Methodenartikel

Efficiënte en snelle generatie van CAR-T en cytokine-geïnduceerde killercellen in GMP-schaalbare apparaten

1.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/69369

⸱

5 december 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Immunology and Molecular Oncology Unit, Veneto Institute of Oncology IOV - IRCCS, 2Department of Surgery, Oncology and Gastroenterology, University of Padua, 3Department of Cardiac, Thoracic, Vascular Sciences and Public Health, University of Padua

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een schaalbare methode voor de uitbreiding van Adoptive Cell Therapies (ACT)-producten, namelijk Chimeric Antigen Receptor (CAR)-T-cellen en Cytokine-Induced Killer (CIK)-cellen, met behulp van gaspermeable Rapid expansion (G-Rex) apparaten, waarmee efficiënte en robuuste groei wordt aangetoond in een klinisch relevante omgeving.

Samenvatting

Adoptieve celtherapieën (ACT) zijn de afgelopen jaren snel gevorderd, spelen een cruciale rol in kankerimmunotherapie en beïnvloeden de behandelingsuitkomsten significant. Een cruciale stap in de ontwikkeling van celtherapieën, zowel in de preklinische als klinische fase, is het productieproces. Conventionele statische kweekmethoden vereisen frequente celmanipulatie en worden vaak beperkt door verminderde gasuitwisseling en voedingsstoffentoevoer, wat de celopbrengst en het fenotype kan aantasten. Hier presenteren we een stapsgewijze, reproduceerbaar en schaalbaar protocol voor de ex vivo uitbreiding van twee ACT-producten, namelijk Chimeric Antigen Receptor (CAR)-T en Cytokine-Induced Killer (CIK) cellen, met behulp van Gas-permeable Rapid expansion (G-Rex) apparaten. G-Rex-apparaten zijn specifiek ontworpen om de nutriëntenuitwisseling te verbeteren en hoogdichtheidsculturen te ondersteunen met minimale gebruikersinterventie. Onder verschillende ACT-benaderingen hebben CAR-T-cellen opmerkelijk succes getoond bij de behandeling van hematologische maligniteiten, wat een snelle vooruitgang van experimenteel onderzoek naar klinische toepassingen mogelijk maakte. Naast CAR-T-cellen zijn CIK-cellen ook veelvuldig toegepast in klinische onderzoeken vanwege hun karakteristieke fenotype en het ontbreken van therapiegerelateerde bijwerkingen en Graft-versus-Host Disease (GvHD). Dit protocol beschrijft de belangrijkste technische stappen voor beide celtypen, te beginnen met de isolatie en het zaaien van perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's). Kort gezegd worden PBMC's gestimuleerd met anti-CD3/CD28-antilichamen, gevolgd door lentivirale transductie om CAR-T-cellen uit te breiden, of met Interferon-γ (IFN-γ), anti-CD3-antilichamen en Interleukine 2 (IL-2) om CIK-cellen te verkrijgen. Flowcytometrie wordt gebruikt om de levensvatbaarheid en het fenotype van de cellen te monitoren, en functionele assays worden uitgevoerd om het therapeutisch potentieel van het celproduct te bevestigen en de schaalbaarheid van de aanpak te valideren. Al met al biedt dit protocol een praktische oplossing voor het produceren van grote aantallen effectorcellen in een preklinische omgeving, waardoor klinische toepassing bij verschillende populaties van immuuncellen mogelijk wordt. Ten slotte biedt het een schaalbare oplossing voor de productie van high-yield effectorcellen.

Inleiding

Adoptieve celtherapie (ACT) is een belangrijke pijler geworden van geavanceerde therapieën voor kankerbehandeling. Deze aanpak is gebaseerd op het toedienen van ex vivo uitgebreide cellulaire producten om anti-tumor effectiviteitte bereiken 1. Tot nu toe zijn veel celtypen gebruikt in ACT, variërend van antigeen-aspecifieke benaderingen, bijvoorbeeld natuurlijke killer (NK)2, cytokine-geïnduceerde killer (CIK)3,4, natuurlijke killer T (NKT)5, of γδ T-cellen6, tot zeer specifieke en gepersonaliseerde cellen, zoals tumor-infiltrerende lymfocyten (TILs)7 en gemanipuleerde cellengebaseerde therapieën, bijvoorbeeld chimerische antigeenreceptor (CAR)1, 8 en T-cel receptor (TCR) cellen 9,10.

CAR-T-cellen zijn genetisch gemodificeerde T-cellen die worden gegenereerd door ex vivo virale transductie om een synthetische immuunreceptor tot expressie te brengen, ontworpen om een specifiek moleculair doelwit te herkennen. De CAR-structuur bestaat uit een antigeen-specifiek enkelvoudig variabele Fragment (scFv) antilichaam, gecombineerd met intracellulaire signaaldomeinen, waaronder de TCRζ-keten en costimulerende moleculen. Bij antigeenbetrokkenheid levert het intracellulaire domein activatiesignalen af die de proliferatie van T-cellen en antitumoractiviteitbevorderen.

CIK-cellen zijn een heterogene populatie van geactiveerde T-lymfocyten die tijdens ex vivo expansie van CD56 verwerven uit perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC's) of navelstrengbloed (UCB)12. Deze expansie omvat stimulatie met Interferon-γ (IFN-γ), anti-CD3 monoklonale antilichamen en Interleukine-2 (IL-2), gevolgd door 14 dagen kweek in IL-2. CIK-cellen lijken functioneel op zowel NK- als T-cellen en oefenen antitumoractiviteit uit via zowel major histocompatibility complex (MHC)-onafhankelijke als afhankelijke mechanismen 13,14,15,16. Deze eigenschappen maken het mogelijk om CIK-cellen te gebruiken in zowel allogene als autologe therapeutische omgevingen met minimaal graft-versus-host ziekte (GvHD) risico17.

In de klinische praktijk vereisen zowel CAR-T als CIK-celtherapieën de toediening van grote aantallen cellen. CAR-T-cellen worden geïnfuseerd met 50-200 miljoen doses per patiëntvan 18 jaar. Evenzo worden CIK-cellen doorgaans toegediend in doses tot 10 miljard cellen per infuus, waarbij patiënten vaak meerdere infusen krijgen afhankelijk van het behandelprotocol19. Traditionele celkweekmethoden met kolven of platen zijn inefficiënt, tijdrovend en vereisen frequente overdracht, waardoor grootschalige uitbreiding onhaalbaar wordt en het risico op besmetting toeneemt. Geautomatiseerde of semi-geautomatiseerde systemen met zakkweken of bioreactoren maken grootschalige uitbreiding mogelijk, maar hebben beperkingen, zoals schuifspanning of de noodzaak van dichtheidsaanpassingen en frequente mediumperfusie 20,21, en het hanteren van één batch tegelijk, wat leidt tot hoge kosten in zowel academische als industriële contexten. In deze uitdagende situatie wordt een alternatief gerepresenteerd door het gaspermeable rapid expansion (G-Rex) apparaat, een statische kweekmethode met een siliciummembraan op de bodem van de put, wat zorgt voor efficiënte zuurstofuitwisseling en een grotere hoogte van de vaten, waardoor een grote volumecapaciteit mogelijk is. Het systeem ondersteunt dus celgroei zonder middelvervanging of dichtheidsaanpassing22,23. G-Rex-M-systemen hebben schaalbaarheid tot 5000 mL aangetoond en zijn compatibel met geautomatiseerde oogstsystemen, waardoor een besmettingsvrij en gesloten kweekplatform wordt geboden dat gemakkelijk vertaalbaar is van academische naar klinische omgevingen voor de ontwikkeling van geavanceerde geneesmiddelen (ATMP's).

