Methodenartikel

Biolaaginterferometrie voor het onderzoeken van membraaneiwit-remmerbinding: TACAN Mutant en GsMTx4 als modelsysteem

234 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/69348

⸱

8 mei 2026

 ,  , 
1Department of Biochemistry and Pharmacology, Bio21 Molecular Science and Biotechnology Institute, University of Melbourne, 2ARC Centre for Cryo-electron Microscopy of Membrane Proteins, Bio21 Molecular Science and Biotechnology Institute, University of Melbourne, 3Melbourne Protein Characterization, Bio21 Molecular Science and Biotechnology Institute, University of Melbourne

In dit artikel

Samenvatting

Dit manuscript biedt een gedetailleerd protocol voor het optimaliseren en uitvoeren van Bio-Layer Interferometrie (BLI)-experimenten om interacties tussen membraaneiwitten en ligand voor detergent-oplosbare membraaneiwitten te bestuderen. Met behulp van de interactie tussen de TMEM120A M207A-mutant en de peptide-inhibitor GsMTx4 als model, schetst deze workflow eiwitvoorbereiding, biosensorbelasting en kinetische gegevensverzameling.

Samenvatting

Bio-laag interferometrie (BLI) is een efficiënte biofysische techniek die realtime, kwantitatieve analyse van biomoleculaire interacties mogelijk maakt. Hoewel ze vaak worden gebruikt voor oplosbare eiwitten, blijft de toepassing ervan op membraaneiwitten een uitdaging vanwege hydrofobiciteit en afhankelijkheid van detergenten. Deze studie presenteert een geoptimaliseerd BLI-protocol voor het karakteriseren van interacties tussen detergent-oplosbaar membraaneiwit en peptideremmer.

Als modelsysteem werd het gating-modifier peptide Grammostola mechanotoxine 4 (GsMTx4) getest tegen de multifunctionele membraaneiwitmutant TMEM120A M207A. De FLAG-getagde TMEM120A variant werd geïmmobiliseerd op anti-FLAG-biosensoren—die een tag-gebaseerde maar fluorescentie- en enzymlabelvrije opstelling vertegenwoordigden—en blootgesteld aan seriële verdunningen van GsMTx4 om associatie- en dissociatiesnelheden te meten.

Het protocol integreert detergentoptimalisatie met behulp van Lauryl Maltose Neopentylglycol (LMNG) en complementaire karakterisering door massafotometrie en differentiële scanfluorimetrie (DSF). Deze workflow maakt betrouwbare kinetische metingen mogelijk en is compatibel met screening met medium doorvoer. De aanpak kan toepasbaar zijn op andere membraaneiwit-ligandsystemen waarbij detergentstabiliteit wordt gehandhaafd. Al met al benadrukt de studie belangrijke parameters die de immobilisatie-efficiëntie en de levering van analyten beïnvloeden, wat het potentiële nut van BLI ondersteunt bij inhibitorprofilering en mechanistische studies van interacties tussen membraaneiwitten.

Inleiding

Membraaneiwitten spelen centrale rollen in essentiële fysiologische processen, waaronder signaaltransductie, ionen- en metaboliettransport en membraanorganisatie. Gezien hun betrokkenheid bij cellulaire communicatie en homeostase vormen ze een aanzienlijk aandeel van de geneesmiddeldoelen in klinische ontwikkeling. Het begrijpen van interacties tussen membraaneiwit en ligand is cruciaal voor het verduidelijken van functie en het sturen van therapie-ontwerp. De amfipathische aard van deze eiwitten en hun afhankelijkheid van lipidenomgevingen vormen echter aanzienlijke uitdagingen voor zuivering, stabilisatie en biofysische karakterisering.

Oppervlakteplasmonresonantie (SPR) en isotherme titratiecalorimetrie (ITC) zijn veelgebruikte technieken voor het bestuderen van de kinetiek en thermodynamica van interacties tussen membraaneiwiten ligand 1,2. Wanneer ze goed worden geoptimaliseerd, kunnen beide methoden gedetailleerde kwantitatieve inzichten bieden, zelfs voor detergent-oplosbare of gereconstitueerde membraaneiwitten. Microscale thermoforese (MST) is ook met succes toegepast om bindingsaffiniteiten te beoordelen onder bijna-natuurlijke omstandigheden, met name voor membraaneiwitten³. Desalniettemin kunnen deze benaderingen beperkt zijn door aanzienlijke monsterconsumptie, moeilijkheden bij het behouden van de stabiliteit van membraaneiwitten, of beperkte compatibiliteit met bepaalde detergentsystemen.

Bio-laag Interferometrie (BLI) is een realtime optische techniek die kwantitatieve metingen van biomoleculaire interacties mogelijk maakt, inclusief die met detergent- of amfipol-oplosbare membraaneiwitten. Naast de eerder genoemde biofysische technieken biedt BLI een efficiënt platform dat directe meting van bindingskinetiek mogelijk maakt, inclusief associatie (kon), dissociatie (koff) en evenwichtsdissociatieconstanten (KD), met lagere monsterconcentraties en eenvoudige aanpassing aan detergent- of nanodisc-oplosbare membraaneiwitten. Het is ook opmerkelijk dat, net als alle biofysische technologieën, BLI zijn eigen beperkingen heeft, die in de discussiesectie zullen worden genoemd.

BLI detecteert verschuivingen in het interferentiepatroon van wit licht dat wordt weerkaatst door een biosensorpunt, met veranderingen in optische dikte die overeenkomen met biomoleculaire bindingsgebeurtenissen. Deze verschuivingen (Δλ, in nm) worden geregistreerd als sensorgrammen en zijn evenredig met de massa die aan het sensoroppervlak wordt gebonden. BLI is op grote schaal toegepast op interacties tussen eiwit en eiwit en ligand (inclusief peptiden en kleine moleculen) en is geschikt voor affiniteitsvariaties van nanomolair tot micromolair4. De flexibiliteit, lage monsterconsumptie en relatief eenvoudige opstelling maken het een potentieel voordelig hulpmiddel voor het bestuderen van detergent-oplosbare membraaneiwitten 5,6,7.

Deze studie presenteert een BLI-protocol om de interactie te karakteriseren tussen TMEM120A M207A, een membraaneiwit, en Grammostola mechanotoxine 4 (GsMTx4), een peptideremmer. TMEM120A is voorgesteld als een mechanosensitiv ionenkanaal dat betrokken is bij mechanische pijndetectie8; de activiteit van het ionenkanaal blijft echter controversieel. Meerdere studies hebben de afwezigheid van mechanosensitive stromen gerapporteerd wanneer TMEM120A tot expressie komt in heterologe systemen zoals HEK293 of CHO-cellen 1,9,10,11. Tot nu toe hebben meer dan vier cryo-EM-studies de structuur van TMEM120A in gesloten toestand opgelost, en er is geen open conformatie waargenomen: 1,9,10,11.

Moleculaire dynamica-simulaties en elektrofysiologische analyses geven aan dat methionine 207 (M207) in wildtype menselijke TMEM120A kan fungeren als een poortbarrière binnen het ionengeleidingspad11. Mutatie van dit residu naar alanine (M207A) is aangetoond dat het ionenpermeabiliteit verhoogt, waarschijnlijk door het verplaatsen van de helixverpakking en het verdringen van hydrofobe zijketens zoals Phe223. Daarom werd de M207A-mutant geselecteerd voor bindingsstudies met GsMTx4.

GsMTx4 is een gating-modifier peptide afgeleid van spinnengif dat mechanosensitive kationkanalen remt. Het bestaat uit een aminozuursequentie van 32 en heeft een molecuulgewicht van 4 tot 5 kDa, inclusief piezo- en TRP-kanalen, voornamelijk door interactie met de lipide-dubbellaag in plaats van direct de porie12,13 te blokkeren. Eerdere studies hebben aangetoond dat GsMTx4 TMEM120A activiteit vermindert in kunstmatige dubbellaagsystemen8. In de BLI-assays werd de TMEM120A M207A-mutant geïmmobiliseerd op anti-FLAG-biosensoren en blootgesteld aan toenemende concentraties GsMTx4, waardoor de associatie- (kon) en dissociatiesnelheden (koff) werden gemeten.

Dit werk biedt een gedetailleerd protocol voor detergentoptimalisatie en kinetische analyse met behulp van Bio-Layer Interferometrie (BLI). Hoewel BLI enkele beperkingen heeft, zoals mogelijke artefacten door sensoroverbelasting of massatransporteffecten en een verminderde geschiktheid voor snelle associatiesnelheid (kon) interacties, is het een nuttige methode om interacties tussen membraan en eiwit en ligand te bestuderen onder gecontroleerde detergent-oplosbare omstandigheden. Het protocol is geschikt voor systemen met matige tot lage bindingsaffiniteiten (meestal in het nanomolaire tot micromolaire bereik) en kan worden aangepast aan andere hydrofobe doelen wanneer passende controles en buffervoorwaarden worden toegepast.

