Methodenartikel

Kwantitatieve fluorescentie-beeldvorming van alphavirusinfectie voor antivirale screening

44 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/69384

⸱

14 augustus 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1LOEWE Centre for Translational Biodiversity Genomics (LOEWE-TBG), 2Department of Pest and Vector Insect Control, Fraunhofer Institute for Molecular Biology and Applied Ecology IME, Branch of Bioresources, 3Institute for Insect Biotechnology, Justus-Liebig University, 4BMFTR Junior Research Group in Infection Research "ASCRIBE", Fraunhofer Institute for Molecular Biology and Applied Ecology IME, Branch of Bioresources

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Hier wordt een robuust en aanpasbaar protocol gepresenteerd voor de continue visualisatie van alphavirusinfecties. Dit protocol biedt een methode voor het onderzoeken van alphavirusreplicatie en het beoordelen van de werkzaamheid van antivirale verbindingen op cellulair niveau op basis van fluorescentie-imaging.

Samenvatting

Fluorescentiemicroscopie biedt een zeer gevoelige en veelzijdige benadering voor het onderzoeken van alphavirusinfecties op cellulair niveau. Door fluorescentie-gelabelde virussen te combineren met kwantitatieve beeldanalyse, maakt deze methode een gedetailleerde ruimtelijke en temporele karakterisering van de infectiedynamiek mogelijk, inclusief de detectie van subtiele verschillen in replicatiekinetiek en cel-tot-cel verspreiding. Een centraal doel van dit protocol is de toepassing in antiviral screening assays. Beeldgebaseerde kwantificering van de fluorescentie-intensiteit biedt een robuuste en reproduceerbare manier om de effectiviteit van antivirale verbindingen te beoordelen, waardoor vroege en gevoelige detectie van inhiberende effecten in geïnfecteerde cellen mogelijk wordt. Dit vergemakkelijkt de identificatie van veelbelovende antivirale hits en ondersteunt de evaluatie van dosisafhankelijke responsen. De benadering is ook zeer geschikt voor vergelijkende studies van verschillende alphavirusstammen of mutanten, aangezien variaties in replicatiegedrag en verspreidingspatronen direct duidelijk worden. De flexibiliteit, compatibiliteit met meerdere cellijnen en eenvoudige integratie in geautomatiseerde imaging-platforms maken de methode schaalbaar en geschikt voor high-throughput screening campagnes. Over het algemeen bevordert dit protocol de ontdekking en evaluatie van antivirale strategieën. Gezien het feit dat verschillende alphavirussen significante menselijke en veterinaire ziekten veroorzaken, er geen goedgekeurde antivirale therapieën zijn en ze geografisch blijven uitbreiden met opkomende uitbraken, blijft de identificatie van nieuwe antivirale middelen een dringende prioriteit. Daarom vormt deze fluorescentie-gebaseerde workflow een waardevolle en tijdige bijdrage aan modern alphavirusonderzoek.

Inleiding

Alphavirussen zijn omhulde, positive-sense, enkelstrengs ribonuclezuur (RNA) virussen die behoren tot de familie Togaviridae1,2,3. Ze worden hoofdzakelijk overgebracht door muggen en zijn verantwoordelijk voor een reeks ziekten bij mensen en dieren. Het genus alphavirus omvat verschillende medisch significante virussen, zoals het Chikungunya-virus (CHIKV), het Sindbis-virus, het virus van de oostelijke equine encefalitis en het virus van de Venezolaanse equine encefalitis4,5. Deze pathogenen veroorzaken symptomen variërend van koortsachtige ziekten en huiduitslag tot ernstige neurologische complicaties6. Zorgwekkend is dat CHIKV opnieuw is opgekomen als een belangrijk volksgezondheidsprobleem. Sinds het begin van 2025 zijn er in 14 landen al meer dan 220.000 gevallen gemeld, wat resulteerde in ten minste 80 sterfgevallen7. Hoewel het mortaliteitspercentage laag is, ontwikkelt een aanzienlijk deel van de geïnfecteerde personen chronische gewrichtspijn, wat kan leiden tot langdurige invaliditeit en verminderde mobiliteit8. Om gerichte antivirale strategieën te ontwikkelen, is een uitgebreider begrip van de replicatie van alphavirussen en de interacties tussen gastheer en pathogeen essentieel. Ondertussen vertonen sommige alphavirussen, zoals het Semliki Forest-virus (SFV), een lage pathogeniciteit bij mensen, ondanks een hoge genetische en structurele gelijkenis met virulente alphavirussen. Dit maakt SFV een ideaal model voor het bestuderen van alphavirussen zonder een hoog risico voor de menselijke gezondheid te vormen9,10,11.

Traditionele assays, zoals plaque-assays, de 50% tissue culture infectious dose (TCID50)-assay en kwantitatieve polymerasekettingreactie (qPCR)-analyse, zijn waardevol voor het kwantificeren van virale titers en genexpressie, maar zijn beperkt tot eindpuntmetingen en vereisen cellyse of fixatie. Hierdoor kunnen ze de dynamiek van de infectie binnen dezelfde cellen in de loop van de tijd niet direct vastleggen12,13. Om deze beperkingen aan te pakken, biedt real-time fluorescentie-imaging een krachtige, niet-destructieve aanpak voor het monitoren van infectiekinetiek over meerdere tijdspunten. Het gebruik van fluorescentie-gelabelde virussen, zoals mCherry-gelabeld SFV, maakt directe visualisatie en kwantificering van het reportervirus-signaal en de verspreiding in levende cellen mogelijk14,15. Voor de hier beschreven experimenten werden veelgebruikte cellijnen in arbovirusonderzoek ingezet. U4.4-cellen, afgeleid van Aedes albopictus-larven, zijn muggencellen die efficiënte replicatie van veel arbovirussen ondersteunen en studies naar vector-virusinteracties faciliteren16,17. Parallel daaraan bieden BHK-21-cellen, een fibroblast-achtige zoogdiercellijn afkomstig uit nierweefsel van babyhamsters, een permissief gewervelde gastheersysteem dat frequent wordt gebruikt voor virale propagatie en moleculaire virologie-assays18.

