Generatie van een model gebaseerd op een muisprostaatorganoïde voor het bestuderen van gastheer-pathogeen interacties

Samenvatting

Dit protocol beschrijft de generatie van een muisprostaat-organoïde-gebaseerd model dat in 2D is gekweekt. Het omvat organoïde dissociatie, celzaadvorming, differentiatie, beoordeling van de epitheelintegriteit en in-vitro infectie met uropathogene Escherichia coli. Het model biedt apicale toegankelijkheid en is geschikt voor het bestuderen van gastheer-pathogeen interacties, waarmee het beperkingen van traditionele 3D-organoïde systemen overwint.

Samenvatting

Oudere mannen worden sterk getroffen door prostaatziekten, zoals goedaardige prostaathyperplasie, prostatitis en prostaatkanker. Samen dragen deze aandoeningen aanzienlijk bij aan de wereldwijde gezondheidslast en zijn ze een van de belangrijkste oorzaken van ziekte bij mannen. Organoïde modellen hebben ziektemodellering getransformeerd door de replicatie van belangrijke kenmerken van de epitheelstructuur en -functie in vitro mogelijk te maken. De gesloten lumenstructuur van organoïden beperkt echter de experimentele toegang tot het apicale oppervlak, waardoor studies naar gastheer-pathogeen interacties worden belemmerd. Om deze uitdagingen te overwinnen, hebben we een fysiologisch relevant kweeksysteem ontwikkeld waarin cellen afkomstig van muisprostaatorganoïden als een tweedimensionaal (2D) model worden gezaaid. Deze aanpak behoudt essentiële epitheelkenmerken terwijl directe toegang tot het apicale oppervlak mogelijk is. Dit stapsgewijze protocol beschrijft de dissociatie van volwassen prostaatorganoïden van de muis en optimale zaaicondities om celhechting, proliferatie en differentiatie te ondersteunen. Immunofluorescentiemicroscopie bevestigde de expressie van prostaatspecifieke markers in het organoïde-gebaseerde model en toonde een nauwkeurige weergave aan van de celstructuur van het prostaatweefsel. TEER-metingen, samen met F-actine en tight junction kleuring, bevestigden celdifferentiatie en barrièrevorming verder. Infectie van het model met uropathogene Escherichia coli (UPEC) toonde het nut ervan aan bij het onderzoeken van gastheer-pathogeen interacties. Dit model biedt een waardevol platform om prostaatepitheelbiologie en ziektemechanismen te onderzoeken en is bijzonder geschikt voor het bestuderen van gastheer-pathogeen interacties en het evalueren van potentiële therapeutische strategieën.

Inleiding

De prostaatklier is een klein orgaan dat zich onder de blaas bevindt en de plasbuis omringt. Het is een essentieel orgaan van het mannelijke voortplantingskanaal en de belangrijkste functie is het produceren van prostaatvloeistof. Deze vloeistof is goed voor tot 30% van het zaadplasma en is essentieel om het sperma te voeden en te beschermen tijdens de reis door het vrouwelijke voortplantingskanaal¹. Prostaatziekten, zoals prostatitis, goedaardige prostaathyperplasie en prostaatkanker, komen veel voor en vormen wereldwijd een aanzienlijke last op de gezondheidszorg 2,3,4,5. Hoewel goedaardige prostaathyperplasie en prostaatkanker uitgebreid worden bestudeerd, blijven prostatitis, en vooral bacteriële prostatitis, relatief onderbelicht. Prostatitis treft tot 16% van de mannen wereldwijd ^6,7, waarbij bacteriële infecties ongeveer 10% van de gevallen uitmaken. Ondanks de prevalentie is bacteriële prostatitis nog steeds slecht begrepen. Escherichia coli (E. coli) stammen, specifiek uropathogene E. coli (UPEC), zijn de belangrijkste oorzaak van bacteriële prostatitis ^8,9.

Onderzoek naar de moleculaire mechanismen van prostaatinfectie blijft beperkt door het ontbreken van fysiologisch relevante in vitro modellen. De meeste studies naar prostaatziekte hebben traditioneel vertrouwd op cellijnen of diermodellen. In het bijzonder zijn kankerachtige of getransformeerde cellijnen zoals LNCaP of RWPE-1 veelvuldig gebruikt om prostaatziekten en de respons op behandeling^te modelleren 10,11,12,13. Deze modellen missen echter celsamenstelling en de complexiteit van gezond of kankerachtig prostaatepitheel. Bovendien hebben veel andere studies diermodellen (voornamelijk muismodellen) gebruikt om verschillende hypothesen te bestuderen over prostaatinfectie, immuunrespons, groei van prostaattumoren en metastase 14,15,16,17. Hoewel deze modellen tot nu toe het meest geavanceerd en informatief zijn, roepen ze doorgaans ethische zorgen op, vergen ze aanzienlijke tijd en middelen en kunnen ze duur zijn. Alternatief zijn ex vivo weefselexplanten en primaire celculturen ook gebruikt voor kortlopende studies van weefselreacties op medicijnen of kankerontwikkeling 18,19,20. Toch hebben deze modellen een beperkte levensduur en is de beschikbaarheid van vers menselijk weefsel vaak beperkt.

Driedimensionale (3D) organoïde culturen afkomstig van volwassen stamcellen zijn een veelbelovend alternatief geworden voor het modelleren van epitheelweefsels in vitro. In tegenstelling tot conventionele cellijnen behouden organoïden belangrijke kenmerken van het oorspronkelijke epitheel, zoals cellulaire heterogeniteit, weefselspecifieke architectuur en functionele kenmerken 21,22,23. In tegenstelling tot primaire celculturen of ex vivo explants kunnen organoïde culturen over een lange periode worden uitgebreid en doorgevoerd zonder senescent te worden. Deze eigenschappen maken organoïde systemen bijzonder geschikt voor het bestuderen van ziekte- en gastheer-pathogeen interacties in een fysiologisch relevante context. Prostaatorganoïden zijn gegenereerd uit gezond en kankerachtig menselijk weefsel, evenals uit muismodellen, en worden voornamelijk gebruikt in prostaatkankeronderzoek 24,25,26. Desalniettemin vormt de 3D-structuur van organoïden voor infectiestudies een aanzienlijke uitdaging, voornamelijk vanwege beperkte toegang tot het luminale celoppervlak. Traditioneel zijn intacte 3D-organoïden geïnfecteerd door het micro-injecteren van het pathogene agent, hetzij door het organoïde eerst te dissociëren in fragmenten of enkele cellen voordat het met de pathogene²³ wordt incubeerd. Hier kan variabiliteit in grootte en 3D-structuur de reproduceerbaarheid en doorvoer beïnvloeden. Als alternatief bieden apical-out organoïden een manier om de beperking van lumen-ontoegankelijkheid te overwinnen. Het cultiveren van organoïden in suspensie, hetzij in ultra-lage hechtingsweefselkweekplaten of op oppervlakken die zijn bedekt met niet-adhesierende oppervlakteactieve stoffen, veroorzaakt een omkering van de organoïde polariteit. Daardoor kijkt het apicale oppervlak naar buiten, waardoor directe toegang mogelijk is voor pathogene infectiestudies^27,28. Deze culturen kunnen echter niet op de lange termijn worden onderhouden, en variabiliteit in organoïdegrootte en celaantal bemoeilijkt het bepalen van de multipliciteit van infectie (MOI). Bovendien zijn de mechanismen achter de omkering van polariteit en de effecten daarvan op de organoïde cellen nog niet volledig begrepen. Om de beperkingen van organoïden als in-vitro infectiemodellen te overwinnen, zijn apiek toegankelijke organoïde-gebaseerde modellen ontwikkeld met organoïden uit organen zoals de maag, darm of long 29,30,31. Dergelijke systemen behouden de belangrijkste epitheelkenmerken en maken eenvoudigere manipulatie, beeldvorming en gecontroleerde blootstelling aan ziekteverwekkers en/of geneesmiddelen mogelijk. De kweekvoorwaarden die celdifferentiatie mogelijk maken, vertalen zich echter niet altijd van de organoïdeculturen naar de 2D-kweekmodellen^31,32.