Protocol

1. Eiwitzuivering en monsteroptimalisatie

  1. Celkweek en transfectie
    1. Kweek HEK293T/SF17 suspensiecellen in serumvrij medium, aangevuld met 20 mM L-glutamine in een schudincubator die staat op 120 RPM, 37 °C, 80% luchtvochtigheid en 8% CO₂. Cellen onderhouden door tot passage vijf door te geven; laten cellen een dichtheid van ongeveer 5 × 10⁶ cellen/mL bereiken.
    2. Transfecteer de cellen met het TMEM120A M207A-plasmide (N-terminal FLAG-Linker-3C-Linker-TMEM120A M207A) in de pCDNA3.1-vector met een commercieel transfectiereagens volgens de instructies van de fabrikant (zie de Materiaaltabel).
    3. De pellet transfecteerde cellen door middel van centrifugatie bij 5.000 × g gedurende 15 minuten bij 4 °C. Bewaar de celpellet op -80 °C tot zuivering.
  2. Cellyse en oplosbaarheid (Figuur 1)
    1. Sussen een 30 mL celpellet opnieuw in een oplosbaarheidsbuffer met 100 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonzuur (HEPES), pH 7,8; 300 mM NaCl; 0,5% (w/v) of 4,98 mM laurylmaltose neopentylglycol (LMNG); 1x proteaseremmer-cocktail; 50 μg DNase I; 10% (v/v) glycerol.
    2. Lys de cellen door ultrasonicatie met 25% amplitude en gebruik een pulscyclus van 20 seconden aan/20 seconden uit, gedurende 15 minuten, terwijl het monster op ijs blijft om oververhitting te voorkomen.
    3. Klariseer het lysaat door centrifugatie bij 25.800 × g gedurende 45 minuten bij 4 °C.
  3. Affiniteitszuivering met anti-FLAG hars
    1. Equilibriseer anti-FLAG M2-hars met equilibratiebuffer die 25 mM HEPES, pH 7,8 bevat; 200 mM NaCl; 0,05% (w/v) of 0,4975 mM LMNG; 10% (v/v) glycerol.
    2. Incubeer het geklarificeerde supernatant met evenwichtige hars gedurende 2 uur bij 4 °C op een wip.
    3. Was de hars 2x met een washbuffer die 25 mM HEPES, pH 7,8 bevat; 150 mM NaCl; 0,05% (w/v) of 0,4975 mM LMNG; 10% (v/v) glycerol.
    4. Elute het gebonden eiwit met behulp van elusjonsbuffer die 25 mM HEPES, pH 7,8 bevat; 400 mM NaCl; 0,001% (w/v) of 0,00995 mM LMNG; 10% (v/v) glycerol; 200 μg/mL FLAG-peptide.
  4. Concentratie- en grootte-uitsluitingschromatografie (SEC)
    1. Concentreer het geëlueerde eiwit tot ~500 μL met een centrifugaalfilter met een afsnijding van 30 kDa.
    2. Voer SEC uit met behulp van de referentiegrootte uitsluitingskolom, geëlibreerd met 25 mM HEPES, pH 7,8; 200 mM NaCl; 0,00015% (w/v) of 0,00149 mM LMNG.
    3. Verzamel en verzamel piekfracties die overeenkomen met het doeleiwit.
    4. Concentreer gepoolde fracties tot ~3 mg/mL eindconcentratie. Na affiniteitszuivering wordt bevestigd dat het TMEM120A M207A-eiwitmonomeer ongeveer 43 kDa voorkomt op SDS-PAGE (Figuur 2A). Voor SEC bevestig dat het gezuiverde eiwit in LMNG elueert als een monodisperse piek die overeenkomt met ongeveer 150 kDa, wat samen met de LMNG detergentmicelle het TMEM120A M207A-dimeer vertegenwoordigt (Figuur 2B).
      OPMERKING: Soms kan de monomeerproteïneband rond 50 kDa voorkomen, wat gebruikelijk is voor detergent-oplosbare membraaneiwitten, omdat kokende membraanproteïnemonsters niet typisch zijn.

2. Thermische stabiliteitsanalyse door nanodifferentiële scanning fluorimetrie (NanoDSF)

  1. Verdun het gezuiverde TMEM120A M207A-eiwit tot 0,15 mg/mL in SEC-buffer (25 mM HEPES, pH 7,8, 200 mM NaCl, 0,00015% LMNG).
  2. Laad 10 μL van elk monster in hooggevoelige haarvaten.
  3. Voer de thermische verschuivingstest uit op een NanoDSF-instrument met een temperatuurstijging van 25 °C naar 90 °C.
  4. Gebruik compatibele software om de test op te zetten en geautomatiseerde analyse uit te voeren.
  5. Bevestig dat er één enkele thermische overgangscurve (Tm) zichtbaar is, wat wijst op een coöperatieve ontvouwingsgebeurtenis (Figuur 3).

3. Massafotometrie voor het bepalen van oligomere toestanden

  1. Bereid een monster voor dat is verdund tot 80 nM in SEC-buffer (25 mM HEPES, pH 7,8, 200 mM NaCl, 0,00015% LMNG).
  2. Plaats het monster in voorgereinigde massafotometrie-compatibele preparaten.
  3. Verzamel data met standaardinstellingen en kalibreer met eiwitstandaarden.
  4. Verwerk gegevens met analysesoftware om massaverdelingshistogrammen te genereren (Figuur 4A-C).

4. Biolaaginterferometrie (BLI) protocol

OPMERKING: Dit protocol beschrijft een BLI kinetische assay die is ontworpen om interacties te bestuderen tussen FLAG-gelabelde TMEM120A M207A en liganden zoals GsMTx4, met behulp van een 384-well microplaatformaat. Hoewel ontwikkeld voor TMEM120A, kan de workflow worden aangepast voor andere membraaneiwitten. Alle experimenten werden uitgevoerd met een optisch interferometrieplatform met FLAG-biosensorsondes om FLAG-gelabelde TMEM120A M207A te immobiliseren. Een zwarte microplaat met 384 putten werd gebruikt met een geoptimaliseerde grootte-uitsluitingschromatografie (SEC) buffer die 25 mM HEPES, 200 mM NaCl, 0,00015% (w/v) LMNG en 0,0005% Tween-20 met pH 7,8 bevatte. Tween-20 werd toegevoegd om niet-specifieke binding te minimaliseren. De eiwitconcentratie bleef gehandhaafd op 250 nM, en alle assays werden dubbel uitgevoerd om reproduceerbaarheid te waarborgen.