Dit protocol beschrijft in detail de monitoring van virale reporterexpressie en de karakterisering van antivirale verbindingen, met furine-remmers als voorbeeld. Furine is een proproteïne-convertase dat in veel eukaryoten voorkomt en een sleutelrol speelt bij de activering van precursoren van groeifactoren, hormonen, matrixmetalloproteïnasen, plasmaproteïnen en receptoren19,20. Veel alphavirussen maken gebruik van furine om hun oppervlakte-eiwitten te splitsen en te activeren, een cruciale stap voor een succesvolle replicatie20. Furine-remmers zijn synthetisch ontworpen verbindingen die de furine-activiteit blokkeren en daarmee de virale replicatie verminderen21,22,23. Gezien de beperkte beschikbaarheid van gestandaardiseerde protocollen voor geautomatiseerde analyse op basis van fluorescentiemicroscopie van alphavirusinfecties met behulp van een multimode cell-imaging reader, wordt een gedetailleerde workflow verstrekt voor het karakteriseren van antivirale verbindingen in aedine-cellen. Het protocol beschrijft de stappen voor celkweek, virusproductie, infectie, behandeling met antivirale verbindingen (furine-remmers), fluorescentie-imaging en beeldanalyse. De hier beschreven methoden kunnen echter eenvoudig worden aangepast voor andere virussen en alternatieve fluorescerende labels.

Protocol

1. Biosafety

OPMERKING: Het recombinant mCherry-getagd Semliki-forestvirus (SFV-mCherry) dat in dit protocol wordt gebruikt, is genetisch gemodificeerd24,25,26. De incorporatie van een fluorescent reportergen classificeert dit als een genetisch gemodificeerd organisme, waardoor het onderhevig is aan aanvullende inperkings- en regelgevingseisen. Werk met andere alphavirussen, in het bijzonder meer pathogene virussen zoals CHIKV, kan aanvullende inperkingsmaatregelen en vergunningen vereisen.

  1. Reinig de biologische veiligheidskast met een geschikt desinfectiemiddel en pas UV-bestraling toe gedurende ten minste 30 min vóór en na de virale assays.
  2. Voer al besmet materiaal af volgens de lokale regels voor biologische veiligheid. Verzamel vast en vloeibaar afval afzonderlijk in autoclaafbare containers en autoclaaf deze vóór afvoer.

2. Bereiding van antivirale verbindingen

OPMERKING: De furine-remmers MI-113027 (trans-4-(aminomethyl) cyclohexanecarboxyl-arginine-valine-arginine-4-amidinobenzylamide), MI-113127 (trans-4-(guanidinomethyl) cyclohexanecarboxyl-arginine-valine-arginine-4-amidinobenzylamide) en MI-114822,23 (4-(guanidinomethyl) phenylacetyl-arginine-tert.-leucine-arginine-4-amidinobenzylamide) die in deze studie zijn gebruikt, zijn voorbeelden van antivirale verbindingen die zijn geselecteerd voor testen. Furine-remmer MI-1148 werd gebruikt als negatieve controle in de cytotoxiciteitstest en als positieve controle in de antivirale test.

  1. Los antivirale verbindingen op in een geschikt oplosmiddel. Gebruik indien mogelijk steriel water om cytotoxische effecten te vermijden. Dimethylsulfoxide of methanol kan worden gebruikt tot een maximum van 2% (v/v). Het gebruik van stamoplossingen van 10 mM in steriel water wordt aanbevolen.
  2. Bewaar stamoplossingen bij -20 °C, afhankelijk van de stabiliteit en oplosbaarheid, tenzij anders gespecificeerd door de fabrikant.

3. Celkweek

  1. Kweek U4.4-cellen in Leibovitz's L-15-medium aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS), 1% niet-essentiële aminozuren uit MEM, 1% tryptosefosfaatbouillon, 1% glutamine en 1% penicilline/streptomycine (Pen/Strep) (zaaidichtheid: ca. 1 × 106 cellen/T25-fles, cultuurvolume: 5 mL). Houd de cellen aan 28 °CPassageer U4.4-cellen één keer per week in een ratio van 1:6, maar pas de zaaidichtheden aan op basis van de experimentele behoeften.
    OPMERKING: Aanvullende cellijnen, zoals C6/36-cellen, zijn ook compatibel met dit protocol. Alternatieve media en supplementen kunnen naar gelang worden gebruikt. De toevoeging van antibiotica is optioneel en kan worden weggelaten.
  2. Kweek babyhamsterniercellen (BHK-21) in Dulbecco's Modified Eagle's Medium aangevuld met 10% FBS, 1% glutamine of Statisch evenwicht, ΣFx=0, grafiek, krachtbalansanalyse, mechanisch stabiliteitsdiagram.‑alanyl‑Statisch evenwicht, ΣFx=0, grafiek, krachtbalansanalyse, mechanisch stabiliteitsdiagram.‑glutamine en 1% Pen/Strep (zaaidichtheid: ca. 1 × 106 cellen/T75-kolf, cultuurvolume: 10 mL). Houd de cellen aan bij 37 °C in een bevochtigde incubator met 5% CO22Passageer de cellen elke 4-5 dagen in een ratio van 1:12, met de mogelijkheid om de zaaidichtheden naar behoefte aan te passen.
  3. Zorg ervoor dat de cellen gezond blijven en actief prolifereren.