Hier beschrijven we een protocol om een apicaal toegankelijk prostaatepitheel-model te genereren met behulp van muis prostaatorganoïden. Dit model was eerder ontwikkeld en gevalideerd in ons laboratorium, waar we de sterke gelijkenis met native prostaatweefsel en de relevantie voor infectiebiologische studies met UPEC³² aantoonden. Het systeem bootst nauwgezet de cellulaire samenstelling en polariteit van het prostaatepitheel na, terwijl het verbeterde toegankelijkheid biedt voor experimentele manipulatie. Bovendien tonen we de toepasbaarheid aan voor het bestuderen van gastheer-pathogeen interacties in de prostaat, wat een beter hanteerbaar alternatief biedt voor in vivo modellen en een fysiologisch relevanter systeem dan conventionele cellijnen of 3D-organoïdemodellen.

Protocol

Ethische verklaring: Alle dierprocedures voldeden aan de richtlijnen voor dierenverzorging en gebruik van de Universiteit van Würzburg en waren goedgekeurd onder de relevante institutionele en overheidsvoorschriften. Alleen WT-muizen die bij ons instituut door andere onderzoeksgroepen voor onafhankelijke doeleinden waren geëuthanaseerd, werden in deze studie gebruikt. Er werden geen dieren specifiek geofferd voor dit werk, in overeenstemming met de 3R-principes (vervanging, reductie en verfijning).

OPMERKING: Het hier gepresenteerde protocol is gebaseerd op een eerdere studie gepubliceerd door de^{auteurs 32}. Alle hier beschreven stappen moeten worden uitgevoerd in een steriele bioveiligheidskast, gebruikmakend van de toepasselijke aseptische technieken en met passende persoonlijke beschermingsmiddelen. Murine prostaatorganoïden werden gegenereerd uit C57BL/6 muizen en bewaard in 3D-kweek, zoals eerder beschreven^25,26. Om de 3R-principes te volgen, werden de muisprostaten door de dierenfaciliteit gedoneerd van onbehandelde, naïeve WT-muizen (minstens 6 maanden oud) die om andere redenen waren geofferd. Kort gezegd werden muisprostaaten gehakt en verteerd in twee stappen met collagenase en TrypLE Express Enzyme. Cellen werden vervolgens in druppels extracellulaire matrix (ECM) gezaaid om de 3D-organoïden te genereren. Kweekmedium werd aan de cultuur toegevoegd en elke 3 dagen aangevuld. 3D-organoïdeculturen werden eenmaal per week doorgevoerd en vanaf passage 3 gebruikt voor 2D-zaaien. Een week oude muizenprostaatorganoïden werden gebruikt om het organoïde-gebaseerde model op een 2D-oppervlak te zaaien volgens het huidige protocol. Het coaten van weefselkweekplaten met ECM-eiwitten is voor dit protocol niet vereist.

1. Generatie van het prostaatorganoïde-gebaseerde model

1. 3D-organoïde isolatie
   1. Aspireer het medium uit het gewenste aantal putten van 3D-organoïden uit een 24-wellplaat. Vervang het door 500 μL adDMEM/F12+/+ per put (zie Materiaaltabel).
   2. Gebruik een P1000-pipet om de ECM-val mechanisch te verstoren. Verzamel de vering in een 15-mL conische buis. Verzamel maximaal twee putten per buis.
   3. Vul bij met adDMEM/F12+/+ tot 10 mL. Draai de buis voorzichtig 3-4 keer om om te mengen. Centrifugeer op 450 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
2. 3D-organoïde ontwrichting in enkele cellen
   1. Aspireer het supernatant. Sussief de pellet opnieuw in 2 mL voorverwarmde (37 °C) TrypLE Express Enzyme, aangevuld met 10 μM RHOKi.
   2. Broed 15 minuten in een waterbad bij 37 °C. Gebruik elke 5 minuten een P1000-pipet om de celsuspensie te mengen.
      OPMERKING: Controleer de celsuspensie onder een omgekeerde microscoop met een 4x objectief om te verifiëren dat de cellen grotendeels één zijn. Kleine klonten van 2-3 cellen zijn acceptabel. Meestal is 15 minuten incubatie voldoende, maar dit kan indien nodig worden verlengd.
   3. Vul aan met 10 ml adDMEM/F12+/+. Draai de buis voorzichtig 3-4 keer om om te mengen. Centrifugeer op 450 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
3. Plating van enkelcellige suspensie
   1. Aspiraat het supernatant zonder de pellet te verstoren. Suspenseer de celpellet opnieuw in kweekmedium aangevuld met 10 μM RHOKi (300 μL kweekmedium per put van 3D-organoïden gebruikt in stap 1.1.1).
      OPMERKING: Het kweekmedium bestaat uit: Advance Dulbecco's Modified Eagle Medium/F12, 10 mmol L⁻¹ HEPES, 1x GlutaMAX, 1x B27, 1 mM N-acetylcysteïne, 10% Noggin geconditioneerd medium, 10% R-spondin 1 geconditioneerd medium, 50 ng·^mL-1 EGF, 1 nM 5α-dihydrotestosteron (DHT), 0,2 μM TGFβi en 100 ng·^mL-1 Primocine (zie Materiaaltabel). Voor infectie-experimenten gebruik kweekmedium zonder Primocin.
   2. Tel het aantal cellen in de suspensie met behulp van een Neubauer-telkamer.
   3. Verdun de celsuspensie in kweekmedium aangevuld met 10 μM RHOKi tot een concentratie van 62.500 cellen·^mL-1. Gebruik 200 μL celsuspensie per put om te zaaien op platen met 48 putten (weefselcultuur behandeld door de fabrikant, zie Materiaaltabel) of 300 μL per put op gechamberde μ-slides (zie Tabel van Materialen). Plaats de plaat in een celkweekincubator bij 37 °C en 5%_CO2.
      OPMERKING: Elke put van 3D-organoïden, gebruikt in Stap 1.1.1. levert doorgaans ongeveer 200.000 cellen op.
   4. Na één dag zijn de meeste enkele cellen aan het 2D-oppervlak verbonden. Verander het kweekmedium elke 2-3 dagen. Confluency wordt binnen 7 dagen bereikt.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat RHOKi alleen wordt toegevoegd voor de eerste zaaiing en niet voor latere mediumwisselingen.
4. Het onderscheid maken van het organoïde-gebaseerde model.
   OPMERKING: Volg de volgende stappen om een gedifferentieerd organoïde-gebaseerd model te verkrijgen, verrijkt met luminale cellen.
   1. Voeg 10 nM DHT toe aan de celsuspensie (stap 1.3.3). Gebruik kweekmedium aangevuld met 10 nM DHT voor de volgende mediumwissels (elke 2-3 dagen).
      OPMERKING: Als er geen DHT aan de celsuspensie wordt toegevoegd (en daaropvolgende mediumwisselingen), wordt het organoïde-gebaseerde model verrijkt met basale cellen.

2. Transepitheliale elektrische weerstand (TEER) metingen

1. Zaad de organoïde celsuspensatie in bij een concentratie van 62.500 cellen·^mL-1, met 300 μL (verkregen in stap 1.3.3.) op een 8-put PET μ-slide met 40 elektroden per put (zie Materiaaltabel). Voeg 300 μL kweekmedium toe, beschreven in 1.3.1, aan een van de putten zonder cellen.
   OPMERKING: De celvrije put wordt gebruikt als blank voor metingen.
2. Verbind de μ-slide met het impedantie-gebaseerde celanalysesysteem (zie Table of Materials) met het 16-put station dat in een weefselkweekincubator is geplaatst. Meet de TEER op 400 Hz gedurende 7 dagen. Verander het kweekmedium elke 2-3 dagen.

3. Immunofluorescentiekleuring

OPMERKING: Voor deze methode moet je ervoor zorgen dat cellen worden gezaaid in kamervormige μ-slides (zie Materiaaltabel), die compatibel zijn met hoge-resolutie microscopietoepassingen.

