Gestandaardiseerde isolatie en cytokine-priming van mesenchymale stromale cellen afkomstig van muisbeenmerg voor verbeterde immunomodulatie

Samenvatting

Hier demonstreren we een protocol voor het isoleren van mesenchymale stromale cellen uit muisbeenmerg, samen met een cytokine-primingmethode om het immunosuppressieve effect van de BMSC's op immuuncellen te versterken.

Samenvatting

Mesenchymale stromale cellen (MSC's) hebben een sterke regeneratieve en immunomodulerende functie. Deze eigenschappen maken MSC's krachtige cellulaire geneesmiddelen voor de behandeling van meerdere immuunstoornissen. Beenmerg is de primaire en meest gebruikte bron van MSC's. Preklinische mechanistische studies met muismodellen zijn cruciaal om kennis te verkrijgen van de optimale toedieningsstrategieën voor BMSC in klinische studies bij mensen. Daarom is standaardisatie van het productieproces van de muis-MSC's ook cruciaal voor betere therapeutische resultaten. Een centraal doel van dit protocol is om aan te tonen hoe gecontroleerde interferon-gamma (IFN-γ) priming de intrinsieke immunosuppressieve eigenschappen van BMSC's versterkt. We beschrijven de generatie van geconditioneerde media (CM) uit onbehandelde of IFN-γ-pre-gelicentieerde BMSC's en evalueren hun biologische activiteit met behulp van primaire peritoneale macrofagen. Via ELISA en flowcytometrische profilering beschrijft het protocol hoe BMSC-afgeleid secretoom – vooral wanneer het IFN-γ-geprimeerd is – anti-inflammatoire macrofagenpolarisatie aanstuurt, gekenmerkt door verhoogde IL-10-productie en M2-geassocieerde oppervlaktemarkers. Over het geheel genomen stelt dit protocol een uniform kader vast voor het produceren van functioneel consistente muis-BMSC's en voor het beoordelen van hun immunomodulerende potentie. Door technische variabiliteit te verminderen en visuele en procedurele helderheid te bieden, ondersteunt het verbeterde reproduceerbaarheid in preklinisch MSC-onderzoek en faciliteert het geoptimaliseerde MSC-implementatiestrategieën voor translationele studies.

Inleiding

Mesenchymale stromale cellen (BMSC's) afkomstig van het beenmerg hebben brede toepassingen in zowel preklinische als klinische studies. Hun lage immunogeniciteit, gemakkelijke toegankelijkheid en multilineage-differentiatiecapaciteit maken BMSC's veelbelovende kandidaten voor gebruik in klinische omgevingen als cellulaire farmaceutica ^1,2,3. Hun immunosuppressieve en regeneratieve eigenschappen zijn uitgebreid benut in klinische studies om ontstekingsaandoeningen te behandelen zoals graft-versus-host ziekte (GVHD)⁴, sepsis⁵ en inflammatoire darmziekte (IBD)⁶. De beenmergstromale niche bestaat uit een heterogene stromale celpopulatie. Desalniettemin voldoen alle MSC's aan de criteria die zijn gedefinieerd door de International Society for Cellular Therapy (ISCT), waaronder: plastische hechting, expressie van oppervlaktereceptoren -- CD73, CD90 en CD105 bij mensen, en CD29, CD44 en CD90 bij muizen -- zonder de expressie van hematopoëtische of endotheelmarkers - CD11b, CD14, CD19, CD34, CD45, CD79a, HLA-DR, en de capaciteit voor adipogeen chondrogene, of osteogene differentiatie⁷.

BMSC's blijven functioneel door de afgifte van paracriene factoren, gezamenlijk bekend als het secretoom, waaronder cytokinen, chemokinen, groeifactoren, extracellulaire blaasjes en diverse andere oplosbare en contactafhankelijke moleculen ^8,9. Het secretoom van de MSC's moduleert de niche door op bidirectionele wijze te interageren met elementen van het aangeboren immuunsysteem¹⁰. Factoren die vrijkomen tijdens MSC's-macrofagen interacties kunnen macrofagen verschuiven naar een pro-inflammatoire of anti-inflammatoire fenotype^11,12. Omgekeerd wordt de functionele toestand van MSC's ook gereguleerd door lokale immuuncellen – met name macrofagen – via feedbackmechanismen¹¹. Deze MSC-macrofagen crosstalk is onmisbaar voor de immunosuppressieve werking van MSC's. Adoptief overgedragen MSC's verminderen alleen weefselontsteking wanneer macrofagen aanwezig zijn, zoals waargenomen in colitis muismodellen. Daarentegen is de interactie van MSC's met B- of T-lymfocyten zonder macrofagen onvoldoende om hun therapeutische effect uit te oefenen¹³.