  1. Overwegen bij het ontwerp van de assay
    1. Temperatuurevenwicht
      1. Voordat je met de BLI-test begint, breng je alle assaycomponenten - inclusief buffers, monsters en biosensorprobes - in evenwicht tot kamertemperatuur (ongeveer 20-25 °C). Houd tijdens het verzamelen van gegevens de assaytemperatuur op 30 °C, wat wordt aanbevolen voor kinetische analyses om de stabiliteit van eiwitten, ligandbinding en reproduceerbaarheid te optimaliseren.
        OPMERKING: Deze equilibratiestap zorgt voor consistente kinetische profielen en minimaliseert artefacten veroorzaakt door temperatuurschommelingen tijdens het experiment. Geef voldoende tijd (minstens 10-15 minuten) zodat alle reagentia en biosensoren thermisch evenwicht bereiken voordat de assay begint.
    2. Sensorhydratatie en regeneratie
      1. Hydrateer nieuwe FLAG-biosensoren in 250 μL BLI-compatibele buffer (SEC-buffer met 25 mM HEPES, 200 mM NaCl, 0,00015% w/v LMNG en 0,0005% Tween-20, pH 7,8) in de Max-plaat gedurende minimaal 10 minuten vóór gebruik.
        OPMERKING: Behandel biosensoren voorzichtig met schone, stofvrije pincet om besmetting te voorkomen, die de signaalopname kan verstoren en tot inconsistente resultaten kan leiden. Voor hergebruik van de sensor voer je regeneratie uit met een Q-buffer (0,3 M glycine, pH 3,8). Goede hydratatie en regeneratie zijn cruciaal om de sensorprestaties en reproduceerbaarheid te behouden, vooral bij het werken met detergent-oplosbare membraaneiwitten, die gevoelig zijn voor omgevingsomstandigheden.
    3. Bufferbehandeling
      1. Vermijd luchtbellen bij het doseren van vloeistoffen, omdat deze de optische signaalopname kunnen verstoren.
    4. Buffersamenstelling en consistentie
      1. Gebruik een buffer die niet-specifieke interacties minimaliseert terwijl de eiwitfunctie behouden blijft. Voor TMEM120A M207A bereidt u de buffer voor met 25 mM HEPES, 200 mM NaCl, 0,00015% (w/v) LMNG, 0,0005% (w/v) Tween 20, pH 7,8.
    5. Eiwitimmobilisatie
      1. Optimaliseer de ligandbelasting om 50-80% sensorverzadiging te bereiken. Gebruik een vaste concentratie eiwit bij 250 nM, met een typische laadduur van ongeveer 120 s. Laad FLAG-getagged TMEM120A M207A (250 nM) op de biosensor gedurende 120 seconden om 50-80% verzadiging te bereiken.
      2. Bevestig dat het biosensorsignaal 50 - 80% van de maximale bindingscapaciteit bereikt tijdens de laadfase.
        OPMERKING: Signalen onder 50% kunnen wijzen op onvoldoende eiwitimmobilisatie, terwijl signalen boven 80% massatransportbeperkingen of sterische belemmering kunnen veroorzaken, wat mogelijk kinetische metingen in gevaar brengt.
      3. Om potentiële massatransporteffecten te beoordelen, voer een controle-experiment uit waarbij de analytconcentratie (bijv. 100 nM GsMTx4) constant wordt gehouden terwijl de belastingsniveaus van TMEM120A-M207A op FLAG-biosensoren variëren (Aanvullende Figuur S1).
        OPMERKING: Latere kinetische metingen – waaronder associatie, dissociatie, globale bindingspassen en de bepaling van kaan en kaf – verschilden niet significant van die uit de hoofdtest. Dit resultaat geeft aan dat TMEM120A belasting binnen het bereik van 50-80% geen significante massatransportartefacten introduceert, waarmee wordt bevestigd dat het belastingsniveau van de biosensor geschikt is voor betrouwbare kinetische analyse.
    6. KD-schatting
      1. Bepaal de bindingsaffiniteit (KD) door analyte (GsMTx4) concentraties van 0 μM, 5 μM, 10 μM, 20 μM, 30 μM, 50 μM en 100 μM te testen.
    7. Achtergrondsignaalregelaars
      1. Bevat passende controles om achtergrondsignalen nauwkeurig af te trekken en betrouwbare kinetische metingen te garanderen.
      2. Gebruik een referentie-FLAG-probe om rekening te houden met niet-specifieke binding of drift die tijdens de assay kan optreden.
        OPMERKING: Deze referentieprobe mag het doeleiwit niet immobiliseren en dient als uitgangspunt om het signaal van de monsterhoudende probes te corrigeren.
      3. Trek het referentiesignaal af van het samplesignaal om alleen specifieke interacties te analyseren tussen FLAG-gelabelde TMEM120A M207A en analyten.
        OPMERKING: Controleer dat de referentie FLAG-probe gedurende de hele assay minimaal signaal laat zien. Een stabiele, lage baseline wijst op verwaarloosbare niet-specifieke binding. Als het referentiesignaal fluctueert of toeneemt, herbeoordeel dan de samenstelling van de buffer, het hanteren van de probe of de monstervoorbereiding om niet-specifieke interacties te verminderen voordat je doorgaat met kinetische analyse.
  2. Configuratie van basisparameters voor kinetica-analyse
    1. Stel de frequentie van gegevensverzameling in op 5 Hz om 5 datapunten per seconde te verzamelen (aanbevolen voor alle kinetische assays).
    2. Selecteer 384-well plaat als plaatformaat.
    3. Stel de shaker-snelheid in op 1.000 RPM en de temperatuur tussen omgevingstemperatuur en 30 °C (30 °C wordt in dit experiment gebruikt voor optimale kinetische resultaten).
  3. Configureer de plaatopstelling.
    1. Ga naar het tabblad Plate Setup en definieer puttoewijzingen voor zowel de 384-well plaat als de Max-plaat.
    2. Wijs putfuncties toe op de 384-put plaat.
      OPMERKING: De symbolen en annotaties die voor zowel de 384-well-plaat als de Max-plaat worden gebruikt, zijn samengevat in Aanvullende Tabel S1.
      1. Label putten volgens de rol: buffer, eiwit (laden), ligand (monster).
      2. Annoteer eiwitlaadputten met concentratie (bijv. 250 nM) voor kinetische assays.
        OPMERKING: Nauwkeurige etikettering is essentieel voor het berekenen van kon en KD (zie aanvullende figuur S2A).
    3. Configureer de Max plate map (probe plate).
      1. Wijs biosensorprobes toe aan geschikte putten.
      2. Als probe-regeneratie gepland is, wijs dan putten toe voor regeneratie- en neutralisatiebuffers. Label deze putten duidelijk in de software om goede automatisering tijdens de regeneratie te waarborgen (zie Aanvullende Tabel S2).
        OPMERKING: De assaybuffer bestond uit 25 mM HEPES (pH 7,8), 200 mM NaCl, 0,00015% (w/v) LMNG en 0,0005% (v/v) Tween-20. De regeneratiestap van de anti-FLAG biosensorprobes werd uitgevoerd met een Q-buffer die 0,3% glycine bevatte (pH 3,8), gevolgd door een neutralisatiestap met de assaybuffer (25 mM HEPES, 200 mM NaCl, 0,00015% LMNG en 0,0005% Tween-20, pH 7,8).
  4. Selecteer het tabblad Assay Steps .
    1. Ga naar het tabblad Assay Steps om de kinetische assay-workflow te configureren. Specificeer putposities voor elke assayfase, inclusief basislijn, eiwitbelasting, associatie en dissociatie (zie aanvullende figuur S3).
    2. Selecteer het juiste staptype in het dropdownmenu. Zorg ervoor dat de associatie- en dissociatiestappen correct zijn gelabeld voor een nauwkeurige kinetische analyse.
    3. Voer de duur van elke stap in seconden in om de belichtingstijden voor alle interactiefasen te definiëren.
      1. Stel de basisstap duur in om sensorevenwicht vóór eiwitbelasting mogelijk te maken (60 s).
      2. Stel de duur van de eiwitlaadstap in om de gewenste ligandimmobilisatieniveaus van (60 s) te bereiken (Figuur 5).
      3. Stel de duur van de associatiestap in zodat voldoende analytebinding mogelijk is (300 s) (Figuur 5).
      4. Stel de duur van de dissociatiestap in om de kinetische kinetiek van de analyte te ontbinden adequaat vast te leggen (600 s) (Figuur 5).
    4. Stel de shakersnelheid (RPM) in voor elke stap om consistente menging en optimale datakwaliteit (1.000 RPM) te behouden.
  5. Uitlijnen en filterstappen (zie Aanvullende Figuur S4 en Aanvullende Figuur S5)
    1. Voer ruwe datacorrectie uit door het databereik indien nodig aan te passen om artefacten uit kinetische stappen te verwijderen.
    2. Om de Y-as uit te lijnen, lijn je de gegevens aan het begin van de associatiestap uit door Associatie te selecteren onder Lijn Stap Type en de optie Begin te activeren.
    3. Schakel de Interstep-correctieoptie in om continuïteit tussen stappen te behouden tijdens standaard kinetische assays.
    4. Filtering: Pas datasmoothing toe om signaalruis te verminderen zonder trends te vervormen. Selecteer Verwerkt om gladde data te vergelijken met ruwe signalen.
  6. Stel een referentiestap in (zie Aanvullende Figuur S6).
    1. Wijs een referentieprobe aan door de referentieprobe te selecteren en op de Ref. Probe-knop te klikken.
    2. Selecteer steekproefsondes door op de bijbehorende kolomnummers van de steekproefprobes te klikken.
    3. Om de aftrekfunctie te definiëren, open je de Formule-editor, klik je op Formule Bewerken en definieer je de aftrekfunctie om de achtergrond te verwijderen.
    4. Bekijk de tabelweergave om te bevestigen dat referentiesubtractie correct is toegepast.
  7. Bindende pasvorm stap
    1. Ga naar het tabblad Fitting en definieer analyseparameters (Aanvullende Figuur S7).
    2. Dataselectie: Includeer zowel associatie- als dissociatiefasen voor lokale kinetische fitting. Sluit uitschieters handmatig uit als ze slechte curve fitting of onregelmatig signaal vertonen.
    3. Selectie van bindingsmodel: Kies het 1:1 bindingsmodel dat past bij de data, tenzij er complex gedrag wordt waargenomen. Bekijk curve-overlays en residuen om de geschiktheid van het model te valideren.
    4. Passingsstrategie: Kies een van de volgende fittingstrategieën op basis van de datakwaliteit en experimentele doelstellingen:
      1. Lokaal: Past elke analyteconcentratie individueel aan, waardoor onafhankelijke evaluatie van associatie- en dissociatiekinetiek mogelijk is.
      2. Globaal: Past alle analyteconcentraties gelijktijdig aan met behulp van één set kinetische parameters, waarmee een algemeen model voor de dataset wordt geboden.
      3. Volledig: Past wereldwijd bij zowel associatie- als dissociatiefasen over alle concentraties.
      4. Gedeeltelijk: Past alleen bij de associatiefase, waarbij dissociatie wordt genegeerd.
        OPMERKING: BLI-gegevens werden geanalyseerd met een 1:1 Langmuir-bindingsmodel met lokale, volledige fitting. Lokale fitting zorgt ervoor dat elke analyteconcentratie onafhankelijk wordt behandeld, wat een nauwkeurige weergave van associatiekinetiek biedt en artefacten uit heterogeniteit in de dissociatiefase minimaliseert. Deze aanpak voorkomt overfitting in regio's met variabele of instabiele signalen, waardoor een betrouwbaardere schatting van kinetische parameters mogelijk is (kaan en kuit) (Tabel 1 en Tabel 2).
  8. Kinetische analyse
    1. Beoordeling van gepasste krommen en residuen: Onderzoek de aangepaste krommen en bijbehorende residuen om de kwaliteit en validiteit van het model te beoordelen. Bevestig dat residuen willekeurig rond nul zijn verdeeld zonder systematische afwijkingen (zie Figuur 4E voor representatieve residuen).
    2. Uitsluiting van slecht passende gegevens: Verwijder analyteconcentraties die vlakke, ruisachtige of anderszins onbetrouwbare signalen vertonen om de algehele modelnauwkeurigheid te verbeteren.
      OPMERKING: Zo werd de concentratie van 10 μM uitgesloten van de fitting vanwege overlapping met de 5 μM-dataset, wat de schatting van kinetische parameters kon vertekenen (zie Figuur 6A,B).