1. Op het geselecteerde tijdstip verwijder je het medium en was je de cellen drie keer met 1x PBS. Fixeer de cellen 15 minuten op kamertemperatuur met 4% paraformaldehyde (PFA) (vermijd lichtblootstelling).
   VOORZICHTIG: 4% paraformaldehyde kan een allergische huidreactie veroorzaken, ernstige oogschade veroorzaken en wordt vermoed kanker te veroorzaken. Gebruik altijd de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM). Vermijd inademing van stof, dampen, gassen, nevel, dampen of sprays. Draag beschermende handschoenen en zorg ervoor dat besmette kleding in het laboratorium blijft totdat ze correct is ontsmet. Voer de inhoud en containers af via een goedgekeurde afvalverwerkingsfaciliteit.
2. Na de fixatie was je de cellen 3 keer met 1x PBS (5 minuten per stuk). Permeabiliseer de cellen met 0,5% Triton X-100 (zie Materiaaltabel) gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
   VOORZICHTIG: Triton X-100 veroorzaakt huidirritatie en ernstige oogschade. Het is zeer giftig voor aquatisch leven met langdurige effecten en kan endocriene verstoring in het milieu veroorzaken. Draag bij het hanteren beschermende handschoenen, oog- en gezichtsbescherming. Voer de inhoud en containers af via een goedgekeurde afvalverwerkingsfaciliteit. Vermijd het loslaten in de omgeving.
3. Was de cellen twee keer met 1x PBS (5 minuten per stuk). Blokkeer de cellen met een blokkeringsbuffer (1% BSA in PBS, zie Materiaaltabel) gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
4. Verdun de primaire antilichamen in blokkerende buffer (1% BSA in 1x PBS) en incubeer met de cellen een nacht bij 4 °C op een wiegplatform. De volgende dag incubeer je 1 uur op kamertemperatuur. (zie Materiaaltabel voor antistofverdunningen).
   OPMERKING: Voor het kleuren van F-actine met falloïde of plasmamembraan met CellMask (zie Materiaaltabel), sla stap 3.4 over.
5. Was de cellen 3 keer met 1x PBS (5 minuten per stuk). Verdun de secundaire antilichamen, falloïde of CellMask (zie Materiaaltabel) in een blokkerende buffer (1% BSA in 1x PBS) en incubeer met de cellen 1 uur op kamertemperatuur.
6. Was de cellen 3 keer met 1x PBS (5 minuten per stuk). Incubeer de cellen 15 minuten op kamertemperatuur met Hoechst (zie Materiaaltabel) verdund in 1x PBS om de kernen te kleuren.
7. Was de cellen 3 keer met 1x PBS (5 minuten per stuk) en laat de cellen 1x PBS over. Bewaar op 4 °C.
8. Beeld de kamervormige μ-slides glaasjes af (zie Materiaaltabel) in een laserscanning confocale microscopie of fluorescentiemicroscoop.
   OPMERKING: Overzichtsbeelden kunnen worden gemaakt met een 20x objectief op een fluorescentiemicroscoop om de algehele infectie-efficiëntie en verspreiding te beoordelen. Beelden met hogere resolutie werden gemaakt met een confocale microscoop uitgerust met een 40x wateronderdompelingsobjectief om individuele bacteriën te visualiseren die aan epitheelcellen vastzaten of geïnternaliseerd waren. Fluorforen werden geëxciteerd met laserlijnen op 405, 499, 590 en 653 nm, afhankelijk van de gebruikte fluoroforen. Emissie werd gedetecteerd met emissievensters ingesteld op 415 tot 516 nm voor Hoechst, 509 tot 573 nm voor GFP of Alexa 488, 600 tot 651 nm voor McErry of Alexa 594, en 663 tot 720 nm voor Alexa 647. Z-stacks werden verkregen met een stapgrootte van 0,5 μm en bedekten de volledige dikte van de epitheellaag. Beelden werden gemaakt met een resolutie van 1024 bij 1024 pixels, met een scanfrequentie van 400 Hz en framegemiddelde ingesteld op 4, wat zorgt voor een goede beeldkwaliteit. Laservermogen en detectorversterking werden constant gehouden onder alle omstandigheden binnen hetzelfde experiment. Alle beeldvormingsparameters, waaronder laservermogen, detectorversterking, scansnelheid en gemiddeling, moeten worden geoptimaliseerd en aangepast afhankelijk van de gebruikte confocale microscoop.

4. Bacteriële infectie met uropathogene E. coli (UPEC)

OPMERKING: Zorg ervoor dat je een organoïde-gebaseerd model gebruikt dat 7 dagen zonder Primocin wordt onderhouden (zie Materiaaltabel) voor de volgende stappen.

De uropathogene E. coli-stam UTI89, die constitutief een mCherry-eiwit uit het plasmide pFPV-mCherry (ampicillineresistent) tot expressie brengt, werd in deze studie gebruikt.

VOORZICHTIG: Draag bij het hanteren van infectieuze ziekteverwekkers (Biosafety Level 2) handschoenen en de juiste oog- en gezichtsbescherming. Draag altijd een volledig dichtgeknoopte labjas. Voer alle procedures uit in een gecertificeerde biologische veiligheidskast. Decontaminateer werkoppervlakken en was je handen grondig na het hanteren van biologische materialen. Verzamel BSL-2 afval in aangewezen biohazardcontainers die geschikt zijn voor autoclaven. Decontaminateer afvalstoffen vóór verwijdering door autoclaven of een andere geschikte decontaminatiemethode.

1. Drie dagen voor het infectie-experiment wordt de UPEC-stam uitgesperd op een LB-agarplaat aangevuld met het bijbehorende antibioticum (in dit protocol werd ampicilline 100 μg·^mL-1 gebruikt) en 16-24 uur geïncubeerd bij 37 °C.
   VOORZICHTIG: Sommige antibiotica kunnen allergische reacties of irritatie veroorzaken bij contact en bijdragen aan antimicrobiële resistentie als ze verkeerd worden weggegooid. Bereid altijd antibiotica voor en voeg ze toe in een biologische veiligheidskast terwijl je de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen draagt (handschoenen en oogbescherming). Verwijder antibiotica-bevattende oplossingen als chemisch afval via een goedgekeurde afvalverwerkingsfaciliteit.
2. Twee dagen voor het infectie-experiment inoculeer je 3 mL LB-bouillon aangevuld met het bijbehorende antibioticum (ampicilline 100 μg·^mL-1) met een enkele UPEC-kolonie van de agarplaat (stap 4.1). Incubeer statisch op 37 °C gedurende 12-16 uur.
3. Een dag voor het infectie-experiment vortex je de bacteriële cultuur uit stap 4.2 en meet je de OD₆₀₀. Bereken het volume van deze cultuur dat nodig is om 3 mL LB-bouillon aangevuld met ampicilline (100 μg^·mL-1) te inoculeren tot een startOD₆₀₀ van 0,05 met de volgende formule: Volume (μL) = (0,05 * 3.000 μL) / gemeten OD₆₀₀. Tel het berekende volume van de cultuur uit stap 4.2 op. naar de verse LB-bouillon en statisch incuberen bij 37 °C gedurende 24 uur.
   OPMERKING: De OD₆₀₀ van de overnight cultuur uit stap 4.2 zou tussen 1.7 en 2.2 moeten liggen.
4. Op de dag van infectie vortex je de bacteriekweek uit stap 4.3 en meet je de OD₆₀₀. Oogst OD₆₀₀ 1 uit de cultuur, centrifugeer dan op 12.000 x g gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant.
5. Opnieuw opschorsen in 1 mL Primocin-vrij organoïde kweekmedium zonder DHT. Verdunn tot een MOI van 100.
   OPMERKING: Elke put in een plaat met 48 putten wordt op dag 7 beschouwd als ongeveer 150.000 cellen. Deze schatting werd verkregen door cellen te tellen in een put vóór infectie in meerdere experimenten. Om de MOI nauwkeurig aan te passen, wordt aanbevolen om er één extra goed te zaaien voor celtelling vóór infectie. Om het benodigde volume bacteriële suspensie (stap 4.4) te bepalen, vermenigvuldig je het aantal cellen per put met de MOI om het totale aantal benodigde bacteriën per put te verkrijgen, en deel je dit getal vervolgens door de bacteriële concentratie (8 × 10⁵ bacteriën/μL) om het volume in μL te verkrijgen.
6. Vervang het kweekmedium van het organoïde-gebaseerde model door kweekmedium dat bacteriën bevat. Pas het volume aan volgens het kweekoppervlak: gebruik 200 μL per put voor 48-put platen en 300 μL per put voor μ-slides. Incubeer 1 uur in een celkweekincubator bij 37 °C en 5%_CO2.
7. Na de incubatieperiode aspireert u het bacteriehoudende medium uit het organoïde-gebaseerde model. Was de put drie keer met adDMEM/F12+/+ om extracellulaire bacteriën te verwijderen.
8. Voeg kweekmedium toe met 50 μg^·mL-1 gentamicine om extracellulaire bacteriën te doden. Breng het 30 minuten uit.
   OPMERKING: De concentratie van gentamicine moet mogelijk worden aangepast afhankelijk van de gebruikte bacteriële stam. Bij gebruik van een concentratie hoger dan 50 μg·^mL-1 wordt aanbevolen om te controleren op cellulaire cytotoxiciteit.
9. Verwijder medium en vervang dit met een nieuw medium aangevuld met 10 μg^·mL-1 gentamicine voor de resterende infectietijd.
   Verwerk de geïnfecteerde cellen voor fluorescentiekleuring, na sectie 3, of voor kwantificering door flowcytometrie, na sectie 5.

