Onderzoeksartikel

ML385 verzwakt kwaadaardige progressie van door silica geïnduceerde longadenocarcinoomcellen via de ROS/NRF2-autofagie-asroute

487 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/69382

⸱

31 oktober 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Medicine, Anhui University of Science and Technology, 2Department of Medical Laboratory, Huaian Hospital of Huaian City, 3Department of Pathology, The Affiliated Huai'an NO.1 People's Hospital of Nanjing Medical University, 4Department of Medical Laboratory, The Affiliated Huai'an NO.1 People's Hospital of Nanjing Medical University, 5Department of Pediatrics, The Affiliated Huai'an NO.1 People's Hospital of Nanjing Medical University, 6Department of Anesthesiology, The Affiliated Huai'an NO.1 People's Hospital of Nanjing Medical University, 7Key Laboratory of Industrial Dust Deep Reduction and Occupational Health and Safety of Anhui Higher Education Institutes, 8Department of Blood Transfusion, Shanghai Pudong New Area People's Hospital

In dit artikel

Samenvatting

Deze studie maakt gebruik van dier- en celmodellen om te onderzoeken of NRF2-remmer ML385 de door silica geïnduceerde kwaadaardige progressie van longadenocarcinoom via de ROS/NRF2-autofagie-asroute verzwakt.

Samenvatting

Blootstelling aan silica wordt in verband gebracht met een verhoogd risico op longadenocarcinoom, maar het moleculaire mechanisme blijft onduidelijk. Deze studie heeft tot doel een herhaalbaar experimenteel protocol op te stellen om te onderzoeken hoe de nucleaire factor erytroïde 2-gerelateerde factor 2 (NRF2)-remmer ML385 door silica geïnduceerde kwaadaardige progressie van longadenocarcinoom remt door de ROS/NRF2-autofagie-asroute te reguleren. Ten eerste werd een silicosemodel opgesteld door intranasale perfusie van silicasuspensie in C57BL/6-muizen. De mate van longfibrose werd geëvalueerd door Masson-kleuring, de infiltratie van immuuncellen werd geanalyseerd door immunofluorescentie en de expressies van NRF2, cycline-afhankelijke kinase 1 (CDK1) en spanningsafhankelijk anionkanaal 1 (VDAC1) in longweefsel werden gedetecteerd door immunohistochemie. Vervolgens werd in in vitro experimenten de RAW264.7 macrofaagcellijn behandeld met silica. Autofagische flux en oxidatieve stressniveaus werden geëvalueerd door middel van LC3-lysosoom co-lokalisatie en ROS-sondes, en interventie werd uitgevoerd met de NRF2-remmer ML385. Ten slotte werden de effecten van ML38 op migratie, invasie en apoptose van longadenocarcinoomcellen geanalyseerd door middel van scratch-assay, cellen die door poriën van een specifieke grootte gaan en flowcytometrie. De resultaten toonden aan dat silica longfibrose, infiltratie van immuuncellen en opregulatie van NRF2, CDK1 en VDAC1 bij muizen (p < 0,001) kan induceren, en de autofagische flux van macrofagen kan remmen en ROS-niveaus kan verlagen. ML385 kan deze effecten omkeren (p < 0,05). Dit protocol biedt een compleet experimenteel proces van in vivo modelconstructie tot in vitro mechanismeonderzoek, en biedt een operationeel technisch pad voor het bestuderen van het moleculaire mechanisme van silica-gerelateerd longadenocarcinoom en therapeutische strategieën gericht op NRF2.

Inleiding

Longadenocarcinoom is wereldwijd de belangrijkste oorzaak van kankergerelateerde sterfgevallen, met naar schatting 2 miljoen nieuwe gevallen en 1,76 miljoen sterfgevallen per jaar1. In de afgelopen jaren is de incidentie van longadenocarcinoom bij mensen die nog nooit hebben gerookt gestegen, wat verband kan houden met omgevingsfactoren zoals luchtvervuiling2. Silica is een veel voorkomende milieuverontreinigende stof en is geïdentificeerd als een potentiële pathogene factor voor menselijk longadenocarcinoom3. Silica kan aanhoudende chronische ontstekingen veroorzaken, wat leidt tot infiltratie van macrofagen, lymfocyten en neutrofielen, en het vrijkomen van reactieve zuurstofsoorten en ontstekingsfactoren4. Deze langdurige inflammatoire micro-omgeving bevordert het optreden van longadenocarcinoom 5,6. Hoewel het verband tussen blootstelling aan silica en longadenocarcinoom is bevestigd, is het specifieke moleculaire mechanisme ervan niet volledig opgehelderd.

