Methodenartikel

Lokalisatie van plasmamembraan en intracellulaire neuronale nicotinische acetylcholinereceptoren met behulp van kwantitatieve beeldvorming in zoogdiercellen

494 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/69371

⸱

19 december 2025

 ,  , 
1Department of Chemistry and Biochemistry, University of Alaska Fairbanks, 2Institute of Arctic Biology, University of Alaska Fairbanks

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft expressie en kwantificatie van neuronale nicotinische acetylcholinereceptoren met behulp van de zoogdier-Neuro-2a-cellijn. pH-gevoelige fluorescentielabels en confocale microscopie maken een nauwkeurige evaluatie mogelijk van receptorlokalisatie bij het plasmamembraan ten opzichte van die in pH-neutrale intracellulaire compartimenten, wat de studie van nAChR-transport en farmacologische modulatie vergemakkelijkt.

Samenvatting

Kwantificering van neuronale nicotinische acetylcholinereceptoren (nAChR's) die tot expressie komen op het plasmamembraan van zoogdiercellen is belangrijk voor de ontwikkeling van nieuwe doelselectieve therapieën en voor het bestuderen van chaperoneiwitten die receptortransport moduleren. Deze studie presenteert een robuuste set methodologieën om zowel homomere als heteromere nAChR's tot expressie te brengen in zoogdiercellen van Neuro2a (N2a) en om hun oppervlakte- versus intracellulaire lokalisatie te kwantificeren met behulp van pH-gevoelige fluorescentietags. pHuji en superecliptische pHluorine (SEP) zijn pH-gevoelige eiwitten die kunnen worden ontworpen om recombinante eiwitten te taggen, waardoor de ruimtelijke verdeling van nAChR-subeenheden zichtbaar is. Deze fluorescerende labels zenden een neutrale pH uit, maar worden geblust in zure omgevingen. Om de relatieve interne versus plasmamembraanlokalisatie van α7, α4 en β2 nAChR-subunits te volgen, wordt pHuji of SEP gekoppeld aan het C-terminus van elk DNA-construct. Om α7-pHuji samen met zijn chaperon NACHO, of (α4-SEP; β2-pHuji), tot expressie te brengen in N2a-cellen, wordt een lipide-gebaseerd DNA-transfectiereagens gebruikt. Het transfectie-reagens en plasmide-DNA worden afzonderlijk geïncubeerd in een gereduzeerd serummedium bij kamertemperatuur, waarna ze worden gecombineerd tot lipiden-DNA-complexen die de plasmideafgifte in cellen vergemakkelijken. Na incubatie worden cellen gefotografeerd met behulp van live-cel confocale microscopie onder zowel hoge als lage pH-omstandigheden of in aanwezigheid van een subtype-selectieve fluorescerende ligand. Beelden worden geanalyseerd met gecorrigeerde totale celfluorescentie in de relevante fluorofoorkanalen, wat kwantitatieve informatie geeft over de verdeling van fluorescerend getagde nAChR-subeenheden tussen het plasmamembraan en de intracellulaire compartimenten. Levende-cel confocale beeldvorming maakt realtime tracking van nAChR-subeenheidslokalisatie mogelijk om verschillen tussen interne en oppervlaktereceptorpopulaties te onderscheiden. Robuuste plasmamembraanexpressie van α7-pHuji of (α4-SEP; β2-pHuji) wordt bereikt binnen 24 uur bij 37 °C. Deze methode kan worden aangepast met extra chaperonnen, hulpsubeenheden of fluorescerende liganden voor de studie van nAChR-transport, farmacologische modulatie en ziektegerelateerde veranderingen in nAChR-expressie.

Inleiding

Neuronale nicotinische acetylcholinereceptoren (nAChR's) zijn ligand-gestuurde transmembraanionkanalen die op het plasmamembraan van veel celtypen tot expressie worden gebracht, waaronder neuronen, gliacellen en immuuncellen. Deze receptoren bestaan uit α (α2-α10) of β (β2-β4) subeenheden die zich samenvoegen tot homomere of heteromere subtypes, waarbij α7 en α4β2 nAChR's het meest voorkomen in de hersenen 1,2. Dysregulatie van deze subtypes is in verband gebracht met de ziekte van Alzheimer, nicotinegebruik, slaapgerelateerde hypermotorische epilepsie, de ziekte van Parkinson en een ernstige depressieve stoornis, naast andere neurologische en psychiatrische aandoeningen 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 . Snelle en betrouwbare methoden om nAChR's tot expressie te brengen en te kwantificeren zijn essentieel voor het begrijpen van ziektemechanismen en voor het ontwikkelen van doelgerichte therapieën. Het bereiken van robuuste plasmamembraanexpressie van deze receptoren is echter vaak uitdagend en tijdrovend. De hier beschreven methode maakt sterke expressie van nAChR's mogelijk binnen ongeveer 24 uur na DNA-transfectie en kan worden gecombineerd met liganden of chaperoneiwitten die receptortransport moduleren.

Er bestaan verschillende benaderingen voor het expresseren van nAChR's, waaronder transiënte DNA-transfectie of het genereren van stabiele cellijnen die het gewenste subtype tot expressie brengen. Hoewel het creëren van stabiele cellijnen nuttig is voor langetermijnstudies met hetzelfde receptorsubtype, is het proces arbeidsintensief en kan het enkele maanden in beslag nemen. Eenmaal gevestigd kunnen dergelijke cellijnen variabele receptorexpressie vertonen over passages, verlies van expressie in de loop van de tijd, of selectiebias voor klonen met suboptimale receptorfunctie of dichtheid13. Een verlaging van de incubatietemperatuur van 37 °C naar 30 °C, de toevoeging van moleculaire chaperones zoals nicotine, of een verlengde incubatietijd kan de oppervlakte-expressie bevorderen 13,14,15. Deze beperkingen zijn vooral uitgesproken bij heteromere nAChR's, die correcte subeenheidassemblage en -transport vereisen, en voor studies die zich richten op chaperon-ondersteunde receptorregulatie. Daarom is routinematige validatie van receptorsubtypeexpressie over passages noodzakelijk bij het werken met stabiele nAChR-expressieve cellijnen.