5. Kwantificering van infecties door flowcytometrie

1. Aspireer het kweekmedium en was de cellen drie keer met 1x PBS. Gebruik 100 μL TrypLE Express Enzyme om de cellen los te koppelen. Incubeer 5-10 minuten totdat alle cellen losgekoppeld zijn.
   OPMERKING: Een put uit een plaat met 48 putten is voldoende volgens de conditie.
2. Verzamel de celsuspensie en breng deze over in een put van een 96-put plaat (conische onderkant). Voeg 100 μL flowcytometerbuffer (1x PBS, 10% FBS, 5 mM EDTA) erbovenop om het TrypLE Express Enzyme te inactiveren.
3. Centrifugeer de 96-put plaat op 450 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Verwijder het supernatant en suspendeer de pellet opnieuw in 150 μL flowcytometerbuffer.
4. Verzamel en kwantificeer geïnfecteerde cellen met behulp van de flowcytometer (zie Tabel van Materiaal).
   OPMERKING: Flowcytometrie werd uitgevoerd met een 488 nm excitatielaser en een 615/20 nm emissiefilter voor detectie van mCherry-positieve cellen. De gegevens werden verkregen met een hoge debiet (66 μL·min⁻¹), waarbij minstens 10.000 gebeurtenissen per monster werden verzameld en alleen gebeurtenissen met een voorwaartse verstrooiingshoogte groter dan 80.000 werden opgenomen. Geïnfecteerde cellen werden geïdentificeerd op basis van mCherry-fluorescentie in vergelijking met een niet-geïnfecteerde (naïeve) controlegroep, na uitsluiting van afval en dubbeltjes. Een levensvatbaarheidsmarker (bijv. propidiumjodide of andere levende/dode kleuringen) kan worden opgenomen in de gatingstrategie om de levensvatbaarheid van cellen te beoordelen. Dit kan vooral nuttig zijn bij het eerste werk met het model om ervoor te zorgen dat celdissociatie de cellen niet nadelig beïnvloedt.

Resultaten

Dit protocol beschrijft de generatie van een organoïde-gebaseerd model van het muizenprostaatepitheel dat het celtype en de transcriptie-expressie van het epitheelcompartiment van het natuurlijke weefsel recapituleert. Dit model wordt gegenereerd met behulp van 3D-organoïden van volwassen stamcellen die zijn gemaakt uit volwassen muisprostaatweefsel. Deze organoïdeculturen worden vervolgens in cultuur bewaard en wekelijks doorgevoerd. Voor het organoïde-gebaseerde model begint de eerste stap in de workflow (Figuur 1A) met het gebruik van 7 dagen oude 3D-organoïden. Deze periode is nodig om een geschikte grootte en celdichtheid te bereiken voor het volgende zaaien op een 2D-oppervlak. Na het passeren werden kleine fragmenten organoïden (Figuur 1B, Dag 0) in ECM gezaaid en mochten groeien. In de loop van de tijd groeien ze uit tot grote, bolvormige structuren met een gedefinieerd binnenste lumen op dag 7 (Figuur 1B). Na het dissociëren van de 7 dagen oude organoïden in enkele cellen, werden de cellen op een met weefselkweek behandelde plaat (Figuur 1C, Dag 0) gezaaid, met hetzelfde kweekmedium als de 3D-organoïdeculturen (1nM DHT) om een monolaag te vormen. Op dag 1 begonnen de vastzittende cellen zich te vermenigvuldigen. In de daaropvolgende dagen breidde de monolaag zich uit en bereikte de confluence tussen dag 3 en dag 5, zoals waargenomen door brightfield-microscopie (Figuur 1C). Om de morfologische veranderingen in de tijd te karakteriseren en om het moment te monitoren waarop het organoïde-gebaseerde model confluence bereikt, hebben we het plasmamembraan gekleurd met CellMask en fluorescentiebeeldvorming uitgevoerd op meerdere tijdstippen (Figuur 1D).

Omdat androgenreceptor (AR) signalering een belangrijke regulator is van celdifferentiatie in de prostaat, en het moduleren van de concentratie testosteron (of DHT) in het organoïde kweekmedium aantoonde geleidelijke differentiatie van stamcellen naar basale of luminale cellen³², pasten we de DHT-niveaus in het kweekmedium aan om de verrijking van luminale cellen (DHT 10 nM) of basale cellen (zonder DHT, Controle; Methode1, Figuur 2A). Zoals getoond in Figuur 2 (B-F) werden er geen grote verschillen waargenomen in celgroei of confluentie. Zoals verwacht drukten de meeste cellen in de controleconditie (organoïde kweekmedium zonder DHT) cytokeratine 5 (KRT5), een marker van prostaatbasale stamcellen (Figuur 2B,E). Ter vergelijking: slechts enkele cellen vertoonden lage niveaus van CD24a, een marker van gedifferentieerde luminale prostaatcellen (Figuur 2B,F).

Suppletie met 1 nM DHT, zoals we eerder^{beschreven 32}, resulteerde in een gemengde populatie met zowel basale als luminale cellen. De expressie van CD24a bleef echter laag, wat wijst op onvolledige differentiatie in luminale cellen (Figuur 2C, F³²). Het verhogen van DHT naar 10 nM bevorderde volledige differentiatie van luminale cellen, terwijl sommige basale cellen behouden bleef, na 7 dagen kweek (Figuur 2D-F). De differentiatie van organoïde-gebaseerde modellen kan ook worden beoordeeld met behulp van brightfield-microscopie. Hoewel de verschillen tussen de omstandigheden niet erg duidelijk zijn wanneer cellen schaars zijn (Dag 0 - 5, Figuur 1C, Aanvullende Figuur 1A), worden celmorfologie en uiterlijk tussen de drie kweekcondities duidelijk en zichtbaar bij brightfield-microscopie op Dag 7 (Figuur 1C, Aanvullende Figuur 1A,B). Bij afwezigheid van DHT leken cellen platter en onregelmatiger van vorm, terwijl bij 10 nM DHT cellen dicht op elkaar waren gepakt met een polygonale opstelling, die leek op een kasseienmorfologie (Aanvullende Figuur 1B).

Opmerkelijk is dat 3D-organoïde culturen ook morfologische veranderingen ondergingen bij gekweekte concentraties DHT. Specifiek werd een duidelijke dosisafhankelijke toename van organoïdegrootte waargenomen, waarbij de grootste organoïden zich vormden in aanwezigheid van 10 nM DHT (Figuur 1B, Aanvullende Figuur 2A,B). Deze resultaten geven aan dat het AR-pad cruciaal is, niet alleen voor celdifferentiatie, maar ook voor het moduleren van de groeidynamiek van muisprostaatorganoïden.