4. Virusproductie

  1. Bereiding van SFV-mCherry (SFV6-2SG-mCherry) stocks in BHK-21 cellen.
    1. Kweek BHK-21 cellen (zaaidichtheid: ca. 1 × 105 cellen/well, kweekvolume: 500 µL) in een transparante celkweekplaat met 24 wells onder de hierboven beschreven omstandigheden.
    2. Bij een confluentie van ongeveer 90% (doelconfluentie: ca. 2 × 105 cellen), transfecteer de BHK-21 cellen met het SFV6-2SG-mCherry plasmid met behulp van een transfectiereagens in infectiemedium (DMEM aangevuld met 1% Pen/Strep en 0,2% runder serumalbumine). Verdun hiervoor 1 µL transfectiereagens in 25 µL serumarm medium.
    3. Verdun in een aparte buis 0,5 µg plasmid DNA en 1 µL van een gepatenteerd additief in 25 µL serumarm medium. Voeg de verdunde DNA-oplossing toe aan de oplossing met het verdunde transfectiereagens en laat dit 15 min incuberen bij kamertemperatuur. Voeg vervolgens 50 µL van het resulterende complex toe aan de cellen.
      OPMERKING: Andere transfectiereagens kunnen worden gebruikt, mits ze compatibel zijn met de specifieke cellijn, en de instructies kunnen variëren afhankelijk van het gebruikte reagens.
    4. Verzamel 48 u na transfectie het virusbevattende supernatant met een pipet, verdeel dit in aliquoten van 250 µL per DNA/RNA-vrije buis en bewaar deze bij -80 °C.
  2. Titratie via TCID50 assay.
    1. Kweek BHK-21 cellen (zaaidichtheid: ca. 2 × 104 cellen/well, kweekvolume: 100 µL) in een zwarte 96-well plaat van imaging-kwaliteit onder de hierboven beschreven omstandigheden.
    2. Ontdooi een virusaliquot, bereid tienvoudige seriële verdunningen van de virusmonsters in infectiemedia (15 µL virusmonster + 135 µL infectiemedia), verwijder het oude medium en voeg 100 µL van de verdunningen toe aan de cellen.
    3. Incubeer de cellen gedurende 1 u bij 37 °C in een bevochtigde incubator met 5% CO₂ en vervang het inoculum daarna door 100 µL vers infectiemedium.
    4. Beoordeel 48 u na infectie (hpi) de virale replicatie door fluorescentiemeting met een multimode imaging well-plate reader (gedetailleerde beschrijving in sectie 7) en bepaal het cytopathisch effect veroorzaakt door de virusinfectie. Bereken de TCID50 waarde op basis van de methode van Reed-Muench28 en reken dit om naar geschatte virale titers (PFU/mL) met de standaard Poisson-benadering waarbij 1 TCID50 overeenkomt met 0,7 PFU.

5. Bepaling van de cytotoxiciteit

  1. Kweek U4.4-cellen (uitzaaidichtheid: ca. 3 × 104 cellen/well, kweekvolume: 100 µL) in een transparante 96-wells celkweekplaat onder de hierboven beschreven omstandigheden.
    OPMERKING: De buitenste wells (rijen A en H; kolommen 1 en 12) werden wel voorzien van cellen, maar uitgesloten van de experimentele analyse om randeffecten, waaronder verhoogde verdamping, te voorkomen.
  2. Bij 90% confluentie (doelconfluentie: ca. 6 × 104 cellen), behandel de cellen met 100, 50, 25 en 12,5 µM van de furine-remmers MI-1130 en MI-1131 in een totaalvolume van 100 µL. Voeg MI-1148 toe (dezelfde concentraties als MI-1130 en MI-1131), onbehandelde cellen en met water behandelde cellen als negatieve controles, en ionomycine (100 µM in de assay) als positieve controle voor cytotoxiciteit.
  3. 48 uur na behandeling (hpt), bepaal de celviabiliteit met een luminescentie-assay gebaseerd op ATP-kwantificering. Voeg een gelijk volume van het luminescentie-assay-reagens toe aan elke well (1:1 ten opzichte van het kweekmedium), schud de plaat 2 min om cellyse te waarborgen, en incubeer 10 min in het donker voordat de luminescentie wordt gemeten.
    OPMERKING: Andere assays voor celviabiliteit gebaseerd op verschillende detectieprincipes kunnen ook worden gebruikt.
  4. Registreer de luminescentie in een zwarte of witte 96-wells plaat met behulp van de multimode-reader.

6. Virale infectie en behandeling met een antiviraal middel

  1. Kweek U4.4-cellen (zaaidichtheid: ca. 3 × 104 cellen/well, kweekvolume: 100 µL) in een zwarte 96-well plaat van imaging-kwaliteit onder de hierboven beschreven omstandigheden.
    OPMERKING: De buitenste wells (rijen A en H; kolommen 1 en 12) werden wel gezaaid met cellen, maar uitgesloten van de experimentele analyse om randeffecten, waaronder verhoogde verdamping, te voorkomen.
  2. Infecteer de cellen (doelconfluentie: ca. 6 × 104 cellen) met SFV-mCherry bij een multiplicity of infection (MOI) van 0,01 in niet-gesupplementeerd L-15 medium met een inoculatievolume van 100 µL, en incubeer gedurende 1 u bij 28 °C.
    OPMERKING: Er mogen alleen reportervirusstammen met een laag passagegetal worden gebruikt, vooral bij het werken met zeer lage MOI's en infecties die meerdere dagen duren.
  3. Verdun de furine-remmers MI-1130, MI-1131 en MI-1148 tot eindconcentraties van 100, 50, 25 en 12,5 µM in een aparte 96-well V-bodemplaat met gesupplementeerd L-15 medium. Bereid 110 µL per well voor om een overschot van 10% te garanderen, en breng 100 µL (eindvolume) over op de cellen. Gebruik als controles geïnfecteerde cellen behandeld met het oplosmiddel van de antivirale verbindingen en geïnfecteerde cellen die alleen het virus bevatten als negatieve controle. Niet-geïnfecteerde, onbehandelde cellen moeten ook worden toegevoegd om de achtergrondfluorescentie te meten.
  4. Verwijder na de infectieperiode van 1 u het inoculum en breng 100 µL van de verdunde furine-remmers over van de V-bodemplaten naar de zwarte platen van imaging-kwaliteit.
  5. Incubeer de cellen bij 28 °C.