In de beschreven procedure hebben we de voordelen en eigenschappen van G-Rex-apparaten benut om het uitbreidingsprotocol van zowel CAR-T als CIK-cellen te optimaliseren. We toonden aan dat beide celtypen efficiënt kunnen worden uitgebreid en opgeschaald, waarbij een consistent fenotype en functioneel profiel behouden blijven over verschillende kweeksystemen. Een schematisch overzicht van het expansieprotocol voor zowel CIK- als CAR-T-cellen is weergegeven in Figuur 1.

Figuur 1
Figuur 1: Overzicht van CAR-T en CIK celexpansieprotocollen met gebruik van G-24 of G-6M kweekapparaten. CAR-T en CIK-cellen worden vanaf dag 0 uit geïsoleerde PBMC's geëxplodeerd. Voor de uitbreiding van CAR-T-cellen worden PBMC's op dag 1 gestimuleerd met anti-CD3- en anti-CD28-antilichamen, genetisch gemodificeerd op dag 2, en vervolgens gekweekt met hIL-7 en hIL-15 suppletie elke 3-4 dagen, met de laatste oogst voor functionele assays op dag 9. In het G-6M-formaat is cytokinesuppletie beperkt tot dag 2, zonder extra cytokinevoeding gedurende de kweekperiode. Voor de uitbreiding van CIK-cellen worden PBMC's op dag 1 gestimuleerd met rhIFN-γ en op dag 2 met anti-CD3-antistoffen en rhIL-2, die vervolgens elke 3-4 dagen worden toegediend. Bij G-24 is een mediumverandering vereist gelijktijdig met het cytokinesupplement. CIK-cellen worden op dag 14 geoogst voor latere functionele assays. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Protocol

Geanonimiseerde buffy coats van gezonde donoren die eerder waren getest op afwezigheid van pathogene besmetting (bijv. HIV, HCV, HBV, syfilis) werden verkregen bij de Bloedbank van het Padova Ziekenhuis vóór schriftelijke geïnformeerde toestemming. Bloedmonsters werden gemanipuleerd in gecertificeerde bioveiligheidskasten en het personeel droeg de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM).

OPMERKING: Alle procedures met lentivirale vectoren zijn uitgevoerd onder BioSafety Level 2 (BSL-2) voorwaarden, volgens de institutionele richtlijnen. Behandeling van lentivirale vectoren vereist extra voorzorgsmaatregelen, waaronder dubbele handschoenen. Biogevaarlijk afval (waaronder virale materialen, getransduceerde cellen en mensgemaakte monsters) werd geautoclaveerd vóór verwijdering, terwijl chemisch afval (inclusief fluorescerende kleurstoffen en reagentia) volgens institutionele protocollen voor gevaarlijk afval moest worden gescheiden. Let op dat specifieke bioveiligheidsvereisten per instelling kunnen verschillen en vooraf moeten worden geverifieerd voordat het protocol wordt ingevoerd.

1. PBMC's isolatie

  1. Isoleer PBMC's uit gezonde donor buffycoats of perifere bloedmonsters door dichtheidsgradiëntcentrifugatie. Verdun de buffy cos met een gelijke hoeveelheid steriele 1x fosfaatbuffer zoutoplossing (PBS) en leg het verdund bloed zorgvuldig over hetzelfde volume Lymphoprep in een 50 mL kegelvormige buis. Verdunning met 1x PBS is niet nodig voor perifere bloed. Centrifugeer op 400 x g gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur zonder rem.
  2. Na centrifugatie verzamel je de PBMC-laag op het plasma-Lymfoprep-interface en was je deze met steriele 1x PBS. Centrifugeer en resuspendeer PBMC's in hematopoëtisch celkweekmedium (CM) aangevuld met 1% penicilline/streptomycine (hierna cCM). Beoordeel het aantal cellen en de levensvatbaarheid met behulp van de Trypan Blue uitsluitingsassay.

2. CAR-T-celexpansie door PBMC's in G-24-kweekvaten

  1. PBMC-activatie (Dag 0)
    1. Suss 2 x 106 vers geïsoleerde PBMC's in 2 mL cCM, aangevuld met 5% foetaal rundereserum (FBS) (hierna cCM-F), wat resulteert in een uiteindelijke zaaidichtheid van 1 x 106 PBMC's/cm2/mL, en breng het over in een put van een 24-put G-Rex (G-24) kweekvat. Zaad zoveel putten als het aantal verschillende transductiecondities dat op Dag 1 moet worden uitgevoerd (Stap 2.2 - Dag 1).
    2. Voeg 4 μl anti-CD3 (zuiver-functionele kwaliteit, eindconcentratie: 0,2 μg/mL) en 20 μl anti-CD28 (zuiver-functionele kwaliteit, eindconcentratie: 1 μg/mL) antilichamen direct toe aan elke put om T-cellen te activeren. Kweekcellen in een bevochtigde couveuse gehouden op 37 °C, 5%CO2.
  2. T-celtransductie met lentivirale vectoren (Dag 1)
    1. Na nachtelijke stimulatie oogst en telt u de geactiveerde T-cellen met behulp van de Trypan Blue uitsluitingstest om de levensvatbaarheid te beoordelen. Bereken 1 x 106 levensvatbare geactiveerde cellen voor elke put van G-24 (putoppervlak van 2 cm²), wat overeenkomt met een zaaddichtheid van 0,5 x 106 cellen/cm². Cellen overbrengen in een buis en centrifugeren op 300 x g gedurende 5 minuten.
    2. Bereid het transductiemedium voor elke put voor door het juiste lentivirale vectorvolume te combineren, gebaseerd op de concentratie (TU/mL) van de lentivirale vectorpreparaat (hier, CD19-CAR-BBζ lentivirus verkregen van St. Jude Children's Research Hospital25; multipaticiteit van infectie (MOI) 20), met 5 μl van de transductie-enhancer protamine sulfaat (8 mg/mL voorraadoplossing wordt verkregen door protaminesulfaat op te lossen in 1x PBS en steriel gefilterd met een 0,2 μm filter; eindconcentratie van 50 μg/mL). Gebruik CM-medium aangevuld met 5% FBS zonder toevoeging van penicilline/streptomycine om een uiteindelijk volume van 0,8 mL/put (0,4 mL/cm²) te bereiken. Voor niet-transduceerde (UTD) controle bereid je het beschreven transductiemedium voor zonder de toevoeging van lentivirale vectoren.
    3. Suspendeer pelleted cellen (stap 2.2.1) opnieuw in 0,8 mL/put transductiemedium en plaat ze in een nieuwe G-24 put. Incubeer 's nachts bij 37 °C, 5%CO-2.
      OPMERKING: Als transductie van meerdere putten met dezelfde lentivirale vector gepland is, bereid dan een mastermix voor van het transductiemedium met het virus en protaminesulfaat in de gewenste concentratie. Meng goed om homogeniteit te garanderen. Vervolgens aliquot 0,8 mL van deze master mix in elke buis met pelletcellen om consistente transductiecondities over alle monsters te garanderen.
  3. CAR-T-cellen kweken en uitzetten (dag 2 tot dag 9)
    1. Op dag 2 verhoog je het kweekvolume tot een eindvolume van 8 mL/put door 7,2 mL verse cCM-F toe te voegen, aangevuld met humaan Interleukine-7 (hIL-7) en humaan Interleukine-15 (hIL-15) bij een uiteindelijke concentratie van 10 ng/mL elk (volume cytokines berekend met een totaal volume van 8 mL per put).
    2. Op dag 5 vernieuw je het kweekmedium door zorgvuldig 6 mL geconditioneerd medium uit elke put te verwijderen zonder de cellen onderin de put te verstoren, en dit te vervangen door 6 mL verse cCM-F aangevuld met hIL-7 en hIL-15 (eindconcentratie: 10 ng/mL berekend met een totaal volume van 8 mL per put). Bij het werken met meerdere putten, bereid dan een mastermix van cCM-F-media aangevuld met hIL-7 en hIL-15 cytokines om een gelijkmatige verdeling van de cytokines te garanderen.
    3. Op dag 9 worden de CAR-T-cellen efficiënt uitgebreid en klaar voor latere toepassingen. Om de CAR-T-cellen te oogsten, verwijder en verwijder je voorzichtig 5 ml geconditioneerd medium. Met een 1000 μL pipet, suspensieer je de CAR-T-cellen opnieuw in de resterende 3 mL media en plaats je ze in een 15 mL buis. Tel CAR-T-cellen en controleer hun levensvatbaarheid met behulp van de Trypan Blue exclusion-assay. Typisch worden ongeveer 3 x 10 7 CAR-T-cellen (3,24 ± 1,67 x 107cellen) verkregen uit elke G-24-put (Aanvullende Tabel 1).