Resultaten

De TMEM120 M207A-mutant werd tot expressie gebracht in HEK293SF-17 suspensiecellen met behulp van een pCDNA3.1-vector die codeert voor een N-terminale FLAG-tag Figuur 1. Transiënte transfectie maakte recombinante eiwitexpressie mogelijk. Na celoogst werden membraaneiwitten opgelost in 0,5% laurylmaltose neopentylglycol (LMNG), een niet-ionisch detergent dat geschikt is voor het behouden van de membraaneiwit-oplosbaarheid.

De oplosbare fractie werd onderworpen aan affiniteitszuivering met anti-FLAG M2-hars. De hars werd gewassen met een buffer die 0,01% LMNG bevatte om niet-specifiek gebonden eiwitten te verwijderen, en TMEM120 M207A werd geëlueerd in een buffer met 0,001% LMNG. De elusie werd geconcentreerd met centrifugale filters met molecuulmassa-afsnijdingen van 30 kDa of 100 kDa, afhankelijk van de opbrengst van het monster. Verdere zuivering werd uitgevoerd door grootte-uitsluitingschromatografie (SEC). De laatste SEC-stap werd uitgevoerd in een buffer met 0,00015% LMNG, wat een monodisperse elusieprofiel opleverde dat consistent is met een homogene en stabiele eiwitbereiding die geschikt is voor latere structurele en functionele analyses (Figuur 2B).

Optimalisatie en biofysische karakterisering van FLAG-getagged TMEM120 M207A worden samengevat in Figuur 2. Expressie en zuivering werden bevestigd door SDS-PAGE, dat een enkele band van ongeveer 50 kDa liet zien. De waargenomen migratie lag iets boven het verwachte molecuulgewicht van de monomere vorm (Figuur 2A), waarschijnlijk vanwege het niet-gekookte monster vóór de elektroforese. Het SEC-chromatogram toonde een enkele, symmetrische piek die elueerde bij een volume dat overeenkwam met een schijnbare molecuulmassa van ongeveer 150 kDa in 0,00015% (w/v) LMNG (Figuur 2B), wat consistent is met de TMEM120A M207A-dimeer in LMNG-detergentmicellen. Dit elusiegedrag vertoont een homogene en monodisperse eiwitpopulatie, waardoor het geschikt is voor downstream biofysische karakterisering.

De detergent-micelle-eigenschappen van LMNG onder de experimentele buffercondities werden geanalyseerd met massafotometrie. Metingen werden uitgevoerd in SEC-buffers met variërende concentraties LMNG in afwezigheid van eiwit om de bijdrage van detergentmicellen aan de heldere molecuulmassa te evalueren. Bij 0,001% (w/v) LMNG, een concentratie boven de kritische micelleconcentratie (CMC), werd de overheersende piek gedetecteerd bij ongeveer 69 kDa, wat overeenkomt met LMNG-micellen alleen zonder geassocieerd eiwit (Figuur 4A). Wanneer de LMNG-concentratie werd verlaagd tot 0,0001% (w/v), onder de CMC, verschoof de belangrijkste soort naar ~48 kDa, wat wijst op de aanwezigheid van kleinere resterende LMNG-aggregaten of submicellaire assemblages zonder eiwit (Figuur 4B). Verderop (Figuur 4C) werd TMEM120A M207A verdund in een SEC-buffer met verschillende concentraties LMNG om de oligomere toestand te beoordelen door massafotometrie. Bij 0,00001% LMNG (~20x onder de CMC, magenta) werd een overheersende piek waargenomen bij ongeveer 42 kDa, overeenkomend met het monomeer van TMEM120A M207A. Bij 0,00015% LMNG (~10x onder de CMC, blauw) gaf de hoofdpopulatie bij ~86 kDa de aanwezigheid van dimeren aan. Het verhogen van de LMNG-concentratie tot 0,001% (~2x boven de CMC, oranje) resulteerde in een hoofdsoort ~150 kDa, consistent met eiwit-detergentcomplexen. Bij 0,002% LMNG (~4x boven de CMC, groen) werd een brede verdeling gedetecteerd rond 180 kDa, wat grotere micelle-geassocieerde assemblages of hogere-orde oligomeren vertegenwoordigt. Deze resultaten tonen aan dat de LMNG-concentratie binnen de SEC-buffer sterk invloed heeft op de heldere oligomere toestand van TMEM120A M207A, waarbij het monomeer-dimeer evenwicht onder de CMC wordt waargenomen en detergent-eiwitcomplexvorming boven de CMC overheerst.

De thermodynamische stabiliteit van TMEM120A M207A, verzameld van de hoofdpiek van SEC en bewaard in de SEC-buffer (25 mM HEPES, 200 mM NaCl, 0,00015% (w/v) LMNG, pH 7,8) werd geëvalueerd met thermische denaturatieanalyse. Het eiwit vertoonde een buigpunt van ongeveer 46 °C, overeenkomend met zijn smelttemperatuur (Tm) onder deze detergent-oplosbare omstandigheden. DezeTm-waarde duidt op matige thermische stabiliteit, wat suggereert dat TMEM120A M207A een correct gevouwen conformatie binnen LMNG-micellen behoudt, maar bij hogere temperaturen kan beginnen te ontvouwen of aggregeren.

Biolaaginterferometrie (BLI) toont μM-bindingsaffiniteit van TMEM120A M207A tot GsMTx4T. De sporen in Figuur 5 illustreren vijf experimentele stappen: (1) basislijn, (2) TMEM120A M207A-monsterbelasting, (3) basislijn om niet-specifieke binding en overtollige TMEM120A M207A te verwijderen, (4) associatie, en (5) dissociatie. Golflengteverschuiving (nm) wordt over de tijd uitgezet voor toenemende concentraties van GsMTx4 (0, 5, 10, 20, 30, 50 en 100 μM) die interageren met geïmmobiliseerde TMEM120A M207A.

Tijdens de initiële basislijn (stap 1) bleef het signaal stabiel, wat de sensorevenwicht in de buffer bevestigde. TMEM120A M207A-belasting (stap 2) veroorzaakte een karakteristieke toename van het signaal, overeenkomend met ~50-80% sondelaturatie over sensoren. De laadfase vertoonde een licht gebogen respons in plaats van een scherp plateau, mogelijk een teken van gedeeltelijke massatransportbeperking, waarbij TMEM120A M207A-diffusie naar het sensoroppervlak langzamer is dan de bindingssnelheid — een effect dat vaak voorkomt bij membraan- of detergent-oplosbare eiwitten die de schijnbare oppervlaktebedekking kunnen beïnvloeden.

De daaropvolgende basisstap (stap 3) verwijderde effectief de ongebonden of losjes bevestigde TMEM120A M207A. Tijdens de associatiefase (stap 4) resulteerde het verhogen van de GsMTx4-concentraties in duidelijke, concentratieafhankelijke toename van de golflengteverschuiving. Tijdens de dissociatie (stap 5) werd de biosensor geplaatst in een SEC-buffer met LMNG, die zich ~10x onder de CMC bevond. De eerste 5-10 seconden van dissociatie toonden een snelle signaalafname, waarschijnlijk wat een snelle afgifte van GsMTx4 uit gemakkelijk toegankelijke locaties vertegenwoordigt, gevolgd door een langzamere afname die mogelijk stabieler TMEM120A M207A-GsMTx4-complexen met langzame dissociatiekinetiek weerspiegelt. Referentie-probesignalen bleven gedurende het hele experiment vlak, wat wijst op minimale niet-specifieke binding. Al met al tonen deze gegevens specifieke TMEM120A M207A-GsMTx4-interacties aan; de waargenomen kinetiek moet echter met voorzichtigheid worden geïnterpreteerd vanwege de detergentomgeving en de mogelijke effecten van massatransport.

De associatie- en dissociatiesensorgrammen van de verwerkte gegevens na referentieprobe-subtractie (Figuur 6A) toonden concentratieafhankelijke responsen voor GsMTx4 in het bereik van 5-100 μM. Toenemende ligandconcentraties veroorzaakten progressief hogere golflengteverschuivingen, gevolgd door een geleidelijke, langzame afname tijdens de dissociatiefase van 200 seconden. De 10 μM-dataset werd uitgesloten van de passing vanwege overlap met de 5 μM-trace, wat de algehele modelkwaliteit verbeterde.