Vaak zijn onderzoekers geïnteresseerd in nAChR-subeenheidvarianten en chaperon- of hulpeiwitsubeenheden en moeten daarom een verscheidenheid aan DNA's snel achter elkaar tot expressie brengen om snelle flexibiliteit in hun assays mogelijk te maken. Tijdelijke expressie van nAChRs is in dit opzicht voordelig omdat het proces snel kan worden afgerond, waardoor de onderzoeker meerdere receptorsubtypes of experimentele omstandigheden kan bestuderen zonder maanden te wachten op het genereren van stabiele cellijnen. Een veelvoorkomend verschijnsel, zelfs bij transiënte expressie, is dat veel nAChR's 24 uur na inductie bij 37 °C in de cel blijven, wat extra incubatieperiodes van > 48 uur16,17 vereist. Bijvoorbeeld, zonder het chaperoneiwit dat resistent is tegen remmers van cholinesterase (RIC)-3, wordt slechts ~1% van α7 nAChR tot expressie gebracht op het plasmamembraan van zoogdiercellenSHE-P 18. Bij co-expressie van RIC-3 wordt ongeveer 20% van de α7 nAChR's op het oppervlak gedetecteerd. Hoewel dit een verbetering betekent, blijft de totale receptorabundantie laag. Co-expressie van α7 nAChRs met NACHO kan de expressie van het oppervlak verder verbeteren, hoewel nog steeds minder dan 40% van de totale receptorpopulatie naar het plasmamembraan19 gaat. Een andere benadering houdt in dat getransfecteerde cellen worden geïncubeerd bij 30 °C om de plasmamembraanexpressiete verbeteren bij 20,21. Voor α4β2 nAChRs resulteert deze temperatuurverlaging in een vervijfvoudiging van de dichtheid van de oppervlaktereceptoren, zonder overeenkomstige toename van het totale subuniteiwit21. Deze verbetering vereist echter minstens één extra dag en meer gebruik van verbruiksartikelen, reagentia en instrumentatie.

Het gepresenteerde werk biedt een set geoptimaliseerde methoden om specifieke nAChR-subtypes binnen 24 uur na transfectie in zoogdier-N2a-cellen tot expressie te brengen en te kwantificeren, met een behalen van ongeveer 83% voor α7, 77% voor α4 en 56% voor β2-subeenheden die gelokaliseerd zijn aan het plasmamembraan. In het geval van α7 nAChR's kan plasmamembraanexpressie worden gekwantificeerd met α7-selectief, fluorescentief-gelabeld α-bungarotoxine (αBTX) of via recombinante fluorescentietagging. Om elke subeenheid te labelen, worden de pH-gevoelige fluorescerende eiwitten pHuji en superecliptic pHluorine (SEP)22,23,24 geengineerd op het C-terminus van individuele nAChR-subeenheden 25,26. pHuji en SEP zijn pH-gevoelige varianten van respectievelijk rode en groene fluorescerende eiwitten, die fluoresceren bij pH 7,4 maar onder zure omstandigheden worden getemperd (27,28). Omdat SEP- en pHuji-fluorescentie wordt onderdrukt bij pH < 6, weerspiegelt elk waargenomen intracellulair signaal fluoroforen die zich in neutrale compartimenten bevinden in plaats van op het plasmamembraan. Het moet worden opgemerkt dat sommige organellen, zoals het Golgi-apparaat, een zure lumen hebben; dus fluoroforen die aan het C-terminale gebied van nAChR-subeenheden zijn gehecht worden niet gedetecteerd terwijl subeenheden door de secretorische route29 gaan. Het verschil tussen totale fluorescentie bij pH 7,5 en die bij pH < 6 vertegenwoordigt het signaal dat wordt opgewekt door nAChR's op het plasmamembraan. Het vastleggen van beelden met live-cell confocale microscopie biedt een hoge ruimtelijke resolutie, waardoor nauwkeurige kwantificering van subeenheidslokalisatie mogelijk is. Bovendien zorgt het uitvoeren van alle experimenten op levende cellen ervoor dat elke cel als eigen controle kan dienen, waarbij rekening wordt gehouden met variabiliteit in eiwitexpressie tussen cellen binnen elke behandelgroep30. Deze methode kan verder worden aangepast om extra chaperoneiwitten toe te voegen, zoals NACHO of andere, om nAChR-transport te onderzoeken. Aanvullende toepassingen zijn onder meer farmacologische modulatie, de opname van hulpsubeenheden en de analyse van ziektegerelateerde veranderingen in de nAChR-expressie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

OPMERKING: De volgende procedure beschrijft methoden die met succes zijn gebruikt om de N2a-cellijn tijdelijk te transfecteren met nAChR-subeenheden (Figuur 1). Robuuste plasmamembraanexpressie wordt binnen 24 uur bereikt, zoals vastgelegd met live-cel confocale microscopie.