De transcriptiefactor NRF2, gecodeerd door het NFE2L2-gen, speelt een cruciale rol als hoofdregulator bij het handhaven van cellulaire redoxhomeostase als reactie op oxidatieve stress 7,8. Onder normale omstandigheden wordt NRF2 gelabeld en afgebroken door het KEAP1-CUL3 ubiquitine-ligasecomplex. Onder stimulatie van oxidatieve stress of elektrofiele stoffen wordt de activiteit van KEAP1 geremd, waardoor NRF2 zich stabiel kan ophopen en de kern kan binnendringen, waardoor de verdedigings- en regulerende rol van de kern9 wordt uitgeoefend. Desalniettemin kan overmatige NRF2-activering in de micro-omgeving van de tumor de glycolyse en de overleving van tumorcellen verbeteren door ROS-accumulatie te stoppen en apoptotische resistentie te stimuleren10,11. Studies hebben aangetoond dat blootstelling aan silica kan leiden tot abnormale activering van de NRF2-signaleringsroute 12,13. Daarom kan het richten op NRF2 een effectieve strategie zijn om in te grijpen in de kwaadaardige progressie van longadenocarcinoom geïnduceerd door silica14.

Deze studie heeft tot doel te verduidelijken of de NRF2-remmer ML385 door silica geïnduceerde kwaadaardige progressie van longadenocarcinoom remt door de ROS/NRF2-autofagie-asroute te reguleren. We hebben een silica-geïnduceerd muismodel opgesteld om de belangrijkste kenmerken van de ziekte te reproduceren en hebben in vitro experimentele methoden gebruikt om de interactie tussen macrofagen en tumorcellen te bestuderen. We ontdekten dat silica de expressie van ontstekings- en immuunmoleculen induceerde en de tumorvorming verder bevorderde via de ROS/NRF2-autofagie-asroute. Toen de NRF2-remmer (ML385) werd gebruikt, vertraagde het bevorderende effect van silica op tumorvorming, wat suggereert dat de NRF2-remmer een rol kan spelen bij de behandeling van door silica geïnduceerde longtumoren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle donorblokken zijn verkregen uit pathologische archiefmonsters die tussen 2016 en 2018 zijn verzameld in het Affiliated Huai'an NO.1 People's Hospital van de Nanjing Medical University. De monsters werden vóór gebruik geanonimiseerd en verwerkt in overeenstemming met goedgekeurde protocollen. De ethische commissie van het Affiliated Huai'an No.1 People's Hospital van de Nanjing Medical University, KY-2024-250-01. Het fokken, weggooien en toepassen van experimentele muizen volgt strikt de Regeling Administratie Proefdieren en internationale richtlijnen.

Bouw van een door silica geïnduceerd muismodel
Preparaat van muizen en silicasuspensie: Kweek mannelijke C57BL/6-muizen van 6-8 weken oud op in een dierenkamer met een kamertemperatuur van 20-25 °C en een cyclus van 12 uur licht / 12 uur donker. Om de siliciumstofsuspensie voor te bereiden, werd 300 mg siliciumstofpoeder nauwkeurig gewogen en gesuspendeerd in 10 ml steriele 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing. Vervolgens werd het mengsel gedurende 5 minuten krachtig gevortexeerd en geoscilleerd, en vervolgens gedurende 30 minuten ultrasoon behandeld in een ultrasone waterbadmachine om een uniforme verspreiding van de deeltjes te garanderen en aggregatie te voorkomen. De uiteindelijke concentratie van deze reservesuspensie is 30 mg/ml. Steriliseer het door te autoclaveren op 121 °C gedurende 30 min. Voor elk gebruik is het noodzakelijk om 2-3 minuten te vortexen en opnieuw te schudden om eventuele bezonken deeltjes weer in suspentie te brengen.