7. Fluorescentie-imaging van levende cellen, kwantitatieve beeldanalyse en datapresentatie

  1. Meting van virale reporterexpressie via fluorescentiemicroscopie (zie Supplementary Figure 1, Supplementary Figure 2, Supplementary Figure 3, Supplementary Figure 4, Supplementary Figure 5, Supplementary Figure 6, en Supplementary Figure 7 voor de programma-instellingen).
    1. Kleur op 24 en 48 hpi de celkernen door 8 µL van een celpermeante nucleaire tegenkleuringsoplossing per well toe te voegen. Incubeer gedurende 30 min bij 28 °C.
      OPMERKING: De infectie kan op meerdere tijdspunten worden gemonitord. Metingen op 48 u na infectie geven echter het sterkste signaal (zie Supplementary Figure 8) en maken het mogelijk om antivirale effecten het meest betrouwbaar te beoordelen. Read-outs op 24 u of tussenliggende tijdspunten zijn haalbaar, maar het verlengen van de incubatie voorbij 48 u verhoogt het risico op overgroei van cellen. Kies aan het begin van het experiment een passende celconfluentie om ervoor te zorgen dat de cellen niet overgroeien tegen het gekozen tijdspunt voor de read-out. Dit voorkomt belemmering van een nauwkeurige celtelling.
    2. Voeg na incubatie (en in aanvulling op het transparante afdekdeksel) een transparante seal-folie toe over de bovenkant van de plaat voor de veiligheid.
      OPMERKING: Bij het gebruik van een imaging-apparaat is het essentieel om het juiste plaattype te kiezen. Verlichtings-, integratietijd- en gain-instellingen variëren afhankelijk van het reportergen. Het wordt sterk aanbevolen om voorlopige metingen uit te voeren om de optimale parameters te bepalen. De initiële verlichtings-, integratie- en gain-instellingen die zijn gebruikt om het protocol onder de gegeven omstandigheden vast te stellen, zijn opgenomen in Supplementary Figure 2, waar de programma-instellingen gedetailleerd worden beschreven.
    3. Neem beelden van de gehele well op via image stitching (vier velden per well bij 4x vergroting) met behulp van de multimode reader.
    4. Meet de rode fluorescentie-intensiteit met een Texas Red filterkubus (Excitatie: 586/15 nm; Emissie: 647/57 nm).
    5. Bepaal het totaal aantal cellen via het DAPI-kanaal met de volgende instellingen (Excitatie: 377/50 nm; Emissie: 447/60 nm).
  2. Kwantitatieve beeldanalyse (zie Supplementary Table 1 voor de ruwe data).
    OPMERKING: Voor de fluorescentiemetingen werd een microplate imaging reader gebruikt. De gedetailleerde parameters die voor deze assay zijn gebruikt, kunnen worden gevonden in Supplementary Figure 2.
    1. Verwerk de beelden met geschikte imaging-software.
    2. Selecteer in het data-reductiepaneel 'Image Stitching' naar DAPI- en Texas Red-kanalen om één enkel beeld van de wells te creëren.
    3. Voeg 'Image Statistics' toe en selecteer 'Total intensity' op het Texas Red Stitched-kanaal. Pas 'Image Preprocessing' toe om achtergrondruis uit het DAPI Stitched-kanaal te verwijderen.
    4. Voer een 'Cellular Analysis' uit op het Preprocessed DAPI Stitched-kanaal.
    5. Bereken de gemiddelde rode fluorescentie-intensiteit per cel door de gemiddelde fluorescentie van de niet-geïnfecteerde, onbehandelde controle-wells af te trekken van elke behandelde well, en het resultaat vervolgens te delen door het totaal aantal cellen in de overeenkomstige well.
  3. Probleemoplossing
    1. Monitor de focusstabiliteit tijdens de meting, met name bij lange imaging-metingen of bij gebruik van temperatuurgevoelige platen.
    2. Schakel autofocus in en verhoog de autofocus-frequentie als er focusdrift wordt waargenomen. Verminder de acquisitiesnelheid of laat de platen equilibreren naar de temperatuur van het instrument voordat u beelden vastlegt als de drift aanhoudt.
    3. Gebruik platen van imaging-kwaliteit om een consistente signaalkwaliteit tijdens de acquisitie te garanderen. Voorkom bleed-through en overbelichting door overmatige verlichting en lange integratietijden te vermijden.
    4. Verlaag de excitatie-intensiteit, verkort de integratietijd of verminder de gain totdat signaalverzadiging wordt voorkomen. Verifieer dat de fluorofoor-kanalen goed gescheiden zijn en pas de filterinstellingen aan indien nodig.
      OPMERKING: Bleed-through tussen DAPI en mCherry is over het algemeen laag, maar hangt af van het gebruikte reporterconstruct (bijv. GFP).
    5. Vermijd over-confluentie van cellen om een correcte infectiekinetiek en assay-gevoeligheid te behouden. Als er over-confluentie optreedt, verkort dan de incubatietijd vóór de meting.
    6. Monitor kleurstof-gerelateerde effecten op de celviabiliteit en signaalkwaliteit, met name bij hoge concentraties. Verlaag de kleurstofconcentratie of verkort de incubatietijden als er kleurstof-gerelateerde toxiciteit of een oververzadigde achtergrond wordt waargenomen.
    7. Bereid kleurstoffen voor en bewaar deze volgens de aanbevelingen van de fabrikant om de signaalstabiliteit te behouden.

Resultaten

In dit werk wordt een gedetailleerd protocol gepresenteerd voor het monitoren van de verspreiding van het alfavirus en de evaluatie van antivirale verbindingen (bijv. furine-remmers) met behulp van fluorescentiemicroscopie in een multi-wellplaatformaat. Om de visualisatie van de remmende effecten op de expressie van de virale reporter aan te tonen, werden drie eerder gesynthetiseerde furine-remmers geselecteerd voor testen in de aedine cellijn U4.4: MI-1148, MI-1130 en MI-1131. Een overzicht van de experimentele workflow is geïllustreerd in Figuur 1.

Voordat de antivirale effectiviteit wordt beoordeeld, is het essentieel om de cytotoxiciteit te evalueren om er zeker van te zijn dat elke afname van de virale replicatie niet is te wijten aan celdood door de verbinding. Daarom werden U4.4-cellen bij een confluentie van 90% behandeld met de remmers in concentraties van 100, 50, 25 of 12,5 µM. Onbehandelde cellen en cellen behandeld met water (oplosmiddelcontrole) dienden als negatieve controles, terwijl ionomycine werd gebruikt als positieve controle. De cellevensvatbaarheid werd 48 u na de behandeling beoordeeld met een luminescente assay gebaseerd op ATP-kwantificering. Voor de geteste furine-remmers werd geen significante afname van de cellevensvatbaarheid waargenomen (Figuur 2).

Gezien het gebrek aan cytotoxiciteit werden de verbindingen vervolgens geëvalueerd op antivirale activiteit. Hiervoor werden U4.4-cellen gedurende 1 h geïnfecteerd met SFV-mCherry, gevolgd door behandeling met dezelfde furine-remmers in dezelfde concentraties. Geïnfecteerde, onbehandelde cellen en geïnfecteerde, met water behandelde cellen dienden als negatieve controles voor antivirale activiteit, terwijl niet-geïnfecteerde, onbehandelde cellen werden gebruikt om de achtergrondfluorescentie te bepalen. 48 h na de behandeling werd de expressie van de virale reporter gekwantificeerd met fluorescentiemicroscopie. Voorafgaand aan de beeldvorming werd aan elke put 8 µL van een celpermeabele nucleaire tegenkleuringsoplossing toegevoegd en 30 min geïncubeerd om de celkernen te kleuren. Het rode fluorescentiesignaal dat overeenkomt met de expressie van de virale reporter en het totaal aantal kernen werden gekwantificeerd vanuit de bewerkte fluorescentiebeelden. Onder de geteste remmers vertoonde MI-1148 een potente antivirale activiteit, waarbij de expressie van de virale reporter dosisafhankelijk significant werd verminderd (Figuur 3). In contrast hiermee vertoonden MI-1130 en MI-1131 geen waarneembare remming van de virale reporterexpressie bij enige van de geteste concentraties. De ruwe gegevens en de analyse van de antivirale assay zijn opgenomen in Aanvullende Tabel 1.