3. CIK-uitbreiding in G-24 kweekvaten

  1. PBMC-activatie (Dag 0)
    1. Zaad 1 x 106 vers geïsoleerde PBMC's per put van een G-24 kweekvat, wat overeenkomt met een dichtheid van 0,5 x 106/cm2, in 8 mL cCM aangevuld met recombinant menselijk Interferon-γ (rhIFN-γ, eindconcentratie: 1000 IU/mL). Incubeer de cellen bij 37 °C, 5%CO2.
  2. CIK celstimulatie en -uitbreiding (Dag 1 tot Dag 14)
    1. Op dag 1, 22-24 uur na rhIFNγ-stimulatie, voeg direct 4 μL anti-CD3 antilichaam (eindconcentratie: 50 ng/mL) en 4 μL recombinant humaan Interleukine-2 (rhIL-2, eindconcentratie: 500 IU/mL) toe aan elke put. Incubeer de cellen bij 37 °C, 5%CO2.
    2. Elke 3 tot 4 dagen (op dag 5, 9 en 12 van celkweek) wordt 6 mL geconditioneerd medium vervangen door verse cCM en rhIL-2 (eindconcentratie: 500 IU/mL), waarbij de uiteindelijke concentratie rhIL-2 wordt berekend ten opzichte van het volledige volume van 8 mL.
    3. Op dag 14 oogst je CIK-cellen door 5 mL geconditioneerd medium weg te gooien en deze opnieuw te suspenderen in de resterende 3 mL geconditioneerd medium. Breng cellen over in een buis van 15 mL en beoordeel het totale aantal cellen en de levensvatbaarheid van cellen met behulp van de Trypan Blue uitsluitingstest. Typisch worden ongeveer 8 x 107 bulk CIK-cellen (8,6 ± 4,58 x 107cellen) verkregen uit elke put (Aanvullende Tabel 2).
      OPMERKING: Aspireer tijdens mediumwisselingen voorzichtig het supernatant, waarbij je erop let dat je de cellaagpopulatie niet verstoort of het gasdoorlatende membraan niet raakt. Schade aan het membraan kan de gasuitwisseling belemmeren en de levensvatbaarheid van de cel negatief beïnvloeden.

4. Grootschalige productie van CAR-T en CIK-cellen

OPMERKING: De CAR-T en CIK-celexpansieprotocollen beschreven in secties 2 en 3 kunnen eenvoudig worden opgeschaald naar grotere G-Rex-kweekapparaten, namelijk het G-6M-formaat. Bij de overgang van het G-24-formaat (oppervlakte: 2 cm2) naar het G-6M-apparaat (oppervlakte: 10 cm2) blijven alle concentraties en dichtheden constant, terwijl alle volumes en absolute grootheden evenredig worden vergroot met een factor 5 om het toegenomen oppervlak te evenaren. Dit betekent dat de zaaidichtheid van cellen, de concentraties van mediasupplementen en de concentraties van cytokinen ongewijzigd blijven, maar dat de totale volumes media, het aantal gezaaide cellen en de absolute hoeveelheden toegevoegde cytokines evenredig worden opgeschaald. Deze schaalbaarheidsfunctie maakt een soepele overgang mogelijk van kleinschalige onderzoeksprotocollen naar preklinische of vroege klinische productie zonder dat er significante protocolwijzigingen nodig zijn, waardoor consistente eigenschappen van effectorcellen behouden blijven.

  1. CAR-T-celexpansie in G-6M-formaat apparaten
    1. Voer activatie van PBMC's uit op dag 0 en lentivirale transductie op dag 1, zoals beschreven in sectie 1, waarbij alle concentraties en dichtheden behouden blijven terwijl volumes en absolute hoeveelheden met een factor 5 worden opgeschaald.
    2. Breng op dag 2 het kweekvolume tot in totaal 100 mL met behulp van cCM-F medium. Bereken en voeg hIL-7 en hIL-15 toe om de uiteindelijke concentratie van 10 ng/mL te bereiken.
      OPMERKING: In tegenstelling tot het G-24-formaat maakt het hogere ontwerp van het G-6M-apparaat een groter medium volume mogelijk, waardoor er gedurende de kweekperiode een constante toevoer van voedingsstoffen en cytokines mogelijk is zonder dat mediavervanging nodig is (de "Fill and Forget"- methode). Daarom zijn er op dag 5 geen extra cytokines nodig.
    3. Om CAR-T-cellen op dag 9 te oogsten, verwijder je ongeveer 90 ml medium uit elke put met een serologische pipet en suspendeer je de cellen opnieuw in de resterende 10 mL. Cellen overbrengen naar een 15 mL buis en gebruiken deze voor latere assays.
  2. CIK-celexpansie in G-6M-formaatapparaten
    1. Voer PBMC's seeding uit op dag 0 volgens het protocol beschreven in Sectie 3 en schaal alle volumes en reagentia op met een factor 5 om overeen te komen met het grotere apparaatformaat (G-6M).
    2. Pas op dag 1 het kweekvolume aan op in totaal 100 mL met cCM-media. Voeg een uiteindelijke concentratie van 500 IU/mL rhIL-2 en 50 ng/mL anti-CD3 toe aan elke put.
    3. Geef elke 3-4 dagen (dag 5, 9 en 13) 500 IE/mL rhIL-2 per put zonder middelmatige verandering.
    4. Oogst CIK-cellen op dag 14 door ongeveer 90 mL medium uit elke put te verwijderen met een serologische pipet. Suspendeer de cellen opnieuw in de resterende 10 mL, plaats ze in een 15 mL buis en gebruik ze voor volgende assays.

