide interpretatie van latere calciumsignalen (ΔF/F) te waarborgen. Voer stappen 3.2.2.2-3.2.2.4 uit.
      2. Stel het laservermogen aan op het formele beeldniveau (bijvoorbeeld 30-50 mW).
      3. Maak afbeeldingen voor een paar seconden in een snelle, laagresolutie previewmodus.
      4. Observeer de realtime weergegeven gemiddelde fluorescentieintensiteit (of monitor direct de beeldhelderheid). Controleer of het signaal stabiel blijft en geen tekenen van snelle fotobleaching vertoont voordat je doorgaat met experimentele gegevensverzameling.
    3. Centreer het beeldveld binnen het schedelraam.
      1. Breng ultrasone gel of gedestilleerd water aan tussen het objectief en de dekmantel voor de onderdompeling. Gebruik infrarood Dodt-gradiëntcontrast of epifluorescentieverlichting om oppervlaktevaaten te identificeren en het gezichtsveld (FOV) uit te lijnen om grote oppervlaktevaten (>20 μm diameter) te vermijden.
      2. Schakel over naar twee-foton excitatiemodus met een instelbare femtoseconde-gepulseerde Ti:Saffierlaser. Stel de excitatiegolflengte in op 920 nm - optimaal voor het exciteren van GCaMP6f (piek ~920 nm) terwijl groene autofluorescentie en fotoschade worden geminimaliseerd in vergelijking met kortere golflengten.
      3. Verhoog geleidelijk het laservermogen (meestal 20-50 mW gemeten bij het monster) terwijl je door de transparante dura naar het corticale oppervlak (pia mater) focust. Pas de Z-positie van het objectief aan met een piëzo-elektrisch nano-focusapparaat om een diepte van 200 ± 10 μm onder het piale oppervlak te bereiken, overeenkomend met corticale laag II/III.
      4. Bevestig diepte via karakteristieke neuronale dichtheid en morfologie: een dichte populatie van kleine tot middelgrote piramidale neuron-somaten (10-15 μm diameter) met zichtbare apicale dendrieten.
      5. Optimaliseer de laservermogen- en fotomultiplierbuis (PMT) versterkingsinstellingen om een sterke basislijn GCaMP6f-fluorescentie (F0) te bereiken zonder verzadiging (pixelintensiteit ~50-70% van het detectormaximum) en minimale achtergrond30,31.
        OPMERKING: Tijdens de beeldvorming werd het gemiddelde vermogen van het 920 nm excitatielicht precies gehandhaafd op 30-50 mW bij het doel. Dit vermogensniveau werd gevalideerd via pilotexperimenten op dierlijk weefsel dat identieke chirurgische procedures onderging, waardoor effectieve signaalacquisitie werd gegarandeerd voor scantijden tot 25 minuten, terwijl fotoschade en fluorescentie-fotobleaching werden geminimaliseerd.
  3. Hoogsnelheids calciumbeeldverwervingsprotocol
    1. Configureer de resonante scanner voor hogesnelheids frame-acquisitie:
      Framegrootte: 512 × 512 pixels (typisch gezichtsveld: ~450 × 450 μm, pixelgrootte ~0,88 μm)
      Framerate: 7 frames per seconde (fps) bereikt via bidirectionele scanning (~14 kHz lijnsnelheid). Deze snelheid bemonstert de GCaMP6f-vervalkinetiek (τ~500 ms) adequaat, terwijl de signaal-ruisverhouding (SNR) in balans wordt gebracht en fotobleaching wordt geminimaliseerd.
      Pixel dwell-tijd: ~0,8 μs (geoptimaliseerd voor SNR bij 7 Hz).
    2. Start continue time-lapse verwerving met acquisitiesoftware (bijv. ScanImage, Prairie View). Noteer een basisperiode van 5 minuten vóór het begin van EA-stimulatie om pre-stimulus neurale activiteitsdynamiek (F₀) vast te stellen.
