Methodenartikel

Een computationele pijplijn voor intergene/intragene enhancer RNA-kwantificering in embryonale stamcellen van muizen

DOI:

10.3791/69400

⸱

28 oktober 2025

 ,  , 
1Department of Convergent Bioscience and Informatics, and Graduate School of Biological Sciences, Chungnam National University (CNU)

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol biedt een gestroomlijnde computationele pijplijn voor het kwantificeren van ontluikende enhancer-transcripties. Door de toegankelijkheid van chromatine, de chromatinefunctie en transcriptiegegevens te integreren, maakt het nauwkeurige detectie en strengspecifieke analyse van de enhancer-activiteit in complexe intragene regio's mogelijk, terwijl het toegankelijk blijft voor onderzoekers zonder uitgebreide bio-informaticatraining.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kern-cis-regulerende elementen, bekend als enhancers, spelen een centrale rol bij het mogelijk maken van nauwkeurige transcriptieregulatie van doelgenen die diverse cellulaire functies en ontwikkelingsprocessen aansturen. Deze enhancers worden vaak in beide richtingen getranscribeerd, waardoor lange niet-coderende transcripten worden geproduceerd die enhancer-RNA's (eRNA's) worden genoemd. De expressie van eRNA's is nauw verbonden met actieve chromatinekenmerken, zoals H3K27ac en co-activatorrekrutering, en draagt functioneel bij aan de transcriptionele activering van doelgenen. Desalniettemin blijft de detectie en kwantificering van eRNA's een uitdaging, vooral wanneer ze overlappen met transcriptie van gastheergen. Om dit aan te pakken, presenteren we een gestandaardiseerde, gebruiksvriendelijke computationele workflow voor het analyseren van enhancertranscriptie van ontluikende RNA-sequencinggegevens. Het protocol leidt gebruikers door gegevensvoorverwerking, leesmapping en kwaliteitscontrole, gevolgd door strengspecifieke kwantificering van enhancer-geassocieerde transcriptie, met speciale procedures voor intragene enhancers waar signaaltoewijzing complex is. Visualisatiemodules maken een duidelijke inspectie van de activiteit van de enhancer in genomische contexten mogelijk, en ingebouwde opties ondersteunen analyses van zowel intergene als intragene enhancers. Deze workflow is ontworpen voor onderzoekers met beperkte expertise op het gebied van bio-informatica en biedt een praktisch kader voor consistente, reproduceerbare en schaalbare studies van enhancer-transcriptie, waardoor een bredere toepassing van enhancer-biologie in diverse systemen mogelijk wordt.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Enhancers zijn cis-regulerende DNA-elementen die de transcriptie van doelgenen regelen door chromatinelussen te organiseren en de transcriptiemachinerie te rekruteren 1,2,3. Hun weefselspecifieke activiteit maakt nauwkeurige regulatie tijdens de ontwikkeling en afstammingsbinding mogelijk 4,5,6,7,8. Actieve versterkers vertonen karakteristieke chromatinekenmerken zoals H3K4me1 (histon H3 Lysine 4 monomethylering) en H3K27ac (histon H3 Lysine 27 acetylering) en worden meestal aangetroffen in DNase I overgevoelige gebieden die open chromatine 9,10,11,12 markeren. Deze eigenschappen zorgen ervoor dat transcriptiefactoren en RNA-polymerase II toegang krijgen tot het DNA, waardoor ontluikende transcriptie wordt geïnitieerd op enhancer loci 13,14,15,16.

Dit sequentiële biologische proces produceert van versterkers afgeleide transcripten, eRNA's genaamd, die bidirectioneel, niet-coderend en meestal niet-gepolyadenyleerd RNA's zijn 13,14,15,16. eRNA's dienen als markers van enhancer-activiteit en functioneren op zichzelf als effectoren 16,17,18,19,20,21,22,23,24. Ze bevorderen productieve rek door negatieve verlengingsfactor (NELF) vrij te geven uit gepauzeerd RNA-polymerase II16,19 en helpen bij het stabiliseren van enhancer-promotorlussen 17,18,20. Ze ondersteunen ook de vorming van transcriptionele condensaten, mogelijk via m6A (N 6-methyladenosine) modificatie 21,22,23.

Toch blijft de functie van intragene enhancer-transcriptie, geïnitieerd door regulerende elementen in genlichamen, controversieel. Sommige studies melden dat eRNA's van intragene versterkers de genexpressie van de gastheer vergroten25, mogelijk door NELF-afgifte en stimulusafhankelijke productieve verlenging te bevorderen26,27. Ander werk suggereert daarentegen dat deze transcriptie gastheergenen kan belemmeren via RNA-polymerase II-botsingen of transcriptionele interferentie, wat leidt tot verzwakking of voortijdige beëindiging28,29. Deze tegenstrijdige waarnemingen, samen met de dubbele rol van eRNA's als markers en regulatoren, benadrukken de noodzaak van zorgvuldige kwantificering en functionele dissectie. Toch is het meten van intragene eRNA's moeilijk omdat ze vaak overlappen met sense-streng hosttranscripten 13,25,26,30. De uitdaging wordt versterkt wanneer enhancers zich bevinden in regio's met geneste genen of overlappende transcriptie op beide strengen, waardoor enhancer-specifieke signalen worden verdoezeld.

Om deze uitdagingen het hoofd te bieden, hebben we een bio-informaticapijplijn ontwikkeld om enhancer-geassocieerde transcripten te detecteren, kwantificeren en visualiseren, met een bijzondere focus op intragene regio's. De pijplijn integreert de Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing (ATAC-seq), Chromatin Immunoprecipitation Sequencing (ChIP-seq), Global Run-on Sequencing (GRO-seq) en genomische annotaties om resolutie op enhancerniveau te bereiken, zelfs in complexe genomische contexten.