De representatieve resultaten tonen aan dat het protocol betrouwbaar verbindingen met antivirale activiteit identificeert, zoals blijkt uit de sterke afname van het reportersignaal waargenomen bij MI-1148. In contrast hiermee verlaagden de inhibitoren MI-1130 en MI-1131 de reporterexpressie niet, wat aangeeft dat hun potente furine-inhibitie, weerspiegeld door picomolaire inhibitieconstanten, onder deze omstandigheden niet leidde tot antivirale activiteit (Figuur 4). Deze bevindingen onderstrepen het vermogen van de assay om actieve verbindingen te onderscheiden van inactieve verbindingen en om de identificatie van potente en relevante leadstructuren te ondersteunen.

Antiviraal screeningsproces; celcultuur, virale infectie, behandeling met verbindingen; gegevensanalyse-schema.
Figuur 1: Experimentele workflow. Een schematisch overzicht van de experimentele procedure die is gebruikt om de antivirale activiteit van furine-remmers in de aedine cellijn U4.4 te evalueren. De workflow omvat de voorbereiding van verbindingen, het zaaien van cellen, infectie met mCherry-getagd Semliki Forest-virus, behandeling met verbindingen, fluorescentiemicroscopie voor real-time visualisatie en kwantificering van de expressie van de virale reporter. Deze illustratie is gemaakt met BioRender. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Staafdiagram van celviabiliteit, vergelijking van drugconcentraties; behandelingen met MI-1148, MI-1130, MI-1131.
Figuur 2: Cytotoxische effecten van furineremmers in U4.4-cellen. Bij een confluentie van ongeveer 90% werden U4.4-cellen behandeld met MI-1148, MI-1130 en MI-1131 bij 100, 50, 25 en 12,5 µM. Onbehandelde cellen en met water behandelde cellen dienden als negatieve controles, terwijl ionomycine (100 µM) werd gebruikt als positieve controle. 48 u na de behandeling werd de celviabiliteit beoordeeld via ATP-kwantificatie. De gegevens werden genormaliseerd ten opzichte van de onbehandelde controle en uitgedrukt als percentage (%). De gemiddelde celviabiliteit (n=3) wordt getoond, en de foutenbalken representeren de variatiecoëfficiënt. De stippellijn representeert de grens voor cytotoxiciteit, vastgesteld op 80%. n.d. = niet detecteerbaar. De datarepresentatie is uitgevoerd met GraphPad Prism v9.5.1. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Staafdiagram van celrode intensiteit versus drugconcentratie; statistische analyse van verbindingen uit de MI-serie.
Figuur 3: Antivirale activiteit van furine-remmers tegen het mCherry-gelabelde Semliki Forest-virus (SFV) in de aedine cellijn U4.4. Bij ongeveer 90% confluentie werden cellen gedurende 1 h geïnfecteerd met SFV-mCherry, gevolgd door behandeling met MI-1148, MI-1130 en MI-1131 bij 100, 50, 25 en 12.5 µM. Op 48 h na de behandeling werd de expressie van de virale reporter gekwantificeerd via fluorescentiemicroscopie. Voorafgaand aan de beeldvorming werd 8 µL van een celpermeabele nucleaire tegenkleuringsoplossing aan elke put toegevoegd en gedurende 30 min geïncubeerd om de celkernen te kleuren. Fluorescentiebeelden werden verkregen met een Texas Red-filter voor het virale signaal en een DAPI-filter voor de kernen. Beeldanalyse werd uitgevoerd om de totale rode fluorescentie-intensiteit (indicatief voor virale replicatie) en het totale aantal cellen per put te kwantificeren. Gegevens (n = 4) worden gepresenteerd als totale rode intensiteit per cel (totaal virussignaal / totaal celgetal). Foutbalken vertegenwoordigen de standaarddeviatie. Statistische significantie vergeleken met SFV-geïnfecteerde controle, met behulp van eenweg-ANOVA en de multiple comparisonstest van Dunnett: **** = P<0.0001; ns = P>0.05. Gegevensrepresentatie en statistische analyse werden uitgevoerd met GraphPad Prism v9.5.1. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Microscopiebeeld van SFV-geïnfecteerde celculturen bij verschillende concentraties, waarbij de infectieniveaus zichtbaar zijn.
Figuur 4: Representatieve fluorescentiebeelden die de antivirale activiteit van furine-remmers tegen het mCherry-gelabelde Semliki Forest-virus (SFV) in de aedine-cellijn U4.4 tonen. De cellen bij een confluentie van ongeveer 90% werden gedurende 1 h geïnfecteerd met SFV-mCherry, gevolgd door behandeling met MI-1148, MI-1130 en MI-1131 bij concentraties van 100, 50, 25 en 12.5 µM. Geïnfecteerde, onbehandelde cellen en geïnfecteerde, met water behandelde cellen dienden als negatieve controles, terwijl niet-geïnfecteerde, onbehandelde cellen werden opgenomen als achtergrondcontroles. Het reportersignaal werd 48 h na de behandeling beoordeeld via fluorescentiemicroscopie met een Texas Red-filter om het mCherry-signaal vast te leggen. Schaalbalk = 2000 µm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende tabel 1: Ruwe gegevens van de totale intensiteit van het virussignaal en het celgetal. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 1: Procedurestappen die zijn gebruikt op de imaging reader voor de representatieve resultaten. Ten eerste een temperatuurinstelling (rood) die overeenkomt met de kweekcondities van U4.4-cellen. Vervolgens drie onafhankelijke beeldactiestappen (oranje) voor metingen van DAPI, Texas Red en Brightfield. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 2: Beeldinstellingen in de procedurestappen die op de beeldlezer zijn gebruikt voor de representatieve resultaten. De eerste instellingen die moeten worden aangepast zijn: vergroting (4x) en beeldformaat (Full WFOV). De te meten fluorofoor moet worden geselecteerd, en de parameters voor illuminatie, integratietijd en gain moeten dienovereenkomstig worden aangepast. Ten slotte moeten de beeldmontage (2x2) en de overlap (30 µm x 30 µm) worden geselecteerd. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 3: Datareductiestappen gebruikt in de image reader voor de representatieve resultaten. De eerste stap is image stitching (blauw) voor de DAPI- en Texas Red-kanalen. Ten tweede geeft Image Statistics (paars) de meting voor de totale intensiteit. Vervolgens is de stap voor beeldvoorbehandeling (groen) vereist om achtergrondruis uit het DAPI-kanaal te verwijderen. Ten slotte wordt de Cellular Analysis (geel) uitgevoerd op het voorbehandelde gestitchte beeld van DAPI. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 4: Afbeeldevenwicht (image stitching) in de datareductiestappen die zijn gebruikt op de beeldlezer voor de representatieve resultaten.De meest relevante instelling is de verkleining van het uiteindelijke beeld (80%), omdat een lagere waarde de resolutie van het beeld en daarmee de uiteindelijke meting van de parameters beïnvloedt. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Figuur 5: Beeldstatistieken in de datareductiestappen die zijn gebruikt op de image reader voor de representatieve resultaten. Het is belangrijk om het juiste kanaal (Stitched: Fluorophore) te selecteren, een minimale drempelwaarde (2500) te kiezen en tot slot de parameter die gemeten moet worden (Total Intensity). Voor een nauwkeurigere meting kan een Image Plug worden gemaakt. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 6: Beeldbewerking bij de stappen voor datareductie die zijn toegepast op de beeldlezer voor de representatieve resultaten.De meest relevante instelling is de rolling ball-parameter (30 µm), waarbij prioriteit is gegeven aan fijne resultaten. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 7: Cellulaire analyse in de datareductiestappen die zijn gebruikt op de image reader voor de representatieve resultaten. Het is belangrijk om het kanaal te kiezen waarvan de afbeelding vooraf is bewerkt. Kies ervoor om elkaar raken objecten te scheiden en gaten met maskers op te vullen. Het is cruciaal om het juiste bereik voor de objectselectie te kiezen (5-50 µm). Ten slotte kan voor verfijnde resultaten een image plug worden gemaakt. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 8: Antivirale activiteit van furine-remmers tegen mCherry-gelabeld Semliki Forest-virus (SFV) in de aedine cellijn U4.4. Bij ongeveer 90% confluentie werden de cellen gedurende 1 h geïnfecteerd met SFV-mCherry, gevolgd door behandeling met MI-1148, MI-1130 en MI-1131 bij 100, 50, 25 en 12,5 µM. Na 24 h (rode balken) en 48 h (groene balken) na de behandeling werd de expressie van de virale reporter gekwantificeerd via fluorescentiemicroscopie. Foutbalken vertegenwoordigen de standaarddeviatie (n = 4). Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