Muizen ademden silicasuspensie in via de neus. De micropipet werd gebruikt om de oplossing langzaam en druppelsgewijs in de neusholte van de muizen te brengen. De muizen werden verdeeld in 6 groepen met 20 muizen in elke groep. Het inhalatievolume van elke groep was 10 μl, 30 μl, 50 μl, 70 μl, 90 μl en 200 μl, met een concentratie van 30 mg/ml, eenmaal daags gedurende 40 opeenvolgende dagen. Pak bij het parfumeren de huid achter het oor van de muis vast met de duim en wijsvinger van de linkerhand en fixeer het lichaam en de staart van de muis met de andere vingers. Zorg ervoor dat de muis in rugligging ligt met het hoofd iets naar achteren gekanteld, zodat de suspensie op natuurlijke wijze in de luchtwegen kan worden ingeademd. We ontdekten dat er geen overlijden was na de tweede dag van inademing van 10 μL, 30 μL, 50 μL en 70 μL silicasuspensie bij muizen, terwijl er een overlijden was na de tweede dag van inademing van 90 μL en 200 μL silicasuspensie bij muizen. Daarom was het maximale volume silica-inhalatie bij muizen 70 μL per dag.

Bij het hanteren van kristallijn silica moet dit worden uitgevoerd in een bioveiligheidskast of zuurkast, en N95-maskers, stofdichte brillen, nitrilhandschoenen en beschermende kleding moeten tijdens het hele proces worden gedragen. Bij het bereiden van de suspensie moeten de bewegingen voorzichtig zijn en moet een weegkamer worden gebruikt om het ontstaan van aerosolen te voorkomen. Al het silica-contactafval moet worden ingezameld in afgesloten containers met perforatieweerstand en worden afgevoerd in overeenstemming met de voorschriften voor gevaarlijk chemisch afval. Het is ten strengste verboden om het te mengen met algemeen afval of in het riool te gieten. Biologisch afval, zoals celkweekmedium, moet worden opgevangen in speciale vuilnisbakken met ontsmettingsmiddelen en onder hoge druk worden gesteriliseerd. Karkassen en weefsels van dieren moeten in biologische afvalzakken worden gedaan en onder hoge druk worden gesteriliseerd voor onschadelijke behandeling.

Evalueer het succes van het door silica geïnduceerde muismodel. Beoordeel dieren op verschillende tijdstippen na inademing van silica, namelijk op de 3e, 14e en 40e dag. De muizen werden in professionele euthanasieapparaten voor dieren geplaatst en kooldioxide werd geïntroduceerd met een vulsnelheid van 30%-50% volume/min. Ze werden continu blootgesteld totdat ze stopten met ademen. Na bevestiging van het overlijden werden vervolgoperaties uitgevoerd. Het longweefsel werd verwijderd. Longweefsel werd gedurende 48 uur gefixeerd in een 4% paraformaldehyde-oplossing bij kamertemperatuur. Na fixatie werd het weefsel gedehydrateerd met gradiëntalcohol, transparant gemaakt met xyleen en vervolgens ingebed in paraffine. Doorlopende secties werden gemaakt met behulp van een paraffinesnijmachine met een dikte van 4-5 μm voor daaropvolgende histologische kleuring en immunohistochemische analyse. Het longweefsel heeft geen ontkalkingsbehandeling nodig. Pathologisch onderzoek van longweefsel werd uitgevoerd om succesvolle modelgeneratie te evalueren. De succescriteria van de constructie van silicosemodellen waren als volgt: significante longontsteking, fibrose en het voorkomen van silicoseknobbeltjes.

Analyse van immuuncelinfiltratie in het silica-geïnduceerde muismodel
De longweefsels van muizen op dag 14 na inhalatie van silica werden gekleurd met fluorescerende markers die CD3e (verdunningsverhouding 1:200), CD8a (verdunningsverhouding 1:200), CD86 (verdunningsverhouding 1:200), F4/80 (verdunningsverhouding 1:200) en Nk1.1 (verdunningsverhouding 1:200) bevatten om immuuncellen te visualiseren. Fixeer cel- of weefselsecties en blokkeer met 5% runderserumalbumine (BSA) gedurende 1 uur om niet-specifieke binding te verminderen. Gebruik normaal serum van dezelfde soort als het blokkerende antilichaam, verdun het serum met PBS in een verhouding van 1:10 en voeg 100 μL verdund serum toe aan het monster. Blokkeer vervolgens 30 minuten bij kamertemperatuur zodat het serum endogene antilichamen kan blokkeren. Na het sealen 2x voorzichtig afspoelen met PBS. De primaire antilichamen die CD3e (verdunningsverhouding 1:200), CD8a (verdunningsverhouding 1:200), CD86 (verdunningsverhouding 1:200), F4/80 (verdunningsverhouding 1:200) en Nk1.1 (verdunningsverhouding 1:200) bevatten, werden 's nachts geïncubeerd bij 4 °C of bij kamertemperatuur gedurende 1-2 uur. Na het wassen met PBS werd het fluorescerende secundaire antilichaam toegevoegd en gedurende 1 uur in het donker geïncubeerd.