5. Fenotypekarakterisering van effectorcellen door flowcytometrie

OPMERKING: Aan het einde van het expansieprotocol wordt oppervlaktemarkeranalyse via flowcytometrie uitgevoerd op CAR-T- en CIK-cellen om hun fenotype te evalueren, inclusief verschillende differentiatietoestanden, d.w.z. Naïef (CD45RA+CD62L+), Centraal Geheugen (CM, CD45RA-CD62L+), Effectorgeheugen (EM, CD45RA-CD62L-) en Effectorgeheugen CD45RA-positief (EMRA, CD45RA+CD62L-; Aanvullende figuur 1A-B).

  1. Verzamel 3 x 10 à5 cellen per kleurbuis. Was cellen in 1x PBS met 1% FBS (PBS-F), centrifugeer op 300 x g gedurende 5 minuten, en susseer de celpellet opnieuw in 50 μL antistofmengoplossing bereid in kleuringsbuff (1 deel Brilliant kleuringsbuffer en 1 deel PBS-F) volgens het gewenste kleurpaneel (Tabel 1 en Tabel 2).
  2. Incubeer de cellen 20 minuten op 4 °C beschermd tegen licht, was daarna de gekleurde cellen en centrifugeer ze. Als een tweede kleuringsstap nodig is, voer dan de kleuring uit met de specifieke antistofmengsel, zoals eerder beschreven (stap 5.1).
  3. Tot slot was en kleur je cellen met een levensvatbaarheidskleurstof, hier Fixable Viability Stain 780 (FVS780), in 50 μL van 1x PBS, 15 minuten incuberen bij 4 °C beschermd tegen licht. Na het beitsen is geen wasstap nodig. Voeg na de incubatie 200 μL 1x PBS toe aan elk monster en ga je verder met flowcytometrische verwerving. Gedetailleerde gatingstrategie is weergegeven in aanvullende figuur 1A-B.
DoelKloonFluorochroomConcentratie/VerdunningDoel
Eerste beitsstaprhCD19-His//2 μg/mLCAR-molecuuldetectie
Incubatie bij 4 °C gedurende 20 minuten
Wasstap
Tweede kleuringsstapZijnGG11-8F3.5.1PE1/50CAR-molecuuldetectie
CD3UCHT1BV5101/40Afstamming
CD4SK3BV6501/40Afstamming
CD8RPA-T8BV4211/20Afstamming
CD45RAHI100PerCP-Cy5.51/83Rijping
CD62LDREG-56FITC1/10Homing, activatie
Incubatie bij 4 °C gedurende 20 minuten
Wasstap
Derde beitsstapFVS780//1/5000Onderscheiding tussen levende/dode cellen
Incubatie bij 4 °C gedurende 15 minuten

Tabel 1: Antilichaampaneel gebruikt voor CAR-T-celkleuring. Kleurpaneel gebruikt om CAR-expressie, T-celfenotype en differentiatiestatus te evalueren. Antilichaamklonen, concentratie en geconjugeerd fluorochroom worden voor elk doelwit van belang gerapporteerd.

DoelKloonFluorochroomVerdunningDoel
Eerste beitsstapCD56HCD56PE1/40Afstamming
NKG2D1D11APC1/83Activering
CD3UCHT1BV5101/40Afstamming
CD4SK3BV6501/40Afstamming
CD8RPA-T8BV4211/20Afstamming
CD45RAHI100PerCP-Cy5.51/83Rijping
CD62LDREG-56FITC1/10Homing, activatie
Incubatie bij 4 °C gedurende 20 minuten
Wasstap
Tweede kleuringsstapFVS780//1/5000Onderscheiding tussen levende/dode cellen
Incubatie bij 4 °C gedurende 15 minuten

Tabel 2: Antilichaampaneel gebruikt voor het kleuren van CIK-cellen. Kleuringspaneel gebruikt om CIK-subpopulaties, fenotype en differentiatiestatus te evalueren. Antilichaamklonen, concentratie en geconjugeerd fluorochroom worden voor elk doelwit van belang gerapporteerd.

6. Evaluatie van de specifieke cytotoxische activiteit van CAR-T- en CIK-cellen

OPMERKING: De cytotoxische activiteit van CAR-T- en CIK-cellen wordt gemeten door ze samen te cultiveren met doelcellen op de gewenste effector-tot-doelcelverhouding (E:T). Het type test hangt af van het type doelcellen, of deze afkomstig zijn van solide tumoren of hematologische maligniteiten. In dit protocol beschrijven we een fluorescentiecel-kleurstofgebaseerde flowcytometrie-assay voor suspensiecellen en een impedantie-gebaseerde Real-Time Cell Analysis (RTCA) assay voor hechtende cellen.