De mogelijkheid om de replicatie van het alphavirus in real-time te observeren, biedt een sequentieel en cumulatief perspectief ten opzichte van conventionele endpoint-tests. Dit protocol voor live-cell imaging over meerdere tijdspunten is een nuttig model voor het bestuderen van alphavirussen, aangezien het een dynamisch platform biedt voor het observeren van de virale verspreiding.

Het succes van dit protocol is afhankelijk van verschillende parameters. Ten eerste is het belangrijk om de cytotoxiciteit van de verbindingen te beoordelen voorafgaand aan een antivirale assay om vals-positieve resultaten als gevolg van celdood uit te sluiten. Zodra de evaluatie van de cytotoxische effecten is uitgevoerd, kan de antivirale activiteit van de verbindingen vervolgens worden bepaald. Voor de geteste verbindingen werd geen cytotoxiciteit waargenomen. MI-1130 en MI-1131 vertoonden geen significante invloed op de expressie van de virale reporter, terwijl MI-1148, gebruikt als positieve controle, deze effectief onderdrukte. Daarnaast is de timing van de infectie in relatie tot het uitplaten van de cellen cruciaal. De cellen moeten een adequate confluentie bereiken om een reproduceerbare infectie te waarborgen zonder overgroei. Het is ook belangrijk om de multiplicity of infection te optimaliseren, afhankelijk van de cellijn, om een graduele infectie waar te nemen zonder de celviabiliteit in gevaar te brengen. Ten slotte moet de frequentie van de beeldacquisitie zorgvuldig worden bepaald om de visualisatie van de graduele expressie van de virale reporter mogelijk te maken zonder grote sprongen. Voor de meeste toepassingen biedt het maken van beelden om de acht uur, bijvoorbeeld, een effectieve balans tussen temporele details en de integriteit van het monster.

De belangrijkste kracht van dit protocol is de aanpasbaarheid ervan. In dit experiment hebben we SFV-mCherry en U4.4-cellen gebruikt om de monitoring van virale reporterexpressie en inhibitie na behandeling met furine-remmers aan te tonen. Het protocol kan echter worden geoptimaliseerd voor de fluorescentieanalyse van alternatieve virussen met verschillende reportermarkers, zoals GFP, evenals andere gastheerceltypen, waaronder primaire cellen en gedifferentieerde cellijnen. Hoewel het protocol zich richt op behandeling met verbindingen na infectie, kan de workflow ook eenvoudig worden aangepast voor time-of-addition-experimenten, waaronder voorbehandeling, co-behandeling, onmiddellijke behandeling na infectie of vertraagde behandeling, om het mechanisme van de antivirale werking verder te onderzoeken. Het protocol werd aanvankelijk gebruikt om de functionaliteit van de RNAi-machinerie van C6/36- en U4.4-cellen te vergelijken14. Het is verder uitgebreid om te onderzoeken hoe dsRNA dat direct op het virus is gericht, de virale reporterexpressie remt15.