Kinetische analyse werd uitgevoerd met een 1:1 Langmuir associatie-dissociatiemodel met een lokale full-fittingstrategie, waarbij individuele analytenconcentraties onafhankelijk werden aangepast binnen een gedeeld kinetisch kader (Figuur 6B). De gepasseerde krommen (rood) kwamen goed overeen met de experimentele sporen, wat resulteerde in een geschatte dissociatieconstante (KD) in het lage micromolaire bereik. De residuele analyse (Figuur 6C) toonde geen grote systematische afwijkingen aan, wat aangeeft dat het toegepaste model geschikt was voor de dataset. Kleine verschillen die tijdens de vroege associatiefase worden waargenomen, kunnen beperkingen in massatransport of de effecten van de wasmiddel-micelleomgeving weerspiegelen. Aanvullende voorbeelden van gepasste associatie- en dissociatiecurves, residugrafieken en fittingstatistieken over meerdere assay-replicaten en probeposities worden weergegeven in Aanvullende Figuur S8.

In de ruwe gegevens (Figuur 5) toonden de eerste 5-10 seconden van dissociatie een snelle signaalafname, waarschijnlijk wat de snelle afgifte van GsMTx4 uit gemakkelijk toegankelijke locaties vertegenwoordigt, gevolgd door een langzamere afname die mogelijk een stabielere TMEM120A M207A-GsMTx4-complexen met langzame dissociatiekinetiek weerspiegelt. Daarom werden in Tabel 2 de eerste 100 seconden dissociatie uit de fitting verwijderd. Het ontbreken van systematische afwijking wijst op een goede aansluiting van het lokale volledig passende Langmuir 1:1-model voor TMEM120A M207A bij alle geteste concentraties (Figuur 7).

Kinetische analyse van GsMTx4-binding aan TMEM120A M207A toonde concentratieafhankelijke associatie- en dissociatiegedrag aan over het ligandbereik van 5-100 μM (Tabel 1). De waargenomen associatierateconstanten (kon) namen bescheiden toe met een stijgende GsMTx4-concentratie, variërend van ongeveer 1,0 × 10⁻⁶ tot 3,2 × 10-6 1/M·s, terwijl de geschatte dissociatiesnelheidsconstanten (koff) binnen de experimentele fout bijna nul bleven, wat wijst op een langzame of verwaarloosbare dissociatiefase onder de geteste omstandigheden. De berekende evenwichtsdissociatieconstanten (Kd) lagen in het lage tot midden-micromolaire bereik (~0,8-3,3 μM), wat consistent is met een matige affiniteitsinteractie. Lokale volledige fitting met een Langmuir 1:1 bindingsmodel leverde hoogwaardige fits op over alle GsMTx4-concentraties, met correlatiecoëfficiënten boven de 0,99 en lage relatieve χ2-waarden voor zowel associatie- als dissociatiefasen (Tabel 1). De berekende evenwichtsdissociatieconstanten waren consistent over concentraties en replicata, metKD-waarden in het lage micromolaire bereik (~1-2 μM), wat wijst op matige maar specifieke binding tussen TMEM120A M207A en GsMTx4.

Replicate datasets bij elke concentratie toonden reproduceerbaarheid, zoals blijkt uit hoge correlatiecoëfficiënten (R² > 0,99) voor zowel associatie- als dissociatiefits. De volledige en relatieve χ²-waarden waren laag en vergelijkbaar tussen replicaten, wat de robuustheid van het 1:1 Langmuir-bindingsmodel dat in de analyse werd toegepast, verder ondersteunde. Bij hogere ligandconcentraties (≥50 μM) werden licht verhoogdek-on - enk-D-waarden waargenomen, wat mogelijk kleine massatransporteffecten of lokale oppervlakteheterogeniteit weerspiegelt in plaats van echte affiniteitsveranderingen. Kinetische consistentie over meerdere replicaties en probeposities wordt verder geïllustreerd in Aanvullende Figuur S9.

De kinetische profielen tonen aan dat GsMTx4 specifiek en stabiel interageert met TMEM120A M207A, waardoor relatief stabiele complexen ontstaan die worden gekenmerkt door langzame dissociatie en micromolaire bindingsaffiniteit.