figure-protocol-1
Figuur 1: Schematische presentatie van de individuele methoden die in het protocol worden gepresenteerd. Cellen worden gekweekt totdat ze voor 70%-80% samenvloeien in beeldvormende schalen. De cellen worden vervolgens behandeld met het transfectie-reagens en het DNA-complex. (Boven) 24 uur later kunnen cellen worden behandeld met een fluorescentie-gelabelde ligand om subeenheden te labelen die op het plasmamembraan zijn uitgedrukt en vervolgens met een confocale microscoop worden afgebeeld. (Onderaan) Alternatief kunnen voor nAChR-subeenheidgenen die zijn aangepast om 24 uur na transfectie met een pH-gevoelig eiwit te worden getagd, cellen levend worden gefotografeerd met een confocale microscoop om de totale fluorescentie van de cellen vast te leggen. De pH 7,4 beeldvormingsbuffer wordt vervolgens vervangen door de pH 5,5 afkoelbuffer. Dit zal de fluorescentie van de pH-gevoelige eiwitten die zijn gelabeld aan de nAChR-subeenheden op het plasmamembraan van de cel stoppen, waardoor alleen de interne subeenheden fluorescerend blijven. Dezelfde cellen worden opnieuw gefotografeerd. Beeldanalyse wordt uitgevoerd met ImageJ om de expressie van interne en externe subeenheden te kwantificeren. Deze procedures kunnen worden aangepast om chaperone en hulpeiwitten te bevatten. Gemaakt in BioRender. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

1. N2a nAChR transiënte transfectie

OPMERKING: De N2a-cellijn werd gekozen omdat deze een neuronaal fenotype vertoont en een lage endogene expressie van nAChR's. De genen van α7-pHuji, α4-SEP en β2-pHuji subunit zijn elk afzonderlijk gehuisvest in de zoogdier-expressievector pcDNA3.1(+). Het chaperoneiwit NACHO wordt tot expressie gebracht uit pREP9 (gul geschonken door Dr. R. Loring, Northeastern University). Gebruik in alle stappen steriele technieken en werk in een bioveiligheidskast. Draag een schone laboratoriumjas, veiligheidsbril en handschoenen. Maak alle materialen die de bioveiligheidskast binnenkomen of verlaten schoon met 70% ethanol. De volgende stappen beschrijven transfectie in een 35 mm poly-D-lysine-gecoate glazen bodemschaal, die geschikt is voor beeldvorming. De volumes kunnen worden aangepast naar behoefte voor verschillende kweekvaten.

  1. Kweek N2a-cellen in een T25 (of vergelijkbare) weefselkweekfles met Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM), aangevuld met 10% foetaal rundereserum (FBS) en, indien nodig, 100 U/mL penicilline en 100 μg/mL streptomycine. Incubeer bij 37 °C, 5% CO₂ totdat de cellen ~90% confluentie bereiken. Visualiseer met een 4x lichtmicroscoopobjectief.
  2. Monitor dagelijks de confluentie met een lichtmicroscoop en vervang het groeimedium elke 1-2 dagen om optimale omstandigheden te behouden. Wanneer cellen ~90% confluentie bereiken, zijn ze klaar om in beeldvormende schotels te worden geplaatst.
  3. Verwarm alle reagentia tot 37 °C in een waterbad. Maak de bioveiligheidskast en alle materialen schoon met 70% ethanol voordat je met de procedure begint.
    VOORZICHTIG: 70% ethanol is een zeer brandbare vloeistof en damp die ernstige oogirritatie kan veroorzaken. Blijf uit de buurt van hitte, vonken, open vlammen en andere ontstekingsbronnen. Bewaar in een goed geventileerde ruimte met containers stevig afgesloten. Draag beschermende handschoenen en oog-/gezichtsbescherming bij het hanteren. Bij contact met huid of ogen, spoel onmiddellijk met water en zoek medische hulp als de irritatie aanhoudt. In plaats daarvan kan een alternatief desinfectiemiddel, zoals een bleekoplossing van 5%-10%, worden gebruikt.
  4. Aspiraat het oude medium uit de kolf en was cellen met 5 mL PBS. Voeg 1 ml trypsine toe aan het kolf en draai het voorzichtig rond. Incubeer tot de cellen losgaan (<5 min). Om oververtering te voorkomen, voeg je onmiddellijk 4 mL EMEM-groeimedium toe en pipette je voorzichtig om een single-cell suspension te creëren.
  5. Met een hemocytometer bepaal je de celconcentratie en bereken je het benodigde volume EMEM-groeimedium om de suspensie aan te passen zodat 1 mL 0,5-2 x 10⁵ cellen bevat.
  6. Plaats 1 ml celsuspensie per 35 mm schotel en voeg genoeg EMEM-groeimedium toe om het totale volume op 2 mL te brengen. Incubeer 's nachts bij 37 °C, 5% CO₂. Cellen zijn klaar voor transfectie bij 70%-80% confluentie.
  7. Op de dag van transfectie verwarmen we de reagentia tot 37 °C, ontdooien ze de nAChR-subeenheid-DNA's volledig en brengen we de transfectiereagens op kamertemperatuur. Maak alle reagentia schoon met 70% ethanol voordat je ze in de bioveiligheidskast plaatst.
  8. Om α7 nAChR's tot expressie te brengen: Verdun in een microcentrifugebuis 4 μg α7 (1 μg/μL) en 1 μg NACHO (1 μg/μL) plasmide-DNA's druppelwijs in gereduceerd serummedium (zonder antibioticum) tot een eindvolume van 250 μL. Meng voorzichtig door te pipetteren na DNA-toevoeging.
    1. Om α4β2 nAChRs te expresseren: verdun 4 μg van elk subeenheid-DNA in een totaal van 250 μL gereduzeerd serummedium. Meng voorzichtig door te pipetteren. Pas de verhouding van elke subeenheid aan om expressie van specifieke receptorisoformen te optimaliseren.
    2. Om α4β2 nAChRs met een extra plasmide uit te drukken, voeg je gelijke hoeveelheden van elk plasmide-DNA toe. Het blauwe fluorescerende eiwit mTagBFP2³¹ in pcDNA3.1(+) dient als controleplasmide en kan worden vervangen door elke α4β2 chaperon.
  9. Meng het DNA-transfectie-reagens voorzichtig voordat je het gebruikt. In een aparte microcentrifugebuis verdun je 8 μL transfectie-reagens druppelgewijs in 250 μL gereduzeerd serummedium. Incubeer 5 minuten op kamertemperatuur. Ga binnen 25 minuten door naar de volgende stap.
  10. Na 5 minuten combineert u de verdunde DNA's met het verdunde transfectiereagens (totaal = 500 μL) druppelwijs. Meng voorzichtig door te pipetteren en incubeer 20 minuten op kamertemperatuur. DNA-lipidecomplexen blijven tot 6 uur stabiel.
  11. Terwijl de complexen zich vormen, verwijder je kweekschotels uit de broedmachine en vervang je het medium door 1 ml serumvrije EMEM (geen antibiotica).
  12. Voeg druppelgewijs 500 μL van het DNA-transfectie-reagenscomplex toe aan elke schotel (eindvolume = 1,5 mL). Meng voorzichtig door het bord te wiebelen om een gelijkmatige verdeling over het gerecht te garanderen, vooral over het glasonder. Incubeer bij 37 °C gedurende 24 uur en vervang het medium na 4-6 uur om de celgezondheid te bevorderen.