Om de epitheliale integriteit en polarisatie van de modellen te beoordelen, voerden we transepitheliale elektrische weerstand (TEER) metingen uit in het organoïde-gebaseerde model dat werd gekweekt zonder of 10 nM DHT. TEER-waarden namen in beide toestanden in de loop van de tijd toe, maar waren aanzienlijk hoger in aanwezigheid van 10 nM DHT (Figuur 3A), wat wijst op een verbeterde epitheliale barrièrefunctie. Deze resultaten werden ondersteund door falloïdekleuring van actinefilamenten, die typisch in een apicale ring zijn georganiseerd bij de cel-cel verbindingen in luminale prostaatepitheelcellen. In de 10 nM DHT-conditie leek de actinering duidelijker dan de controleconditie, wat consistent is met verhoogde celpolariteit en epitheelorganisatie (Figuur 3B). Daarnaast toonde immunokleuring voor zonula occludens 1 (ZO-1) een toename van tight junctions in de 10 nM DHT-conditie (Figuur 3C), wat de integriteit van versterkte epitheliale barrières en differentiatie richting een luminaal fenotype verder ondersteunt. Orthogonale projecties tonen aan dat organoïden gekweekt met 10 nM DHT een goed gedefinieerde epitheliale polariteit vertonen (aanvullende figuur 3A). Basale KRT5⁺-cellen bevinden zich onderaan, en luminale CD24a⁺-cellen zijn verspreid langs de epitheellaag, met een sterkere kleuringsintensiteit richting de apicale zijde. Deze architectuur lijkt op die van het prostaatweefsel van de muis (aanvullende figuur 3B). Opmerkelijk is dat gegevens uit de Human Protein Atlas aantonen dat deze markers een vergelijkbare lokalisatie hebben in menselijk prostaatweefsel, waarbij KRT5⁺ basale cellen onder een CD24a⁺ luminale laag liggen (Aanvullende Figuur 3C)³³. Daarentegen tonen cellen die onder controle- of 1 nM DHT-condities zijn gekweekt geen duidelijke ruimtelijke scheiding tussen basale en luminale markers, en de celhoogte was veel lager dan bij de 10 nM-conditie (aanvullende figuur 3A). Dit geeft aan dat 10 nM DHT-suppletie epitheliale differentiatie en polarisatie bevordert in het 2D-model op een manier die vergelijkbaar is met het native prostaatepitheel. Omdat het organoïde-gebaseerde model dat met 10 nM DHT is gekweekt, sterk lijkt op het oorspronkelijke prostaatepitheel van de muis (Figuur 2D, Aanvullende Figuur 3A,B), dient het als een relevant platform voor het onderzoeken van gastheer-pathogeen interacties. Om de toepasbaarheid van het model aan te tonen, gebruikten we infecties met UPEC, specifiek de UTI89-stam, een van de meest gebruikte UPEC-stammen in het genitourinaire kanaalveld, als voorbeeld. Zoals te zien is in Figuur 4A, werden bacteriën 24 uur lang in LB-bouillon gekweekt (zoals beschreven in Methode 4) en een uur met de cellen geïncubeerd. Extracellulaire bacteriën werden vervolgens gedood met gentamicine om invasie en intracellulaire replicatie te kwantificeren. Bij infectie van het organoïde-gebaseerde model hechtte UPEC zich in grote aantallen aan de epitheelcellen (0 hpi; Figuur 4B, linker paneel; Figuur 4C). Vervolgens, en na de gentamicinebehandeling (1 hpi), nam het aantal UPEC-positieve cellen aanzienlijk af door de dood van extracellulaire bacteriën (Figuur 4B, middenpaneel; Figuur 4C). Bij 24 hpi bleef het aantal geïnfecteerde cellen onveranderd (Figuur 4C), maar confocale microscopiebeeldvorming toonde aan dat intracellulaire bacteriën bleven zich repliceren en gemeenschapsachtige structuren vormden, vergelijkbaar met die eerder beschreven in het blaasepitheel (Figuur 4B, rechter paneel). Geïnfecteerde cellen werden geïdentificeerd door mCherry-fluorescentie met niet-geïnfecteerde (naïeve) controles als referentie, na uitsluiting van afval en dubbelen (aanvullende figuur 4).

Figuur 1: Overzicht van de workflow en morfologische evolutie van de prostaatorganoïden en de organoïde-gebaseerde modellen in de tijd. (A) Schematische weergave van de experimentele workflow (Methode 1). (B) Brightfield-beelden die de morfologische ontwikkeling van de prostaatorganoïden tonen, aangevuld met 1 nM DHT, vastgelegd op dag 0, 1, 3, 5 en 7 (van links naar rechts). Schaalbalk: 200 μm. (n = 3). (C) Brightfield-beelden van het organoïde-gebaseerde model, aangevuld met 1 nM DHT, gemaakt op dag 0, 1, 3, 5 en 7 (van links naar rechts). Schaalbalk: 200 μm. (n = 3). (D) Vertegenwoordigende immunofluorescentiemicroscopiebeelden van het organoïde-gebaseerde model, aangevuld met 1 nM DHT en gekleurd met CellMask (rood), op dag 1, 3, 5 en 7 (van links naar rechts). De kernen werden tegengekleurd met Hoechst 33342 (blauw). Schaalbalk: 50 μm. (n = 3) Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: DHT moduleert de differentiatie van afstamming in het organoïde-gebaseerde model. (A) Schematische weergave van de verschillende voorwaarden die voor differentiatie worden gebruikt. (B-D) Representatieve immunofluorescentiemicroscopiebeelden van het organoïde-gebaseerde model gekweekt gedurende 7 dagen in de (B) afwezigheid (Ctrl) of aanwezigheid van (C) 1 nM of (D) 10 nM DHT. Beelden werden gemaakt op dag 1, 3, 5 en 7 (van links naar rechts). De organoïde-gebaseerde modellen werden gekleurd op CD24a (luminale celmarker, groen) en KRT5 (basale celmarker, magenta). De kernen werden tegengekleurd met Hoechst 33342 (blauw). Schaalbalk: 50 μm. (n = 4). (E,F) Beeldkwantificatie van (E) KRT5⁺ en (F) CD24a⁺ cellen in het organoïde-gebaseerde model dat zonder DHT (Ctrl), 1nM of 10nM is gekweekt. De gegevens worden weergegeven als percentage positieve cellen per gezichtsveld. Statistische test: eenrichtings-ANOVA met Tukey's post hoc test. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Het organoïde-gebaseerde model gedifferentieerd met 10 nM DHT vertoont een hogere celpolarisatie vergeleken met de controle. (A) TEER-analyse van het organoïde-gebaseerde model dat 7 dagen wordt gekweekt in afwezigheid (Ctrl; roze) en aanwezigheid van DHT (10 nM; groen). Foutbalken geven SD weer (n = 3). Statistische test: eenrichtings-ANOVA met Tukey's post hoc test. (B,C) Representatieve immunofluorescentiemicroscopiebeelden van het organoïde-gebaseerde model, gekweekt gedurende 7 dagen zonder (Ctrl; boven) of met 10 nM DHT (onder) en gekleurd op (B) F-actine (rood) en (C) ZO-1 (rood). De kernen werden tegengekleurd met Hoechst 33342 (blauw). Schaalbalk: 50 μm. (n = 3) Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Analyse van infectiedynamiek in het organoïde-gebaseerde model. (A) Schematische weergave van het infectieprotocol (sectie 4). (B) Representatieve immunofluorescentiemicroscopiebeelden die het geïnfecteerde organoïde-gebaseerde model tonen op 0, 1 en 24 uur na infectie (hpi; van links naar rechts). UPEC worden in het rood weergegeven. De kernen werden tegengekleurd met Hoechst 33342 (blauw). Schaalbalk: 50 μm. (n = 3). (C) Flowcytometrie-analyse van UPEC-positieve cellen (mCherry-positief, geïnfecteerde cellen) bij 0, 1 en 24 hpi. De gatingstrategie is weergegeven in aanvullende figuur 4. Foutbalken vertegenwoordigen SEM (n = 3). Statistische test: eenrichtings-ANOVA met Tukey's post hoc test. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende Figuur 1: Morfologische evolutie van het organoïde-gebaseerde model in de tijd. (A,B) Brightfield-beelden van een organoïde-gebaseerd model in de (A) afwezigheid (Ctrl) en (B) aanwezigheid van 10 nM DHT, vastgelegd op dag 0, 1, 3, 5 en 7 (van links naar rechts). Schaalbalk: 200 μm. (n = 3) Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Figuur 2: DHT-concentratie beïnvloedt de groei van 3D-prostaatorganoïden. (A) Brightfield-beelden van organoïde-gebaseerd model in afwezigheid (Ctrl; boven) en aanwezigheid van 10 nM DHT (onder), afgebeeld op dag 0, 1, 3, 5 en 7 (van links naar rechts). Schaalbalk: 200 μm. (n = 3). (B) Kwantificering van de grootte van 3D-organoïden op dag 7, gekweekt onder drie verschillende omstandigheden: geen DHT (Ctrl; roze), 1 nM DHT (paars) en 10 nM DHT (groen). Statistische test: eenrichtings-ANOVA met Tukey's post hoc-test (n = 3). Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Figuur 3: Karakterisering van de morfologie van prostaatorganoïden en epitheelpolariteit. (A) Orthogonale projecties van confocale z-stacks die epitheelorganisatie en apikal-basale polariteit onder verschillende DHT-concentraties illustreren (Ctrl, 1 nM en 10 nM DHT). Basale cellen werden gekleurd op KRT5 (magenta) en luminale cellen op CD24a (groen). Schaalbalk: 50 μm.(B) Immunofluorescentiekleuring van OCT-ingebedde muisprostaatweefsel met basale (KRT5, magenta) en luminale (CD24a, groene) epitheelmarkers. De kernen worden tegengekleurd met DAPI (blauw). Schaalbalk: 50 μm. Kort gezegd werden de stukjes muisweefsel vastgesteld met 4% PFA, 's nachts gedehydrateerd met 30% sucrose, en in OCT ingebedde³². De glaasjes werden vervolgens 10 minuten gerehydrateerd in PBS en geïnjecteerd met immuno-kleuring na sectie 3. (C) Immunohistochemische analyse van CD24a- en KRT5-eiwitexpressie in menselijk prostaatweefsel (Panel C is gehaald uit The Human Protein Atlas Database(versie 25.0; Human Protein Atlas proteinatlas.org), Uhlén, M. et al(2015)³³, https://www.proteinatlas.org/ENSG00000186081-KRT5/tissue/prostate). Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Figuur 4: Strategie voor het identificeren van geïnfecteerde cellen met flowcytometrie-gating. Cellen werden eerst gegated op basis van side scatter height (SSC-H) versus forward scatter height (FSC-H) om puin uit te sluiten, gevolgd door gating op SSC-H versus side scatter area (SSC-A) om losse cellen te selecteren. mCherry-positieve (geïnfecteerde) cellen werden vervolgens geïdentificeerd met behulp van Counts versus PE-Texas Red-H fluorescentie (histogram). Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