De eerste fase III klinische proef met allogene BMSC's werd afgerond door Osiris Therapeutics in de Verenigde Staten voor de behandeling van steroïde-refractaire GVHD (NCT00366145)¹. Sindsdien zijn talrijke preklinische en klinische studies uitgevoerd, hoewel het succes van klinische onderzoeken niet aan de verwachtingen op basis van preklinische uitkomsten heeft voldaan. Om het slagingspercentage van MSC-gebaseerde klinische onderzoeken te verbeteren, is optimalisatie van geneesmiddeluitrolstrategieën essentieel. Het begrijpen van de optimale toedieningsroute, therapeutische celdosis en fysiologische toestand van de cellen op het punt van zorg is cruciaal. Zo hebben studies in een in vivo colitis muismodel aangetoond dat cryopgeconserveerde MSC's of intraveneuze toediening suboptimale toedieningsmethoden zijn¹⁴.

Verschillende benaderingen, zoals cytokinepre-licentie, genetische modificatie of hypoxische preconditionering, zijn uitgebreid bestudeerd om de persistentie en therapeutische bruikbaarheid van MSC's in vivo te verbeteren¹⁵. In het muisachtige-achterpoot-ischemiemodel verbeterde hypoxie-preconditionering (2%_O2) de proliferatie- en migratiecapaciteit van MSC's door verhoogde expressie van het warmteshockeiwit, 78-kD glucose-gereguleerd eiwit (GRP78)¹⁶. IL-1β (Interleukine-1 beta) voorafgaande licentie vergroot het vermogen van MSC's om neutrofielen, monocyten, lymfocyten en eosinofielen te gebruiken¹⁷. Na in-vivo levering worden MSC's blootgesteld aan geactiveerde T- en NK-cellen afgeleid van IFNγ, wat de productie van indolamine 2,3-dioxygenase (IDO) door MSCs¹⁸ verhoogt. IDO is een essentieel onderdeel van het secretoom van MSC's, wat de proliferatiesnelheid van T-cellen vermindert. Interessant genoeg is de immunosuppressieve capaciteit van MSC's verminderd wanneer ze worden gecocultiveerd met IFNγ-/- muizenafgeleide T-lymfocyten¹⁹. Uit studies is gebleken dat IFN-γ pre-licenties het percentage T-celgemedieerde apoptose in cryoppreserve MSC's^{verlaagt: 13,20}. IFNγ-priming verbetert het therapeutische resultaat van BMSC's¹³. Al dit bewijs wijst gezamenlijk op de onmisbare rol van IFNγ bij de productie van krachtigere immunosuppressieve MSC's.

Om de meest effectieve toedieningsmodaliteit van MSC's te bepalen, zijn diermodellen veel gebruikt vanwege hun ethische toegankelijkheid. Om variabiliteit in preklinische uitkomsten te verminderen, is het cruciaal een geoptimaliseerde methode voor het productieproces van de MSC's vast te stellen die zorgt voor een hoge opbrengst, cellevensvatbaarheid en consistentie over tijd²¹. Het passeren van MSC's is een belangrijke variabele die verschillende therapeutische uitkomsten kan opleveren. Tijdens in vitro kweek kan passaging de karakterisering en potentie van MSC's reguleren, en na een bepaald aantal passages worden de cellen senescent²². Daarom is het in elke klinische of preklinische studie cruciaal om consistent te zijn met het gebruik van het MSC-passnummer. Evenzo is consistentie met een specifiek protocol voor isolatie van MSC's ook een belangrijke factor voor het bereiken van reproduceerbaarheid in het resultaat van MSC-gebruik. Onder de vele benaderingen zijn antistofgebaseerde celsortering²³, negatieve selectiemethode²⁴, enzymatische vertering²⁵ populaire methoden voor MSC-isolatie. De toepasbaarheid van deze methoden hangt echter af van de bron, omdat onjuist gebruik de opbrengst, potentie en de differentiatiecapaciteit van trilineage vermindert.