2. Levende cellabeling van plasmamembraan-expressieve α7 nAChR's met behulp van αBTX Alexa Fluor 647

OPMERKING: De volgende procedure wordt doorgaans 24 uur na transfectie uitgevoerd. Bescherm αBTX Alexa Fluor 647 (αBTX-AF647) tegen licht om fotovernietiging van de fluorofoor te voorkomen.

  1. Verwarm alle reagentia voor tot 37 °C en ontdooi de αBTX-AF647 kolf (2,3 μM) oplossing. Maak schoon met 70% ethanol en plaats het in de bioveiligheidskast.
  2. Haal de schaal met de cellen die zijn getransfecteerd met α7- en NACO-DNA's uit de broedmachine, maak de buitenkant schoon met 70% ethanol en plaats deze in de bioveiligheidskast.
  3. Gooi het oude medium weg door vacuümzuiging. Om de cellen te wassen, voeg je 2 ml vers EMEM-groeimedium toe.
  4. Verwijder het wasmedium door vacuümzuiging. Voeg 2 ml EMEM-groeimedium toe aan de gerechten.
  5. Vervang de juiste hoeveelheid medium door αBTX-AF647 om een uiteindelijke concentratie van 80 nM te bereiken. Broed 's nachts uit bij 37 °C.
  6. In de ochtend voorwarmen PBS of een voorkeursmedium en schoonmaken met 70% ethanol. Zet het over naar de bioveiligheidskast.
  7. Verwijder de getransfecteerde cellen uit de broedmachine, maak ze schoon en plaats ze in de bioveiligheidskast.
  8. Verwijder het oude medium met αBTX-AF647 en doe het in een geschikte afvalcontainer.
  9. Was cellen met 2 ml PBS 3x, elk 10 minuten op kamertemperatuur. De spoelingen verwijderen ongebonden ligand en vuil, en de tijd kan worden aangepast aan de behoeften van de onderzoeker. Verwijder PBS na elke wasbeurt.
  10. Voeg 2 ml PBS of een voorkeursbeeldvormingsmedium toe en ga verder met het beelden van cellen met een confocale microscoop.

3. Levende-cel beeldvorming van totale en interne α7-pHuji nAChR's

OPMERKING: De volgende procedure maakt gebruik van een in huis gemaakte α7-pHuji pcDNA3.1 plasmide, co-transfecteerd met de NACHO chaperon. Een vergelijkbaar protocol werd gebruikt om α4-SEP en β2-pHuji tot expressie te brengen in pcDNA3.1 met het controleplasmide mTagBFP2 pcDNA3.1, zoals beschreven in de sectie Resultaten. Bescherm monsters tegen licht gedurende de procedure om fotovernietiging van de fluoroforen te voorkomen.