De pijplijn bestaat uit vier belangrijke stappen: (i) voorverwerking, uitlijning, piekoproepen en signaalgeneratie31; (ii) identificatie van de versterker met behulp van chromatinekenmerken; (iii) toewijzing van strengoriëntatie, met name in genlichamen; en (iv) kwantificering en visualisatie van ontluikende enhancer-transcripten. Dit raamwerk is met name nuttig voor systemen met sequentiegegevens met hoge resolutie, zoals de embryonale stamcellen van muizen die in dit onderzoek zijn geanalyseerd, en het kan worden uitgebreid naar andere organismen wanneer geschikte datasets beschikbaar zijn. Door enhancer-specifieke kwantificering mogelijk te maken waar bestaande pijplijnen tekortschieten, biedt deze workflow een praktisch hulpmiddel voor het benchmarken en bestuderen van intragene eRNA-transcriptie in diverse genomische contexten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

OPMERKING: Alle onbewerkte gegevenssets die in de workflow worden gebruikt, worden vermeld in tabel 1. Details van bio-informaticahulpmiddelen zijn te vinden in de Materiaaltabel. Het aantal threads dat in deze pijplijn wordt gebruikt, kan worden aangepast door de variabele THREADS te wijzigen die boven aan elk script is gedefinieerd. Gebruikers kunnen het aantal verhogen om de analyse te versnellen, afhankelijk van de CPU-bronnen van de gebruiker.
Na elke stap wordt een logbestand gegenereerd. Gebruik voor snelle foutcontroles commando's zoals cat StepXX_log.txt; grep -qF "ERROR" StepXX_log.txt & echo "ERROR found. Repareren voor de volgende stap." || echo "OK: geen FOUTMARKERINGEN". Als er een FOUT verschijnt, beschouwt u de stap als mislukt en lost u deze eerst op.

1. Downloaden van de volledige analysepijplijn uit de GitHub-repository

(https://github.com/myunggeunO/Enhancer-transcript-identification-from-read-to-visualization/)

  1. Start de Command-Line Interface (CLI) die geschikt is voor het gebruikte besturingssysteem.
    1. Windows: Stel een Linux-omgeving in met behulp van Windows Subsystem for Linux (WSL). Volg de officiële instructies om WSL te installeren en te configureren voordat u verder gaat32.
    2. macOS: Ga verder zonder extra configuratie, aangezien macOS op Unix is gebaseerd. Raadpleeg de officiële handleiding om terminal33 te openen.
    3. Linux-gebruikers, met name degenen die Ubuntu gebruiken: Open een terminal zoals beschreven in de instructies waarnaar wordt verwezen34.
  2. Voer wget https://github.com/myunggeunO/Enhancer-transcript-identification-from-read-to-visualization/archive/refs/heads/main.zip -O ~/pipeline.zip   uit in de terminal om de pijplijn te downloaden voor de identificatie van de versterker en de kwantificering van het RNA-enhancer.
  3. Typ unzip ~/pipeline.zip -d ~/ in de terminal. Hiermee worden alle benodigde bestanden in de thuismap uitgepakt.
  4. Voer rm ~/pipeline.zip uit en typ mv ~/Enhancer-transcript-identification-from-read-to-visualization-main ~/Enhancer-transcript-identification-from-read-to-visualization om het archief te verwijderen en de uitgepakte map te hernoemen.
  5. Typ cd ~/Enhancer-transcript-identification-from-read-to-visualization/ en voer chmod +x scripts/* uit om alle scripts in de map "scripts/" uitvoerbaar te maken.

2. Instellen van een mamba/conda-omgeving voor analysepijplijn

  1. Typ bash-scripts/Step1_conda_environment_formation.sh om een virtuele mamba-omgeving te maken en uit te voeren. Als dit tijdens de uitvoering wordt gevraagd, typt u Y en drukt u op Enter om de pakketinstallaties te bevestigen. Voor macOS volgt u stap 2.1.1; voor systemen waarop Mamba of Conda al is geïnstalleerd, volgt u stap 2.1.2.
    1. MacOS: Open het script en vervang de miniconda-downloadlink door macOS-versie:
      https://repo.anaconda.com/miniconda/Miniconda3-latest-MacOSX-x86_64.sh
      Volg daarna stap 2.1.
    2. Zodra (enhancer-env) in de prompt verschijnt, typt u bash-scripts/Step2_package_installation.sh om de vereiste pakketten voor downstream-analyses te installeren. Typ Y en druk op Enter als daarom wordt gevraagd tijdens de installatie.
    3. Controleer na het uitvoeren van stap 2.2 de terminaluitgang op eventuele foutmeldingen. Los eventuele problemen op; Voer vervolgens stap 2.2 opnieuw uit.
    4. (OPTIONEEL) Voer de mamba-lijst uit om te controleren of alle door mamba beheerde pakketten in de materiaaltabel zijn geïnstalleerd. HOMER wordt handmatig geïnstalleerd en verschijnt niet in de mamba-lijst. Controleer HOMER door te controleren of de map "~/homer/" bestaat.

3. Download openbaar beschikbare ChIP-seq-, ATAC-seq- en GRO-seq-datasets van SRA (Sequence Read Archive)

  1. Voer cp scripts/Step{3..12}_*.sh ./ uit om de benodigde shell-scripts te kopiëren voor de verwerking van onbewerkte leesbewerkingen.
  2. Typ bash Step3_download_file_list.sh > Step3_log.txt 2>&1 en druk op de Enter-toets om onbewerkte sequentiegegevens van SRA te downloaden en te verwerken.
    OPMERKING: Dit script automatiseert het downloaden en voorbereiden van openbare sequencinggegevens voor analyse. Het creëert een gestandaardiseerde mappenstructuur onder "MATERIAL/", geordend op testtype en repliceren (biologisch: rep1/rep2; technisch: trep1/trep2). Een ingebouwde lijst met SRA-toetredingsnummers stimuleert het ophalen met prefetch (v3.2.0), conversie naar FASTQ met fasterq-dump (v3.2.0) (paired-end: --split-files) en compressie met pigz (v2.8) om de opslag te verminderen. De verwerking volgt prefetch, fasterq-dump, pigz, waarbij de uitvoer wordt geschreven naar de bijbehorende mappen "00.Rawdata/".