Hier presenteren we een gestandaardiseerd protocol voor de isolatie en karakterisering van BMSC's, met nadruk op het voorkeursaantal passages, cryopreservatietechniek en BMSC-afgeleide conditiemediaverzameling. We bieden ook een protocol voor IFN-γ-gemedieerde MSC-priming en tonen tot slot een vergelijkende studie aan naar hoe peritoneale macrofagen verschillend reageren op normale of IFN-γ pre-gelicentieerde BMSC's.

Protocol

De huidige studie werd uitgevoerd met goedkeuring en volgens de richtlijnen van de ethische commissie voor dieren van het ICMR-National Institute for Research in Reproductive and Child Health (IAEC Project No.09/23) en de University of Wisconsin-Madison Institutional Animal Care and Use Committee. Vrouwelijke C57Bl/6J-muizen van 6-8 weken, gefokt en gehuisvest onder specifieke ziekteverwekkervrije (SPF) omstandigheden, werden gebruikt voor het huidige onderzoek.

OPMERKING: We hebben de bioveiligheidsprotocollen gevolgd die zijn vastgesteld door het Institutional Biosafety Committee (IBSC) tijdens het werk aan de in vivo - of in vitro-studies . Kort gezegd, voor dieronderzoek hielden we voorzichtig omgaan om stress en risico op letsel te verminderen. We gebruikten geschikte PBM, zoals veiligheidsbrillen, handschoenen, een laboratoriumjas, een mondkapje en een wegwerpmuts. Voor biohazard chemische reagentia zoals DMSO gebruikten we een bioveiligheidskast om de chemicaliën te verwerken. We gebruikten de specifieke afvalcontainer om biohazard-reagentia of scherpe voorwerpen weg te gooien.

1. Isolatie van mesenchymale stromale stromale cellen van het muisbeenmerg

OPMERKING: Na het verzamelen van de achterpoot moeten de resterende stappen worden uitgevoerd in een weefselkweek laminaire flowkap, en steriele aseptische technieken²⁶.

1. Euthanaser de muis door een cervicale dislocatie, gevolgd door grondig spoelen met 70% ethanol. Gebruik een oogpincet om voorzichtig de buikhuid tussen de twee heupgewrichten van de muis te knippen en de huid voorzichtig met een schaar te snijden.
2. Scheid de huid door voorzichtig naar de voet toe te trekken. Snijd de heupgewrichten en enkel af om beide achterpoten vrij te maken.
3. Breng snel de achterpoten over in ijskoude DMEM, aangevuld met 1x penicilline/streptomycine en 2% FBS om weefselschade te voorkomen tot het verdere dissectieproces.
4. Neem elk achterbeen in een petrischaaltje met het ijskoude medium. Haal voorzichtig de spier en het bindweefsel van het dijbeen en het scheenbeen af door voorzichtig de diafyse van het bot te schrapen. Overbreng het gereinigde bot in een nieuwe Petrischaal met het ijskoude medium.
5. Maak het dijbeen en het scheenbeen los, en maak vervolgens een snee aan de uiteinden van het scheenbeen en het dijbeen net onder het uiteinde van het beenmergholte. Bescherm de beenmergholte maximaal tijdens de dissectie van het dijbeen en scheenbeen.
6. Neem een 1 ml steriele spuit met een 21 G naald en haal het medium uit de petriplaat. Met een steriele pincet houdt u het verwijderde dijbeen vast en steekt u de naald voorzichtig in de mergholte. Spoel de beenmergholte door om het beenmerg te verwijderen. Herhaal deze stap totdat het bot wit is. Spoel het scheenbeen op dezelfde manier door.
7. Pipetteer voorzichtig in en uit om de celklonten in de Petrischaal te verspreiden. Gebruik een 70 mm filtergaas om de celsuspensie te filteren om botdeeltjes te verwijderen. Verzamel het filtraat en centrifugeer het op 230 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
8. Verwijder het supernatant en suspendeer de pellet opnieuw met volledig medium (DMEM, 10% FBS, 5% L-Glutamine, penicilline en Streptomycine). Meet de opbrengst en levensvatbaarheid van cellen met Trypan blue exclusion en tellen op een hemocytometer.
9. Zaad de cellen in een 75 cm² gekweekte kolf met een celdichtheid van 5000 cellen/^cm2 in complete DMEM-medium¹³. Verwijder niet-hechtende hematopoëtische cellen na 48 uur kweek door het medium te veranderen. Vervang het medium om de 3-4 dagen door nieuw media.
   OPMERKING: Gebruik een celkweekfles in plaats van een schotel om besmetting te voorkomen. Haal de fles niet vaak uit de couveuse om de cellen te controleren, omdat dit de celgroei verstoort.
10. Om de hechtende cellen los te maken, was je ze één keer met PBS, voeg 0,25% trypsine-EDTA toe, houd je de cellen 5 minuten in trypsine. Dit helpt om de cellen van de put los te maken.
11. Voeg volledig medium toe, sussieer opnieuw en centrifugeer op 230 x g gedurende 5 minuten op kamertemperatuur. Gooi het supernatant weg. Voeg complete DMEM-media toe aan de pellet, suspensie opnieuw en zaai de cellen met een dichtheid van 5.000 cellen/cm^².
12. Doorlaat de cellen wekelijks door het medium elke 3-4 dagen te vervangen. Na de derde passage test je de kweek van de MSC met flowcytometrische analyse zoals beschreven in stap 6. Gebruik passage 3-5 cellen voor elk experiment.
    OPMERKING: Om de cellen te cryoppreserve voor toekomstig experimenteel gebruik, centrifugeer je de cellen op het gewenste volume, suspendeer je de cellen opnieuw in vriesmedium, bewaar je 1 x 10 à⁶ cellen in 1 mL vriesmedium in elke cryoviaal bij -80 °C 's nachts, en vervolgens wordt de cellen overgebracht in stikstof voor langdurig gebruik.
    Samenstelling van vriesmedia: 70% DMEM, 20% FBS, 10% DMSO.