Verschillende ziekten kunnen de prostaat aantasten, waaronder goedaardige prostaathyperplasie, prostatitis en prostaatkanker. Deze ziekten komen veel voor en beïnvloeden de kwaliteit van leven van patiënten^{aanzienlijk 2}. Ondanks hun aanzienlijke impact op de gezondheidszorg blijft ons begrip van deze ziekten, met name de onderliggende mechanismen en gastheerresponsen bij niet-kankerachtige aandoeningen, beperkt. Dit komt grotendeels door het gebrek aan fysiologisch relevante experimentele modellen. Enerzijds vangen geïmmortaliseerde cellijnen niet de complexiteit of differentiatiestatus van normaal prostaatepitheel vast. Diermodellen, voornamelijk knaagdieren, brengen daarentegen ethische zorgen op en zijn niet kosteneffectief. Een alternatieve benadering is het gebruik van menselijke primaire cellen of door patiënten afgeleide weefselexplanties. De beperkte beschikbaarheid van vers prostaatweefsel beperkt echter de brede toepassing ervan. Deze beperkingen benadrukken de noodzaak van andere in-vitro systemen die fysiologisch relevant, gemakkelijk te gebruiken en experimenteel beheersbaar zijn. In deze context heeft de technologie van organoïden van volwassen stamcellen de ziektemodellering getransformeerd. Deze 3D-culturen hebben het vermogen zichzelf te organiseren, waardoor de epitheliale identiteit en de epitheliale cellulaire diversiteit^{behouden blijven.} Hoewel hun 3D-architectuur toepassingen mogelijk heeft gemaakt in kankeronderzoek, geneesmiddelentesten en regeneratieve geneeskunde 23,34,35,36,37,38,39,40,41, vormt hun afgesloten structuur, met het apicale oppervlak naar binnen gericht, praktische uitdagingen voor experimentele toegang, vooral als in-vitro Infectiemodellen. Apical-out organoïden lossen deze beperking op door de epitheelpolariteit om te keren, waardoor het apicale oppervlak bloot komt voor directe infectiestudies^27,28. Hun effectiviteit als infectiemodel kan echter beperkt zijn door variabiliteit in hun grootte, ongelijke blootstelling aan pathogenen en kwetsbaarheid tijdens langdurige infectie.

Hier presenteren we een protocol voor het genereren van een organoïde-gebaseerd model van de muisprostaat dat de epitheelcelsamenstelling en transcriptieprofiel van het inheemse muisepitheel recapituleert, terwijl het gemakkelijke toegang tot het apicale oppervlak biedt. Geoptimaliseerd in ons eerdere werk³², maakt dit model nauwkeurige controle mogelijk over belangrijke experimentele variabelen, waaronder zaaidichtheid, uniforme blootstelling aan prikkels, gedefinieerde bacteriën-celverhoudingen (MOI) en high-throughput beeldvormingsparameters die vaak moeilijk te standaardiseren zijn in conventionele 3D-organoïde systemen.

In lijn met het 3R-principe (Vervangen, Reduceren, Verfijnen) voor dierproeven⁴², zijn de organoïden die als bron van primaire cellen voor dit model worden gebruikt, afgeleid van wildtype, naïeve muizen die zijn geofferd voor niet-gerelateerde doeleinden, zoals fokken. Prostaaten worden verkregen via donaties van nabijgelegen dierenfaciliteiten, waardoor de noodzaak om extra dieren specifiek voor dit protocol te offeren afneemt.

Robuuste en betrouwbare differentiatie van organoïden en organoïde-gebaseerde modellen is cruciaal voor het getrouw repliceren van de cellulaire samenstelling en functionele kenmerken van het native weefsel, waardoor hun relevantie als in vitro-modellen wordt gegarandeerd. Celdifferentiatie binnen organoïden wordt sterk beïnvloed door de specifieke samenstelling van het kweekmedium, inclusief de precieze concentraties van groeifactoren en farmacologische agentia (d.w.z. medicijnremmers). Het manipuleren van deze factoren maakt directe differentiatie mogelijk naar specifieke cellijnen, zoals aangetoond in verschillende organoïde systemen. Zo bevordert het verwijderen van WNT bij intestinale organoïden de differentiatie van enterocyten, wat verder kan worden versterkt door interferon gamma (besproken in³⁸). Differentiatie in bekercellen kan worden bereikt door verwijdering van p38-remmer en nicotinamide of door Notch-inhibitie via DAPT/DBZ (herzien in³⁸). IGF-1 en FGF-2 zijn ook aangetoond dat ze langdurige uitbreiding van secretoire celverrijkte culturen^{ondersteunen 43}. Bovendien bevordert IL-22 de differentiatie van Paneth-cellen, en ontstaan entero-endocriene cellen via inhibitie van routes zoals Notch en BMP³⁸. Evenzo vertonen gastrische organoïden en organoïde-gebaseerde monolagen differentiatie richting pitcellen wanneer WNT uit het kweekmedium wordt verwijderd, terwijl het toevoegen van nicotinamide aan het medium cellen naar een klierfenotype (nek- en hoofdcellen) leidt^.