    3. Precies op t = 5 min, begin de EA-stimulatie bij ST36 terwijl de beeldvorming ononderbroken doorgaat. Verzamel continu data gedurende de 20 minuten durende EA-stimulatieperiode. Totale scanduur = 25 minuten (1500 s, ~10.500 frames).
    4. Sla data op als een multi-TIFF-stack of propriëtair binair formaat met ingebedde tijdstempels die gesynchroniseerd zijn met EA-triggerpulsen via een TTL-invoerkanaal.
    5. Monitor de stabiliteit van laservermogen en focusdrift (<2 μm) in realtime; pauze kort voor herfocussen alleen als er aanzienlijke drift optreedt (bijv. >5 μm), waarbij het tijdstip 32,33 wordt genoteerd.
  4. Rigoureuze bewegingscorrectie en ruimtelijke registratie
    1. Na de acquisitie verwerk je de ruwe beeldstack met NoRMCorre (Non-Rigid Motion Correction) in MATLAB om ruimtelijke artefacten uit resterende microbewegingen (bijv. ademhaling, puls) te elimineren.
    2. Splits eerst de stack op in overlappende ruimtelijke patches (bijvoorbeeld 64 × 64 pixels, 50% overlap). Voor elke patch bereken je een referentiesjabloon door het gemiddelde van frames met hoge SNR uit de basisperiode te nemen.
    3. Met behulp van Fourier-gebaseerde kruiscorrelatie bereken men X-Y-translatieverschuivingen voor elk frame ten opzichte van het sjabloon. Pas deze verschuivingen toe via subpixelinterpolatie.
    4. Vervolgens behandel niet-rigide vervormingen: modelleer lokale vervormingen binnen patches met stukgewijze affiene transformaties (translatie + afschuiven). Werk het sjabloon iteratief bij om de registratienauwkeurigheid te verbeteren. Belangrijke parameters:
      max_shift: 20 pixels (limiet voor vertaling)
      max_dev: 3 pixels (maximale niet-rigide afwijking)
      bin_width: 50 frames (temporeel binning voor template-updates)
    5. Visualiseer de effectiviteit van correctie door de frame-tot-frame correlatiegrafiek te inspecteren (zou na correctie rond 1,0 moeten stabiliseren) en een gemiddelde beeldprojectieverschilkaart te genereren (pre- vs. post-correctie). Bewaar de bewegingsgecorrigeerde stack voor downstream analyse. Deze stap is cruciaal voor nauwkeurige pixel-gewijze analyse van calciumtransiënten, vooral tijdens door EA veroorzaakte subtiele ledemaatbewegingen.

4. Spatiotemporele dynamica-analyse

De bewegingsgecorrigeerde beeldvormingsstack ondergaat geautomatiseerde neuronale segmentatie en signaalextractie met behulp van de Suite2p-pijplijn (v0.12.3) in Python. Belangrijke verwerkingsfasen zijn onder andere:

  1. Ruimtelijke voetafdrukidentificatie
    1. Pas beperkte niet-negatieve matrixfactorisatie (CNMF) toe om de stack op te splitsen in ruimtelijke componenten.
    2. Initialiseer regio's van belang (ROI's) met een correlatie-gebaseerde aanpak: voeg pixels met ruimtelijke kruiscorrelatie > 0,7 en lokale SNR > 4 samen tot kandidaat-ROI's. Onderscheid somatische ROI's van dendrieten/axonen op grootte (8-15 μm diameter) en circulariteit (compactheidsdrempel >0,6).
  2. Neuropil-contaminatiecorrectie
    1. Voor elke ROI definieer je een concentrische neuropil annulus (binnenstraal: 1,5× ROI-straal, buitenstraal: 2,5× ROI-straal).
    2. Bereken de neuropilcoëfficiënt (r_neuropil) via de kleinste-kwadraten-regressie:
      F_corrected(t) = F_raw(t) - 0,7 × F_neuropil(t)
      (Coëfficiënt empirisch gevalideerd voor Thy1-GCaMP6f-muizen).