2. Bereiding van geconditioneerd medium uit gekweekte MSC's

1. Zaad de cellen met een dichtheid van 5000 cellen/cm^² in 6 putplaten. Kweek MSC's tot 80% confluent.
2. Verzamel het geconditioneerde medium van de celkweekplaat en centrifugeer op 230 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur, filter en gebruik voor behandeling.

3. Bereiding van IFNγ geprimeerd geconditioneerd medium uit gekweekte MSC's

1. Zaad de cellen in 6 putplaten met een dichtheid van 5000 cellen/cm^². Behandel de cellen met 25 ng/mL IFNγ gedurende 48 uur. Voer een dosisafhankelijke studie uit om het optimale effect van IFNγ op MSC's te verkrijgen. Voor dit experiment selecteer je een bereik van IFNγ-concentraties, 5, 10, 25, 50, 100 ng/mL, om MSC's vooraf te licentiëren. De concentraties van 5 en 10 ng/mL waren significant minder effectief bij macrofagenpolarisatie, en 25 ng/mL werd geïdentificeerd als de optimale concentratie (aanvullende figuur 1).
2. Na het dekanteren van het met IFN-γ bevattende medium spoel je de put 2x met PBS om volledige verwijdering van IFN-γ te garanderen. Eventuele resterende IFN-γ kan de uitkomst van de studie beïnvloeden.
3. Incubeer de cellen nog eens 24 uur in normaal DMEM-medium bij 37 °C. Na 24 uur verzamel je het geconditioneerde medium volgens stap 2.

4. Isolatie en kweek van peritoneale holte-afgeleide macrofagen

1. Injecteer 5 ml ijskoude PBS (met 3% FBS) in de buikholte van muizen, gevolgd door een zachte massage van de buik.
2. Haal de PBS-oplossing terug met een steriele spuit. Verzamel in een 10 mL buis. Centrifugeer de oplossing op 300 x g gedurende 5 minuten.
3. Verwijder het supernatant. Los de pellet op in volledig RPMI-medium (RPMI, 10% FBS, 1x penicilline en streptomycine). Plat de cellen op 5000 cellen/cm².
4. Verwijder niet-hechtende cellen na 24 uur en kweek tot de samenvloeiing. Gebruik cellen voor verdere experimentele procedures indien nodig.