  1. Bereid een pH 7,4 beeldbuffer voor (Tabel 1) en pH 5,5 afkoelbuffer (Tabel 2) zoals beschreven23.
  2. Verwarm reagentia tot 37 °C, maak schoon met 70% ethanol en breng het over in de bioveiligheidskast. Verwijder de getransfecteerde cellen uit de incubator, maak ze schoon met 70% ethanol en plaats ze in de bioveiligheidskast.
  3. Verwijder het oude medium door te zuigen. Spoel het gerecht 3x met 2 ml PBS en 10 minuten op kamertemperatuur. Voeg 2 ml pH 7,4 beeldvormingsbuffer toe.
  4. Breng de schotel naar de confocale microscoop. Plaats de beeldschotel met pH 7,4 beeldbuffer in de glaashouder en plaats de houder in de voorverwarmde omgevingskamer op de confocale microscoop.
  5. Verbind de buis van de peristaltische pomp met de houder voor de beeldvormingsschotel en sluit de kamer.
  6. Open de beeldvormingssoftware en selecteer lasers voor de fluoroforen van belang (pHuji 566/598 nm, α4-SEP 499/520 nm, β2-pHuji 568/603 nm en mTagBFP2 359/461 nm).
  7. Scan de schotel om cellen te lokaliseren voor beeldvorming met een 10x-60x objectief. Verhoog de vergroting indien gewenst en pas de scherpsteldiepte aan indien nodig.
  8. Pas de laserintensiteit en detectorgevoeligheid aan om de fluorescentie te visualiseren zonder achtergrondsignaal. Stel de diafragma aan om het fluorescentiesignaal te vergroten, indien nodig.
  9. Selecteer de voorkeursresolutie en maak de afzonderlijke afbeelding met het gewenste objectief (bijv. 60x).
  10. Noteer de locatie op de schotel-kaart om dezelfde cellen te verplaatsen na de bufferverandering naar pH 5,5 afkoelbuffer.
  11. Herhaal het beeldvormingsproces voor verschillende gebieden op de schotel, waarbij elke nieuwe locatie wordt vastgelegd. Gebruik dezelfde opname-instellingen voor alle beelden (experimentele en controlegroepen) om geldige vergelijkingen mogelijk te maken.
  12. Houd alleen de uitlaatleiding aangesloten op de peristaltische pomp, zuig langzaam de pH 7,4 buffer uit de schaal in een afvalcontainer.
  13. Wanneer het grootste deel van de buffer is verwijderd (zonder uitdrogende cellen), zet dan de inlaatlijn over op de pH 5,5 afschrikbuffer.
  14. Zet de peristaltische pomp aan om langzaam pH 5,5 buffer (1,5 mL/min) aan de schotel toe te voegen, zodat cellen aan elkaar blijven zitten.
  15. Laat de pomp 20 minuten draaien en let op dat de buffer correct in en uit de schotel stroomt.
  16. Zet de pomp uit en incubeer de cellen met de pH 5,5 afkoelbuffer voor nog eens 20 minuten om evenwicht te garanderen.
  17. Om de beeldvorming te herhalen, laad je de opgeslagen locaties van de vorige sessie om terug te keren naar dezelfde regio's.
  18. Controleer of de brandpuntsdiepte en positie correct zijn, want ze kunnen verschuiven na de uitwisseling van de buffer.
  19. Herhaal beeldvorming op alle opgeslagen locaties met behulp van de pH-gequenched-conditie.
ReagensConcentratie (mM)
NaCl135
KCl5
MgCl21.8
HEPES20
d-glucose1
Stel de oplossing aan op pH 7,4

Tabel 1: Recept voor beeldvormingsbuffer. De volgende reagentia werden samengevoegd en de oplossing werd aangepast naar pH 7,4.

ReagensConcentratie (mM)
NaCl135
KCl5
MgCl20.4
CaCl21.8
MES20
d-glucose1
Stel de oplossing aan op pH 5,5

Tabel 2: Recept voor afkoelbuffer .De volgende reagentia werden gemengd en de resulterende oplossing werd aangepast naar een pH van 5,5.

4. Beeldkwantificatie

OPMERKING: Deze procedure legt uit hoe celbeelden geanalyseerd kunnen worden met ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD) en de gecorrigeerde totale celfluorescentie (CTCF) methode32.

  1. Open ImageJ en open de afbeelding die geanalyseerd moet worden. De afbeelding zal als een stapel verschijnen waarbij elk vastgelegd kanaal binnen hetzelfde frame gescheiden is.
  2. Navigeer naar het Fase-kanaal. Als de afbeelding te fel is (gebruikelijk voor lege of achtergrondgebieden), selecteer dan Proces > Contrast verbeteren en klik dan op OK.
  3. Met het vergrootglas zoom je in (+) op één cel. Met het Freehand-selectiegereedschap traceert u de omtrek van de cel in het fasekanaal.
  4. Schakel over naar het fluorescerende kanaal dat overeenkomt met de fluorofoor van interesse. Stel de gewenste metingen in door te kiezen voor Analyseren > Metingen instellen. Zorg ervoor dat Area, Mean Gray Value en Integrated Density worden gecontroleerd.
  5. Om het geselecteerde gebied te meten, kies je Analyseren > Meten of druk je op Command + M (Mac) / Ctrl + M (Windows).
  6. Neem drie achtergrondmetingen door lege gebieden nabij de cel te traceren. Herhaal de stappen voor het gewenste aantal cellen.
  7. Meetgegevens verschijnen in een apart Resultatenvenster in ImageJ. Kopieer en plak deze gegevens in Excel voor analyse.
  8. Bereken het gemiddelde achtergrondgemiddelde uit de drie achtergrondmetingen.
  9. Bereken de CTCF-waarde voor elke cel met de volgende formule:
    CTCF=Geïntegreerde dichtheid− (Oppervlakte van cel x Gemiddelde achtergrondfluorescentie)
  10. Herhaal dit proces voor meerdere cellen en beelden per experimentele groep (en pH-conditie, indien van toepassing). Exporteer alle resultaten naar een data-analysesoftware voor statistische verwerking.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Na bovenstaande transfectieprocedures werden α7 nAChRs en het NACHO chaperoneiwit geco-expresseerd in N2a-cellen. Zowel niet-getransfecteerde als getransfecteerde cellen werden gelabeld met αBTX-AF647 24 uur na DNA-transfectie. Omdat αBTX niet membraandoorlatend is, komt alle gedetecteerde fluorescentie voort uit receptoren die aanwezig zijn op het plasmamembraan. In Figuur 2A,A′ werd zwakke αBTX-AF647-kleuring waargenomen in niet-getransfec...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De gepresenteerde methodologieën voor het expresseren en kwantificeren van nAChR-subunits in zoogdier-N2a-cellen pakken langdurige uitdagingen aan bij het bereiken van snelle (~24 uur) en overvloedige nAChR-expressie (> 60%) plasmamembraan voor geneesmiddelenontdekking, lokalisatie en traffickingstudies. Een belangrijke kracht van deze set protocollen is de aanpassingskracht voor zowel homomere (α7) als heteromere (α4β2) nAChR's, en het is waarschijnlijk toepasbaar op andere nAChR-subtyp...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