  3. Signaaldeconvolutie
    1. Leid piekactiviteit af met behulp van OASIS (l₁-geregulariseerde deconvolutie) met AR(2) ruismodel om de piekkans S(t) te schatten uit ΔF/F-sporen:
      ΔF/F(t) = k ⋅ S(t) + b + ε
      waarbij 'k' de calciumtransiënte korrel is en ε Gaussische ruis.
  4. Kwaliteitscontrole
    1. Sluit ROI's met SNR <3, ruimtelijke overlap >30% of neuropilcorrelatie >0,3 uit. Visuele verificatie wordt uitgevoerd via Suite2p GUI34.
      Specifieke bewerkingen en interface-elementen zijn beschikbaar in Supplementair Bestand 1. Het hierboven gegenereerde motion-gecorrigeerde TIFF-bestand werd direct in de Suite2p-pijplijn gevoerd. Hoewel de geïntegreerde omgeving van Suite2p een eigen rigide bewegingscorrectie bevat, werd deze redundante interne stap uitgeschakeld omdat er al een preciezere niet-rigide correctie was toegepast. Automatisch geëxtraheerde neuronale ROI's zijn te vinden in Supplementair Bestand 2.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Structurele karakterisering van de S1-cortex en neurale activiteit van de basislijn
We begonnen met het vaststellen van een structurele en functionele basislijn met hoge nauwkeurigheid voor onze beeldvormingsexperimenten. Weefselmorfologieanalyse toonde waarneembare structurele verschillen aan tussen niet-geplakte (Figuur 2A) en dekmantel aangebrachte (Figuur 2B) craniale vensterpreparaten. Hoewel het aanbren...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om de kritieke kloof in het observeren van de corticale effecten van elektroacupunctuur (EA) in realtime te overbruggen, presenteren we een uitgebreid geïntegreerd protocol dat chronische craniële vensterimplantatie voor optische toegang, gestandaardiseerde EA-stimulatie en longitudinale twee-foton calciumbeeldvorming combineert, gericht op de primaire somatosensorische (S1) cortex.

Dit geïntegreerde protocol biedt verschillende duidelijke voordelen ten opzich...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door een subsidie van de National Natural Science Foundation of China (nr. 82405550). We danken de leden van het Zhang-lab voor nuttige discussies.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
CarprofenMCEN/A5 mg/kg voor analgesie
Digitaal stereotactisch frameRWDKopf Model 1900
Elektroacupunctuur stimulatorHANS LH202 (2/100 Hz bifasische pulsen)N/AHANS LH202 (2/100 Hz bifasische pulsen)
IsofluraanRWDR510-22-10Medische kwaliteit, 100% zuurstofdrager
Micro-boorsysteemRWD0,5-mm hardmetalen boortje, met zoutoplossing gekoeld
Povidon-jodiumMCEHY-B223410% oplossing
ScanImageScanImagehttps://scanimage.org/
Steriele zoutoplossingBeyuntianST341-500ml0,9% NaCl
Chirurgisch microscoopZeisshttps://www.zeiss.com/meditec/en/products/surgical-microscopes.html10-40× vergroting
Thy1-GCaMP6f transgene muizenCygen55239788-12 weken oud, mannelijk/vrouwelijk
Twee-foton microscoopNikon A1MPNikon A1MPTi:Saffier laser (920 nm excitatie)

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Li, X., et al. A central and peripheral dual neuromodulation strategy in pain management of zoster-associated pain. Sci Rep. 14 (1), 24672(2024).
  2. Xia, R., et al. Autonomic nervous system in bone remodeling: From mechanisms to novel therapies in orthopedic diseases. Orthop Surg. 17 (6), 1561-1576 (2025).
  3. Arvanitidis, M., Falla, D., Sanderson, A., Martinez-Valdes, E. Does pain influence force steadiness? A protocol for a systematic review. BMJ Open. 11 (1), e042525(2021).