5. Enzym-gekoppelde immunosorbent-assay

1. Voor het detecteren van IL-10 afkomstig van met BMSCs-CM behandelde macrofagen, volgt u de onderstaande stappen.
   1. Behandel de macrofagen 24 uur met BMSCS-CM en verzamel de supernatant de volgende dag.
   2. Meet de hoeveelheid IL-10 met de IL-10 ELISA-kit volgens de instructies van de fabrikant.
2. Voor het detecteren van CCL2 afkomstig van BMSC's of IFNγ-behandelde BMSC's, gebruik de CCL2 ELISA-kit volgens de instructies van de fabrikant.

6. Flowcytometrie-analyse voor MSC's en macrofagenotypering

1. Zaad de cellen in een platen met 6 putten en maak het samenvloeiend. Was één keer met PBS (1 mL) gevolgd door trypsinisatie. Voeg trypsine toe bij 0,25% en incubeer 5 minuten in trypsine om de cellen volledig van het bord te halen.
2. Voeg media toe om de trypsine-activiteit te deactiveren. Verzamel de cellen in een 10 mL polystyreen buis. Centrifugeer op 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C voor macrofagen en 230 x g voor 5 minuten bij 4 °C voor BMSC's.
3. Verwijder het supernatant en suspendeer de cellen opnieuw in 2 mL kleurbuffer (ijskoude PBS met 2% FBS en 0,05% azide). Draai op 230 x g gedurende 7 minuten. Dekanteer en verstoor de pellet. Voeg 1 ml Ghost red 780 viability-kleurstof toe en 50 ml FACS-buffer, suspendeer het opnieuw en plaats het in de flowtube. Kleur in het donker gedurende 30 minuten.
4. Na 30 minuten was je de cellen met 1 ml kleurmiddel. Dekanteer en verstoor de pellet. Voeg het gewenste volume antilichaam of isotypecontrole toe. Nog eens 30 minuten in het donker incuberen. Was de cellen met een kleurbuffer, decant en sus opnieuw in 400 ml kleurbuffer. Monsterbuis is klaar voor afname.
5. Om een bestrijding van levend dode kleuring voor te bereiden, los je na trypsinisatie en centrifugatie de pellet op in 2 mL kleuringsbuffer. Haal 1 ml uit een andere microcentrifugebuis en voeg hieraan 10 ml DMSO toe om de cellen te doden. Vortex en 10 minuten incuberen. Meng dit nu met de andere 1 ml van de celhoudende oplossing in een stroombuis.
6. Voeg 1 ml kleuringsbuffer toe en draai op 230 x g gedurende 7 minuten. Dekanteer en verstoor de pellet. Voeg 1 ml Ghost red 780 viability-kleurstof toe en 50 ml FACS-buffer, suspendeer het opnieuw en plaats het in de flowtube. Kleur in het donker gedurende 30 minuten. Na 30 minuten was je de cellen met 1 ml kleurmiddel. Dekanteer en verstoor de pellet. Suspendeer het opnieuw in 400 mL beitsbuffer. Het met levend dode bevlekte monster is klaar voor afname.
   OPMERKING: Voor het kleuren van muizenmacrofagen moet een extra kleuringsstap worden toegevoegd vóór het standaard kleuringsprotocol. Om onnauwkeurigheid in stroomgegevens te voorkomen, is het blokkeren van de FC-receptor een cruciale stap, die voorkomt dat niet-specifieke antistoffen binden aan Fc-receptoren op cellen. Om de Fc-receptor te blokkeren, voeg je 1 mL Fc-blokkerend reagens (gezuiverd anti-muis CD16/CD32-antilichaam) toe aan de celsuspensie en incubeer je 15 minuten bij kamertemperatuur. Voer de resterende stromende antistofkleuringsstappen uit zonder het Fc-blokkerende reagens af te wassen.
7. Om de stroomgegevens te analyseren, moeten aanvankelijk enkele cellen worden geselecteerd op basis van de voorverbreedde en zijverstrooide parameters. Deze stap is cruciaal om puin en celaggregaten te verwijderen. Daarna worden de afzonderlijke cellen afgesloten op basis van levende-dode kleuring. Voer verdere analyses uit op basis van de levende celpopulatie (Aanvullende Figuur 2).