  1. Fluorescentiecel-kleurstof-gebaseerde flowcytometrie-assay
    OPMERKING: Antigeenspecifieke cytotoxiciteit tegen hematologische maligniteiten kan worden geëvalueerd met een fluorescentiecel-kleurstof-gebaseerde flowcytometrie-assay. Voor co-kweek worden doelcellen gelabeld met een fluorescerende kleurstof om identificatie mogelijk te maken. Na co-kweek met effectorcellen wordt de dood van de doelcel beoordeeld door te kleuren met een levensvatbaarheidskleurstof. Flowcytometrische analyse maakt het mogelijk om antigeen-specifieke doding te kwantificeren, gebaseerd op het aandeel niet-levensvatbare fluorescentie-kleurstofpositieve cellen.
    1. Voor elke co-kweekconditie verzamel je 2 x 105 doelcellen en sussen ze opnieuw in 400 μL complete kweekmedium om een uiteindelijke concentratie van 5 x 105 cellen/mL te bereiken. Voeg fluorescerende kleurstof toe bij een eindconcentratie van 5 μM (hier Cell Trace Violet kleurstof, CTV). Bred 30 minuten uit bij 37 °C, beschermd tegen licht. Na de incubatie was je de cellen één keer met een volledig medium en suspendeer je de pellet opnieuw bij een uiteindelijke concentratie van 4 x 10cellen van 5 ml.
    2. Doseer 500 μL van de gekleurde doelcel-suspensie (hier 2 x 10mm Raji-cellen als een CD19+ suspensiedoelcelmodel) in schone 5 mL buizen volgens de experimentele opstelling. Bevestig succesvolle kleuring met flowcytometrie door doelcellen te identificeren als cellen positief op de fluorescerende kleurstof (SSC-A versus CTV). Ongeveer 98% van de fluorescerende kleurstof-positieve cellen wordt aanbevolen.
    3. Tegelijkertijd telt en bereid je effectorcellen voor (hier 5 x 106van CD19 CAR-T-cellen) voor elke co-kweekconditie. Was de cellen en susseer ze opnieuw in een compleet kweekmedium bij de juiste concentratie om de gewenste effector-doelverhouding (E:T) te bereiken. Voeg 500 μL van de effectorcel-suspension toe aan elke overeenkomstige buis met doelcellen.
      1. Om een 25:1 E:T-verhouding te bereiken, voeg je 5 x 10 effectorCD19 CAR-T-cellen toe aan 2 x 10 Raji doelcellen in elke buis en bereid je zoveel buizen voor als vereist is door het experimentele ontwerp.
    4. Incubeer de coculturen 6 uur bij 37°C in een bevochtigde broedmachine met 5%CO2. Voeg een controleconditie op die alleen doelcellen bevat om spontane celdood te meten. Deze controle is belangrijk om achtergronddood te onderscheiden van effectorcel-specifieke cytotoxiciteit.
    5. Was de co-gekweekte cellen en kleur ze met FVS780 vitaliteitskleurstof verdund in 1x PBS (eindverdunning 1:5000). Broed 15 minuten op 4 °C, beschermd tegen licht. Was de cellen en suspendeer de uiteindelijke celpellet opnieuw in 600 μL PBS-F buffer. Ga door met de verwerving van flowcytometrie om de effectorcel-specifieke cytotoxiciteit te evalueren.
      1. Voer de flow cytometer gating-strategie als volgt uit: identificeer doelcellen als cellen die positief zijn voor de fluorescerende kleurstof (SSC-A versus CTV), en bereken vervolgens binnen deze populatie het percentage dode doelcellen (SSC-A versus FVS780, Aanvullende Figuur 1C). Bereken Specifieke Lysis door spontane doelceldood (%FVS780+ binnen CTV+ in de doel-only conditie) af te trekken van de effectorcel-specifieke cytotoxiciteit (%FVS780+ binnen CTV+ in de effector-target co-cultuurconditie).
  2. Real-time celanalyse (RTCA) assay
    OPMERKING: De RTCA-assay is een methode om de cytotoxische activiteit van effectorcellen te beoordelen tegen hechtende doelcellen26. Doelceldood wordt gedetecteerd als een verschil in het impedantiesignaal door het loskoppelen van cellen van de E-plaat die betrokken is bij het xCELLigence-apparaat. Voer de RTCA-assay uit volgens het door de fabrikant aanbevolen protocol om optimale assayprestaties en reproduceerbaarheid te waarborgen.
    1. Subcultuur richt cellen één dag voor de assay (dag -1) om ervoor te zorgen dat ze 60%-80% confluentie bereiken op dag 0. Deze stap is cruciaal om de cellen aan het begin van het experiment in actieve proliferatie te houden. Het is de voorkeur om doelcellen te gebruiken tussen passages 5-20, met minimaal 1 week (3-4 passages) na ontdooiing om optimale celprestaties te garanderen.
    2. Voeg op dag 0 voorzichtig 50 μL kweekmedium toe aan elke put van de E-plaat, schakel de plaat in het apparaat in en neem het achtergrondsignaal op. Breng de plaat vervolgens terug naar de kap voor de celzaai-stap.
    3. Tel doelcellen en breng het benodigde totale aantal over in een schone buis. Susselt cellen opnieuw in een geschikt volume kweekmedium om de gewenste concentratie te bereiken voor het zaaien in de E-plaat, en breng 100 μL doelcellen over in elke put (hier 4 x 104 MCF-7 cellen als een adherent tumor cellijnmodel). Houd de plaat minstens 30 minuten op kamertemperatuur in de kap om een gelijkmatige bevestiging van de doelcellen te garanderen. Schakel de plaat in het apparaat in bij 37 °C in een CO-2-incubator en start de realtime opname (verwervingsinterval van 15 minuten voor 22 uur).
      OPMERKING: Voer doelcel-titratie uit voordat je een nieuwe doelcellijn gebruikt, zoals aanbevolen door de fabrikant.
    4. Op dag 1 (ongeveer 20-22 uur na het zaaien van de doelcel) telt u de effectorcellen en susseert u ze opnieuw in een vers kweekmedium, waarbij u de celconcentratie aanpast om de gewenste effector-tot-doelverhouding (E:T) te bereiken. Om bijvoorbeeld een 10:1 E:T-verhouding te bereiken, voeg je 4 x 10effector CIK-cellen toe aan 4 x 104 MCF-7 doelcellen per put.
    5. Bereid elke behandelingsconditie voor in technische duplicaten met een steriele 96-well U-bodemplaat en balanceer deze gedurende 15 minuten bij 37°C. Doseer 50 μL effectorcel-suspension voor elke conditie met een multikanaals pipet. Plaats de E-plaat terug in het instrument en ga door met de realtime verwerving (verwervingsinterval van 15 minuten voor 24 uur). Bereken Specifieke Lysis met de volgende vergelijking:
      Vergelijking 1

Resultaten

Het hier beschreven protocol biedt een efficiënte en robuuste workflow voor de ex vivo uitbreiding en engineering van effectorcellen uit geïsoleerde PBMC's, namelijk CAR-T en CIK-cellen. Deze methode vereist minimale celmanipulatie en maakt gebruik van de gasuitwisselingscapaciteit van G-Rex-apparaten, waardoor ze een superieure beschikbaarheid van voedingsstoffen en zuurstofvoorziening bieden ten opzichte van conventionele statische kweeksystemen23,24. Een belangrijk voordeel van dit protocol is de inherente schaalbaarheid van kleinschalige 24-well apparaten (G-24), geschikt voor preklinische studies, tot grotere 6M-apparaten (G-6M), compatibel met translationele of klinische productiebehoeften, zonder dat er andere wijzigingen in het protocol nodig zijn dan proportionele schaal.

Met dit protocol werden zowel CAR-T als CIK-cellen succesvol parallel uitgebreid vanuit gezonde donor PBMC's in G-24 en G-6M formaten, zoals beschreven in secties 2-4. Aan het einde van de kweekperiode vertoonden beide celtypen een hoge vouwexpansie en levensvatbaarheid, met vergelijkbare proliferatie tussen de twee apparaatformaten (Figuur 2, Aanvullende Tabel 1, Aanvullende Tabel 2), wat de reproduceerbaarheid van het protocol over verschillende kweekschalen benadrukt.