Massonkleuring en immunohistochemische analyse
Paraffinesecties werden van was ontdaan met xyleen en gehydrateerd met gradiëntalcohol, en vervolgens werd het antigeen opgehaald in natriumcitraatbuffer met pH 6,0 door thermische sanering onder hoge druk. Voor thermische sanering onder hoge druk plaatst u de in reparatiebuffer gedrenkte weefselplakken 8-12 minuten in een magnetron op middelhoog vuur. De endogene peroxidase-activiteit werd gedurende 20 minuten geblokkeerd met 3% waterstofperoxideoplossing en vervolgens werd de niet-specifieke bindingsplaats gedurende 30 minuten geblokkeerd met 5% BSA bij kamertemperatuur. Voeg de primaire antilichamen NRF2 (1:200), CDK1 (1:400) en VDAC1 (1:500) toe en incubeer een nacht bij 4 °C. Voeg na 3x wassen met PBS HRP-gelabeld geitenanti-konijn secundair antilichaam (1:500) toe en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Paraffinesecties werden onderworpen aan DAB-kleuring, hematoxyline-tegenkleuring, dehydratatietransparantie en neutrale gelafdichting om de overeenkomstige moleculaire immunohistochemische resultaten te verkrijgen. Wanneer DAB wordt gebruikt voor kleurontwikkeling, moet de matige kleurontwikkeling bruingeel tot bruinbruin zijn en moet de achtergrond helder zijn. Zowel een overmatige (donkerbruine) als een te lage (lichtgele) kleurontwikkeling vereisen een optimalisatie van de kleurontwikkelingstijd.

De mate van longfibrose werd semi-kwantitatief geanalyseerd met behulp van de Ashcroft-scoremethode15: met Masson gekleurde secties werden waargenomen onder een microscoop met een vergroting van 100x en het longweefsel werd willekeurig verdeeld in 8 regio's. Elke regio werd gescoord op basis van de mate van fibrose (0-8 punten), waarbij de eindscore het gemiddelde van alle regio's was: 0 punten (normaal longweefsel), 1-2 punten (milde fibrose), 3-4 punten (matige fibrose), 5-8 punten (ernstige fibrose).

De immunohistochemische resultaten werden kwantitatief geanalyseerd met behulp van Image-software. Vijf velden met een hoge vergroting werden willekeurig geselecteerd en de gemiddelde optische dichtheidswaarde (MOD) van elk veld werd gemeten als een indicator van het eiwitexpressieniveau.

Onderzoek naar de impact van silica en ML385 op autofagie en ROS in RAW264.7-cellen
Zowel RAW264.7- als A549-cellen (geleverd door de Anhui University of Science and Technology) werden gekweekt met behulp van DMEM-medium met een hoog glucosegehalte, aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline-streptomycine bispecifieke antilichaamoplossing. De 1 x 107 cellen werden gelijkmatig gekweekt in een incubator met constante temperatuur bij 37 °C en 5% CO2. 5 μL 30 mg/ml silicasuspensie werd toegevoegd aan 1 x 105 cellen/ml RAW264.7-cellen. Na incubatie gedurende 24 uur werden de cellen 3x gespoeld met PBS en werden de autofagie en oxidatieve stress gedetecteerd door ROS-, LC3- en lysosoomsondes. Tegelijkertijd werd ML38516, een remmer van NRF2, gebruikt om de expressie van NRF2 te remmen (eindconcentratie van ML385: 5 mM/L). Autofagie en oxidatieve stress werden gedetecteerd volgens de bovenstaande experimentele stappen. De oxidatieve stress en autofagiestroom van de twee groepen werden statistisch geanalyseerd.