4. Voer kwaliteitscontrole en trimmen van onbewerkte metingen uit

  1. Typ bash Step4_read_trimming_and_QC.sh > Step4_log.txt 2>&1 om lees-, bijsnijd- en kwaliteitscontrole van onbewerkte FASTQ-bestanden uit te voeren.
    OPMERKING: Dit script verwerkt onbewerkte FASTQ-bestanden van GRO-seq, ATAC-seq en ChIP-seq (H3K27ac, H3K4me1) met bijbehorende invoerbesturingselementen. Het voert FastQC (v0.12.1)35 uit op onbewerkte lezingen en snijdt vervolgens adapters bij met Trim Galore (v0.6.10)36 met behulp van testspecifieke parameters. Voor GRO-seq verwijdert het eerst NextSeq G-staarten en zeer korte lezingen (--nextseq 20, --lengte 20), en gebruikt vervolgens Cutadapt (v5.1)37 om lange poly-A-kanalen te strippen met behoud van lezingen langer dan 20 nucleotiden ( -a A{15}, -m 20). Voor ATAC-seq verwerkt het bibliotheken met gepaarde uiteinden en richt het zich op Tn5/Nextera-adapters (--paired, --nextera). Voor H3K27ac en bijbehorende invoer verwerkt het ChIP-seq-bibliotheken met gepaarde uiteinden (--paired). Voor H3K4me1 en zijn invoer voert het standaard single-end trimmen uit (standaard). FastQC wordt opnieuw uitgevoerd op bijgesneden lezingen. Uitvoer wordt naar de map "01.Clean/" van elke test geschreven en tussenliggende GRO-seq-adapter-bijgesneden bestanden worden verwijderd.

5. Bereid de Bowtie2-referentie-index voor

  1. Kies een van de twee onderstaande opties om de Bowtie2 (v2.5.4)38 genoomindex voor te bereiden op het referentiegenoom van mm10 (Mus musculus).
    1. Voer bash Step5_1_download_reference_index.sh > Step5_1_log.txt 2>&1 uit om de vooraf gebouwde Bowtie2-index te gebruiken die door ontwikkelaars is geleverd.
    2. Rennen bash Step5_2_download_reference_make_index_with_
      bowtie2.sh > Step5_2_log.txt 2>&1       om de ruwe MM10-genoomsequentie te downloaden en de index handmatig op te bouwen.
      OPMERKING: Beide benaderingen genereren een indexbestand naar de map "reference_index/" en zijn functioneel equivalent voor standaarduitlijning.

6. Lijn bijgesneden lezingen uit op mm10-referentiegenoom

  1. Typ bash Step6_alignment_to_make_bam.sh > Step6_log.txt 2>&1 om de lezingen van elke test uit te lijnen op referentie en om BAM-bestanden te genereren.
    OPMERKING: Deze stap brengt de lezingen van elke test in kaart met eerder geïndexeerde mm10-referentie. H3K27ac ChIP-seq en bijbehorende invoer maken gebruik van paired-end mapping voor gebalanceerde nauwkeurigheid (-1, -2) met standaardgevoeligheid. H3K4me1 ChIP-seq en bijbehorende invoer maken gebruik van single-end mapping onder standaardinstellingen (-U). ATAC-seq maakt gebruik van zeer gevoelige mapping om variabele, lange Tn5-afgeleide fragmenten (--zeer-gevoelig, -X 2000) te accommoderen met gepaarde invoer (-1, -2). GRO-seq maakt gebruik van zeer gevoelige mapping om korte, bijgesneden lezingen (--zeer-gevoelig) beter te plaatsen met single-end invoer (-U). SAM-bestanden worden geconverteerd naar BAM en gefilterd met samtools (v1.22.1)39-weergave , met behulp van matige MAPQ voor ChIP/invoer (-b, -q 10) en strengere drempels voor ATAC-seq en GRO-seq (-b, -q 30); De uiteindelijke BAM-bestanden worden naar de map "02.Align/" van elke dataset geschreven.

7. Technische replica's van H3K27ac ChIP-seq-gegevens samenvoegen

  1. Voer bash Step7_merge_trep.sh > Step7_log.txt 2>&1 uit om technische replica's van H3K27ac ChIP-seq en bijbehorende BAM invoerbestanden samen te voegen.
    OPMERKING: Dit script sorteert BAM-bestanden voor technische replica's met sambamba (v1.0.1)40 sorteren en voegt vervolgens H3K27ac ChIP-seq en bijbehorende invoer samen in geconsolideerde BAM's met sambba-samenvoeging. Als de gegevensset van de gebruiker geen technische replica's bevat, slaat u deze stap over en gaat u verder met afzonderlijke BAM-bestanden.

8. Verwijder duplicaten en niet-essentiële chromosomen

  1. Verwijder duplicaten en sorteer toegewezen leesbewerkingen op ChIP-seq en GRO-seq.
    1. Typ bash Step8_1_duplicate_removal_sorting-ChIP_GRO.sh > Step8_1_log.txt 2>&1 om duplicaten uit histon ChIP-seq-datasets te verwijderen en sorteer zowel ChIP-seq- als GRO-seq-uitvoer-BAM's.
      OPMERKING: Dit script verwijdert PCR-duplicaten met sambamba markdup (-r) en coordinate-sorteert met sambamba sort. Voor H3K27ac richt de verwerking zich op BAM's van samengevoegde technische replica's, waarbij ChIP en invoer afzonderlijk worden verwerkt. Voor H3K4me1 worden elke replicatie en gematchte invoer afzonderlijk verwerkt. Voor GRO-seq wordt het verwijderen van duplicaat overgeslagen en wordt alleen coördinatensortering toegepast. Uitvoer wordt opgeslagen in de map "02.Align/" van elke dataset.
  2. Verwijder duplicaten en filter mitochondriale chromosoom-mapped lezingen van ATAC-seq.
    1. Typ bash Step8_2_duplicate_chrM_removal_sorting_ATAC.sh > Step8_2_log.txt 2>&1 om PCR-duplicaten te verwijderen, mitochondriale lezingen (chrM) te filteren en ATAC-seq BAMs te sorteren.
      OPMERKING: Dit script verwijst naar ENCODE-pijplijnaanbevelingen voor ATAC-seq-gegevensverwerking. Het begint met het sorteren van namen met sambamba sort (-n) en het fixeren van mate-pair informatie met behulp van samtools fixmate (-m). Deze stap zorgt ervoor dat de partnerinformatie correct wordt toegewezen voordat duplicaten worden gemarkeerd. Daarna worden PCR-duplicaten verwijderd met behulp van samamba-opmaak (-r). Mitochondriale lezingen worden verwijderd door een keep-list te genereren van samtools idxstats (exclusief chrM en *) en alleen vermelde referenties te behouden met samtools view (-b). De uiteindelijke coördinatensortering wordt uitgevoerd met sambamba sort. Opgeschoonde BAM's worden naar de map "02.Align/" van elke replicaat geschreven.