Om de schaalbaarheid van de kweekapparaten te valideren, werden effectorcellen fenotypisch en functioneel verder gekarakteriseerd. Voor de CD19 CAR-T-cellen hebben we de CAR-expressie gekwantificeerd en de CD4+ en CD8+ subsets geëvalueerd, waarbij we een overwicht van CD19 CAR+ CD8+ T-cellen noteerden (Figuur 3A-B, Aanvullende Tabel 1). Voor CIK-cellen beoordeelden we de frequentie van T (CD3+CD56-), NK (CD3-CD56+) en CIK (CD3+CD56+) populaties (Figuur 3D), evenals de expressie van de activerende receptor NKG2D (Figuur 3E, Aanvullende Tabel 2). Bovendien observeerden we vergelijkbare fenotypes en expressie van specifieke populatiemarkers tussen de G-24- en G-6M-kweekformaten voor zowel CAR-T- als CIK-cellen. De differentiatiestatus van zowel CD19 CAR-T als CIK-celproducten werd geanalyseerd met CD62L- en CD45RA-kleuring (Figuur 3C-F, Aanvullende Tabel 1, Aanvullende Tabel 2), waarbij vergelijkbare geheugen- en effectorfenotypes tussen cellen gekweekt in G-24- en G-6M-formaten aan het licht kwamen. Deze bevindingen tonen aan dat het opschalen van het proces de fenotypische integriteit of differentiatiestatus van de uitgebreide effectorcelpopulaties niet aantast.

Tot slot, om de functionele potentie te evalueren, gebruikten we doelspecifieke cytotoxiciteitsassays. Zowel CD19 CAR-T als CIK-cellen die in een van beide apparaten expandeerden, vertoonden krachtige cytolytische activiteit, wat het behoud van functionele eigenschappen over de hele schaal bevestigt (Figuur 4). Al met al ondersteunen deze resultaten de geschiktheid van de uitgebreide producten voor latere toepassingen in preklinische modellen en mogelijk klinische tests.

Figuur 2
Figuur 2: Proliferatie en levensvatbaarheid van CD19 CAR-T en CIK-cellen. CAR-T-cellen (n = 5) en CIK-cellen (n = 6) die uit PBMC's in G-24- en G-6M-platen zijn uitgebreidd, werden respectievelijk op dag 9 en dag 14 van de expansie verzameld om celtelling en evaluatie van de (A-C) vouwtoename en (B-D) percentage van levensvatbare cellen uit te voeren. Histogrammen geven de gemiddelde expressie ± standaarddeviatie (SD) weer en stippen geven enkele donoren aan (zie Aanvullende Tabel 1 en Aanvullende Tabel 2 voor individuele waarden). De gegevens werden geanalyseerd met een tweezijdige meervoudige paarige t-test (A-C) of meervoudige tweezijdige Wilcoxon matched-pairs rangtest (B-D), met Holm-Sidak-correctie voor meervoudige vergelijkingen (*p < 0,05). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3
Figuur 3: Beoordeling van het fenotype van CD19 CAR-T en CIK cellen uitgebreid in G-24 en G-6M apparaten. De expressie van CAR-moleculen op CD19 CAR-T-cellen (n = 5) werd geanalyseerd met flowcytometrie om (A) de transductie-efficiëntie in G-24- en G-6M-expansieprotocollen te beoordelen, evenals de expressie van (B) CD4+/CD8+ en (C) naïeve/geheugensubpopulaties in de CD3+CAR+-subset. Het fenotype van bulk CIK-cellen (n = 6) werd geanalyseerd met flowcytometrie om (D) het percentage CIK (CD3+CD56+), NK (CD3-CD56+) en T (CD3+CD56-), evenals de expressie van (E) NKG2D en (F) naïeve/geheugensubpopulatie in de CD3+CD56+ subset (G-24 n=5, G-6M n=6) te onderzoeken. Naïef (CD45RA+CD62L+), centraal geheugen (CM, CD45RA-CD62L+), effectorgeheugen (EM, CD45RA-CD62L-), en effectorgeheugen CD45RA-positief (EMRA, CD45RA+CD62L-). Histogrammen geven de gemiddelde expressie ± SD weer en stippen geven enkele donoren aan (zie Aanvullende Tabel 1 en Aanvullende Tabel 2 voor individuele waarden). De gegevens werden geanalyseerd met een tweezijdige meervoudige gepaarde t-test (B-C-D-F) of tweezijdige Wilcoxon matched rank test (A-E), met Holm-Sidak correctie voor meervoudige vergelijkingen (*p < 0,05). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4
Figuur 4: Evaluatie van CD19 CAR-T en CIK-cel cytotoxiciteit. (A) Specifieke lyse van CD19 CAR-T-cellen (oranje, n = 5) of niet-transduceerde (UTD) cellen (grijs, n = 5) tegen de Burkitt's lymfoom Raji-cellijn (als een suspensiecellijnmodel) werd uitgevoerd door een 6 uur durende flowcytometrie-gebaseerde dodelijke assay. De resultaten worden weergegeven als de gemiddelde specifieke lyse ± SD. (B) De cytotoxiciteit van CIK-cellen gekweekt in G-24 (lichtblauw, n = 7) of G-6M (donkerblauw, n=6) tegen de borstkanker MCF-7 cellijn (als een adherent cellijnmodel) werd elke 15 minuten over 24 uur gemonitord met een realtime celanalyzer. De resultaten worden weergegeven als de gemiddelde specifieke lysis ± SEM. De gegevens werden geanalyseerd met de Mann-Whitney test, Holm-Sidak correctie voor meervoudige vergelijkingen (*p < 0,05). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende Figuur 1: Gate-strategie gebruikt voor flowcytometrie-analyses. Representatieve grafieken die de gatingstrategieën illustreren voor (A) CAR-T-cel en (B) CIK celfenotypische karakterisering, en (C) fluorescerende cel kleurstof-gebaseerde cytotoxiciteitsassay. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Tabel 1: Groei, levensvatbaarheid en fenotype van CD19 CAR-T celculturen van individuele donoren. Totaal aantal cellen, vouwtoename, levensvatbaarheid en fenotypische karakterisering van CD19-CAR T-cellen die op dag 9 van de kweek zijn geoogst in G-24- en G-6M-apparaten, worden voor elke donor getoond. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Tabel 2: Groei, levensvatbaarheid en fenotype van CIK-celculturen van individuele donoren. Totaal celaantal, vouwtoename, levensvatbaarheid en fenotypische karakterisering van CIK-cellen die op dag 14 van de kweek zijn geoogst in G-24- en G-6M-apparaten worden getoond voor elke donor. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

Dit protocol beschrijft de implementatie van een efficiënt en schaalbaar platform voor de generatie van twee verschillende ACT-producten, namelijk CAR-T en CIK-cellen, uit PBMC's met G-Rex-kweeksystemen. We hebben proof-of-concept functionele en fenotypische assays geïmplementeerd om de schaalbaarheid van de aanpak te valideren. We toonden aan dat zowel fenotype als activiteit van de uitgebreide cellen behouden blijven tijdens de opschaling, waardoor het systeem geschikt is voor onderzoekstoepassingen en directe klinische vertaling. We hebben inderdaad met succes aangetoond dat zowel CAR-T- als CIK-cellen efficiënt kunnen worden uitgebreid met een hoge celopbrengst, terwijl een functioneel effectorfenotype en een krachtige antigeenspecifieke cytotoxiciteit behouden blijven bij verschillende kweekapparaten.