De auteurs willen James Janoso bedanken voor zijn technische microscopie-expertise en het Center for Transformative Research in Metabolism (National Institute of General Medical Sciences van de National Institutes of Health onder Award Number P20GM130443) voor de ondersteuning van de Microscopy Core aan de University of Alaska Fairbanks. De inspanningen van LW werden deels ondersteund door financiering van het Higher Education Investment Fund, verstrekt door de staat Alaska via de University of Alaska. De inspanningen van SMS werden ondersteund door de Institutional Development Award (IDeA) van het National Institute of General Medical Sciences van de National Institutes of Health onder subsidienummer P20GM103395. Het onderzoek dat in deze publicatie wordt gerapporteerd, werd ondersteund door het National Institute of Mental Health van de National Institutes of Health (MMW met toekenningsnummer R03MH135358) en het National Institute of General Medical Sciences (MMW met toekenningsnummer R16GM150455) van de National Institutes of Health.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.25% Trypsin-EDTA (1X) Gibco25200-056Celafscheidingsreagens
Alpha-Bungarotoxin Alexa Fluor 647InvitrogenB35450Alpha-Bungarotoxin-conjugaat
BSL-level 1 Biosafety Cabinet NuaireNU-425-400Steriele werkruimte voor celcultuur
Calcium chlorideAventor/VWRBDH9224Buffercomponent
D-(+)-GlucoseMilliPore Sigma G8270Buffercomponent
EMEM met L-glutamineATCC30-2003Cellmedium
Endotoxin-vrij DNAZelf gemaakt met behulp van Zymo-kitsniet van toepassingnAChR DNA's te gebruiken voor cellulaire tijdelijke transfecties
Endotoxin-vrije microcentrifugebuizen, 0.5 mL Aventor/VWR89000-010DNA- en transfectievoorbereiding
Endotoxin-vrije microcentrifugebuizen, 1.5 mL Aventor/VWR20170-038DNA- en transfectievoorbereiding
Fetal Bovine SerumAventor/VWR97068-085Serumsupplement
Fluoview FV10iOlympusFV10iConfocale microscoop
Glass Bottom MatTek DishesMatTekP35GC-0-10-CBeeldvormingsschotels
GraphPad Prism v. 10GraphPad Prismhttps://www.graphpad.com/featuresData-analysesoftware
HEPESMilliPore Sigma H3375Buffercomponent
Lipofectamine 2000Invitrogen11668019Transfectiereagens
Magnesium chloride hexahydrateThermo scientific413410025Buffercomponent
MES hydrateMilliPore Sigma M5287Buffercomponent
mTagBFP2-pBADAddGene 54572Controle-DNA voor cellulaire tijdelijke transfectie 
Neuro 2 a (N2a) cellenAmerican Type Culture CollectionCCL-131Cellen gebruikt voor DNA-transfecties en nAChR-expressie
Opti-MEMGibco31985-070Medium met verminderd serum
Penicilline/StreptomycineAventor/VWRK952-100mLAntibioticum
PeristaltiekpompGilsonMiniPuls3Bufferwijzigingen bij beeldvorming 
Phosphate-buffered salineQuality Biological119-069-131Salinebuffer
Pipet AidDrummond 140084Precies vloeistoftransport
Pipet tips (steriele en endotoxine-vrije, 1000uL)Rainin30389216Precies vloeistoftransport
Pipet tips (steriele en endotoxine-vrije, 20uL)Rainin30389229Precies vloeistoftransport
Pipet tips (steriele en endotoxine-vrije, 250uL )Rainin30389246Precies vloeistoftransport
Pipetten, P10Rainin L-10XLSPrecies vloeistoftransport
Pipetten, P100Rainin L-100XLSPrecies vloeistoftransport
Pipetten, P1000Rainin L-1000XLSPrecies vloeistoftransport
KaliumchlorideMilliPore Sigma P3911Buffercomponent
Serologische pipetten (steriele en endotoxine-vrije, 10 ML )Aventor/VWR89130-898Precies vloeistoftransport
Serologische pipetten (steriele en endotoxine-vrije, 25 mL )Aventor/VWR89130-900Precies vloeistoftransport
Serologische pipetten (steriele en endotoxine-vrije, 5 mL )Aventor/VWR76201-710Precies vloeistoftransport
Serologische pipetten (steriele en endotoxine-vrije, 50 mL )Aventor/VWR75816-088Precies vloeistoftransport
NatriumchlorideAventor/VWRBDH9286Buffercomponent
WeefselkweekflaconFalcon353109Groeiende schotels
ZymoPure II Plasmid Maxiprep KitZYMO RESEARCHD4203-A + D4203-BProductie van endotoxine-vrij DNA
α4-SEP ThermoFisher Scientific GeneArt Gene Synthesis Services  https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cloning/c-misc/geneart.htmlDiensten voor aangepaste gensyntheses
α7-pHujiTwist Biosciencehttps://www.twistbioscience.com/Diensten voor aangepaste gensyntheses
β2-pHujiThermoFisher Scientific GeneArt Gene Synthesis Services  https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cloning/c-misc/geneart.htmlDiensten voor aangepaste gensyntheses