  4. Urits, I., et al. An evidence-based review of galcanezumab for the treatment of migraine. Neurol Ther. 9 (2), 403-417 (2020).
  5. Barbeau, E. J., Chauvel, P., Moulin, C. J., Regis, J., Liegeois-Chauvel, C. Hippocampus duality: Memory and novelty detection are subserved by distinct mechanisms. Hippocampus. 27 (4), 405-416 (2017).
  6. Dannenberg, H., Young, K., Hasselmo, M. Modulation of hippocampal circuits by muscarinic and nicotinic receptors. Front Neural Circuits. 11 (7), 102(2017).
  7. Shang, Q., et al. Erp evidence for consumer evaluation of copycat brands. PLoS One. 13 (2), e0191475(2018).
  8. Shariff, S., et al. Advances in understanding the pathogenesis of epilepsy: Unraveling the molecular mechanisms: A cross-sectional study. Health Sci Rep. 7 (2), e1896(2024).
  9. Wahl, A. S. State-of-the-art techniques to causally link neural plasticity to functional recovery in experimental stroke research. Neural Plast. 2018 (1), 3846593(2018).
  10. Zheng, X. S., Yang, Q., Vazquez, A. L., Tracy Cui, X. Imaging the efficiency of poly(3,4-ethylenedioxythiophene) doped with acid-functionalized carbon nanotube and iridium oxide electrode coatings for microstimulation. Adv Nanobiomed Res. 1 (7), 2000092(2021).
  11. De Pasquale, F., et al. A cortical core for dynamic integration of functional networks in the resting human brain. Neuron. 74 (4), 753-764 (2012).
  12. Stamatakis, A. M., et al. Miniature microscopes for manipulating and recording in vivo brain activity. Microscopy (Oxf). 70 (5), 399-414 (2021).
  13. Gu, Z., Jamison, K., Sabuncu, M. R., Kuceyeski, A. Human brain responses are modulated when exposed to optimized natural images or synthetically generated images. Commun Biol. 6 (1), 1076(2023).
  14. Li, J., et al. Pedot:Pss-based bioelectronics for brain monitoring and modulation. Microsyst Nanoeng. 11 (1), 87(2025).
  15. Lee, C. R., Najafizadeh, L., Margolis, D. J. Investigating learning-related neural circuitry with chronic in vivo optical imaging. Brain Struct Funct. 225 (2), 467-480 (2020).
  16. Kirwan, P., et al. Development and function of human cerebral cortex neural networks from pluripotent stem cells in vitro. Development. 142 (18), 3178-3187 (2015).
  17. Gomez, J., Neco, P., Difranco, M., Vergara, J. L. Calcium release domains in mammalian skeletal muscle studied with two-photon imaging and spot detection techniques. J Gen Physiol. 127 (6), 623-637 (2006).
  18. Sylte, O. C., Muysers, H., Chen, H. L., Bartos, M., Sauer, J. F. Neuronal tuning to threat exposure remains stable in the mouse prefrontal cortex over multiple days. PLoS Biol. 22 (1), e3002475(2024).
  19. Imori, T., Matsuda, H., Tohjo, M., Kamata, Y. An experimental production of suppurative otitis media in dog, and a trial to evaluate the therapeutic effect of cefmetazole on this otitis media. Jpn J Antibiot. 35 (9), 2277-2287 (1982).
  20. Holtmaat, A., et al. high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nat Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).
  21. Bray, M. A., et al. Cell painting, a high-content image-based assay for morphological profiling using multiplexed fluorescent dyes. Nat Protoc. 11 (9), 1757-1774 (2016).
  22. Jirkof, P., et al. Assessment of postsurgical distress and pain in laboratory mice by nest complexity scoring. Lab Anim. 47 (3), 153-161 (2013).
  23. Fang, K., Cheng, W., Yu, B. Effects of electroacupuncture at varied frequencies on analgesia and mechanisms in sciatic nerve cuffing-induced neuropathic pain mice. J Mol Neurosci. 74 (4), 98(2024).