Bij het gebruik van dit protocol kunnen bepaalde uitdagingen optreden. Reportervirussen zijn zeer nuttig voor talrijke toepassingen in vivo29 en in vitro30, maar kunnen ook een lagere virulentie31 vertonen en genetische instabiliteit van de reportergenen32 laten zien. Celdetachement veroorzaakt door overconfluentie kan een heldere visualisatie en beeldvorming belemmeren, wat de celtelling beïnvloedt. Langdurige blootstelling aan live-cell dyes (bijv. Hoechst 33342 voor kernen) kan het celgedrag of de levensvatbaarheid veranderen15. Bovendien kunnen experimenten met sterk pathogene alfavirussen, zoals CHIKV, strengere biosafety-maatregelen en overeenkomstige protocolaanpassingen vereisen. Daarnaast kan in sommige gevallen focus drift optreden door de variabiliteit van de platen of het gebruik van verschillende platen. Zo kunnen fluorescentiesignalen in transparante celkweekplaten vanuit wells naar aangrenzende wells lekken, terwijl witte platen overbelichting kunnen veroorzaken. In beide gevallen wordt de nauwkeurigheid van de meting van het fluorescentiesignaal beïnvloed.

Dit protocol biedt verschillende voordelen ten opzichte van conventionele virologische assays. Plaque-assays en TCID50-assays leveren bijvoorbeeld eindpuntgegevens over virustiters12. Bovendien biedt qPCR een sensitieve detectie van viraal RNA, maar het kan geen onderscheid maken tussen replicatie-competente virussen en niet-infectieuze virale deeltjes of residuele nucleïnezuren. In tegenstelling hiermee maakt dit type fluorescentie-live-imaging een continue, niet-invasieve beoordeling mogelijk van de virale progressie, verspreiding en behandelingseffecten binnen dezelfde celpopulatie in de loop van de tijd.

Naast het onderzoek naar furine-remmers als antivirale verbindingen kan ons protocol worden aangepast voor andere toepassingen. Het is bijzonder geschikt voor het screenen van antivirale geneesmiddelen, waardoor de kwantificering van dosisafhankelijke reacties op diverse verbindingen mogelijk wordt. Het biedt een platform voor het bestuderen van interacties tussen gastheer en pathogeen, inclusief de timing en lokalisatie van virale entry, replicatie en verspreiding. Het kan worden gebruikt voor de vergelijking tussen reportervirussen, verschillende stammen of verschillende alphavirussen. Daarnaast kan het worden gekoppeld aan benaderingen zoals gene knockdown met behulp van siRNA of dsRNA. Zo kan dit systeem helpen bij het identificeren en valideren van kritieke targets en antivirale verbindingen voor virale replicatie. Deze fluorescentiegebaseerde assay is echter een initiële screeningmethode en geen op zichzelf staande bevestigende methode; verdere onderzoeken, waaronder assays met wild-type virussen, zullen noodzakelijk zijn om de screeningsresultaten te onderbouwen.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflict.

Dankbetuigingen

Wij danken Prof. Dr. Andres Merits, Universiteit van Tartu, Estland, en Prof. Dr. Andreas Pichlmair, Technische Universiteit München, Duitsland, voor het verstrekken van pCMV-SFV6-2SG-mCherry. Wij danken Prof. Dr. Stefanie Becker, Universiteit voor Veterinaire Geneeskunde, Hannover, Duitsland, voor de C6/36-cellen. Wij danken Prof. Dr. Torsten Steinmetzer, Universiteit van Marburg, Marburg, Duitsland, voor het verstrekken van de furine-remmers. Dit werk werd ondersteund door het Landes-Offensive zur Entwicklung Wissenschaftlich-ökonomischer Exzellenz Program van het Hessische Ministerie van Hoger Onderwijs, Onderzoek en Kunst via het LOEWE Centre for Translational Biodiversity Genomics (LOEWE-TBG) met financieringscode: LOEWE/1/10/519/03/03.001(0014)/52, en door het BMFTR (Project ASCRIBE-Grant Number 01KI2024).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Albumine Runderfractie V, pH 7.0SERVA Electrophoresis11930.03
BenchStable DMEMThermo Fisher ScientificA4192101
BHK-21 cellenCLS Cell Lines Service GmbH, Eppelheim, Duitsland603126
CELLUURKweekfles, 50 ML, 25 cm2, PS, rode filterdraaidop, helder, CELLSTAR, TC, sterielGreiner Bio-One690175
Celkweekmicroplaat, 24 wells, PS, F-bodem, (Chimney well), helder, CELLSTAR, TC, deksel met condensatieringen, sterielGreiner Bio-One662160
Celkweekmicroplaat, 96 wells, PS, F-bodem, (Chimney well), µCLEAR, zwart, CELLSTAR, TC, deksel met condensatieringen, sterielGreiner Bio-One655090
Celkweekmicroplaat, 96 wells, PS, F-bodem, (Chimney well), helder, CELLSTAR, TC, deksel met condensatieringen, sterielGreiner Bio-One655180
Celkweekmicroplaat, 96 wells, PS, V-bodem, helderGreiner Bio-One651101
CelscraperVWR734-2602
CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability AssayPromegaG7573
Cytation 5 Cell Imaging Multimode ReaderBiotek
DAPI-filterkubus 1225100Biotekex: 377/50 nm; em 447/60 nm
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM GlutaMAX)Thermo Fisher ScientificA4192102
Foetaal runderserumFisher Scientific11550356
Furine-remmer MI-1130Deze studie
Furine-remmer MI-1131Deze studie
Furine-remmer MI-1148Hardes et al. 2015.  https://doi.org/10.1002/cmdc.201500103 
Gen5 Prime SoftwareBiotek
Ionomycin calciumzout, 99%Thermo Fisher ScientificJ60628
Leibovitz's L-15 medium, GlutaMAX supplement Thermo Fisher Scientific31415029
Lipofectamine 3000 transfectiereagensThermo Fisher ScientificL3000001
MEM niet-essentiële aminozuren (100x)Thermo Fisher Scientific11140050
Microplaat, PS, 96 well, F-bodem, (Chimney well), zwart, Fluotrac, medium bindingGreiner Bio-One655076
NucBlue Live ReadyProbes reagens (Hoechst 33342)Thermo Fisher ScientificR37605
Opti-MEMThermo Fisher Scientific31985062
Penicilline-streptomycine (10 000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140122
SFV6–2SG-mCherryProf. Dr. Andres Merits (Universiteit van Tartu, Estland) en Prof. Dr. Andreas Pichlmair (Technische Universiteit München, Duitsland)
Texas Red-filterkubus 1225102 Biotekex: 586/15 nm; em: 647/57 nm
Tryptosefosfaatbouillon Thermo Fisher Scientific18050039
U4.4 cellenFriedrich-Loeffler-Institut, Federaal Onderzoeksinstituut voor Diergezondheid, Greifswald, Duitsland
Viewseal sealer, helderGreiner Bio-One676070