9. Voer piekaanroepen uit voor elke gegevensset

  1. Voer stap 9 script uit door bash Step9_peak_calling.sh > Step9_log.txt 2>&1 te typen om piekaanroepen voor ChIP-seq- en ATAC-seq-gegevens uit te voeren.
    OPMERKING: Dit script voert piekaanroepen uit met MACS3 (v3.0.3)41 voor ATAC-seq en ChIP-seq (H3K27ac, H3K4me1). ATAC-seq genereert pieken door alle gerepliceerde BAM's als signaal te leveren in no-model modus met shift/extension (-f BAMPE, --nomodel, --shift -100, --extsize 200, -q 0.01). H3K27ac roept brede pieken op van samengevoegde technische replicaten met gematchte invoer (-f BAMPE, --broad). H3K4me1-processen repliceren elk afzonderlijk met de bijbehorende invoer in single-end broad mode (-f BAM, --broad), en overlappende pieken worden verkregen met bedtools (v2.31.1)42 kruisen. Uitvoer wordt geschreven naar de map "peak_calling/" van elke gegevensset, met zeer betrouwbare H3K4me1-pieken onder "peak_calling/overlapped_peak/".

10. Biologische replicaten van ChIP-seq en ATAC-seq BAM-bestanden samenvoegen voor downstream signaalanalyse

  1. Voer bash Step10_merge_rep_forMakingSignal.sh > Step10_log.txt 2>&1 uit om BAM-bestanden samen te voegen van biologische replica's van ATAC-seq en H3K4me1 ChIP-seq.
    OPMERKING: Dit script combineert replicate BAMs met sambamba merge voor ATAC-seq, H3K4me1 ChIP-seq en bijbehorende H3K4me1-invoer. Gefuseerde BAM's ondersteunen downstream-analyses (bijv. bigWig-signaalgeneratie, normalisatie). Uitvoer-BAM's worden opgeslagen in de mappen "merge/02.Align/" onder elk voorbeeldpad.

11. Genereer tag-mappen en signaleer bigWig-bestanden van toegewezen lezingen

  1. Voer bash Step11_make_tag_to_signal.sh > Step11_log.txt 2>&1 uit om tagmappen te maken en bigWig-signaalbestanden te genereren voor in kaart gebrachte lezingen van elke dataset.
    OPMERKING: Dit script bouwt HOMER-tagmappen met makeTagDirectory en genereert vervolgens bigWig-signaaltracks met de opdracht makeUCSCfile met behulp van HOMER (v5.1)43 en ucsc-bedgraphtobigwig (v482)44-pakketten . Alle signaalsporen worden gemaakt met behulp van chromosoomgroottebestanden van UCSC Genome Browser (https://hgdownload.soe.ucsc.edu/goldenPath/mm10/). GRO-seq produceert streng-specifieke signaalrails (-style rnaseq, -strand + / -, -bigWig). ATAC-seq produceert niet-genormaliseerde tracks van samengevoegde BAMs (-bigWig). ChIP-seq (H3K27ac, H3K4me1) produceert input-genormaliseerde tracks met een pseudo-telling van 1 (-bigWig, -i, -pseudo 1). Uitvoer is georganiseerd onder "03.TagDir/" en "04.bigwig/".

12. Bereid bestanden voor op de identificatie van de verbeteraar

  1. Typ bash Step12_E_identification_material.sh > Step12_log.txt 2>&1 in de terminal om de benodigde bestanden en referentie voor te bereiden voor de identificatie van de verbeteraar.
    OPMERKING: Deze stap verzamelt alle benodigde bestanden voor de identificatie van de versterker in de mappen "01.E_identification/material/", georganiseerd in de mappen "ATAC/", "Histone/" en "Annotation/". Het kopieert piekbestanden (ATAC-seq, H3K27ac, H3K4me1) naar de juiste mappen. Het GENCODE M23-annotatiebestand (mm10) wordt automatisch gedownload en referentiebestanden, waaronder ENCODE blacklist45 (mm10-blacklist.v2.bed) en chromosoomgroottebestand (mm10.chrom.sizes) worden gekopieerd van een vooraf gedefinieerd pad.

13. Identificeer promotorkandidaten en genlichamen aan de hand van annotatie

  1. Typ cd 01.E_identification/ om de werkmap in te voeren en voer vervolgens cp uit.. /scripts/Step{13..20}_*.sh ./ om enhancer-identification scripts te kopiëren.
  2. Voer bash Step13_promoter_candidates_genebody_identification.sh > Step13_log.txt 2>&1 uit om BED-bestanden te genereren voor promotorregio's, genlichamen en eiwitcoderende genen (PCG's) met behulp van GENCODE-annotatie.
    OPMERKING: Dit script verwerkt gedownloade GENCODE M23 Gene Transfer Format (GTF) om BED-bestanden te maken voor promotorkandidaten, alle genlichamen en PCG-lichamen, waarbij de uitvoer wordt opgeslagen in "material/Annotation/". Promotors worden gedefinieerd als een venster van 2 kb rond de TSS (Transcription Start Site) van elk transcript met bedtools slop (-b 2000, -g mm10.chrom.sizes). Gen- en eiwitcoderende lichamen zijn afgeleid van GTF-vermeldingen die zijn geannoteerd als gen, waarbij eiwitcoderende vermeldingen verder zijn gefilterd op "gene_type = protein_coding".