In de prostaat speelt de androgeenreceptor (AR) een cruciale rol bij het handhaven van weefselhomeostase 46,47,48,49. Testosteron, geproduceerd door Leydig-cellen in de testikels, wordt in de prostaatepitheelcellen omgezet in DHT door de 5α-reductase. DHT activeert AR, dat dimeriseert, transloceert naar de kern en bindt aan androgeenrespons-elementen om genen te reguleren die betrokken zijn bij celdifferentiatie en homeostase⁵⁰. Eerdere studies hebben aangetoond dat suppletie van 1 nM in 3D-muis prostaatorganoïden voldoende is om celdifferentiatie te bereiken in luminale cellen⁵¹. Anderen hebben ook aangetoond dat suppletie met vitamine D (specifiek 1,25-dihydroxyvitamine D) de groei van de menselijke prostaatorganoïden bevorderde en de differentiatie versnelde door de canonieke WNT-activiteit te remmen en het WNT-familielid DKK3⁵² te onderdrukken. In deze studies werden echter alleen 3D-organoïden gebruikt. Ons eerdere onderzoek³² en anderen⁵³ toonde aan dat suppletie met 10 nM DHT in 3D-organoïden niet voldoende is om volledige differentiatie te bereiken. Daarentegen is het gebruik van het hier beschreven 2D-model, dat wil zeggen het plaatsen van cellen in 2D met 10 nM DHT, voldoende om het model te differentiëren naar een toestand vergelijkbaar met het native tissue³². Om dit verschil tussen de 3D- en 2D-modellen te begrijpen, zal verder onderzoek nodig zijn, maar het kan worden verklaard door de verschillende mechano-fysische aanwijzingen tussen de systemen of door de aanwezigheid van ECM-bevattende groeifactoren in het 3D-model.

Drie belangrijke epitheelcellen zijn te vinden in volwassen prostaatweefsel: luminale, basale en neuro-endocriene cellen. Hiervan zijn alleen luminale en basale cellen aanwezig in alle tot nu toe gepubliceerde organoïdemodellen. Het ontbreken van de zeldzame neuro-endocriene cellen suggereert dat de huidige organoïde protocollen mogelijk niet volledig geoptimaliseerd zijn. Tussen luminale en basale cellen is een prostaat-intermediaire celpopulatie ook beschreven als een overgangstoestand die zowel luminale (d.w.z. CD24a) als basale (d.w.z. SCA-1) markers^18,51 tot uiting brengt. Deze subpopulatie wordt vaak aangetroffen in de periurethrale prostaatregio, waardoor ze vaak periurethrale luminale cellen⁵⁴ worden genoemd. Hoewel dit in sommige 3D-organoïde systemen onder specifieke differentiatie- of signaalcondities^53,55 is gerapporteerd, zien we geen duidelijke scheiding tussen luminale en intermediaire cellen in ons systeem³². Een mogelijke verklaring is dat we tijdens 3D-organoïdegeneratie geen onderscheid maken tussen verschillende prostaatregio's, en om besmetting met urethrale cellen te voorkomen, verwijderen we het weefsel direct naast de urethrale prostaatverbinding. Daarom zijn organoïdeculturen afkomstig van proximale of urethra-gerelateerde gebieden waarschijnlijk beter in staat om intermediaire cellen te produceren.

De integriteit van barrières wordt beschouwd als een kenmerk van een volwassen en gedifferentieerd epitheel, dat een beschermende barrière biedt tegen toxines en microben die het onderliggende weefsel bereiken. Strakke verbindingen (rijk aan ZO-1-eiwitten⁵⁶) spelen een essentiële rol bij het reguleren van paracellulaire permeabiliteit en het behouden van de integriteit van de epitheliale barrière⁵⁷. Naarmate epitheelcellen differentiëren, versterkt de rijping van deze intercellulaire verbindingen de barrière⁵⁸. Daarom is het beoordelen van barrière-integriteit een belangrijke uitleg voor een in vitro epitheelmodel. In dit protocol tonen we drie complementaire methoden voor het beoordelen van barrière-integriteit: TEER-meting, ZO-1 immunokleuring en F-actine kleuring. Hoewel alle drie de methoden de integriteit van barrières effectief beoordelen, verschillen ze aanzienlijk in de benodigde apparatuur en middelen. TEER-metingen leveren een kwantitatieve waarde die in de tijd kan worden gevolgd, wat dynamisch inzicht geeft in de functie van barrières; Deze techniek vereist echter gespecialiseerde hardware en software die niet in elk laboratorium beschikbaar zijn. Daarentegen is kleuring met anti-ZO-1 antilichamen of falloïde veel beter beheersbaar qua tijd en kosten (bijvoorbeeld falloïdine-kleuring kan in ongeveer 3 uur - sectie 3 worden uitgevoerd).

Dit protocol beschrijft hoe je 3D-muisprostaatorganoïden gebruikt om een apisch toegankelijk 2D-model te genereren. Verschillende reviews hebben de voor- en nadelen van organoïden en organoïde-gebaseerde systemen geschetst bij het bestuderen van gastheer-pathogeen interacties 23,36,59. Bij infectiestudies is het cruciaal om rekening te houden met de natuurlijke plaats van interactie tussen pathogenen en het epitheel van de gasther. In de prostaat zijn luminale cellen doorgaans het eerste contactpunt, en daarom is toegang tot het apicale oppervlak essentieel om de infectiedynamiek nauwkeurig te modelleren. Bij conventionele 3D-prostaatorganoïden is het apicale oppervlak gericht op het organoïde lumen en is het niet direct toegankelijk. In deze kan blootstelling aan pathogeen worden bereikt door micro-injectie, wat laag doorvoer heeft en technisch uitdagend, of door het verstoren van de organoïden, wat de epitheelpolariteit aantast en resulteert in niet-fysiologische interactieplaatsen²³. Daarentegen biedt het apical toegankelijke 2D-model dat in dit protocol wordt gepresenteerd directe toegang tot het luminale oppervlak. Dit maakt gecontroleerde en fysiologisch relevante blootstelling aan pathogenen mogelijk, precieze regulatie van de MOI en compatibiliteit met high-throughput, high-resolution of live-cell imaging platforms. Hier tonen we het gebruik van dit model als een in vitro infectiesysteem met behulp van de UPEC-referentiestam UTI89, een veelgebruikte referentie die de belangrijkste bacteriesoort vertegenwoordigt die verantwoordelijk is voor bacteriële prostatitis⁹. Dit model kan echter gemakkelijk worden aangepast om andere prostaatpathogenen zoals Enterococcus faecalis of Pseudomonas aeruginosa te bestuderen, waardoor het een veelzijdig platform is voor infectiebiologie in de prostaat.

De dissociatie van 3D-organoïden is een cruciale stap voor het succesvol vestigen van het organoïde-gebaseerde model. Het niet volledig dissociëren van de 3D-organoïden, wat resulteert in grote fragmenten, kan de celadhesie aan het kweekoppervlak verstoren, terwijl langdurige blootstelling aan het dissociatiereagens langer dan 30 minuten de levensvatbaarheid van de cel vermindert. Bovendien is het essentieel om een consistent passage-interval van ongeveer zeven dagen vóór dissociatie en zaaien te handhaven, omdat de fysiologische toestand van de organoïden hun vermogen om zich te hechten en te onderscheiden sterk beïnvloedt. Een andere cruciale factor die de succesvolle ontwikkeling van het prostaatorganoïde-gebaseerde model beïnvloedt, is de zaaddichtheid. De zaaiconcentratie die hier werd gebruikt, was geoptimaliseerd voor differentiatie over 7 dagen. Het verhogen of verlagen van deze concentratie zou waarschijnlijk leiden tot verschillende differentiatietijden. Bovendien kan onvoldoende celresuspension vóór het plateren leiden tot een ongelijke verdeling van cellen over putten, wat resulteert in variabele celdichtheden die op hun beurt zowel proliferatie als differentiatie beïnvloeden. Daarnaast kunnen, net als in andere organoïdemodellen, verschillende batches ECM of groeifactoren de groei- en differentiatiecapaciteit beïnvloeden. Daarom is het belangrijk te verifiëren dat het op organoïden gebaseerde model een consistent fenotype behoudt na elke verandering in groeifactor, batch of batchnummer.