  24. Hsiao, I. H., Liao, H. Y., Lin, Y. W. Optogenetic modulation of electroacupuncture analgesia in a mouse inflammatory pain model. Sci Rep. 12 (1), 9067(2022).
  25. Han, J. S. Acupuncture: Neuropeptide release produced by electrical stimulation of different frequencies. Trends Neurosci. 26 (1), 17-22 (2003).
  26. Zeng, L. T., et al. Study on optimization of image processing parameters of pneumoconiosis by DR. Zhonghua Lao Dong Wei Sheng Zhi Ye Bing Za Zhi. 41 (12), 897-900 (2023).
  27. Costa, F. F., et al. Identification of microRNAs as potential prognostic markers in ependymoma. PLoS One. 6 (10), e25114(2011).
  28. Gazerani, P., Aloisi, A. M., Ueda, H. Editorial: Differences in pain biology, perception, and coping strategies: Towards sex and gender specific treatments. Front Neurosci. 15, 697285(2021).
  29. Masamoto, K., Kanno, I. Anesthesia and the quantitative evaluation of neurovascular coupling. J Cereb Blood Flow Metab. 32 (7), 1233-1247 (2012).
  30. Korsunsky, I., et al. sensitive and accurate integration of single-cell data with Harmony. Nat Methods. 16 (12), 1289-1296 (2019).
  31. Theer, P., Hasan, M. T., Denk, W. Two-photon imaging to a depth of 1000 microm in living brains by use of a Ti:Al2O3 regenerative amplifier. Opt Lett. 28 (12), 1022-1024 (2003).
  32. Grewe, B. F., Langer, D., Kasper, H., Kampa, B. M., Helmchen, F. High-speed in vivo calcium imaging reveals neuronal network activity with near-millisecond precision. Nat Methods. 7 (5), 399-405 (2010).
  33. Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. ScanImage: Flexible software for operating laser scanning microscopes. Biomed Eng Online. 2 (1), 13(2003).
  34. Friedrich, J., et al. Multi-scale approaches for high-speed imaging and analysis of large neural populations. PLoS Comput Biol. 13 (8), e1005685(2017).
  35. Tidball, P., et al. Differential ability of the dorsal and ventral rat hippocampus to exhibit group I metabotropic glutamate receptor-dependent synaptic and intrinsic plasticity. Brain Neurosci Adv. 1 (1), 2398212816689792(2017).
  36. Yang, W., Yuste, R. Holographic imaging and photostimulation of neural activity. Curr Opin Neurobiol. 50 (1), 211-221 (2018).
  37. Reismann, D., et al. Longitudinal intravital imaging of the femoral bone marrow reveals plasticity within marrow vasculature. Nat Commun. 8 (1), 2153(2017).
  38. Pfeffer, C. K., Xue, M., He, M., Huang, Z. J., Scanziani, M. Inhibition of inhibition in visual cortex: The logic of connections between molecularly distinct interneurons. Nat Neurosci. 16 (8), 1068-1075 (2013).
  39. Zhou, P., et al. Efficient and accurate extraction of in vivo calcium signals from microendoscopic video data. Elife. 7, e28728(2018).
  40. Dombeck, D. A., Khabbaz, A. N., Collman, F., Adelman, T. L., Tank, D. W. Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice. Neuron. 56 (1), 43-57 (2007).
  41. Godenschweger, F., et al. Motion correction in MRI of the brain. Phys Med Biol. 61 (5), R32-R56 (2016).
  42. Hattori, R., Danskin, B., Babic, Z., Mlynaryk, N., Komiyama, T. Area-specificity and plasticity of history-dependent value coding during learning. Cell. 177 (7), 1858-1872.e15 (2019).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Somatosensory CortexTwo Photon ImagingElectroacupuncture StimulationNeural Circuit DynamicsCalcium ImagingCranial Window ImplantationThy1 GCaMP6f MiceSpatiotemporal DynamicsCortical PlasticityNeuromodulation

Related Articles