14. Verwerk pieken voor de identificatie van enhancer

  1. Voer bash Step14_ATAC_ChIP-seq_processing.sh > Step14_log.txt 2>&1 uit om ATAC-seq voor te verwerken en histon ChIP-seq piekbestanden voor te bereiden op de identificatie van verbeteraars.
    OPMERKING: Dit script verwerkt pieksets voor het aanroepen van enhancer. Voor ATAC-seq worden regio's die regio's overlappen die regio's op de zwarte lijst overlappen verwijderd met bedtools aftrekken (-A) en vervolgens worden pieken die promotorkandidaten overlappen met bedtools aftrekken (-A) uitgesloten; voor histonmarkeringen (H3K27ac, H3K4me1) breidt het elke piek symmetrisch uit met 1 kb aan elke kant met bedtools-slop (-b 1000 -g mm10.chrom.sizes) en verwijdert vervolgens promotor-overlappingen met bedtools aftrekken.

15. Identificeer en classificeer verbeteraars

  1. Voer bash Step15_inter_intragenic_E_sets_identification.sh > Step15_log.txt 2>&1 uit om verbeteraars te definiëren en te classificeren met behulp van chromatinepiekgegevens.
    OPMERKING: Deze stap definieert en annoteert verbetermiddelen met behulp van bedtools. Overlappingen tussen ATAC-seq-pieken en slop-geëxpandeerde H3K4me1-pieken worden verkregen met kruising (-wa, -u), en regio's die ook overlappen met geflankeerde H3K27ac-pieken worden geclassificeerd als actieve versterkers met kruising (-wa, -u); Niet-actieve enhancers worden afgeleid door actieve gebieden te verwijderen uit de volledige enhancer-set met aftrekken. ATAC-seq-toppen die elke enhancer-set overlappen, worden verzameld met intersect (-u), vervolgens worden toppen opgesplitst in intergeen en intrageen met intersect (-v of -u) tegen het genlichaam. Enhancer-intervallen worden uiteindelijk toegewezen aan intergene/intragene klassen op basis van de geassocieerde top van de piek met kruising (-u). Alle resultaten worden opgeslagen in "01.E_identification/" onder "01.allE/", "02.interE/" en "03.intraE/".

16. Wijs tijdelijke strenginformatie toe aan intragene versterkers

  1. Typ bash Step16_assign_temp_strand_from_gene_overlap.sh > Step16_log.txt 2>&1 om tijdelijke strenginformatie toe te wijzen aan de intragene versterker BED.
    OPMERKING: Deze stap wijst genstrenglabels toe aan intragene enhancers door enhancer-intervallen te overlappen met genlichamen met behulp van bedtools intersect (-wa, -wb). Kolommen 1, 2, 3, 4, 5, 16 worden behouden met awk, vervolgens worden de records gesorteerd en gededupliceerd. De uitvoer wordt opgeslagen als "03.intraE/strand_designation/01.overlapped_gene_strand/ES_E_intragenic_strand_with_dup.bed".

17. Geef prioriteit aan de toewijzing van strengen voor versterkers die beide strenggenen overlappen

  1. Type bash Step17_initial_strand_assignment_for_both_strand_enhancers_PCG_based.sh > Step17_log.txt 2>&1 om de richting van de strengen op te lossen voor intragene versterkers die genen op beide strengen overlappen.
    OPMERKING: Dit script lost strengambiguïteit op voor intragene enhancers die genen op beide strengen overlappen door prioriteit te geven aan PCG-overlappingen. Enhancers die op beide strengen aanwezig zijn, worden eerst geïsoleerd (awk-groepering op chrom/start/end/id/strand), PCG-overlappende gevallen op dezelfde streng worden geselecteerd met bedtools intersect (-s, -wa, -u), en niet-PCG-gevallen worden behouden met bedtools intersect (-v). Geselecteerde en behouden sets worden aaneengeschakeld en geordend. Uitgang: "03.intraE/strand_designation/02.enhancer_with_PCG_priority/ES_E_intragenic_PCG_priority.bed".

18. Bereken strengspecifieke Reads Per Kilobase per Million mapped reads (RPKM) waarden voor genen die overlappende PCG-geprioriteerde intragene enhancers

  1. Typ bash Step18_RPKM_cal_from_partially_strand_assigned_enhancers.sh > Step18_log.txt 2>&1 om strengspecifieke RPKM te berekenen voor genen die overlappende enhancers op dezelfde streng zijn.
    OPMERKING: In deze stap wordt "ES_E_intragenic_PCG_priority.bed" uit stap 17 gebruikt, dat versterkers bevat die (i) een PCG op één streng overlapten en een streng ontvingen, (ii) PCG's op beide strengen overlapten en dubbelzinnig bleven, of (iii) geen PCG-overlapping hadden en beide strengen behielden. Overlappende genen met dezelfde streng worden geselecteerd met bedtools die elkaar kruisen (-s, -wa, -u), geconverteerd naar GTF via awk en gekwantificeerd op basis van GRO-seq met featureCounts (v2.1.1)46 strengspecifieke telmodus (-s 1, -t-gen, -g gene_id, -O, --fractie). Het totale aantal in kaart gebrachte lezingen wordt verkregen met samamba-flagstat en RPKM wordt berekend op basis van genlengte, tellingen en totalen. Uitvoer wordt geschreven naar "03.intraE/strand_designation/03.RPKM_calculation_of_overlapped_gene/".

19. Definitieve strengtoewijzing op basis van genexpressie (RPKM) van overlappende genen

  1. Typ bash Step19_second_strand_assignment_by_RPKM.sh > Step19_log.txt 2>&1 om de strengtoewijzing voor intragene versterkers af te ronden.
    OPMERKING: Deze stap wijst strengen toe aan intragene enhancers met behulp van genexpressieondersteuning vanaf stap 18. Overlappingen van dezelfde streng tussen enhancers (ES_E_intragenic_PCG_priority.bed) en genen worden gevonden met bedtools die elkaar kruisen (-s, -wa, -wb). Gen-RPKM-waarden worden via awk/sort/join samengevoegd met genintervallen, waardoor gen-RPKM BED ontstaat. Voor elke enhancer wordt het overlappende gen met de hoogste RPKM geselecteerd en de enhancer erft de streng van dat gen. Resultaten worden opgeslagen in "03.intraE/strand_designation/04.enhancer_strand_designation_by_RPKM_of_gene/ES_E_intragenic_PCG_priority_strand_by_gene_RPKM.bed".