Resultaten

Het algemene experimentele schema wordt beschreven in Figuur 1. Muizenbeenmerg werd verzameld van zowel dijbeen als scheenbeen, zaad, doorgezaaid en flowcytometrie gekarakteriseerd (Figuur 1A). BMSC's conditiemedia (BMSCS-CM) met of zonder IFNγ pre-licentie werden verzameld, en enkele flesjes BMSCS-CM werden opgeslagen bij -80 °C voor toekomstige experimentele behoeften (Figuur 1B).

Cellen afkomstig van het beenmerg werden geteld met een hemocytometer (Figuur 2A) en gezaaid met een dichtheid van 5000 cellen/cm^² in volledige DMEM-media. Na 48 uur werd het eerste medium veranderd, daarna werd het medium elke 3/4 dagen verwisseld, tot volledige confluentie. We hebben de cellen doorgelaten toen ze 80% confluentie bereikten (Figuur 2B). In passage 4 karakteriseerden we cellen op basis van MSC-specifieke markerexpressie. De cellen waren positief op CD44, CD29 en CD90, en negatief op CD45, CD11b en CD34 (Figuur 2C). BMSC's kunnen differentiëren in adipogene, osteogene en chondrogene lijnen 14,27,28,29. Dit handhaaft de identiteitsrichtlijnen van de International Society for Cellular Therapy.

Om het immunosuppressieve effect van MSCs-CM te begrijpen, behandelden we peritoneale holte-afgeleide macrofagen (PMφ) en behandelden deze met BMSCS-CM (Figuur 3A). We voerden flowcytometrie-analyse uit van BMSC's—CM-behandelde macrofagen (Figuur 3B,C). Peritoneale holte-residente cultuur-aangepaste macrofagen werden gekleurd met M1- en M2-specifieke oppervlaktemarkers. We voorkwamen niet-specifieke antistofbinding door macrofagen te incuberen met gezuiverde anti-muis CD32/CD16 (Mouse Fc Block voordat kleuringsantilichamen werden toegevoegd), voordat de cellulaire markers daadwerkelijk werden gekleurd. De expressie van de M1-specifieke markers, CD86 en iNOS, en M2-specifieke markers, CD206 en CD163, werd bestudeerd. Cellen werden eerst gegated op basis van de hematopoëtische marker CD45.2 (voor C57BL6). IL-10 is het kenmerkende cytokine van het M2-fenotype. IL-10 die vrijgegeven werd door MSC's met CM behandelde macrofagen werd gemeten met een ELISA-studie (Figuur 3D). Omdat LPS/IFNg M1-polarisatie³⁰ induceert, diende deze behandeling als negatieve controle.

CCL2 is een van de kenmerkende cytokines die in het secretoom van MSC's zijn geïdentificeerd, wat macrofagepolarisatie¹³ veroorzaakt. CCL2 die door MSC's werd vrijgegeven, werd gedetecteerd door ELISA (Figuur 3E). Om de rol van CCL2 in macrofagenpolarisatie te bevestigen, behandelden we macrofagen vooraf met een CCR2-remmer gevolgd door MSC-CM-behandeling (Figuur 3F), en macrofagenpolarisatie werd opnieuw gedetecteerd door een IL-10 ELISA-studie (Figuur 3F).

Onze resultaten tonen duidelijk aan dat het secretoom van de MSC's anti-inflammatoire macrofagenpolarisatie kan induceren, zoals blijkt uit een verhoogde IL-10-productie in darmafgeleide macrofagen na behandeling met geconditioneerde media (Figuur 3).