In combinatie met de gaspermeabele membraantechnologie van de kweekapparaten leidt dit expansieprotocol tot snellere expansiekinetiek, vermindert het handmatige hantering en zorgt het voor consistente hoge opbrengsten tussen donoren. Deze kenmerken maken het protocol zeer reproduceerbaar en minder arbeidsintensief vergeleken met standaard kweeksystemen20,21, die vaak meerdere media-uitwisselingen en een verhoogd risico op celverlies en besmetting met zich meebrengt.

Bovendien maakt dit protocol naadloze overgangen over productieschalen mogelijk: van kleinschalige open systemen (G-24, geschikt voor preklinisch onderzoek en screening, bijvoorbeeld van CAR-constructies, cytokinecombinaties of donorvariabiliteit) tot grotere open systemen (G-6M, voor pre-GMP-validatie), en uiteindelijk tot grotere gesloten systemen (voor GMP-productie). Zoals beschreven in deze studie, vereist de overgang van kleinschalige naar grotere open systemen slechts proportionele aanpassingen van volumes en celinvoer ten opzichte van apparaatgrootte, wat een aanzienlijk praktisch voordeel biedt. Evenzo is de enige implementatie die nodig is voor de overgang van open naar gesloten systemen voor GMP-productie, en daarmee om het G-6M-protocol aan te passen aan grootschalige GMP-productie, het gebruik van geschikte GMP-kwaliteit reagentia en gesloten systeemapparaten (G-10M-CS met een oppervlakte van 10 cm², overeenkomend met een enkele G-6M-put, of G-100M-CS met een oppervlakte van 100 cm², overeenkomend met de G-100M open tegenhanger) zonder verdere aanpassingen aan het protocol zelf. Deze gesloten apparaten verschillen van hun open tegenhangers door de integratie van steriele buisverbindingen voor geautomatiseerde mediabehandeling, die samenwerken met een vloeistofbehandelingspomp (GatheRex) om een volledig gesloten omgeving te creëren. Deze gesloten systeemaanpak elimineert handmatige media-uitwisselingen en vermindert het risico op besmetting, waardoor het ideaal is voor GMP-conforme productieomgevingen waar steriliteit en reproduceerbaarheid van het grootste belang zijn. Met name is schaalbaarheid een cruciale eigenschap om de kloof tussen vroege ontdekkingen en klinische vertaling te overbruggen, vooral in academische of vroege biotech-omgevingen met beperkte middelen.

Verdere implementatie van dit protocol voor volledige GMP-naleving zou moeten overwegen over te stappen van FBS-bevattende media naar serumvrije/xenovrije formuleringen, in lijn met de huidige regelgevingstrends van de FDA en EMA, om batch-tot-batch variabiliteit te elimineren, potentiële xenogene besmettingsrisico's te elimineren en de naleving van regelgevingte verbeteren 27.

Bovendien biedt de minimale interventie die vereist is door het voorgestelde uitbreidingssysteem een ideaal platform voor het implementeren van multidimensionale fenotypische profilering28 door procedure-geïnduceerde artefacten te verminderen die de fenotypische analyse tijdens productieprocessen kunnen verwarren. Bovendien zou het systeem, naast CAR-T- en CIK-cellen, zeer aanpasbaar kunnen zijn aan andere lymfocytenpopulaties en gemanipuleerde immuuncellen, waardoor het nut inde ontwikkeling van immunotherapie wordt vergroot.

Hoewel het protocol robuust is en geen aanpassingen vereist, zijn enkele stappen bijzonder cruciaal voor succes. Voor de expansie van CIK-cellen is het tijdstip van cytokine-toevoeging essentieel om optimale differentiatie en uitbreiding te waarborgen. Voor CAR-T-cellen moet de transductie 24 uur na activatie plaatsvinden om de efficiëntie te maximaliseren, en lentivirale aliquots moeten slechts één keer worden ontdooid, omdat herhaalde vries-ontdooicycli de transductie-efficiëntie aanzienlijkverminderen met 31.

Biologische variabiliteit tussen primaire celpreparaten draagt van nature bij aan verschillen in expansiesnelheden en functionele activiteit, wat de diversiteit van donoren weerspiegelt. Deze onvermijdelijke en intrinsieke variabiliteit kan effectief worden beheerd door parallelle uitbreidingen van meerdere donoren, waardoor robuuste en reproduceerbare resultaten over experimenten heen worden gegarandeerd.

Concluderend maakt dit protocol snelle, schaalbare en betrouwbare uitbreiding van functionele effectorlymfocyten direct vanuit PBMC's mogelijk, wat flexibiliteit biedt voor zowel vroegfaseonderzoek als grootschalige klinische vertaling. Dit systeem kan gemakkelijk worden aangepast aan verschillende celtypen en genetische modificaties, wat een veelzijdig platform biedt voor de ontwikkeling van immunotherapieën.

Dankbetuigingen

De CAR-constructie werd geleverd onder MTA door het St. Jude Children's Research Hospital. Dit werk werd ondersteund door ScaleReady G-Rex Grant 2025; Universiteit van Padua - SOMMAGGIO_BIRD24_01; AIRC Foundation onder 5x1000 2019 - ID. 22759 programma; Alleanza Contro il Cancro, Progetto CAR-T_2 RCR-2023-23684268. Dit onderzoek kreeg "Ricerca Corrente"-financiering van het Italiaanse ministerie van Volksgezondheid om publicatiekosten te dekken. Figuren werden gemaakt met GraphPad Prism 9 Software en BioRender.com.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Brilliant Stain BufferBD Biosciences566349
CD28 Antibody, anti-humanMiltenyi Biotech130-093-375Clone 15E8
CD3 Antibody, anti-humanMiltenyi Biotech130-093-387Clone OKT3
CD3 BV510BD Biosciences740147Clone UCHT1
CD314 APC (NKG2D)Biolegend320808Clone 1D11
CD4 BV650BD Biosciences563875Clone SK3
CD45RA PerCP-Cy5.5BD Biosciences563429Clone HI100
CD56 PEBiolegend318306Clone HCD56
CD62L FITCBD Biosciences555543Clone FREG-56
CD8 BV450BD Biosciences562428Clone RPA-T8
CellTrace Violet Cell Proliferation KitThermoFisher scientificC34557
Dimethyl sulfoxide (DMSO)ThermoFisher scientificD2650
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (D-PBS)Sigma AldrichD5652
E-plate 16Agilent5469813001
Fetal Bovine Serum (FBS), ValueThermoFisher ScientificA5256701
Fixable Viability Stain 780 (FVS780)BD Biosciences565388
G-Rex 24 Well Plate Wilson Wolf80192M
G-Rex 6M Well Plate Wilson Wolf80660M
HEPES Buffer SolutionLonzaECM0180D
His AntibodyMiltenyi Biotech130-120-718
Human Albumin 20%CSL Behring
Human IL-15 Recombinant ProteinPeproTech200-15
Human IL-7 Recombinant ProteinPeproTech200-07
LSRFortessa X-20BD Biosciences
LymphoprepSTEMCELL Technologies18060
MCF-7ATCCHTB-22Borstkankercel lijn 
Penicillin and StreptomycinLonzaECB3001D
Physiological solution (0.9% Sodium Chloride)Monico
Protamine SulfateSigma AldrichP3369
RajiATCCCCL-86Burkitt's lymfoomcel lijn 
Recombinant Human IFN-gammaR&D Systems285-IF-100/CF
Recombinant IL-2 (Proleukin)Novartis
rhCD19-HisInvitrogenA42607
Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI-1640)EurocloneECB9006L
Stable L-GlutamineLonzaECB3004D
Trypan-Blue solutionSigma AldrichT8154
xCELLigence Real-Time Cell AnalysisAgilent
X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell MediumLonza02-053Q