Referenties

  1. Powers, A. M. Togaviruses: Alphaviruses. eLS. , (2014).
  2. Shaw, A. R., Feinberg, M. B. Vaccines. Clinical Immunology. , Elsevier. (2008).
  3. Gould, E. A., et al. Understanding the alphaviruses: recent research on important emerging pathogens and progress towards their control. Antiviral Research. 87 (2), 111-124 (2010).
  4. Lim, E. X. Y., Lee, W. S., Madzokere, E. T., Herrero, L. J. Mosquitoes as suitable vectors for alphaviruses. Viruses. 10 (2), (2018).
  5. de Caluwé, L., Ariën, K. K., Bartholomeeusen, K. Host factors and pathways involved in the entry of mosquito-borne alphaviruses. Trends in Microbiology. 29 (7), 634-647 (2021).
  6. Adizie, T., Adebajo, A. O. Travel- and immigration-related problems in rheumatology. Best practice & research. Clinical Rheumatology. 28 (6), 973-985 (2014).
  7. ECDC Chikungunya virus disease worldwide overview: Situation update. , (2025).
  8. Paixão, E. S., et al. Chikungunya chronic disease: a systematic review and meta-analysis. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 112 (7), 301-316 (2018).
  9. Atkins, G. J., Sheahan, B. J., Liljeström, P. The molecular pathogenesis of Semliki Forest virus: a model virus made useful. The Journal of General Virology. 80 (Pt 9), 2287-2297 (1999).
  10. Contu, L., Balistreri, G., Domanski, M., Uldry, A. -C., Mühlemann, O. Characterisation of the Semliki Forest Virus-host cell interactome reveals the viral capsid protein as an inhibitor of nonsense-mediated mRNA decay. PLoS Pathogens. 17 (5), (2021).
  11. Teppor, M., et al. Semliki Forest virus chimeras with functional replicase modules from related alphaviruses survive by adaptive mutations in functionally Important Hot Spots. Journal of Virology. 95 (20), (2021).
  12. Smither, S. J., et al. Comparison of the plaque assay and 50% tissue culture infectious dose assay as methods for measuring filovirus infectivity. Journal of Virological Methods. 193 (2), 565-571 (2013).
  13. Shan, L., Yang, D., Wang, D., Tian, P. Comparison of cell-based and PCR-based assays as methods for measuring infectivity of Tulane virus. Journal of Virological Methods. 231, 1-7 (2016).
  14. Omokungbe, B., et al. Gene silencing in the aedine cell lines C6/36 and U4.4 using long double-stranded RNA. Parasites & Vectors. 17 (1), 255(2024).
  15. Centurión, A., Omokungbe, B., Stiehler, S., Vilcinskas, A., Hardes, K. Inhibition of Semliki Forest virus replication with long double-stranded RNA in Aedes albopictus cells. Virus Research. 357, 199584(1995).
  16. Weger-Lucarelli, J., et al. Adventitious viruses persistently infect three commonly used mosquito cell lines. Virology. 521, 175-180 (2018).
  17. Attarzadeh-Yazdi, G., et al. Cell-to-cell spread of the RNA interference response suppresses Semliki Forest virus (SFV) infection of mosquito cell cultures and cannot be antagonized by SFV. Journal of Virology. 83 (11), 5735-5748 (2009).
  18. Gahmberg, C. G., Simons, K. Isolation of plasma membrane fragments from BHK21 cells. Acta pathologica et microbiologica Scandinavica. Section B: Microbiology and immunology. 78 (2), 176-182 (1970).
  19. Thomas, G. Furin at the cutting edge: from protein traffic to embryogenesis and disease. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 3 (10), 753-766 (2002).
  20. Garten, W. Characterization of proprotein convertases and their involvement in virus propagation. Activation of Viruses by Host Proteases. , Springer. Cham. 205-248 (2018).
  21. Becker, G. L., Hardes, K., Steinmetzer, T. New substrate analogue furin inhibitors derived from 4-amidinobenzylamide. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 21 (16), 4695-4697 (2011).
  22. Hardes, K., et al. Novel furin inhibitors with potent anti-infectious activity. ChemMedChem. 10 (7), 1218-1231 (2015).
  23. Hardes, K., et al. Elongated and shortened peptidomimetic inhibitors of the proprotein convertase furin. ChemMedChem. 12 (8), 613-620 (2017).
  24. Pennemann, F. L., et al. Cross-species analysis of viral nucleic acid interacting proteins identifies TAOKs as innate immune regulators. Nature Communications. 12 (1), 7009(2021).
  25. Andersen, L. L., et al. Systematic P2Y receptor survey identifies P2Y11 as modulator of immune responses and virus replication in macrophages. The EMBO Journal. 42 (23), (2023).
  26. Huang, Y., Urban, C., Hubel, P., Stukalov, A., Pichlmair, A. Protein turnover regulation is critical for influenza A virus infection. Cell Systems. 15 (10), 911-929 (2024).
  27. Hardes, K. Synthese, Charakterisierung und Anwendung neuer Inhibitoren der Proproteinkonvertase Furin [Doctoral Dissertation]. , Philipps-Universität Marburg. (2014).
  28. Reed, L. J., Muench, H. A simple method of estimating fifty percent endpoints. American Journal of Epidemiology. 27 (3), 493-497 (1938).
  29. Manicassamy, B., et al. Analysis of in vivo dynamics of influenza virus infection in mice using a GFP reporter virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (25), 11531-11536 (2010).
  30. Yang, P., et al. Imaging of viral replication in live cells by using split fluorescent protein-tagged reporter flaviviruses. Virology. 603, 110374(2025).
  31. Jose, J., Taylor, A. B., Kuhn, R. J. Spatial and temporal analysis of alphavirus replication and assembly in mammalian and mosquito cells. mBio. 8 (1), (2017).
  32. Eckert, N., et al. Influenza A virus encoding secreted Gaussia luciferase as useful tool to analyze viral replication and its inhibition by antiviral compounds and cellular proteins. PloS One. 9 (5), (2014).

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Antivirale screeningfluorescentiemicroscopiebeeldanalyseinfectiedynamiekreplicatiekinetiekcel naar cel verspreidinghigh throughputscreeningantivirale verbindingen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.