figure-results-1
Figuur 1: Zuiveringsworkflow van TMEM120A M207A-mutant tot expressie gebracht in HEK293SF-17 suspensiecellen. Schematisch overzicht van het eiwitzuiveringsproces. TMEM120A M207A werd tot expressie gebracht uit pCDNA3.1-plasmiden in HEK293SF-17 cellen. Cellen werden opgelost in 0,5% LMNG, gevolgd door affiniteitszuivering met anti-FLAG M2-hars. De hars werd gewassen met een buffer die 0,01% LMNG bevatte om niet-specifiek gebonden eiwitten te verwijderen. TMEM120A M207A werd geëlueerd in een buffer met 0,001% LMNG. Het eluaat werd geconcentreerd met ofwel 100 kDa of 30 kDa moleculaire gewichtsafkapfilters en verder gezuiverd door grootte-uitsluitingschromatografie in een buffer met 0,00015% LMNG. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Grootte-uitsluitingschromatografie en SDS-PAGINA van gezuiverde TMEM120A M207A In LMNG wasmiddel (A) SDS-PAGE van FLAG-getagd TMEM120A M207A gezuiverd door grootte-uitsluitingschromatografie. De eiwitband verschijnt op ~50 kDa in baan 1, wat overeenkomt met het verwachte monomeer. (B) SEC-profiel van gezuiverde TMEM120A M207A op een SEC-kolom in SEC-buffer (25 mM HEPES, 200 mM NaCl, 0,00015% LMNG, pH 7,8). Eiwitelutie duidt op een overheersende monodisperze soort die geschikt is voor downstream biofysische assays. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Differentiële scanfluorimetrie van gezuiverde TMEM120A M207A in LMNG. DSF toont een thermodynamisch kantelpunt bij 46 °C, wat de thermische stabiliteit van het eiwit onder de geteste bufferomstandigheden aangeeft. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: karakterisering van gezuiverde TMEM120A M207A in LMNG-detergent met behulp van massafotometrietechniek. (A,B) Massafotometrie van de SEC-buffer met variërende LMNG-concentraties. Bij 0,001% LMNG (boven de kritische micelleconcentratie, CMC) is het schijnbare molecuulgewicht ~69 kDa, wat voornamelijk overeenkomt met LMNG-micellen. Bij 0,0001% LMNG (tien keer onder de CMC) verschijnt de piek op ~48 kDa. (C) Masfotometrie-analyse van LMNG-concentratieafhankelijke effecten op TMEM120A oligomerisatie. TMEM120A in 0,00001% LMNG (~20x onder de CMC, magenta) vertoont een hoofdpopulatie van ongeveer 42 kDa (monomeer). Bij 0,00015% LMNG (~10x onder CMC, blauw) wordt een populatie van ~86 kDa waargenomen, consistent met het dimeer. In 0,001% LMNG (~2x boven CMC, oranje) komt een hoofdsoort met ~150 kDa overeen met eiwit-detergentcomplexen. Bij 0,002% LMNG (~4x boven CMC, groen) duidt een brede verdeling gecentreerd op ~180 kDa grotere micelle-geassocieerde assemblages of hogere-orde oligomeren aan. Deze resultaten tonen aan dat de LMNG-concentratie sterk invloed heeft op de schijnbare oligomere toestand van TMEM120A, waarbij een monomeer-dimeer evenwicht onder de CMC wordt waargenomen en de vorming van eiwit-detergentcomplex boven de CMC overheerst. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5: Ruwe gegevens van software die TMEM120A M207A-GsMTx4-interacties tonen. Biolaaginterferometrie toont aan dat TMEM120A (M207A) de mechanosensitive kanaalremmer GsMTx4 bindt met micromolaire affiniteit. De figuur toont de ruwe BLI-responsgegevens verkregen van Gator Prime-software, waarin de vijf belangrijkste assayfasen worden afgebakend: (1) Initiële basislijn, waarin het signaal stabiel bleef; (2) Eiwitimmobilisatie (belasting), wat resulteert in een toename van ongeveer 1,5 nm in golflengteverschuiving; (3) Tweede basislijn, waarbij het verwijderen van ongebonden of losjes geassocieerd eiwit mogelijk is; (4) Associatiefase (ligandbinding), waarbij toenemende GsMTx4-concentraties een responsstijging tot ~5,5 nm binnen 300 s veroorzaakte; en (5) Dissociatiefase (ligandvrijstelling), die geleidelijke signaalafname over 600 seconden vertoont. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-6
Figuur 6: Bindingskinetiek van TMEM120A M207A met GsMTx4-peptide. (A) Associatie- en dissociatiesensorgrammen van TMEM120A M207A die interageren met GsMTx4 bij vijf concentraties: 5 μM, 20 μM, 30 μM, 50 μM en 100 μM. De 10 μM-dataset werd uitgesloten van de fitting vanwege overlap met de 5 μM-curve, wat de algehele modelpassing verbeterde. Verticale gestippelde rode lijnen geven het begin en einde van de dissociatiefase aan. (B) Het passen van de sensorgrammen werd uitgevoerd met een Local Full fitting Langmuir 1:1 associatie-dissociatiemodel. Rode krommen vertegenwoordigen het aangepaste model, terwijl experimentele sporen overeenkomen met de gemeten associatie- en dissociatiegegevens voor elke GsMTx4-concentratie (twee replicaties per conditie). (C) Residugrafieken die de afwijking tonen tussen experimentele data en het aangepaste model voor zowel associatie- als dissociatiefasen, waarmee de goedheid van fit wordt bevestigd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-7
Figuur 7: Residugrafieken die overeenkomen met de getoonde passende bindingscurves. Elke grafiek vertegenwoordigt de residuen (verschil tussen de experimentele gegevens en het aangepaste model) voor een enkele GsMTx4-concentratie: 5 μM, 20 μM, 30 μM, 50 μM en 100 μM. Residuen worden weergegeven als verschuivingsdeviatie (nm) versus tijd (s), waarbij een willekeurige verdeling rond nul wordt weergegeven over zowel associatie- als dissociatiefasen. Het ontbreken van systematische afwijking wijst op een goede aansluiting van het Local Full fitting Langmuir 1:1 model voor TMEM120A M207A bij alle geteste concentraties. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tabel 1: Samenvatting van kinetische parameters voor TMEM120A M207A-binding aan GsMTx4. Kinetische parameters werden verkregen uit Local Full fitting met behulp van een Langmuir 1:1 bindingsmodel. Associatie (kon), dissociatie (koff), waargenomen snelheidsconstanten (kobs) en evenwichtsdissociatieconstanten (KD) worden gerapporteerd voor elke GsMTx4-concentratie en repliceren. De fitkwaliteit werd beoordeeld met R²- en χ²-waarden voor volledige, associatie- en dissociatiefasen. Over alle concentraties toonden fits hoge correlatiecoëfficiënten (R² > 0,99) en lage relatieve χ²-waarden, wat wijst op betrouwbare modelprestaties. Notities: M Conc. geeft de concentratie van GsMTx4 (μM) aan. kobs vertegenwoordigt de waargenomen snelheidsconstante die gecombineerde associatie- en dissociatieprocessen weerspiegelt. Fouten die worden gerapporteerd voor kobs, kon en koff weerspiegelen passende onzekerheid. R²-waarden geven goodness-of-fit aan voor volle, associatie- en dissociatiefasen. Relatieve χ²-waarden vertegenwoordigen genormaliseerde goodness-of-fit-metrieken, terwijl absolute χ²-waarden een residuele afwijking tussen waargenomen en aangepaste data aangeven. Afkortingen: kop = associatiesnelheidsconstante (1/M·s); koff, = dissociatiesnelheidsconstante (1/s); kobs = waargenomen snelheidsconstante (1/s); KD = evenwichtsdissociatieconstante; Rmax = maximale respons; Req = evenwichtsrespons. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 2: Verwerkingsparameters en residuen van kinetische fitting. Verwerkingsparameters: Associatiestart, 0 s; einde van de vereniging, 300 s; dissociatiestart, 100 seconden; dissociatie-einde, 300 s. Minimale R²-waarde, 0,9; maximale χ²-waarde, 8. Uitlijningsstap: éénstaps einde (index = 1, gemiddelde = 0). Inter-step correctie werd toegepast tijdens de associatiefase. Associatiegemiddelde: 50; Dissociatiegemiddeld, 0. Savitzky-Golay gladstrijken werd uitgeschakeld. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Aanvullende figuur S1: Optimalisatie-experiment voor het laden van verschillende concentraties van TMEM120A M207A-eiwit op anti-FLAG-probes met een vaste concentratie (100 nM) van GsMTx4-peptide. (A) Ruwe BLI-sensorgrammen die de vijf stappen van de kinetische meting tonen: (1) baseline in SEC-buffer of assaybuffer (25 mM HEPES, pH 7,8; 200 mM NaCl; 0,00015% (w/v) LMNG; 0,0005% (v/v) Tween-20); (2) het laden van vier verschillende concentraties TMEM120A M207A op de FLAG-sonde, waarbij de referentieprobe (oranje) als negatieve controle wordt gebruikt om de afwezigheid van niet-specifieke binding te bevestigen; (3) bij de tweede baseline step; (4) de associatiefase, en (5) de dissociatiefase. (B) Globaal 1:1 bindingsmodel past bij de vier TMEM120A M207A-concentraties die interageren met 100 nM GsMTx4-peptiden. (C) Residugrafieken voor zowel de associatie- als de dissociatiefase, die minimale afwijkingen van het aangepaste model tonen (<0,05 nm). Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur S2: Plaatopstelling en assayconfiguratie. (A) Plaatontwerp voor een 384-put plaat, waarbij verschillende parameters kunnen worden toegewezen. Monsters komen overeen met de ligand (GsMTx4) bij verschillende concentraties. Oranje putten geven TMEM120 M207A-eiwit aan bij 250 nM. Wells vertegenwoordigen eiwitreplicaten bij 250 nM, en dezelfde buffer werd gebruikt voor baseline-, associatie- en dissociatiestappen. (B) Max Plate-weergave met vier anti-FLAG biosensorprobes: één referentieprobe en drie probes voor eiwitreplicatieën. Alle probes werden vooraf bevochtigd in assaybuffer, geregenereerd in Q-buffer en geneutraliseerd in assaybuffer. Dezelfde buffer werd gebruikt tijdens de baseline-, associatie- en dissociatiestappen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Figuur S3: Assay-opzetcycli, inclusief basislijn, eiwitbelasting, tweede basislijn, associatie en dissociatie. Afkortingen: B = buffer; L = belasting; 0, 5, 10, 20, 30, 50 en 100 = GsMTx4-concentraties in μM. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Figuur S4: Nieuwe workflow voor kinetica (K) analyse. Selecteer het Experiment-icoon , dat een overzicht geeft van alle assays die binnen één enkel experiment zijn uitgevoerd. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Figuur S5: Nieuwe kinetische (K) analyseworkflow.Uitlijnen en filter-icoon , waar ruwe gegevens voor zowel associatie- als dissociatiefasen kunnen worden bekeken en geanalyseerd. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur S6: Nieuwe workflow voor kinetische analyse (K).Stel het referentiepictogram in , gebruikt om de juiste referentiesensor te selecteren voor achtergrondaftrekking en nauwkeurige gegevensinterpretatie. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Figuur S7: Bindingspassen stappen in de kinetische analyseworkflow. Kinetische fittingparameters die worden gebruikt voor het analyseren van bindingsinteractiegegevens. Het model gaat uit van een 1:1 interactie met een enkele ligandbindingsplaats. Het fittingtype wordt op lokaal gezet, waarbij elke concentratiecurve onafhankelijk wordt aangepast in plaats van globaal. De Full fitting-optie met Full Stitch ingeschakeld omvat de volledige continue associatie- en dissociatiecurves. Tijdsvensters voor associatie- en dissociatiefasen zijn respectievelijk ingesteld van 0 tot 300 s en 0 tot 200 s. Op de achtergrond illustreren de binding fitting-grafiek, residugrafiek en individuele assay-curves de fitkwaliteit en experimentele variabiliteit. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur S8: Bindingspassen in de kinetische analyseworkflow. Binding fitting-grafiek die associatie- en dissociatiefasen toont over meerdere assay-replicaties en probeposities (C1 en D1). De residugrafiek hieronder beoordeelt fit-kwaliteit, waarbij residuen verschillen aangeven tussen de experimentele data en het fitte model; Waarden dicht bij nul weerspiegelen een goede match. De bijgevoegde tabel vat passende statistieken samen, waaronder Full R², Association R², Dissociation R² en Chi-kwadraat (X²) waarden voor elke replica. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Figuur S9: Bindingspassen stappen in de kinetische analyseworkflow. Kinetische analyse van bindingsinteracties van meerdere replicaten en probeposities (C1 en D1). De sensorresponsverschuiving (nm) over tijd (s) toont associatie- en dissociatiefasen, waarbij elke kromme wordt gekleurd door assay en probepositie. De verticale gestippelde rode lijn markeert de overgang tussen associatiefasen (0-300 s) en dissociatiefase. Hieronder staat kinetische parameters die zijn afgeleid van de 1:1 bindingsmodelpasvorming, waaronder analytenconcentratie (M conc.), associatiesnelheidsconstante (kon), dissociatiesnelheidsconstante (koff), fouten en de evenwichtsdissociatieconstante (KD). De consistente pasvorm ondersteunt de robuustheid van de kinetische metingen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Tabel S1: Tabel die de symbolen illustreert die gebruikt worden in zowel de 384-well-plaat als de Max-plaat. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende tabel S2: Kinetische parameters verkregen voor de vier concentraties van TMEM120A M207A geladen op FLAG-biosensoren die interageren met 100 nM GsMTx4-peptide, met vaste kon- en koff-waarden. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

Het karakteriseren van interacties tussen membraaneiwitten blijft uitdagend vanwege de noodzaak van nauwgezette eiwitzuivering, zorgvuldige optimalisatie van detergentconcentratie en nauwkeurig assayontwerp. Deze studie presenteert een gedetailleerde workflow voor TMEM120A M207A, waarin zowel zuivering als kinetische analyse worden geïllustreerd met GsMTx4 met biolaaginterferometrie (BLI).