Figuur 1: Studiestroomdiagram. (A) C57BL/6 muizen werden geëuthanaseerd. Het merg werd uit zowel het dijbeen als het scheenbeen gespoeld, een week gecentrifugeerd en gekweekt, waarbij de media elke 3 dagen werd vervangen. MSC's werden doorgegeven en bij passage 4 gekenmerkt door flowcytometrie en adipogenese. (B) MSC's van passage 4 werden ingezaaid in 6-well platen, in één set met IFNγ toegevoegd bij een concentratie van 25 ng/mL, en in een andere set onbehandeld gelaten. Na 48 uur vervang je het door normale, verse complete DMEM-media. Na 24 uur verzamel je het medium van de plaat, centrifuge en filter. Bewaar het conditiemedium bij -80 °C voor toekomstig gebruik. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Fenotypische karakterisering. (A) Cellen afkomstig van beenmerg werden met een hemocytometer geteld vóór het zaaien. (B) Cellen mochten groeien tot 80% confluentie vóór elke passage. (C) Passage 4-cellen werden gekarakteriseerd door flowcytometrieanalyse met muis MSC-specifieke markers. De schaalbalk geeft 100 mM aan. Figuur 2C is aangepast van¹⁴. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: BM-MSC secretomanalyse. (A) Schema van experimenten. (B) Representatieve plot voor flowcytometrische analyse van MSC-CM-behandelde PMφ. Peritoneale afgeleide cellen werden gegated op basis van de hematopoëtische markers van de CD45.2-positieve populatie. De geselecteerde populatie werd verder gekleurd door M1-specifieke markers CD86 of iNOS, M2-specifieke markers CD206 of CD163, samen met CD11b dubbele kleuring in elk geval. (C) Het percentage van de M1- of M2-populatie van cellen werd gekwantificeerd. Een celpopulatie behandeld met LPS/IFNγ diende als negatieve controle. (D) ELISA werd uitgevoerd om IL-10 te kwantificeren die vrijgegeven is door MSC-CM-treatedPMφ. ELISA werd uitgevoerd om (E) CCL2 te kwantificeren die door MSC-CM werd vrijgegeven, (F) IL-10 die door PMφ werd vrijgegeven. Zoals aangegeven in de figuur werd één reeks experimenten uitgevoerd in aanwezigheid van een CCR2-antagonist. Foutbalken geven het gemiddelde ± SEM aan. Data representatief voor 3 onafhankelijke experimenten met 3 MSC-steekproeven per groep. De t-test van de leerling werd gebruikt om statistische analyses van alle experimenten uit te voeren. ∗p < 0,05, ∗∗p < 0,01, ∗∗∗p < 0,001, ∗∗∗∗p < 0,0001. Figuur 3B-F is aangepast van¹³. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende Figuur 1: BMSC's waren vooraf gelicentieerd met 0, 5, 10, 25, 50, 100 ng/mL IFNg. Macrofagen werden behandeld met IFNγ pre-gelicentieerde MSCs-CM. ELISA werd uitgevoerd om IL-10 te kwantificeren dat vrijkwam door door MSC-CM behandelde PMφ. Foutbalken geven het gemiddelde ± SEM aan. Data representatief voor 3 onafhankelijke experimenten met 3 MSC-steekproeven per groep. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Figuur 2: (A-C) Individuele cellen werden geselecteerd op basis van de voorover verstrooide en zijdelingse verstrooiingsparameters. (D) Enkele cellen werden afgesloten op basis van levend-dode kleuring. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

De isolatie van mesenchymale stromale cellen afkomstig uit muisbeenmerg is een cruciale techniek om de intrinsieke immunosuppressieve en regeneratieve eigenschappen van MSC's in in vivo diermodellen te begrijpen. Hoewel de methode eenvoudig en eenvoudig te volgen lijkt, moeten verschillende stappen met precisie worden uitgevoerd om bacteriële besmetting te voorkomen en een optimale cellulaire opbrengst te garanderen. Elke stap van de procedure moet aseptisch worden uitgevoerd in een ultra-schone omgeving.

Om een lage celopbrengst te voorkomen, selecteer muizen in de leeftijdsgroep van 6-8 weken. Bij het knippen van de uiteinden van het dijbeen en het scheenbeen moet de beenholte zo goed mogelijk worden beschermd en moet het spoelproces stevig maar zacht zijn om volledige beenmergextractie te garanderen. De geïsoleerde cellen moeten worden geïncubeerd onder een geschikte CO₂-concentratie en onder bevochtigde omstandigheden. Tijdens het wisselen van medium is het essentieel om de cellen voorzichtig te wassen met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) voordat het medium wordt vervangen om besmettende hematopoëtische cellen te elimineren. Om hematopoëtische celbesmetting te voorkomen, mag trypsinisatie bij het herpasseren niet langer dan 5 minuten duren. In het begin mag de mediawisseling niet te snel zijn, omdat frequente mediawisseling bacteriële besmetting kan veroorzaken.

Bij elke passage is het noodzakelijk om de cellen in meerdere batches te cryoppreserve om consistentie en beschikbaarheid te behouden. Voor IFN-γ priming moet een dosisafhankelijk experiment worden uitgevoerd om de meest effectieve pre-licentievoorwaarden voor de MSC-geconditioneerde media te bepalen. In onze experimenten testten we een reeks IFNγ-concentraties, namelijk 5, 10, 25, 50, 100 ng/mL, om MSC's vooraf te laten vergunningen. Vervolgens werd 25 ng/mL als optimale concentratie vastgesteld.