20. Wijs strandinformatie toe aan intragene enhancers en enhancer summits

  1. Typ bash Step20_strand_assignment_for_intragenicE_and_summits.sh > Step20_log.txt 2>&1 om bepaalde strenginformatie toe te wijzen aan alle intragene versterkers en elke top.
    OPMERKING: Met deze stap wordt de strengtoewijzing voor intragene versterkers en bijpassende toppen afgerond met behulp van bedtools. Intervallen van tegengestelde strengen worden verwijderd met aftrekken (-S), door streng aangewezen enhancers worden doorsneden met actieve en niet-actieve sets met behulp van intersect (-wa, -u), en topbestanden worden opnieuw geannoteerd door overlappende toppen met door streng aangewezen enhancers via intersect (-wa, -wb) en get streng met awk. De resultaten worden opgeslagen in "03.intraE/final_strand_IntragenicE/" en de submap "summit/".

21. Bereid invoerbestanden voor voor validatie van verbeteraars, kwantificering van eRNA en visualisatie

  1. Typ cd .. / of cd ~/Enhancer-transcript-identification-from-read-to-visualization om naar de hoofdmap van de pijplijn te gaan, typ vervolgens cp scripts/Step21_preparing_quantification_and_visualization.sh ./ om het script te kopiëren voor de voorbereiding van de downstream-analyse.
  2. Voer bash Step21_preparing_quantification_and_visualization.sh > Step21_log.txt 2>&1 uit om alle benodigde bestanden voor te bereiden op enhancer-aggregatie, GRO-seq-signaalverwerking en eRNA-kwantificering.
    OPMERKING: Deze stap bereidt invoerbestanden en mapstructuur voor op validatie van enhancer, eRNA-kwantificering en signaalvisualisatie onder "02.E_visualization_quantification/". Submappen worden gemaakt voor bigWig-bestanden, enhancer BED's, BAM's, signaalmatrices, tellingen en plots. Belangrijke invoer zoals BED's op de top, bigWigs, enhancer-lijsten en GRO-seq BAM's worden gekopieerd naar de juiste locaties.

22. Genereer aggregatieplots voor validatie van de verbeteraar

  1. Typ cd 02.E_visualization_quantification/ om de werkmap in te voeren, typ vervolgens cp .. /scripts/Step{22..24}_*.* ./ om de benodigde scripts voor downstream-analyse te kopiëren.
  2. Voer bash Step22_generation_of_aggregation_plot.sh > Step22_log.txt 2>&1 uit om aggregatieplots van chromatinesignalen te genereren rond elk type enhancer-top.
    OPMERKING: Deze stap visualiseert de gemiddelde verrijking van het chromatinesignaal gecentreerd op enhancer-toppen met behulp van computeMatrix en plotProfile van deepTools (v3.5.6)47. Voor elke gedefinieerde enhancerset berekent computeMatrix-referentiepunt (--referencePoint center, -a 5000, -b 5000, --missingDataAsZero) de signaaldichtheid binnen een venster van 10 kb rond enhancer-toppen met behulp van bigWig-bestanden voor ATAC-seq, H3K27ac en H3K4me1. De uitvoermatrix wordt doorgegeven aan plotProfile, die signaalaggregatiecurven genereert voor vergelijking tussen enhancer-groepen. Aggregatieplots worden opgeslagen in de map "01.Profiling/04_1.aggregation/".

