1. Voorbereiding van synthetische huidmonsters
Een collageengebaseerd synthetisch huidmodel (VITRO-Skin) vel werd onder aseptische omstandigheden in rechthoekige stalen van 5,0 cm × 2,5 cm gesneden in een bioveiligheidskast. Elke proeflap werd in een steriele petrischaal geplaatst en bewaard op 4 °C tot gebruik. Voor de inoculatie werden de monsters in evenwicht gebracht tot kamertemperatuur en gehydrateerd in een vochtige kamer volgens de instructies van de fabrikant om het hydratatieniveau van de menselijke huid na te bootsen.
2. Bereiding van microbiële culturen
American Type Culture Collection (ATCC) referentiestammen, waaronder Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Escherichia coli (ATCC 25922), Enterobacter aerogenes (ATCC 13048), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853), Acinetobacter baumannii (ATCC 19606), Klebsiella pneumoniae (ATCC 13883) en Candida albicans (ATCC 10231), werden gebruikt. Enkele kolonies werden onder aseptische omstandigheden geïnëntificeerd in 5 mL Tryptic Soy Bouth (TSB). Bacteriële culturen werden geïncubeerd bij 35 °C gedurende 24 uur, en schimmelculturen werden 5 dagen geïncubeerd bij 22 °C. Na incubatie werd de troebelheid aangepast naar 0,5 McFarland Standard (ongeveer 1,5 × 10⁸ CFU/mL) met gebruik van steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) voor antimicrobiële assays.
3. Inoculatie van synthetische huidmodellen
Elk gehydrateerd synthetisch huidgedeelte werd ingeënt met 100 μL microbiële suspensie en gelijkmatig verdeeld met een steriele wegwerpspreider. De geïnënte oppervlakken werden 15 minuten aan de lucht gedroogd in een steriele kamer onder laboratoriumomstandigheden (22-24 °C, 60%-70% RH). Monsters werden toegewezen aan drie groepen: onbehandelde controle (Groep A), lichtbron (blauw licht LED, 405 nm) bestraling (Groep B) en UV-C LED (265 nm) bestraling (Groep C). Figuur 1 toont de schematische weergave van de experimenten bij het evalueren van de antimicrobiële effectiviteit van de lichtbron met behulp van het synthetische huidmodel.
4. Lichtbronconfiguratie en bestraling
Een 405 nm blauwlicht-LED-apparaat werd gemonteerd op een aluminium koellichaam om warmteophoping te voorkomen en thermisch veilige bestraling van synthetische huidstalen te garanderen (Figuur 2). De bestraling werd gemeten op het exacte behandelvlak met een gekalibreerde optische vermogensmeter, waarbij de hoogte van de sonde werd aangepast aan de sensordikte. De werkstraling werd gestandaardiseerd op 30 mW/cm² door de werpafstand van de LED aan te passen.
De uniformiteit van de verlichting over het behandelveld werd geverifieerd door het meten van de bestraling op 16 gelijkmatig verdeelde punten, wat een gemiddelde van 30,14 ± 0,78 mW/cm² opleverde (Figuur 3). Voor de basisvergelijking van germicidale effecten werden UV-C-behandelingen uitgevoerd met een 265 nm LED-bron, die 3 mW/cm² leverde op een afstand van 20 cm gedurende 2 minuten.
Fluence werd berekend als irradiantie × belichtingstijd en kwam overeen met 27 J/cm² voor blauw licht (30 mW/cm² × 900 s) en 3,6 J/cm² voor UV-C.
Voor antimicrobiële assays werden gehydrateerde synthetische huidstalen die met microbiële suspensies waren geïnëntificeerd, aseptisch in steriele petrischalen geplaatst (deksels verwijderd) en direct onder de blauwlicht-LED geplaatst. Monsters die aan de bestralingsgroep (Groep B) waren toegewezen, werden continu blootgesteld totdat de doelfluentie was bereikt (15 min). De blootstellingsduur van 15 minuten (27 J/cm²) werd geselecteerd op basis van voorlopige time-kill-experimenten, die consistente antimicrobiële effectiviteit over soorten heen aantoonden en tegelijkertijd een praktische blootstellingsduur vertegenwoordigden voor potentiële klinische of point-of-care toepassingen. De temperatuur van elke proeflap werd elke 5 minuten gemeten met een contactloze infraroodthermometer om te bevestigen dat er tijdens de verlichting geen significante verhitting plaatsvond. Temperatuurmonitoring toonde geen meetbare stijging van de oppervlaktetemperatuur (>2 °C) tijdens blauwlichtbestraling, wat bevestigde dat de waargenomen antimicrobiële effecten niet-thermisch waren.