Referenties

  1. Whiting, P. J., et al. Expression of nicotinic acetylcholine receptor subtypes in brain and retina. Mol Brain Res. 10 (1), 61-70 (1991).
  2. Albuquerque, E. X., et al. Nicotinic Receptor Function in the Mammalian Central Nervous System. Ann New York Acad Sci. 757 (1), 48-72 (1995).
  3. Picard, F., et al. Alteration of the in vivo nicotinic receptor density in ADNFLE patients: a PET study. Brain. 129 (8), 2047-2060 (2006).
  4. Breese, C. Abnormal Regulation of High Affinity Nicotinic Receptors in Subjects with Schizophrenia. Neuropsychopharmacology. 23 (4), 351-364 (2000).
  5. De Luca, V., Voineskos, S., Wong, G., Kennedy, J. L. Genetic interaction between α4 and β2 subunits of high affinity nicotinic receptor: analysis in schizophrenia. Exp Brain Res. 174 (2), 292-296 (2006).
  6. Maskos, U., et al. Nicotine reinforcement and cognition restored by targeted expression of nicotinic receptors. Nature. 436 (7047), 103-107 (2005).
  7. Picciotto, M. R., et al. Acetylcholine receptors containing the β2 subunit are involved in the reinforcing properties of nicotine. Nature. 391 (6663), 173-177 (1998).
  8. Staley, J. K. Human Tobacco Smokers in Early Abstinence Have Higher Levels of β2 Nicotinic Acetylcholine Receptors than Nonsmokers. J Neurosci. 26 (34), 8707-8714 (2006).
  9. Gotti, C., Zoli, M., Clementi, F. Brain nicotinic acetylcholine receptors: native subtypes and their relevance. Trends Pharmacol Sci. 27 (9), 482-491 (2006).
  10. Mineur, Y. S., Mose, T. N., Blakeman, S., Picciotto, M. R. Hippocampal α7 nicotinic ACh receptors contribute to modulation of depression-like behaviour in C57BL/6J mice. British J Pharmacol. 175 (11), 1903-1914 (2018).
  11. Fernandes, S. S., et al. Enhanced cholinergic-tone during the stress induce a depressive-like state in mice. Behav Brain Res. 347, 17-25 (2018).
  12. Ren, J. M., Zhang, S. L., Wang, X. L., Guan, Z. Z., Qi, X. L. Expression levels of the α7 nicotinic acetylcholine receptor in the brains of patients with Alzheimer's disease and their effect on synaptic proteins in SH-SY5Y cells. Mol Med Rep. 22 (3), 2063-2075 (2020).
  13. Letchworth, S. R., Whiteaker, P. Progress and Challenges in the Study of α6-Containing Nicotinic Acetylcholine Receptors. Biochem Pharmacol. 82 (8), 862-872 (2011).
  14. Nelson, M. E., et al. Functional Properties of Human Nicotinic Achrs Expressed by Imr-32 Neuroblastoma Cells Resemble Those of α3β4 Achrs Expressed in Permanently Transfected Hek Cells. J General Physiol. 118 (5), 563-582 (2001).
  15. Cooper, S. T., Harkness, P. C., Baker, E. R., Millar, N. S. Up-regulation of Cell-surface α4β2 Neuronal Nicotinic Receptors by Lower Temperature and Expression of Chimeric Subunits *. J Biol Chem. 274 (38), 27145-27152 (1999).
  16. Harkness, P. C., Millar, N. S. Inefficient cell-surface expression of hybrid complexes formed by the co-assembly of neuronal nicotinic acetylcholine receptor and serotonin receptor subunits. Neuropharmacology. 41 (1), 79-87 (2001).
  17. Dhara, M. Polyamine regulation of ion channel assembly and implications for nicotinic acetylcholine receptor pharmacology. Nat Commun. 11 (1), (2020).
  18. Vallés, A. S., Roccamo, A. M., Barrantes, F. J. Ric-3 chaperone-mediated stable cell-surface expression of the neuronal α7 nicotinic acetylcholine receptor in mammalian cells. Acta Pharmacol Sinica. 30 (6), 818-827 (2009).
  19. Dawe, G. B., et al. α7 nicotinic acetylcholine receptor upregulation by anti-apoptotic Bcl-2 proteins. Nat Comm. 10 (1), (2019).
  20. Peng, J. H., et al. Inducible, heterologous expression of human α7-nicotinic acetylcholine receptors in a native nicotinic receptor-null human clonal line. Brain Res. 825 (1-2), 172-179 (1999).
  21. Cooper, S. T., Harkness, P. C., Baker, E. R., Millar, N. S. Up-regulation of Cell-surface α4β2 Neuronal Nicotinic Receptors by Lower Temperature and Expression of Chimeric Subunits. J Biol Chem. 274 (38), 27145-27152 (1999).
  22. Richards, C. I., et al. Trafficking of α4* Nicotinic Receptors Revealed by Superecliptic Phluorin. J Biol Chem. 286 (36), 31241-31249 (2011).
  23. Shen, Y., Rosendale, M., Campbell, R. E., Perrais, D. pHuji, a pH-sensitive red fluorescent protein for imaging of exo- and endocytosis. J Cell Biol. 207 (3), 419-432 (2014).
  24. Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
  25. O'Brien, B. C. V., Weber, L., Hueffer, K., Weltzin, M. M. SARS-CoV-2 spike ectodomain targets α7 nicotinic acetylcholine receptors. J Biol Chem. 299 (5), 104707(2023).
  26. O'Brien, B. C. V., et al. The human alpha7 nicotinic acetylcholine receptor is a host target for the rabies virus glycoprotein. Front Cell Infect Microbiol. 14, (2024).