Immunohistochemische analyse van VDAC1-, CDK1-, p62- en NRF2-expressies in longadenocarcinoomweefsel
De expressies van VDAC1, CDK1, p62 en NRF2 werden gecontroleerd bij 30 patiënten. Weefsels met longadenocarcinoom en aangrenzende gezonde weefsels werden verkregen uit het Affiliated Huai'an NO.1 People's Hospital van de Nanjing Medical University en werden geanalyseerd door middel van immunohistochemie (IHC). De resultaten van IHC en longfibrose werden statistisch geanalyseerd. Verzamel patiëntgegevens op basis van patiëntinformatie in het ziekenhuissysteem. De specifieke experimentele stappen zijn als volgt: Paraffinesecties werden van was ontlast met xyleen en gehydrateerd met gradiëntalcohol, en vervolgens werd antigeensanering uitgevoerd in natriumcitraatbuffer met pH 6,0 door thermische remedering onder hoge druk. De endogene peroxidase-activiteit werd gedurende 20 minuten geblokkeerd met 3% waterstofperoxideoplossing en vervolgens werd de niet-specifieke bindingsplaats gedurende 30 minuten geblokkeerd met 5% BSA bij kamertemperatuur. Voeg de primaire antilichamen NRF2 (1:200), CDK1 (1:400), p62 (1:500) en VDAC1 (1:500) toe en incubeer een nacht bij 4 °C. Voeg na 3x wassen met PBS HRP-gelabeld geitenanti-konijn secundair antilichaam (1:500) toe en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. DAB-kleurontwikkeling, hematoxyline-tegenkleuring, gedehydrateerde transparante, neutrale gomafdichting. Wanneer DAB wordt gebruikt voor kleurontwikkeling, moet de matige kleurontwikkeling bruingeel tot bruinbruin zijn en moet de achtergrond helder zijn. Zowel een overmatige (donkerbruine) als een te lage (lichtgele) kleurontwikkeling vereisen een optimalisatie van de kleurontwikkelingstijd.

Analyse van celmigratie en invasie
Het effect van de ML385 en het supernatans van de co-incubatie van silica met RAW264.7-cellen op celmigratie en -invasie na incubatie met de longadenocarcinoomcellijn A549 werd bestudeerd. Het supernatans van RAW264.7-cellen die gedurende 24 uur samen met silica waren gekweekt, werd toegevoegd aan A549-cellen. De cellen werden verdeeld in de silicagroep, de silica+ML385-groep en de PBS-groep. De silicagroep: 5 μL 30 mg/ml silicasuspensie werd toegevoegd aan 1 x 105 cellen/ml RAW264.7-cellen. Verwijder na 24 uur incubatie het celsupernatans voor later gebruik. De silica+ML385-groep: 5 μL 30 mg/ml silicasuspensie en een eindconcentratie van 5 mM/L ML385 werden toegevoegd aan 1 x 105 cellen/ml RAW264.7-cellen. Verwijder na 24 uur incubatie het celsupernatans voor later gebruik. PBS-groep: 5 μL PBS werd toegevoegd aan 1 x 105 cellen/ml RAW264.7-cellen. Verwijder na 24 uur incubatie het celsupernatans voor later gebruik. Tijdens de krastest werden A549-cellen eerst gezaaid in platen met 12 putjes met een dichtheid van 5 x 105 per putje. Nadat de cellen waren gegroeid tot 95%-100% fusie, werden krassen gemaakt op de monolaagcellen met behulp van de punt van een steriele pipet van 200 μL. De geëxfolieerde cellen werden voorzichtig afgewassen met PBS. Vervolgens werden de kweekomstandigheden gewijzigd om 1% FBS-basismedium en de supernatanten van elke behandelingsgroep op te nemen om de levensvatbaarheid van de cellen tijdens de experimentele periode van 7 dagen te behouden. Beelden van dezelfde positie werden verzameld onder een omgekeerde microscoop om respectievelijk 0 uur (dag 0) en op de 7e dag (dag 7) na de kras. Ten slotte werd het krasgebied kwantitatief geanalyseerd en werd de krassluitingssnelheid berekend met behulp van ImageJ-software om het effect van het supernatans uit verschillende behandelingsgroepen op het migratievermogen van A549-cellen te evalueren.

In de cellen die door poriën van specifieke grootte worden geleid, werd een polycarbonaat membraankamer van 8 μm gebruikt, waarbij het membraan van de bovenste kamer vooraf was gecoat met gel die de extracellulaire omgeving simuleerde, verdund in een verhouding van 1:8 om een basaalmembraanbarrière te construeren. A549-cellen werden geresuspendeerd in een suspensie die werd gemaakt door serumvrij medium te mengen met de supernatanten van elke behandelingsgroep in een verhouding van 1:1 en vervolgens geïnoculeerd in de bovenste kamer (2 x 104 cellen per kamer). In de onderste kamer werd een oplossing gemaakt door een medium met 20% FBS te mengen met de supernatanten van de overeenkomstige behandelingsgroepen (Silica+ML385-groep, Silica-groep en PBS-groep) in dezelfde verhouding als chemische lokstof. De supernatanten van de overeenkomstige behandelingsgroepen werden verzameld door afzuiging door een pipetpistool in RAW264.7 Celfagocytose van silica. Nadat de cellen gedurende 7 dagen continu waren geïncubeerd bij 37 °C en 5% CO2 , werden de niet-invasieve cellen in de bovenste kamer verwijderd met wattenstaafjes en werden de cellen die het membraan waren binnengedrongen en de onderste kamer hadden bereikt, gefixeerd met 4% paraformaldehyde en gekleurd met 0,1% kristalviolet. Ten slotte werd het aantal invasieve cellen willekeurig geselecteerd uit 5 gezichtsvelden door een optische microscoop.