5. Antimicrobiële effectiviteit van blauw licht LED en UV-C tegen wondpathogenen
Na de behandeling werd elke synthetische huidproef overgebracht in een steriele buis van 15 mL met 9,0 mL PBS (pH 7,4). De buizen werden voorzichtig 1 minuut vortex gemaakt om microben die aan het oppervlak hechten los te maken. Er werden seriële tienvoudige verdunningen gemaakt, en 100 μL aliquots werden geplateerd op Tryptic Soy Agar (TSA) voor bacteriën en Sabouraud Dextrose Agar (SDA) voor schimmels. Platen werden geïncubeerd (bacteriën bij 35 °C gedurende 24 uur; schimmels bij 22 °C gedurende 5 dagen), en kolonievormende eenheden (CFU's) werden opgeteld. Microbiële reductie werd gekwantificeerd met de volgende vergelijkingen:
Logreductie = log10(A) - log10(B)
Procentuele reductie = ((A - B)/A) × 100
Waarbij A = CFU-telling vanaf controle; B = CFU-telling uit behandelde monsters.
Negatieve controles bestonden uit media-only platen en PBS om de steriliteit te verifiëren, terwijl onbehandelde geïnënte stalen werden gebruikt om de behandelingseffectiviteit te vergelijken. Positieve controleplaten bestonden uit geïnëntificeerde ATCC-microbiele suspensies om de kweeklevensvatbaarheid te bevestigen. Alle experimentele stappen werden uitgevoerd onder aseptische omstandigheden.
6. Tijdsafhankelijke antimicrobiële effectiviteit van blauwlichtbestraling
Om het fluence-afhankelijke effect te beoordelen, werden de blootstellingsduur van blauw licht ingesteld op 2 minuten, 5 minuten, 10 minuten, 15 minuten, 20 minuten en 30 minuten. De antimicrobiële activiteit werd geëvalueerd met CFU-enumeratie zoals hierboven, waardoor analyse van dosisafhankelijke relaties mogelijk was.
7. Blauwlicht-LED-effectiviteit in een aerosolkamer die nosocomiale omstandigheden simuleert
Een aangepaste acryl-aerosolkamer, onder gecontroleerde omgevingsomstandigheden, werd gebruikt om nosocomiale luchtblootstelling te simuleren (Figuur 4). Aerosoliseerde microbiële suspensies (~1,5 x 106 CFU/mL) werden geïntroduceerd met een vernevelaar, en synthetische huidstalen werden 30 minuten blootgelegd. Het blauwe licht werd gedurende de belichting op de stalen gericht (10 μW/cm², 20 cm afstand). In het controle-experiment werden identieke belichtingscondities toegepast, maar het BL-LED-apparaat bleef uitgeschakeld. De dichtheid van microbiële cellen in de aerosolkamer werd gemonitord met behulp van metingen van de fall-out activiteit, waarbij de agarplaten vóór blootstelling in de kamer werden geplaatst. Levensvatbare microbiële cellen die aan de synthetische huidstalen (2 cm x 2 cm) zijn vastgehecht, werden gekwantificeerd met behulp van standaard plaattellingsanalyse zoals hierboven beschreven. Deze lage bestraling (10 μW/cm²) werd gekozen om echte omgevingslichtomstandigheden in de gezondheidszorg na te bootsen, waar continue bestraling met hoge intensiteit niet haalbaar is.
8. Optische transmissie en testen van ingebedde kolonies
- Optische transmissie via synthetisch huidsubstraat
Om de penetratie van blauw licht door synthetische huid te kwantificeren, werd de bestraling gemeten met een gekalibreerde optische vermogensmeter die op het behandelvlak was geplaatst. BL-intensiteit (405 nm, 30 mW/cm²) werd gemeten met en zonder gehydrateerde synthetische huidstalen horizontaal geplaatst tussen de LED en de detector. Transmissie (%) werd berekend als de verhouding van doorgegeven bestraling (met huid) tot invallende bestraling (geen huid).