  27. Shen, Y., Rosendale, M., Campbell, R. E., Perrais, D. pHuji, a pH-sensitive red fluorescent protein for imaging of exo- and endocytosis. J Cell Biol. 207 (3), 419-432 (2014).
  28. Sankaranarayanan, S., Angelis, D. D., Rothman, J. E., Ryan, T. A. The Use of pHluorins for Optical Measurements of Presynaptic Activity. Biophy J. 79 (4), 2199-2208 (2000).
  29. Henderson, B. J., et al. Nicotine exploits a COPI-mediated process for chaperone-mediated up-regulation of its receptors. J General Physiol. 143 (1), 51-66 (2013).
  30. Nichols, W. A., et al. Lynx1 Shifts α4β2 Nicotinic Receptor Subunit Stoichiometry by Affecting Assembly in the Endoplasmic Reticulum. J Biol Chem. 289 (45), 31423-31432 (2014).
  31. Subach, O. M., Cranfill, P. J., Davidson, M. W., Verkhusha, V. V. An Enhanced Monomeric Blue Fluorescent Protein with the High Chemical Stability of the Chromophore. PLoS One. 6 (12), e28674(2011).
  32. Fitzpatrick, M. Measuring cell fluorescence using ImageJ. , http://theolb.readthedocs.io/en/latest/imaging/measuring-cell-fluorescence-using-imagej.html#measuring-cell-fluorescence-using-imagej (2025).
  33. Srinivasan, R., et al. Nicotine up-regulates α4β2 nicotinic receptors and ER exit sites via stoichiometry-dependent chaperoning. J Gen Physiol. 137 (1), 59-79 (2011).
  34. Subach, O. M., Cranfill, P. J., Davidson, M. W., Verkhusha, V. V. An Enhanced Monomeric Blue Fluorescent Protein with the High Chemical Stability of the Chromophore. PLoS One. 6 (12), e28674(2011).
  35. Matta, J. A., et al. NACHO Mediates Nicotinic Acetylcholine Receptor Function throughout the Brain. Cell Rep. 19 (4), 688-696 (2017).
  36. Flores, C. M., Rogers, S. W., Pabreza, L. A., Wolfe, B. B., Kellar, K. J. A subtype of nicotinic cholinergic receptor in rat brain is composed of alpha 4 and beta 2 subunits and is up-regulated by chronic nicotine treatment. Mol Pharmacol. 41 (1), 31-37 (1992).
  37. Mazzaferro, S., Whiteman, S. T., Alcaino, C., Beyder, A., Sine, S. M. NACHO and 14-3-3 promote expression of distinct subunit stoichiometries of the α4β2 acetylcholine receptor. Cell Mol Life Sci. 78 (4), 1565-1575 (2021).
  38. Nichols, W. A., et al. Lynx1 Shifts α4β2 Nicotinic Receptor Subunit Stoichiometry by Affecting Assembly in the Endoplasmic Reticulum. J Biol Chem. 289 (45), 31423-31432 (2014).
  39. Fasoli, F., et al. In vivo chronic nicotine exposure differentially and reversibly affects upregulation and stoichiometry of α4β2 nicotinic receptors in cortex and thalamus. Neuropharmacology. 108, 324-331 (2016).
  40. Wada, E., et al. Distribution of alpha2, alpha3, alpha4, and beta2 neuronal nicotinic receptor subunit mRNAs in the central nervous system: A hybridization histochemical study in the rat. J Comparative Neurol. 284 (2), 314-335 (1989).
  41. Zoli, M., Léna, C., Picciotto, M. R., Changeux, J. P. Identification of Four Classes of Brain Nicotinic Receptors Using β2 Mutant Mice. J Neurosci. 18 (12), 4461-4472 (1998).
  42. Briggs, C. A., et al. and Low-Sensitivity Subforms of α4β2 and α3β2 nAChRs. J Mol Neurosci. 30 (1-2), 11-12 (2006).
  43. Weltzin, M. M., George, A. A., Lukas, R. J., Whiteaker, P. Distinctive single-channel properties of α4β2-nicotinic acetylcholine receptor isoforms. PLoS One. 14 (3), e0213143(2019).
  44. Moroni, M., Bermudez, I. Stoichiometry and Pharmacology of Two Human α4β2 Nicotinic Receptor Types. J Mol Neurosci. 30 (1-2), 95-96 (2006).
  45. Nelson, M. E., Kuryatov, A., Choi, C. H., Zhou, Y., Lindstrom, J. Alternate Stoichiometries of α4β2 Nicotinic Acetylcholine Receptors. Mol Pharmacol. 63 (2), 332-341 (2003).
  46. Tapia, L., Kuryatov, A., Lindstrom, J. Ca2+ Permeability of the (α4)3(β2)2 Stoichiometry Greatly Exceeds That of (α4)2(β2)3 Human Acetylcholine Receptors. Mol Pharmacol. 71 (3), 769-776 (2007).
  47. Eaton, J. B., et al. The Unique α4(+)/(−)α4 Agonist Binding Site in (α4)3(β2)2 Subtype Nicotinic Acetylcholine Receptors Permits Differential Agonist Desensitization Pharmacology versus the (α4)2(β2)3 Subtype. J Pharmacol Exp Ther. 348 (1), 46-58 (2014).
  48. Mazzaferro, S., et al. Additional Acetylcholine (ACh) Binding Site at α4/α4 Interface of (α4β2)2α4 Nicotinic Receptor Influences Agonist Sensitivity. J Biol Chem. 286 (42), 31043-31054 (2011).
  49. Richards, C. I., et al. Trafficking of α4* Nicotinic Receptors Revealed by Superecliptic Phluorin. J Bio Chem. 286 (36), 31241-33124 (2011).
  50. Asokan, A., Cho, M. J. Exploitation of Intracellular pH Gradients in the Cellular Delivery of Macromolecules. J Pharma Sci. 91 (4), 903-913 (2002).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Lokalisatie in het plasmamembraanIntracellulaire lokalisatieLive cell confocale microscopiepH gevoelige fluorescentieReceptor traffickingChaperonne eiwittenNeuro2a cellenImageJ analyse

Gerelateerde artikelen