23. Kwantificeer en visualiseer de expressie van enhancer RNA

  1. Voer bash Step23_quantifing_eRNA_RPKM.sh > Step23_log.txt 2>&1 uit om eRNA-expressieniveaus van GRO-seq te kwantificeren met behulp van featureCounts.
    OPMERKING: Deze stap kwantificeert eRNA-transcriptie van gedefinieerde enhancer-regio's op een strengspecifieke manier met behulp van GRO-seq. Intergene enhancers worden geteld met featureCounts in niet-gestrande modus (-s 0, -t enhancer, -g gene_id, -O, --fractie) en intragene enhancers worden gekwantificeerd in antisense-modus (-s 2) om signaal uit te sluiten van overlappende gentranscriptie. BED-regio's worden geconverteerd naar GTF met awk voordat ze worden geteld. Het totale aantal in kaart gebrachte lezingen is afkomstig van sambamba flagstat en het aantal wordt genormaliseerd naar RPKM met behulp van de lengte van de verbeteraar, het aantal gelezen lezen en het totale aantal in kaart gebrachte lezingen. Uitvoer is georganiseerd onder "02.eRNA_quantification/03.count_normalized_with_RPKM/" door "inter/" en "intra/".
  2. Voer Rscript Step24_visualization_of_enhancer_transcript uit. R > Step24_log.txt 2>&1 om eRNA-expressieniveaus tussen enhancergroepen te visualiseren en te vergelijken met behulp van R.
    OPMERKING: R script gebruikt ggplot2 (v3.5.2)48 en cowplot (v1.2.0)49 pakketten om viool- en boxplots te genereren waarin actieve en niet-actieve enhancer-expressie worden vergeleken op basis van RPKM-waarden. Voor visualisatie en statistische tests worden RPKM-waarden getransformeerd naar log2 (RPKM + 1). Statistische significantie wordt beoordeeld met behulp van de Wilcoxon-rangschikkingsomtest. Zowel de samenvattingsgrafieken als de tabel met de p-waarde worden opgeslagen op "03.eRNA_visualization/" voor downstream-interpretatie.
    OPMERKING: Als een stap in deze pijplijn mislukt en aanhoudt, zelfs nadat deze opnieuw is uitgevoerd, meldt u het probleem bij https://github.com/myunggeunO/Enhancer-transcript-identification-from-read-to visualisatie/problemen. Door de mislukte stap duidelijk te vermelden en het logbestand bij te voegen, zorgt u voor nauwkeurige ondersteuning bij het oplossen van problemen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Schematische werkstroom voor de kwantificeringspijplijn van het transcriptie-verbeterpunt
Openbaar beschikbare ChIP-seq (H3K27ac, H3K4me1), ATAC-seq en GRO-seq datasets (Tabel 1) werden verwerkt met een gestandaardiseerde pijplijn die voornamelijk was ontworpen voor validatie. Het trimmen van de adapter en het filteren van de kwaliteit werden uitgevoerd met Trim Galore en Cutadapt, gevolgd door uitlijning met het mm10-referentiegenoom met behulp van Bo...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Na de ontdekking van van enhancer-afgeleide transcripten 13,14,15 is het nauwkeurig kwantificeren van eRNA's een grote uitdaging gebleven, vooral in intragene contexten waar eRNA's vaak overlappen met gastheergentranscripten. Deze overlap bemoeilijkt de toewijzing van strengen en de signaalattributie, waardoor het moeilijk wordt om echte enhancer-transcriptie te ondersche...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie werd ondersteund door het onderzoeksfonds van Chungnam National University [2022-0582-01 (S.-K.K.) en 2023-0545-01 (S.-K.K.)], Zuid-Korea. Figuur 1 is gemaakt met behulp van BioRender (https://biorender.com/).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

```html

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
bedtoolsQuinlan Lab, University of Utah v2.31.1Utilities voor het bewerken van BED-bestanden
bowtie2Langmead Lab, Johns Hopkins Universityv2.5.4Multi-threaded aligner voor het toewijzen van reads naar een referentie-genoom
cowplotWilke Lab, University of Texasv1.2.0Tools voor het combineren en uitlijnen van ggplot2-gebaseerde figuren
cutadaptScience For Life Laboratory, Stockholm Universityv5.1Adapter en poly-A/G staart trimmer
deeptoolsBioinformatics Facility, Max Planck Institutev3.5.6Read telling tool voor het kwantificeren van reads in gedefinieerde genomische regio's
fastqcBabraham Bioinformatics, Babraham Institutev0.12.1Kwaliteitscontrole voor sequencing reads
featureCounts (subread)Shi Lab, Monash Universityv2.1.1Raw read telling tools voor gespecificeerde genomische regio's
homerBenner Lab, University of California San Diego (UCSD)v5.1Toolkit voor ChIP-seq, ATAC-seq en nascent RNA analyse; inclusief tag directory aanmaak en signaalprofilering
macs3Chan Zuckerberg Initiativev3.0.3Peak calling voor ChIP-seq en ATAC-seq datasets
pigz.v2.8Multi-threaded compressie tool voor het genereren van gzip-gecomprimeerde bestanden
sambambaPetersburg State Universityv1.0.1Multi-threaded SAM/BAM bestandsverwerking toolkit
samtoolsWellcome Trust Sanger Institutev1.22.1Tools voor het verwerken en manipuleren van SAM/BAM bestanden
sra-toolsNational Center for Biotechnology Information (NCBI)v3.2.0Voor het downloaden van SRR bestanden van de NCBI SRA database
tidyversePosit PBCv2.0.0Collectie van R packages voor data manipulatie en visualisatie
trim-galoreAltos Labs, Cambridge Institute of Sciencev0.6.10Adapter en low-quality base trimming met multi-threading
Ubuntu 20.04Ontwikkeling en testen van de pipeline
ucsc-bedgraphtobigwig Kent Lab, University of California Santa Cruzev482Tools voor het genereren van bigWig signaal tracks
```