De transmissie onder waterige omstandigheden werd geëvalueerd met een UV-Viz spectrofotometer. Een gehydrateerde synthetische huidstrip werd verticaal in een standaard polystyreencuvet geplaatst, gevuld met gedeïoniseerd water. De cuvette gevuld met water diende alleen als blanke plek. De absorptie bij 405 nm werd geregistreerd, en het percentage transmissie werd berekend met %T = 10(-A) × 100.
- Functionele validatie met behulp van embedded colony assay
Oppervlakte- en ingebedde microbiële reductie-assays werden uitgevoerd als functioneel correlaat van transmissie, waarbij swatches op één oppervlak werden geïnënt maar van de tegenoverliggende (onder)zijde werden bestraald om microben onder het huidoppervlak te simuleren. CFU's werden gekwantificeerd zoals hierboven beschreven in de sectie over antimicrobiële effectiviteit.
9. FT-IR-spectroscopie voor synthetische huiddegradatie na blootstelling aan blauw licht en UV-C
Om mogelijke chemische en structurele veranderingen aan de collageen-gebaseerde synthetische huidmatrix door lichtblootstelling te beoordelen, werd Fourier Transform Infrarood (FT-IR) spectroscopie uitgevoerd. Synthetische huidswatches (2 cm × 2 cm) werden volgens de fabrikantinstructies gehydrateerd, identiek aan swatches die in de microbiële reductie-assays worden gebruikt. Gehydrateerde monsters werden blootgesteld aan ofwel 405 nm blauw licht (30 mW/cm²) of 265 nm UV-C (3 mW/cm²) gedurende 15 minuten (standaardbelichting, 27 J/cm²) of 60 min (worstcase-stressconditie). Na bestraling werden de monsters voorzichtig gedeppt om oppervlaktevocht te verwijderen en onmiddellijk geanalyseerd met FT-IR.
10. ATR-FTIR-meting
Spectra werden verkregen met een IR-spectrofotometer uitgerust met een compatibele analysesoftware. Alle monsters werden geanalyseerd met behulp van de Attenuated Total Reflectance (ATR) iD7-module. Om spectrale veranderingen die toe te schrijven zijn aan bestraling te isoleren, (1) werd een directe spectrale vergelijking uitgevoerd tussen onbehandelde controles en bestraalde monsters. (2) Baseline-afgetrokken vergelijkingen werden uitgevoerd door de onbehandelde controleproef als achtergrondreferentie te gebruiken voordat de bestraalde monsters werden gescand, waardoor alleen de nieuwe of gewijzigde pieken zichtbaar waren.
Deze dubbele aanpak vermindert topografische ruis en verbetert de detectie van subtiele veranderingen in amide- en vingerafdrukgebieden. Hydratatieniveau, swatchdikte en oriëntatie werden gestandaardiseerd voor alle monsters om spectrale variabiliteit te verminderen. Elke belichtingsconditie (controle, BL-15 min, BL-60 min, UV-15 min, UV-60 min) werd in drievoud gescand.
11. Statistische analyse
Alle experimenten werden uitgevoerd met onafhankelijke biologische driedubbele exemplaren, tenzij anders vermeld. De gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± standaarddeviatie (SD) of als gemiddelde met 95% betrouwbaarheidsintervallen (BI), zoals aangegeven in de figuurlegendes. De normaliteit van de gegevensverdeling werd beoordeeld met behulp van de Shapiro-Wilk-test. Paargewijze vergelijkingen tussen twee groepen (bijv. blauw licht versus UV-C, oppervlakte versus ingebedde kolonies) werden uitgevoerd met behulp van ongepaarde tweezijdige Student's t-tests. Voor vergelijkingen met meer dan twee voorwaarden of tijdstippen werd eenrichtingsvariantieanalyse (ANOVA) gevolgd door passende post-hoc testen. De specifieke statistische test die voor elke vergelijking wordt gebruikt, wordt aangegeven in de bijbehorende figuurlegende. Een p-waarde <0,05 werd als statistisch significant beschouwd.