Referenties

  1. Rosenberg, S. A., Restifo, N. P. Adoptive cell transfer as personalized immunotherapy for human cancer. Science. 348 (6230), 62-68 (2015).
  2. Shimasaki, N., Jain, A., Campana, D. NK cells for cancer immunotherapy. Nat Rev Drug Discov. 19 (3), 200-218 (2020).
  3. Cappuzzello, E., et al. How can cytokine-induced killer cells overcome CAR-T cell limits. Front Immunol. 14, 1229540(2023).
  4. Sharma, A., Schmidt-Wolf, I. G. H. 30 years of CIK cell therapy: Recapitulating the key breakthroughs and future perspective. J Exp Clin Cancer Res. 40, 388(2021).
  5. Bayatipoor, H., et al. Role of NKT cells in cancer immunotherapy-from bench to bed. Med Oncol. 40, 29(2022).
  6. Hayday, A., Dechanet-Merville, J., Rossjohn, J., Silva-Santos, B. Cancer immunotherapy by γδ T cells. Science. 386, 6717(2024).
  7. Rohaan, M. W., van den Berg, J. H., Kvistborg, P., Haanen, J. B. A. G. Adoptive transfer of tumor-infiltrating lymphocytes in melanoma: A viable treatment option. J Immunother Cancer. 6, 102(2018).
  8. June, C. H., O'Connor, R. S., Kawalekar, O. U., Ghassemi, S., Milone, M. C. CAR T cell immunotherapy for human cancer. Science. 359 (6382), 1361-1365 (2018).
  9. Fesnak, A. D., June, C. H., Levine, B. L. Engineered T cells: The promise and challenges of cancer immunotherapy. Nat Rev Cancer. 16, 566-581 (2016).
  10. Zhang, J., Wang, L. The emerging world of TCR-T cell trials against cancer: A systematic review. Technol Cancer Res Treat. 18, 1533033819831068(2019).
  11. Sadelain, M., Brentjens, R., Rivière, I. The basic principles of chimeric antigen receptor design. Cancer Discov. 3 (4), 388-398 (2013).
  12. Cappuzzello, E., Sommaggio, R., Zanovello, P., Rosato, A. Cytokines for the induction of antitumor effectors: The paradigm of cytokine-induced killer (CIK) cells. Cytokine Growth Factor Rev. 36, 99-105 (2017).
  13. Palmerini, P., et al. A serum-free protocol for the ex vivo expansion of cytokine-induced killer cells using gas-permeable static culture flasks. Cytotherapy. 22 (9), 511-518 (2020).
  14. Pietà, A. D., et al. Innovative therapeutic strategy for B-cell malignancies that combines obinutuzumab and cytokine-induced killer cells. J Immunother Cancer. 9, e002475(2021).
  15. Pievani, A., et al. Dual-functional capability of CD3+CD56+ CIK cells, a T-cell subset that acquires NK function and retains TCR-mediated specific cytotoxicity. Blood. 118 (12), 3301-3310 (2011).
  16. Cappuzzello, E., Tosi, A., Zanovello, P., Sommaggio, R., Rosato, A. Retargeting cytokine-induced killer cell activity by CD16 engagement with clinical-grade antibodies. OncoImmunology. 5, e1199311(2016).
  17. Rambaldi, B., Rizzuto, G., Rambaldi, A., Introna, M. Genetically modified and unmodified cellular approaches to enhance graft versus leukemia effect, without increasing graft versus host disease: The use of allogeneic cytokine-induced killer cells. Front Immunol. 15, 1459175(2024).
  18. Rotte, A., et al. Dose-response correlation for CAR-T cells: A systematic review of clinical studies. J Immunother Cancer. 10, e005678(2022).
  19. Zhang, Y., Schmidt-Wolf, I. G. H. Ten-year update of the international registry on cytokine-induced killer cells in cancer immunotherapy. J Cell Physiol. 235 (12), 9291-9303 (2020).
  20. Garcia-Aponte, O. F., Herwig, C., Kozma, B. Lymphocyte expansion in bioreactors: Upgrading adoptive cell therapy. J Biol Eng. 15, 13(2021).
  21. Smith, T. A. CAR-T cell expansion in a Xuri Cell Expansion System W25. Methods Mol Biol. 2086, 151-163 (2020).
  22. Ludwig, J., Hirschel, M. Methods and process optimization for large-scale CAR T expansion using the G-Rex cell culture platform. Methods Mol Biol. 2086, 165-177 (2020).
  23. Vera, J. F., et al. Accelerated production of antigen-specific T cells for preclinical and clinical applications using gas-permeable rapid expansion cultureware (G-Rex). J Immunother. 33, 305-315 (2010).
  24. Bajgain, P., et al. Optimizing the production of suspension cells using the G-Rex "M" series. Mol Ther Methods Clin Dev. 1, 14015(2014).
  25. Talleur, A. C., et al. Allogeneic CD27-depleted cells in adoptive cell therapy. Adv Cell Gene Ther. 2, e45(2019).
  26. Erskine, C. L., Henle, A. M., Knutson, K. L. Determining optimal cytotoxic activity of human HER2/neu-specific CD8 T cells by comparing the Cr-51 release assay to the xCELLigence system. J Vis Exp. (66), e3683(2012).
  27. Eberhardt, F., et al. Impact of serum-free media on the expansion and functionality of CD19.CAR T-cells. Int J Mol Med. 52, 58(2023).
  28. Cadiñanos-Garai, A., et al. High-dimensional temporal mapping of CAR T cells reveals phenotypic and functional remodeling during manufacturing. Mol Ther. 33, 2291-2309 (2025).
  29. Wang, X., Byrne, M. E., Liu, C., Ma, M. T., Liu, D. Scalable process development of NK and CAR-NK expansion in a closed bioreactor. Front Immunol. 15, 1412378(2024).
  30. Noldner, P. K., et al. Improving lung cancer tumor-infiltrating lymphocyte (TIL) manufacturing. Cytotherapy. 27, 1240-1250 (2025).
  31. Bandeira, V., et al. Downstream processing of lentiviral vectors: Releasing bottlenecks. Hum Gene Ther Methods. 23, 255-263 (2012).

Herprints en machtigingen

Tags

CAR-T-cellenadoptieve celtherapieG-Rex-apparatenmononucleaire cellen uit perifeer bloedlentivirale transductieflowcytometriecel-expansieprotocolinterleukin-2-stimulatietrypaanblauw-assay
Efficiënte en snelle generatie van CAR-T en cytokine-geïnduceerde killercellen in GMP-schaalbare apparaten
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.