Analyse van de impact van silica en ML385 op de apoptose van A549-cellen met behulp van flowcytometrie
Celpreparatie en groepering: A549-cellen behandeld met de supernatanten van elke behandelingsgroep (PBS-groep, silicagroep, silica + ML385-groep) werden verzameld. De cellen werden 2x voorzichtig gewassen met voorgekoelde PBS, vervolgens opnieuw gesuspendeerd in 1x bindingsbuffer en de celdichtheid werd aangepast naar 1 x 106 cellen per buisje/100 μL. Vervolgens werd 5 μL Annexin V-FITC en 5 μL PI-kleuringsoplossing aan de celsuspensie toegevoegd, voorzichtig gevortexed om te mengen en gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur in het donker geïncubeerd. Na incubatie werd 400 μL 1x bindingsbuffer aan elke buis toegevoegd en onmiddellijk op de machine getest. De detectie werd uitgevoerd met behulp van een flowcytometer. Opgewonden door een laser van 488 nm, werd het fluorescentiesignaal van Annexin V-FITC verzameld via het FITC-kanaal en het fluorescentiesignaal van PI werd verzameld via het PE-kanaal. Vóór het experiment werden enkelvoudige kleuringsmonsters gebruikt voor aanpassing van de fluorescentiecompensatie om spectrale overlap te elimineren. Bij het uitvoeren van gegevensanalyse moet eerst de doelcelpopulatie worden afgebakend in het FSC-A/SSC-A-spreidingsdiagram en moeten fragmenten worden geëlimineerd. Vervolgens werden celadhesies uitgesloten met behulp van het FSC-H/FSC-A-spreidingsdiagram; Ten slotte werd een poort opgezet om onderscheid te maken tussen levende cellen, vroege apoptotische cellen, late apoptotische/necrotische cellen en mechanisch beschadigde cellen. De gegevens zijn verkregen en geanalyseerd met behulp van FlowJo V10-software.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Silica muis model
In figuur 1 kregen de muizen gedurende 40 opeenvolgende dagen intranasaal silica toegediend in een dosering van 30 mg/ml en 70 μl, wat ervoor zorgde dat er geen sterfte plaatsvond bij de muizen en het silicamuismodel met succes kon worden vastgesteld. Ondertussen werden muizensonde met PBS gebruikt als negatieve controles. Het doel was om de invloed van de bewerking en het oplosmiddel zelf te elimineren en ervoor te zorgen dat het fenotype specifiek door...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Longadenocarcinoom is wereldwijd een van de belangrijkste oorzaken van kankergerelateerde sterfgevallen en de incidentie en sterftecijfers nemen jaar na jaar17 toe. Silica is door het Internationaal Agentschap voor Kankeronderzoek geclassificeerd als kankerverwekkend voor de mens van klasse 1 en het risico op longadenocarcinoom neemt toe bij cumulatieve beroepsmatige blootstelling 18,19,20,21.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dank aan de teamleden voor hun steun en bijdrage aan deze studie. Deze studie werd ondersteund door het Key Laboratory of Industrial Dust Deep Reduction and Occupational Health and Safety van Anhui Higher Education Institutes (NO. AYZJSGXLK202202006), Shanghai Pudong New Area People's Hospital Talent Introduction Start-up Fund (NO. PRYYH202501).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
BeyoGold TranswellBeyotime Biotechnology FTW067-48lnsTranswell
CD3eBD Bioscience561827FITC Hamster Anti-Mouse CD3e(145-2C11)
CD86BD Bioscience105013CD86
CD8aBD Bioscience100713CD8a
CDK1Abcamab133327Anti-CDK1
Cell apoptosis detection kitBeyotime Biotechnology C1062Lapoptosis detection
DAPIBeyotime Biotechnology P0131-25mlDAPI
Embedding machineP.S.J MEDICALBM450AEmbedding machine
F4/80BD Bioscience123109F4/80
Fully automatic tissue dehydratorLeica BiosystemsASP3005Fully automatic tissue dehydrator
Glass microscope slidesCitotest250124A1Glass microscope slides
H&E dyeBeyotime Biotechnology C0105MH&E dye
IHC KitAbsin Biotechnologyabs996-5mlIHC Kit
LC3 probeBeyotime Biotechnology C3018MLC3 probe
Low Profile Microtome BladesThermo Fisher3052835Low Profile Microtome Blades
lysosome probeBeyotime Biotechnology C1046lysosome probe
Marker penDeliSK109Marker pen
Masson dyeBeyotime Biotechnology C0189MMasson dye
Matrix-GelBeyotime Biotechnology C0371-5mlMatrix adhesive
MicrotomeLeica BiosystemsHistoCore BIOCUTMicrotome
ML385Abcamab287109NRF2 inhibitor
NK1.1BD Bioscience561117NK1.1
NRF2Abcamab1809YAnti-NRF2
p62Abcamab20735Anti-p62
Paraffin waxSolarbioYA0012Paraffin wax
Reactive oxygen species Assay kitBeyotime Biotechnology S0033MROS probe
SilicaSigma AldrichS5631Crystalline silica
VDAC1Abcamab34726Anti-VDAC1