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bulger, M., Groudine, M. Functional and mechanistic diversity of distal transcription enhancers. Cell. 144 (3), 327-339 (2011).
  2. Smith, E., Shilatifard, A. Enhancer biology and enhanceropathies. Nat Struct Mol Biol. 21 (3), 210-219 (2014).
  3. Li, W., Notani, D., Rosenfeld, M. G. Enhancers as non-coding RNA transcription units: recent insights and future perspectives. Nat Rev Genet. 17 (4), 207-223 (2016).
  4. Whyte, W. A., et al. transcription factors and mediator establish super-enhancers at key cell identity genes. Cell. 153 (2), 307-319 (2013).
  5. Plank, J. L., Dean, A. Enhancer function: mechanistic and genome-wide insights come together. Mol Cell. 55 (1), 5-14 (2014).
  6. Alexander, J. M., et al. Brg1 modulates enhancer activation in mesoderm lineage commitment. Development. 142 (8), 1418-1430 (2015).
  7. Huang, J., et al. Dynamic control of enhancer repertoires drives lineage and stage-specific transcription during hematopoiesis. Dev Cell. 36 (1), 9-23 (2016).
  8. Xiong, L., et al. Genome-wide identification and characterization of enhancers across 10 human tissues. Int J Biol Sci. 14 (10), 1321-1332 (2018).
  9. Heintzman, N. D., et al. Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression. Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).
  10. Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proc Natl Acad Sci. 107 (50), 21931-21936 (2010).
  11. Calo, E., Wysocka, J. Modification of enhancer chromatin: what, how, and why. Mol Cell. 49 (5), 825-837 (2013).
  12. Barakat, T. S., et al. Functional dissection of the enhancer repertoire in human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 23 (2), 276-288 (2018).
  13. Kim, T. -K., et al. Widespread transcription at neuronal activity-regulated enhancers. Nature. 465 (7295), 182-187 (2010).
  14. Melgar, M. F., Collins, F. S., Sethupathy, P. Discovery of active enhancers through bidirectional expression of short transcripts. Genome Biol. 12 (11), R113(2011).
  15. Djebali, S., et al. Landscape of transcription in human cells. Nature. 489 (7414), 101-108 (2012).
  16. Gorbovytska, V., et al. Enhancer RNAs stimulate Pol II pause release by harnessing multivalent interactions to NELF. Nat Commun. 13 (1), 2429(2022).
  17. Mousavi, K., et al. eRNAs promote transcription by establishing chromatin accessibility at defined genomic loci. Mol Cell. 51 (5), 606-617 (2013).
  18. Hsieh, C. -L., et al. Enhancer RNAs participate in androgen receptor-driven looping that selectively enhances gene activation. Proc Natl Acad Sci. 111 (20), 7319-7324 (2014).
  19. Schaukowitch, K., et al. Enhancer RNA facilitates NELF release from immediate early genes. Mol Cell. 56 (1), 29-42 (2014).
  20. Pnueli, L., Rudnizky, S., Yosefzon, Y., Melamed, P. RNA transcribed from a distal enhancer is required for activating the chromatin at the promoter of the gonadotropin α-subunit gene. Proc Natl Acad Sci. 112 (14), 4369-4374 (2015).
  21. Sabari, B. R., et al. Coactivator condensation at super-enhancers links phase separation and gene control. Science. 361 (6400), eaar3958(2018).
  22. Nair, S. J., et al. Phase separation of ligand-activated enhancers licenses cooperative chromosomal enhancer assembly. Nat Struct Mol Biol. 26 (3), 193-203 (2019).
  23. Lee, J. -H., et al. Enhancer RNA m6A methylation facilitates transcriptional condensate formation and gene activation. Mol Cell. 81 (16), 3368-3385 (2021).
  24. Chen, Q., et al. Enhancer RNAs in transcriptional regulation: recent insights. Front Cell Dev Biol. 11, 1205540(2023).
  25. Moon, J., et al. Embryonic stem cell-specific intragenic enhancer RNA essential for NSUN2-mediated stem cell fate regulation. Int J Biol Macromol. 245, 470(2025).
  26. Tuvikene, J., et al. Intronic enhancer region governs transcript-specific Bdnf expression in rodent neurons. Elife. 10, e65161(2021).
  27. Cheng, F., et al. Intronic enhancers of the human SNCA gene predominantly regulate its expression in brain in vivo. Sci Adv. 8 (47), eabq6324(2022).
  28. Hobson, D. J., Wei, W., Steinmetz, L. M., Svejstrup, J. Q. RNA polymerase II collision interrupts convergent transcription. Mol Cell. 48 (3), 365-374 (2012).
  29. Cinghu, S., et al. Intragenic enhancers attenuate host gene expression. Mol Cell. 68 (1), 104-117 (2017).
  30. Bressin, A., et al. High-sensitive nascent transcript sequencing reveals BRD4-specific control of widespread enhancer and target gene transcription. Nat Commun. 14 (1), 4971(2023).
  31. Lee, J., et al. Introductory analysis and validation of CUT&RUN sequencing data. J Vis Exp. (214), e67359(2024).
  32. How to install Linux on Windows with WSL. , Microsoft. https://learn.microsoft.com/en-us/windows/wsl/install (2025).
  33. Terminal user guide. , Apple. https://support.apple.com/guide/terminal/welcome/mac (2025).
  34. How to open terminal in Linux. , GeeksforGeeks. https://www.geeksforgeeks.org/linux-unix/how-to-open-terminal-in-linux/ (2025).
  35. Simon, A. FastQC: a quality control tool for high throughput sequence data. Version 0.10.1, (2010).
  36. Krueger, F. Trim Galore!: a wrapper around Cutadapt and FastQC to consistently apply adapter and quality trimming to FastQ files, with extra functionality for RRBS data. Babraham Inst. , (2015).
  37. Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet J. 17 (1), 3(2011).
  38. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
  39. Li, H., et al. The sequence alignment/map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
  40. Tarasov, A., Vilella, A. J., Cuppen, E., Nijman, I. J., Prins, P. Sambamba: fast processing of NGS alignment formats. Bioinformatics. 31 (12), 2032-2034 (2015).
  41. Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9 (9), R137(2008).
  42. Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
  43. Heinz, S., et al. Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities. Mol Cell. 38 (4), 576-589 (2010).
  44. Kent, W. J., Zweig, A. S., Barber, G., Hinrichs, A. S., Karolchik, D. BigWig and BigBed: enabling browsing of large distributed datasets. Bioinformatics. 26 (17), 2204-2207 (2010).
  45. Amemiya, H. M., Kundaje, A., Boyle, A. P. The ENCODE blacklist: identification of problematic regions of the genome. Sci Rep. 9 (1), 9354(2019).
  46. Liao, Y., Smyth, G. K., Shi, W. featureCounts: an efficient general purpose program for assigning sequence reads to genomic features. Bioinformatics. 30 (7), 923-930 (2014).
  47. Ramírez, F., et al. deepTools2: a next generation web server for deep-sequencing data analysis. Nucleic Acids Res. 44, W160(2016).
  48. Wickham, H. ggplot2: elegant graphics for data analysis. , Springer. 189-201 (2016).
  49. Wilke, C. O. cowplot: streamlined plot theme and plot annotations for ggplot2. CRAN Contrib. Packages. , (2015).
  50. Andersson, R., et al. An atlas of active enhancers across human cell types and tissues. Nature. 507 (7493), 455-461 (2014).
  51. Spicuglia, S., Vanhille, L. Chromatin signatures of active enhancers. Nucleus. 3 (2), 126-131 (2012).
  52. Zentner, G. E., Tesar, P. J., Scacheri, P. C. Epigenetic signatures distinguish multiple classes of enhancers with distinct cellular functions. Genome Res. 21 (8), 1273-1283 (2011).
  53. Blinka, S., Reimer, M. H., Pulakanti, K., Rao, S. Super-enhancers at the Nanog locus differentially regulate neighboring pluripotency-associated genes. Cell Rep. 17 (1), 19-28 (2016).
  54. Zhao, S., Ye, Z., Stanton, R. Misuse of RPKM or TPM normalization when comparing across samples and sequencing protocols. RNA. 26 (8), 903-909 (2020).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Intergene enhancersintragene enhancersGRO seq analyseATAC seq dataH3K27 acetyleringchromatine piekgegevensstrandspecifieke kwantificeringaggregatieplots

Gerelateerde artikelen