Om de integriteit van de data te behouden, moeten cellen uit een specifiek doorgangsnummer consequent worden gebruikt voor alle experimentele assays. Voor flowcytometrische karakterisering van MSC's moeten cellen uit passage 3 of hoger worden gebruikt om betrouwbare detectie van oppervlaktereceptorexpressie te waarborgen. Levende/dode cel-discriminatie tijdens flowcytometriekleuring is essentieel, omdat dit de kans op vals-negatieve resultaten verkleint.

De resultaten vormen een belangrijk mechanisme waardoor exogeen toegediende BMSC's darmontsteking tijdens colitis verminderen. IFN-γ priming versterkt het effect van MSC-geconditioneerde media op macrofagenpolarisatie. CCL2 die vrijkomt uit BMSC's is een cruciale chemokine die op macrofagen werkt om M2-polarisatie te induceren. Onze eerdere bevindingen toonden aan dat CCL2- en CXCL12-chemokines samen macrofagen bewerken om hun polarisatie te bevorderen. Dit evenement is essentieel voor het voortplanten van ontstekingsremmende signalering door latere modulatie van T-cel- en B-celfenotypes¹³.

In onze studie volgden we specifiek een eenvoudig protocol voor isolatie van BMSC's, gebaseerd op de plastische hechtende eigenschap van MSC's. Flowcytometrie-sortering of immunomagnetische sortering kan worden gebruikt om BMSC's te isoleren op basis van MSC-specifieke oppervlaktemarkers. Bij beide methoden is er echter een kans dat er veel cellen verloren gaan tijdens de monstervoorbereiding. Omdat het muisbeenmerg een zeer laag aantal MSC's bevat (naar schatting ongeveer 0,001% tot 0,08% van de beenmergcellen), gaven wij de voorkeur aan de standaard isolatiemethode op basis van plastische hechtende eigenschappen. Deze methode heeft echter een paar nadelen. Het grootste risico is hematopoëtische celbesmetting, wat de therapeutische capaciteit van MSC's kan verminderen. Daarom is het identificeren van een specifiek passagenummer cruciaal, wanneer een significante populatie cellen MSC-specifieke oppervlaktereceptoren uitdrukt.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Celcultuurkap met verticale laminaire stroom, uitgerust met UV-licht
Steriele chirurgische schaar
25/75-cm2 flacon
5/10-mL spuiten met 27G naalden
6-wells cultuurschalen
Accutase	Corning	#AT104
Anti-Muis F4/80 APC	Biolegend	#123116
Anti-Muis CD 11b PE	BD PharMingen	#557397
Anti-Muis CD 45.2 APC	BD PharMingen	#558702
Anti-Muis CD163 Percp eFluor710	eBioscience	#46-1631-80
Anti-Muis CD206 PE	Biolegend	#141706
Anti-Muis CD86 FITC	BD PharMingen	#553691
Anti-Muis iNOS PE-Cy7	eBioscience	#25-5920-80
CCL2 ELISA kit	Invitrogen	#554722
CCR2 antagonist (RS 102895)	Sigma	#R1903
Centrifuge
DPBS	Corning	#21-031-CV
Dulbecco's gemodificeerd arendsmedium (DMEM)	Corning	# 10-013-CV
Fetaal bovien serum	Sigma	#F8067
Filter gaas (70 mm)
Ghost red 780 levensvatbaarheidskleurstof	Tonbo bioscience	#13-0865-T100
IL-10 ELISA Kit	Invitrogen	#88-7105-88
L-Glutamine	Corning	#25-005-CI
Microscoop met fasecontrastuitrusting
Muis IFNγ	R&D systems	#485-MI-100
Penicilline-streptomycine	Corning	#30-002-CI
Rat anti-muis CD16/CD32	BD PharMingen	#553142
RPMImedium	Corning	#10-040-CV
Steriele chirurgische tang (recht en gebogen)
Temperatuur- en gassamenstellingsgecontroleerde incubator
Trypsine	Corning	#25052-cl
Waterbad met temperatuurregeling