Referenties

  1. Thai, A. A., Solomon, B. J., Sequist, L. V., Gainor, J. F., Heist, R. S. Lung cancer. Lancet. 398 (10299), 535-554 (2021).
  2. Liang, D., et al. Lung Cancer in Never-Smokers: A Multicenter Case-Control Study in North China. Front Oncol. 9, 1354(2019).
  3. Olsson, A., et al. Lung Cancer Risks Associated with Occupational Exposure to Pairs of Five Lung Carcinogens: Results from a Pooled Analysis of Case-Control Studies (SYNERGY). Environ Health Perspect. 132 (1), 017005(2024).
  4. Sato, T., Shimosato, T., Klinman, D. M. Silicosis and lung cancer: current perspectives. Lung Cancer Targets Ther. 9, 91-101 (2018).
  5. Nakano-Narusawa, Y., et al. Single Intratracheal Quartz Instillation Induced Chronic Inflammation and Tumourigenesis in Rat Lungs. Sci Rep. 10 (1), 6647(2020).
  6. Hornung, V., et al. Silica crystals and aluminum salts activate the NALP3 inflammasome through phagosomal destabilization. Nat Immunol. 9 (8), 847-856 (2008).
  7. Dodson, M., et al. Modulating NRF2 in Disease: Timing Is Everything. Ann Rev Pharmacol Toxicol. 59, 555-575 (2019).
  8. Bae, T., Hallis, S. P., Kwak, M. K. Hypoxia, oxidative stress, and the interplay of HIFs and NRF2 signaling in cancer. Exp Mol Med. 56 (3), 501-514 (2024).
  9. Yamamoto, M., Kensler, T. W., Motohashi, H. The KEAP1-NRF2 System: a Thiol-Based Sensor-Effector Apparatus for Maintaining Redox Homeostasis. Physiol Rev. 98 (3), 1169-1203 (2018).
  10. Weiss-Sadan, T., et al. NRF2 activation induces NADH-reductive stress, providing a metabolic vulnerability in lung cancer. Cell Metabol. 35 (3), 487-503.e7 (2023).
  11. Rojo de la Vega, M., Chapman, E., Zhang, D. D. NRF2 and the Hallmarks of Cancer. Cancer Cell. 34 (1), 21-43 (2018).
  12. Chen, G., et al. n-BuOH extract of Bletilla striata exerts chemopreventive effects on lung against SiO2 nanoparticles through activation of Nrf2 pathway. Phytomed Int J Phytother Phytopharmacol. 82, 153445(2021).
  13. Song, J., Meng, H., Deng, G., Lin, H. Sustainable Release Selenium Laden with SiO2 Restoring Peripheral Nerve Injury via Modulating PI3K/AKT Pathway Signaling Pathway. Int J Nanomed. 19, 7851-7870 (2024).
  14. Zuo, L., et al. The Nrf2-HMOX1 pathway as a therapeutic target for reversing cisplatin resistance in non-small cell lung cancer via inhibiting ferroptosis. Cell Death Disc. 11 (1), 287(2025).
  15. Ashcroft, T., Simpson, J. M., Timbrell, V. Simple method of estimating severity of pulmonary fibrosis on a numerical scale. J Clin Pathol. 41 (4), 467-470 (1988).
  16. Xu, C., et al. ML385, an Nrf2 Inhibitor, Synergically Enhanced Celastrol Triggered Endoplasmic Reticulum Stress in Lung Cancer Cells. ACS Omega. 9 (43), 43697-43705 (2024).
  17. Qiu, Z., et al. Proteomic characteristics of lung adenocarcinoma tumors that are small but highly invasive. Med Adv. 1 (4), 340-352 (2023).
  18. Christiani, D. C. Occupational Exposures and Lung Cancer. Am J Respirat Crit Care Med. 202 (3), 317-319 (2020).