Zodra het organoïde-gebaseerde model is vastgesteld, moeten ook de infectieparameters zorgvuldig worden geoptimaliseerd. Verschillende MOI's zijn vaak nodig om robuuste en reproduceerbare infectieniveaus te bereiken, afhankelijk van de bacteriële stam en de gekozen meting. Voor UPEC-stam UTI89 (hier en in³² gebruikt) en voor verschillende prostatitis-isolaten³² was een MOI van 100 voldoende om een betrouwbaar aantal geïnfecteerde cellen te verkrijgen over adhesie-, invasie- en replicatietijden. Als de incubatie van cellen met bacteriën echter langer dan 1 uur moet worden verlengd, moet een lagere MOI worden gebruikt om extracellulaire overgroei van UPEC in het medium en daaropvolgende toxiciteit voor de cellen te voorkomen. In dit protocol werd infectie beoordeeld met twee methoden: I) flowcytometrie om het aandeel geïnfecteerde cellen te kwantificeren, en II) confocale microscopie om bacteriële lokalisatie te evalueren. Er kunnen echter ook verschillende andere benaderingen worden gebruikt, zoals kolonievormende eenheidsassays om bacteriële³² te meten, immunokleuring om gastheer- of bacteriële markers³² te detecteren, of transcriptomische analyses om gastheerresponsen te profileren.

Hoewel het op de prostaatorganoïde gebaseerde model een fysiologisch relevant systeem biedt, moeten er verschillende beperkingen worden meegenomen bij het toepassen ervan op infectieonderzoek. Een belangrijke beperking van dit model is het ontbreken van residentiële of perifere immuuncellen, wat het vermogen beperkt om de gastheerrespons op infectie volledig te vangen (bijvoorbeeld immuuncelrekrutering of immuungemedieerde clearance). Andere essentiële componenten die in het model ontbreken zijn onder andere vasculatuur, stroma en zenuwen, die allemaal invloed kunnen hebben op de interacties tussen gastheer en pathogeen. Het opnemen van extra celtypen, zoals stromale fibroblasten, immuuncellen en endotheelcellen, zou helpen een completer weefselmicro-omgeving te creëren. Geavanceerde co-cultuursystemen of microfluïdische orgaan-op-een-chip-platforms kunnen complexe cellulaire interacties verder ondersteunen en dynamische studies van infecties mogelijk maken. Daarnaast moeten bij het gebruik van organoïden afkomstig van diermodellen soortspecifieke verschillen worden meegewogen, vooral bij het bestuderen van mensspecifieke pathogenen. Hoewel ons eerdere werk³² liet zien dat bevindingen uit het op muis gebaseerde prostaatorganoïde model in menselijk weefsel konden worden gereproduceerd, kunnen intersoortvariaties in genregulatie, receptorexpressie of hormoonresponsen de directe relevantie van het model voor de menselijke fysiologie nog steeds beperken. Het integreren van mens-afgeleide organoïden, waar mogelijk, zou de translatiewaarde vergroten door de studie van mens-specifieke pathogeneninteracties en -responsen mogelijk te maken. Hoewel deze toevoegingen organoïde-gebaseerde modellen als krachtige instrumenten voor het bestuderen van prostaatbiologie, infectiepathogenese en therapeutische ontwikkeling kunnen versterken, biedt het puur epitheelale model dat wij presenteren een vereenvoudigd en gecompartimenteerd systeem. Dit maakt gericht onderzoek mogelijk naar epitheel-specifieke gastheer-pathogeen interacties zonder interferentie door andere weefselcomponenten.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
48 well plates	Sarstedt	83.3923	Bottom shape: flat
5α-Androstan-17β-ol-3-one dihydrotestosterone	Sigma-Aldrich	A8380	It was designated as DHT. Stock solution 10μM in 100% ethanol
8-well PET slide with 40 electrodes per well	Applied Biophysics	8W10E+	Slides used for TEER measurments
96 well plates	Sarstedt	82.1583	Bottom shape: conical
Advance Dulbecco’s modified Eagle medium/F12	Thermo Fisher Scientific	12634028	It was designated adDMEM/F12+/+ when supplemented with 10 mmol L−1 HEPES and 1x GlutaMAX
Ampicilin	Roth	K029.2	Concentration stock 100 mg/mL
Anti-CD24a antibody	Proteintech	10600-1-AP	Primary antibody; dilution 1:100 in 1x PBS 1%BSA
Anti-Cytokeratin 5 Alexa Fluor 647 antibody	Abcam	ab193895	Primary antibody; dilution 1:100 in 1x PBS 1%BSA
anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 488 antibody	Invitrogen	A21441	Secondary antibody; dilution 1:500 in 1x PBS 1%BSA
Anti-ZO-1 Polyclonal antibody	Proteintech	21773-1-AP	Primary antibody; dilution 1:750 in 1x PBS 1%BSA
B27, 50x	Thermo Fisher Scientific	12587010
Bovines Serumalbumin (BSA) Fraktion V, NZ-Origin	Roth	8076.3	Component of blocking buffer used at 1% in 1x PBS
chambered µ-Slide 8 Wells	Ibidi	80806	Surface modification: ibiTreat
Conical tube (15 mL)	Sigma Aldrich	T1943	The flat bottom is better for small pellets.
Disodium ethylenediaminetetra-acetate 2H2O (EDTA)	Roth	8043.2	Homemade: 93.0 g in 400 mL of H2O, adjust pH to 8.0, ajust the volume with H2O up to 500 mL; 0.5 M EDTA; component of flow cytometer buffer
Dulbecco's Balanced Salt Solution (DPBS)	Gibco	14190-144	PBS
ECHO Revolve Microscope	ECHO
ECIS Z-Theta -  impedance-based cell analysis system	Applied Biophysics	ECIS Z-Theta	System includes: 16 and/or 96 well station; external control module; Laptop PC; ECIS control, acquisition, and display software; elevated field module for automated cell migration and electroporation
Fetal Bovine Serum (FBS) Superior	Sigma Aldrich	S0615	Component of Flow cytometer buffer; component of culture medium of 293T Cell Line; component of culture medium HEK293T cell line
Flash Phalloidin Red 594	Biolegend	424203	Dilution 1:250 in 1x PBS 1%BSA
Flow cytometer buffer			1x PBS, 10% FBS, 5 mM EDTA
Gentamicin	Sigma Aldrich	G1272
GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	35050-038	L-alanyl-L-glutamine dipeptide, component of adDMEM/F12+/+
Harvard Biochrom Ultrospec 10 Cell Density Meter	Fisher Scientific	10704417
HCS CellMask Deep Red stain	Life Technologies	H32721	Dilution 1:1,000 in 1x PBS 1%BSA
HEK293T cell line transfected with mouse Noggin-Fc expression vector	Cell line from Prof. Dr. Clevers		Used to produce Noggin; culture medium: 500ml DMEM, high glucose, GlutaMAX, pyruvate (Gibco Life Technologies, 31966)+ 50ml FBS; Farin et al. Gastroenterology 143.6 (2012): 1518-1529
HEPES	Thermo Fisher Scientific	15630056	Component of adDMEM/F12+/+
Hoechst 33342	Life Technologies	H3570	Dilution 1:5,000 in 1x PBS
Human epidermal growth factor (EGF)	Peprotech	AF-100-15	Concentration stock 500 µg/mL
Inoculation loops	Sarstedt	86.1567.010
Inoculation tubes	Sarstedt	62.515.006
Leica Stellaris 5 confocal microscope	Leica
Luria Bertani Broth (LB broth)	Roth	X968.1
Matrigel	Corning	356231	Extracellular Matrix (ECM)
N-Acetylcysteine	Sigma-Aldrich	A9165-25G	Concentration stock 500 mM
Noggin CM
NovoCyte Quanteon	Agilent		Flow Cytometer
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma Aldrich	P6148	used at 4% in 1x PBS, 4% sucrose
Primocin	Invivogen	Ant-pm-1
Q-VETTES semi-micro	Ratiolab	2712120
RHOKi (Y-27632)	AbMole	M1817	RhoA/ROCK inhibitor; Concentration stock 10 mM
R-spodin1 CM
R-Spondin1 expressing 293T Cell Line	Sigma Aldrich	SCC111	Used to produce R-spo1 CM; culture medium: 500ml DMEM, high glucose, GlutaMAX, pyruvate (Gibco Life Technologies, 31966)+ 60ml FBS
TGFβi (A-83-01)	Tocris	2939	ALK4/5/7 inhibitor; Concentration stock 5 mM
Triton X-100	Sigma Aldrich	T9284	used 0.5% diluted in PBS 1x
TrypLE Express Enzyme	Gibco	12605028	Enzymatic cell dissociation agent to digest 3D mouse prostate organoids
Uropathogenic Escherichia coli strain UTI