Kritieke stappen en optimalisatie:
Een van de belangrijke cruciale stappen was de concentratie van detergent, die werd geïdentificeerd als een belangrijke factor van eiwitstabiliteit. Het zuiveringsproces omvatte celsolubilisatie met een buffer die 0,5% LMNG bevatte, gevolgd door sequentiële wasbeurt met 0,005% LMNG, elusie met 0,001% LMNG, en definitieve grootte-uitsluitingschromatografie (SEC) in een buffer met 0,00015% LMNG. Deze detergentstrategie, gebaseerd op LMNG's lage kritische micelleconcentratie (CMC) en vertraagde snelheid, zorgde voor verbeterde stabiliteit van het eiwit in micellen tijdens zuivering. De SEC-buffer bevatte detergent in een concentratie die tien keer lager was dan de CMC van LMNG (0,001%), waardoor de impact op downstream biofysische assays effectief werd geminimaliseerd. Eiwithomogeniteit en het ontbreken van aggregatie werden bevestigd met behulp van massaspectrometrie en thermische stabiliteitsanalyse. Figuur 2, Figuur 3 en Figuur 4 illustreren succesvolle optimalisatie van zuivering en eiwitstabilisatie in sub-CMC detergentconcentraties.

Eiwitimmobilisatie op de biosensor werd zorgvuldig gecontroleerd om 50-80% probe-saturatie te bereiken. Een belastingsniveau van 50-80% kan een zekere mate van beperking van massatransport veroorzaken; dit bereik werd echter geselecteerd om voldoende signaalsterkte te bieden in het BLI-systeem, waarbij de sondes tijdens de assay tussen putten bewogen. Het bereiken van dit niveau van ligandimmobilisatie hielp om een consistente signaalkwaliteit te behouden, hoewel dergelijke belastingsniveaus zowel voordelen als mogelijke beperkingen hebben. Het opnemen van een referentieprobe was cruciaal voor BLI-experimenten.

Een extra controle-experiment waarbij vier verschillende niveaus van geïmmobiliseerde TMEM120A werden getest met één peptideconcentratie (100 nM). Deze gegevens zijn nu opgenomen in het herziene manuscript (Aanvullende Figuur S1). Het verhogen van de hoeveelheid geïmmobiliseerd eiwit leverde hogere belastingssignalen op, maar in alle gevallen bleef de verschuiving onder de 1 nm ten opzichte van de basislijn (Aanvullende Figuur S1A). We rapporteerden de gepasste associatie- en dissociatiecurves met behulp van een globaal 1:1 bindingsmodel, en we includeerden ook de residugrafieken, die kleine niet-significante verschillen laten zien tussen de gepasseerde en experimentele gegevens.

In de belangrijkste kinetische assays (5-100 μM analyse) toonden de gepasseerde snelheidsconstanten de verwachte concentratieafhankelijke trends. De koff-waarden varieerden van ongeveer 1,48 × 10⁻⁴ tot 1,43× 10⁻³ s⁻¹, terwijl de kon-waarden varieerden van 1,12 × 10² tot 1,26 × 10¹ M⁻¹s⁻¹. Deze geleidelijke veranderingen over de concentratiereeks zijn consistent met normaal analytafhankelijk associatie- en dissociatiegedrag.

In het controle-experiment, waarbij verschillende probe-belastingsniveaus werden getest bij één analyteconcentratie (100 nM), leverden alle vier de sporen zeer vergelijkbare kinetische constanten op. De koff-waarden waren consequent 1,42 × 10⁻¹ s⁻¹, en de kon-waarden waren consequent 2,76 × 10³ M⁻¹s⁻¹ over alle belastingniveaus. Dit gebrek aan variatie suggereert dat noch de associatie- noch de dissociatiefase werd beïnvloed door probedichtheid, massatransportbeperkingen of analytenherbinding.

Er wordt ook verwacht dat de dissociatie bij 100 nM sneller verschijnt in het controle-experiment. De 100 nM-analytenconcentratie ligt ongeveer een orde van grootte onder de KD, en bij concentraties ver onder KD is het complex minder stabiel en is de effectieve bezetting laag. Onder dergelijke omstandigheden verloopt dissociatie sneller omdat de bindingsaffiniteit zwakker is bij lage analytenconcentraties, en de reassociatie tijdens de dissociatiefase minimaal is. Dit gedrag komt overeen met wat typisch wordt waargenomen wanneer de analyteconcentratie aanzienlijk lager is danK-D.

Gezamenlijk ondersteunen de consistentie van de kinetische parameters over probebelastingen en het verwachte gedrag bij lage analytenconcentraties het idee dat de waargenomen snelheidsconstanten echte bindingseigenschappen weerspiegelen in plaats van artefacten van oppervlaktebelasting of massatransporteffecten.

Bindingskinetiek en interpretatie:
Kinetische analyse werd uitgevoerd met een 1:1 Langmuir associatie-dissociatiemodel met een lokale full-fittingstrategie, waarbij individuele analytenconcentraties onafhankelijk werden aangepast binnen een gedeeld kinetisch kader (Figuur 6B). Deze benadering werd gekozen boven traditionele globale fitting omdat bepaalde datasets, vooral bij lagere ligandconcentraties, kleine overlappingen of vroege fase-afwijkingen vertoonden, waarschijnlijk veroorzaakt door beperkingen in massatransport en de effecten van detergentmicelle op eiwitdiffusie. Global fitting gaat ervan uit dat alle sporen strikt hetzelfde kinetische gedrag volgen, wat kan worden aangetast wanneer de toegankelijkheid van het oppervlak of de lokale microomgeving iets verschilt tussen concentraties. Lokale volledige fitting maakte het mogelijk om elke analyteconcentratie onafhankelijk te modelleren, terwijl een consistent kinetisch kader behouden bleef, zodat de afgeleide parameters het gedrag bij elke concentratie nauwkeurig weerspiegelden. De aangepaste krommen (rood) kwamen nauw overeen met de experimentele sporen, wat resulteerde in een geschatte dissociatieconstante (KD) in het lage micromolaire bereik. Residuele analyse (Figuur 6C) toonde geen grote systematische afwijkingen aan, wat de geschiktheid van het model ondersteunt voor deze detergent-oplosbare membraaneiwitinteracties.

TMEM120A M207A en GsMTx4 vertoondenKD-waarden in het lage micromolaire bereik (∼0,8-3,3 μM). De associatiesnelheid (kon) nam matig toe met ligandconcentratie, terwijl de dissociatiesnelheid (koff) zeer traag bleef, wat wijst op stabiele complexvorming. De initiële snelle signaalverval tijdens de eerste 5-10 seconden van dissociatie weerspiegelde waarschijnlijk gemakkelijk toegankelijke bindingsplaatsen, terwijl de langzamere fase stabielere interacties vertegenwoordigde (Figuur 6A). Deze observaties benadrukken het belang van zorgvuldig selecteren dissociatievensters en het overwegen van massatransportbeperkingen bij het analyseren van detergent-oplosbare membraaneiwitten (Tabel 2).

Beperkingen en probleemoplossing:
Er moeten verschillende beperkingen worden overwogen voor detergent-oplosbare membraaneiwitten zoals TMEM120A M207A. Massatransporteffecten kunnen optreden tijdens de vroege associatiefase, omdat het eiwit langzaam naar het biosensoroppervlak kan diffunderen, wat de kinetische metingen licht kan vervormen. Overbelasting van sensoren is mogelijk als de verzadiging van de sonde het aanbevolen bereik van 50-80% overschrijdt, wat mogelijk de nauwkeurigheid van globale kinetische analyse beperkt en de kon- en koffwaarden beïnvloedt. Detergent-afhankelijke effecten kunnen invloed hebben op de stabiliteit van eiwitten, de oligomere toestand of de toegankelijkheid van het oppervlak, vooral bij concentraties boven of nabij de CMC. Aanvullende factoren zijn onder meer lichte basislijndrift, niet-specifieke binding en uitdagingen bij het vastleggen van de kinetiek van zeer langzame dissociatie.