  19. Requena-Mullor, M., et al. Association between Crystalline Silica Dust Exposure and Silicosis Development in Artificial Stone Workers. Int J Environ Res Public Health. 18 (11), 5625(2021).
  20. Wang, Z., et al. Erchen decoction alleviates silicosis by attenuating ferroptosis and fibrosis in alveolar macrophages via modulating the P53/HMOX1 pathway. J Ethnopharmacol. 352, 120227(2025).
  21. Zhou, Y., Zhang, W., Wu, D., Fan, Y. The effect of silica exposure on the risk of lung cancer: A meta-analysis. J Biochem Mol Toxicol. 37 (4), e23287(2023).
  22. Liu, W., et al. Nrf2 Protects Against Oxidative Stress Induced By SiO2 Nanoparticles. Nanomedicine. 12 (19), 2303-2318 (2017).
  23. Li, S., et al. SiO2 particles induce pulmonary fibrosis by modulating NLRP3 through the ROS/Keap1/Nrf2 signaling pathway in rats. Food Chem Toxicol Int J Published Brit Ind Biol Re Associat. 202, 115520(2025).
  24. Wang, G., et al. Nrf2 mediates the effects of shionone on silica-induced pulmonary fibrosis. Chinese Med. 19 (1), 88(2024).
  25. Tian, Y., et al. Nebulized inhalation of LPAE-HDAC10 inhibits acetylation-mediated ROS/NF-κB pathway for silicosis treatment. J Controlled Release. 364, 618-631 (2023).
  26. Baird, L., Yamamoto, M. The Molecular Mechanisms Regulating the KEAP1-NRF2 Pathway. Mol Cell Biol. 40 (13), e00099-e00120 (2020).
  27. Kreß, J. K. C., et al. The integrated stress response effector ATF4 is an obligatory metabolic activator of NRF2. Cell Rep. 42 (7), 112724(2023).
  28. Xie, B., Wang, S., Jiang, N., Li, J. J. Cyclin B1/CDK1-regulated mitochondrial bioenergetics in cell cycle progression and tumor resistance. Can Lett. 443, 56-66 (2019).
  29. Odle, R. I., Florey, O., Ktistakis, N. T., Cook, S. J. CDK1, the Other "Master Regulator" of Autophagy. Trends Cell Biol. 31 (2), 95-107 (2021).
  30. Liu, Y., et al. Hypoxia-induced GPCPD1 depalmitoylation triggers mitophagy via regulating PRKN-mediated ubiquitination of VDAC1. Autophagy. 19 (9), 2443-2463 (2023).
  31. Yuan, M., et al. IP3R1/GRP75/VDAC1 complex mediates endoplasmic reticulum stress-mitochondrial oxidative stress in diabetic atrial remodeling. Redox Biol. 52, 102289(2022).
  32. Shi, Q., et al. SPOP mutations promote p62/SQSTM1-dependent autophagy and Nrf2 activation in prostate cancer. Cell Death Differentiat. 29 (6), 1228-1239 (2022).
  33. Zheng, Y., et al. Melatonin Alleviates the Oxygen-Glucose Deprivation/Reperfusion-Induced Pyroptosis of HEI-OC1 Cells and Cochlear Hair Cells via MT-1,2/Nrf2 (NFE2L2)/ROS/NLRP3 Pathway. Mol Neurobiol. 60 (2), 629-642 (2023).
  34. Cords, L., et al. Cancer-associated fibroblast phenotypes are associated with patient outcome in non-small cell lung cancer. Cancer Cell. 42 (3), 396-412.e5 (2024).
  35. Wu, F., et al. Single-cell profiling of tumor heterogeneity and the microenvironment in advanced non-small cell lung cancer. Nat Comm. 12 (1), 2540(2021).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Blootstelling aan silicaNRF2 remmerROS NRF2 asautofagiepadlongfibroseinfiltratie van immuuncellenoxidatieve stressflowcytometrie

Gerelateerde artikelen