Veel van deze problemen kunnen worden verminderd door eenvoudige aanpassingen: het verminderen van de eiwitbelasting om oververzadiging te voorkomen, het optimaliseren van de samenstelling van de buffer en het opnemen van referentieprobes om baseline drift of niet-specifieke signalen te corrigeren. In deze studie minimaliseerde de SEC-buffer met 0,00015% LMNG en lage concentraties Tween-20 effectief de niet-specifieke binding terwijl de eiwitstabiliteit behouden bleef. Het zorgvuldig selecteren van het dissociatievenster voor kinetische fitting, samen met replicatemetingen en residuanalyse, was ook belangrijk om de betrouwbaarheid van kinetische parameters te bevestigen. Deze strategieën verbeteren doorgaans de reproduceerbaarheid en helpen robuustere en interpreteerbaardere data te genereren. Lokale volledige fitting werd toegepast in plaats van globale fitting om rekening te houden met kleine verschillen tussen sporen bij individuele ligandconcentraties, zodat kinetische parameters het gedrag van elke dataset nauwkeurig weerspiegelden.

BLI en andere biofysische technieken:
In vergelijking met oppervlakteplasmonresonantie (SPR) en isotherme titratiecalorimetrie (ITC) biedt biolaaginterferometrie (BLI) verschillende praktische voordelen voor het analyseren van interacties tussen membraaneiwit en ligand. Net als SPR en ITC kan BLI gedetailleerde inzichten bieden in bindende interacties, waaronder associatiesnelheden (kon), dissociatiesnelheden (koff) en evenwichtsdissociatieconstanten (KD), zonder dat complexe microfluïdische systemen of een hoge eiwitconcentratie14 nodig zijn. Het open-well, dip-and-read formaat maakt snelle bufferuitwisseling en parallelle verwerking van meerdere monsters mogelijk, wat een hogere experimentele doorvoer ondersteunt. In tegenstelling tot ITC, dat grote hoeveelheden zeer zuiver eiwit vereist en thermodynamische gegevens levert, kan BLI zowel de snelheid van complexvorming als dissociatie meten vanaf minimale monsterconcentratie in nanomolair. BLI is ook compatibel met detergent- of lipidenhoudende buffers, waardoor het geschikt is voor laag-opbrengst of instabiele membraaneiwitten die moeilijk te bestuderen zijn met andere biofysische methoden. Ondanks deze voordelen blijven complementaire technieken zoals SPR of ITC nuttig voor het bevestigen van thermodynamische consistentie en het kruisverifiëren van bindingsparameters onder detergentvrije en detergentische omstandigheden, maar vereisen ze een hoge eiwitconcentratie3.

Toekomstige richtingen:
Deze workflow kan worden uitgebreid om andere membraaneiwitten, eiwit-lipide interacties of het screenen van kleinmolecuulmodulatoren te bestuderen. Het combineren van BLI met orthogonale benaderingen zoals massafotometrie, structurele karakterisering of cryo-EM kan meer gedetailleerde inzichten bieden in oligomerisatie, stoichiometrie en bindingsmechanismen. Verdere optimalisatie kan ook analyse mogelijk maken van liganden met hoge affiniteit, multivalente interacties of complexen in meer inheemse lipidenomgevingen.

Samenvattend maakt zorgvuldige controle van eiwitimmobilisatie, detergentconcentratie en buffercondities het mogelijk dat BLI betrouwbare, reproduceerbare kinetische gegevens genereert voor TMEM120A M207A en vergelijkbare uitdagende membraaneiwitten. Hoewel er inherente beperkingen zijn, biedt de methode een robuust platform voor het bestuderen van specifieke, moderat-affiniteit eiwit-ligand interacties onder goed gedefinieerde experimentele omstandigheden.

Openbaarmakingen

De auteurs hoeven geen belangenconflicten aan te geven.

Dankbetuigingen

Wij danken oprecht het onderzoeksplatform van de Universiteit van Melbourne, de Melbourne Protein Characterisation (MPC) Facility, voor de ondersteuning bij eiwitzuivering en karakterisering. Het onderzoek werd ondersteund door de National Health and Medical Research Council (NHMRC) Ideas Grant (2020/GNT2000934 aan I.R.) en de Australian Research Council (Industrial Transformation Training Centres, IC200100052 aan I.R. en aan M.M.).

Materialen

```html
Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
384-well black microplateGreiner Bio-One781906BLI
Amicon Ultra Centrifugal Filter, 30 kDa MWCOSigma-AldrichUFC903008Purification
Anti-FLAG probeGator Bio160036BLI
ANTI-FLAG M2 Affinity GelSigma-AldrichA2220-10MLPurification
BioRenderBioRenderhttps://biorender.comFigure 1 creation 
Bovine Serum AlbuminSigma-Aldrich9048-46-8Mass photometry
CD 293 Medium (1x)Thermofisher11913019Cell culture
Centrifuge 5920 R: Large Capacity and High PerformanceEppendorfNAPurification
cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor CocktailMerck11836170001Purification
Deoxyribonuclease I from bovine pancreasSigma-Aldrich9003-98-9Purification
ExpiFectamine 293 Transfection KitThermofisherA14524Transfection
Gator Bio softwareGator BioNABLI
Gator PlusGator BioNABLI
GlutaMAX SupplementThermofisher35050061Cell culture
GsMTx4 trifluoroacetateSigma-AldrichSML3140-1MGBLI
HEK293T/SF17 cells adapted to suspension growthATCCATCC CRL11268Cell culture
LMNG (Lauryl maltose neopentyl glycol)ThermofisherA50940Purification
Max PlateGator Bio130062BLI
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)Sigma-Aldrich11359061001Purification
Prometheus High Sensitivity CapillariesNano TemperPR-C006Thermodynamic stability
Prometheus PantaNano TemperNAThermodynamic stability
Q Buffer (0.3% Glycine pH 3.8)Gator Bio120010BLI
Qsonica Q500 Sonicator Ultrasonic Cell DisrupterQsonicaNAPurification
Superdex 200 Increase 10/300 GLCytivaGE28-9909-44Purification
Synthesized TMEM120A (M207A) gene cloned into pCDNA 3.1 plasmid with FLAG-3C-LinkerGenScript BiotechNAPlasmid
TWEEN 20Sigma-AldrichP1379-25MLBLI
Two MPRefeynNAMass photometry
```

Referenties

  1. Rong, Y., et al. TMEM120A contains a specific coenzyme A-binding site and might not mediate poking- or stretch-induced channel activities in cells. eLife. 10, e71474(2021).
  2. Livnat-Levanon, N., Vigonsky, E., Lewinson, O. Real-time measurements of membrane protein-receptor interactions using surface plasmon resonance (SPR). J Vis Exp. (93), e51937(2014).
  3. Kovachka, S., Soule, P., Mus-Veteau, I. Microscale thermophoresis to evaluate the functionality of heterologously overexpressed membrane proteins in membrane preparations. Methods Mol Biol. 2507, 445-461 (2022).
  4. Ciesielski, G. L., Hytönen, V. P., Kaguni, L. S. Biolayer interferometry: a novel method to elucidate protein-protein and protein-DNA interactions in the mitochondrial DNA replisome. Methods Mol Biol. 1351, 223-231 (2016).
  5. Concepcion, J., et al. Label-free detection of biomolecular interactions using biolayer interferometry for kinetic characterization. Comb Chem High Throughput Screen. 12, 791-800 (2009).
  6. Apiyo, D. O. Biolayer interferometry (Octet) for label-free biomolecular interaction sensing. Handbook of Surface Plasmon Resonance. Schasfoort, R. B. N. , 2nd edn, Royal Society of Chemistry. 356-397 (2017).
  7. Egan, D., Slaybaugh, C., Wang, R. Getting started: kinetics assay using bio-layer interferometry. Gator Bio Technical Note. , (2023).
  8. Beaulieu-Laroche, L., et al. TACAN is an ion channel involved in sensing mechanical pain. Cell. 180 (5), 956-967.e17 (2020).
  9. Niu, Y., et al. Analysis of the mechanosensor channel functionality of TACAN. eLife. 10, (2021).
  10. Xue, J., et al. TMEM120A is a coenzyme A-binding membrane protein with structural similarities to ELOVL fatty acid elongase. eLife. 10, e71220(2021).
  11. Chen, X., et al. Cryo-EM structure of the human TACAN in a closed state. Cell Rep. 38, 110445(2022).
  12. Suchyna, T. M. Piezo channels and GsMTx4: two milestones in our understanding of excitatory mechanosensitive channels and their role in pathology. Prog Biophys Mol Biol. 130, 244-253 (2017).
  13. Wallner, J., Lhota, G., Jeschek, D., Mader, A., Vorauer-Uhl, K. Application of bio-layer interferometry for the analysis of protein/liposome interactions. J Pharm Biomed Anal. 72, 150-154 (2013).
  14. Wang, D. S., Fan, S. K. Microfluidic surface plasmon resonance sensors: from principles to point-of-care applications. Sensors (Basel). 16 (8), 1175(2016).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Binding van membraaneiwitteninteractie tussen eiwit en inhibitorGsMTx4 peptideTMEM120A mutantdetergentoptimalisatiemassafotometriedifferenti le scanningfluorimetrieFLAG tag immobilisatiekinetische metingen
Video binnenkort beschikbaar

Gerelateerde artikelen