Methodenartikel

Een eenvoudige microaspiratietechniek om somatische cellen te isoleren uit gecryopreserveerd paardenzaad als nucleaire donoren voor klonen

DOI:

10.3791/69404

⸱

19 december 2025

 ,  ,  , 
1Doctorado en Ciencias Biológicas y de la Salud, Universidad Autónoma Metropolitana, 2Departamento de Producción Agrícola y Animal, División de Ciencias Biológicas y de la Salud, Universidad Autónoma Metropolitana-Xochimilco, División de Ciencias Biológicas y de la Salud, 3Integrated Cell Culture & Bioimaging Laboratory, Division of Science, Mathematics & Agribusiness, Mayville State University, 4Conservation, Genetics & Biotech, LLC, 5Laboratorio de Manejo de la Reproducción Animal, Departamento de Producción Agrícola y Animal, División de Ciencias Biológicas y de la Salud, Universidad Autónoma Metropolitana-Xochimilco

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol biedt een eenvoudige microaspiratietechniek om levensvatbare somatische cellen (SC's) te isoleren uit cryopgereserveerd paardenzaad. In tegenstelling tot traditionele methoden voorkomt deze techniek lange in vitro-kweken en voorkomt het spermabesmetting, waardoor direct gebruik bij somatisch celklonen mogelijk wordt.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sperma is een complex vocht dat, naast spermatozoa, ook andere celpopulaties bevat, waaronder immuuncellen, onvolwassen mannelijke kiemcellen, epitheelcellen en fibroblasten. Deze cellen delen de diploïde conditie, waardoor ze geschikte kandidaten zijn als nucleaire donoren voor het klonen van somatische celkernoverdracht (SCNT). De generatie van levensvatbare embryo's en nakomelingen is aangetoond met behulp van deze cellen. Effectieve methoden om ze van sperma te isoleren zijn centrifugatie en osmotische gradiënttechnieken; echter, langdurige in vitro kweekperiodes zijn noodzakelijk om primaire culturen uit deze geïsoleerde cellen vast te stellen. Bovendien bevatten de genomen monsters een hoge hoeveelheid spermatozoa, wat de vestiging en het onderhoud van in vitro culturen belemmert. Tot nu toe zijn primaire culturen alleen succesvol opgebouwd uit verse spermamonsters, terwijl pogingen met cryoppreserve sperma consequent zijn mislukt. Deze beperking beperkt de mogelijkheid om klonen te genereren uit cryoppreserve spermamonsters aanzienlijk. De huidige studie stelt een eenvoudige microaspiratie-gebaseerde methodologie voor om somatische cellen te isoleren uit cryoppreserve equine sperma. Deze aanpak maakt het mogelijk om snel een voldoende aantal cellen terug te halen voor direct gebruik bij SCNT-kloonprocedures.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Somatische kernoverdracht klonen is een onschatbaar hulpmiddel voor het redden en vermenigvuldigen van individuen van zoötechnisch en wetenschappelijk belang. Talrijke cellijnen zijn gebruikt als nucleaire donoren, waaronder cellen afkomstig van huid, spieren, granulosa, lymfocyten en urinecellen 1,2,3,4. Interessant is dat sperma een nieuw alternatief is geworden voor het verzamelen van somatische cellen (SC's) die als nucleaire donoren voor klonenworden gebruikt 5,6. Deze bevinding is vooral belangrijk voor de redding van personen voor wie alleen sperma is bewaard gebleven. De vestiging van primaire culturen uit SC's geïsoleerd uit bevroren sperma is echter niet succesvol geweest en blijft tot op heden het grootste obstakel voor het verkrijgen van gekloonde dieren uit deze bron 7,8,9. Deze cellen ontstaan waarschijnlijk uit klierepitheel en het bekledingsslijmvlies van tubuli, uit zaadafscheidingen en—belangrijk—uit spermabesmetting met urine, waarbij laatstgenoemde een bekende bron is van somatische cellen met een hoog proliferatief en ongedifferentieerd potentieel3.

Verschillende methoden om SC's uit sperma te isoleren zijn geïmplementeerd, waaronder centrifugatie5, osmotische gradiënten 7,8,10 en flowcytometrie11. Somatische cellen, eenmaal geïsoleerd met deze methoden, vereisen echter nog steeds geoptimaliseerde voorwaarden voor hechting, groei en proliferatie8. De specifieke eisen van deze cellen maken in vitro kweek complexer, omdat langdurige incubatietijden nodig zijn voor de vestiging van primaire celculturen9. Bovendien verstoort de hoge concentratie zaadcellen in de monsters zowel het initieren als het onderhoud van deze culturen5.

In tegenstelling tot eerder beschreven benaderingen biedt deze microaspiratietechniek verschillende duidelijke voordelen. Het maakt de selectie van SC's mogelijk op basis van grootte en morfologie12 en maakt het herstel van kernen mogelijk uit zowel levensvatbare als niet-levensvatbare cellen, een strategie die met succes is aangetoond met bevroren weefsel zonder cryoprotectanten13 en gevriesdroogde voortplantingscellen 14,15,16. Belangrijk is dat SC's direct na het ontdooien van sperma kunnen worden gebruikt, waardoor het risico op ploïdfouten die typisch worden geassocieerd met uitgebreide in vitro kweek van primaire somatische cellen voor dierkloneringvermindert 17,18. Specifiek richt de techniek zich op cryopgereserveerd paardenzaad, waardoor direct voldoende SC's kunnen worden verzameld voor SCNT12.

De fabricage van micropipetten en de ontwikkeling van microaspiratietechnieken zijn de afgelopen decennia aanzienlijk gevorderd. Het gebruik van deze instrumenten maakt precieze manipulatie van gameten, embryo's en hun cytostructuren mogelijk, waardoor nieuwe mogelijkheden ontstaan op het gebied van voortplantingsbiotechnologie (https://www.jove.com). Micromanipulatietechnieken maken het mogelijk om cellulaire mechanische eigenschappen te evalueren en bieden waardevolle inzichten in hun fysiologische toestand19,20, maar dit vakgebied is nog relatief onontkend.

Tot nu toe heeft geen enkel onderzoek een effectieve techniek gevonden om SC's van sperma te isoleren met welke variant van micromanipulatieprocedures dan ook. Gezien de beperkingen van conventionele isolatiemethoden stelt deze studie een praktisch microaspiratie-gebaseerd protocol voor om SC's te isoleren uit cryoppreserve equine sperma, waardoor hun direct gebruik mogelijk wordt in somatische kloonprocedures na verzameling.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gecryopreserveerde spermamonsters, die meer dan 19 jaar bewaard zijn in vloeibare stikstof, zijn verkregen van commerciële distributeurs die zijn goedgekeurd door de relevante veterinaire autoriteiten in Mexico, in overeenstemming met de Mexicaanse officiële standaard NOM-027-ZOO-1995, die het zoosanitaire proces van sperma van huisdieren regelt. Alle spermamonsters, of ze nu gebruikt of ongeschikt voor analyse, werden geïnactiveerd en afgevoerd volgens institutionele bioveiligheidsprotocollen en toepasselijke regelgeving, waaronder NOM-087-ECOL-SSA1-2002 voor het beheer van biologisch-infectieueel afval in Mexico. Restzuur (HF) werd veilig geneutraliseerd onder een dampkap door het langzaam over te brengen in een plastic container en geleidelijk kleine porties CaCO3 of Ca(OH)2 toe te voegen totdat de bruisende energie stopte en onoplosbare CaF2 ontstond. De pH van de geneutraliseerde suspensie werd bevestigd tussen 6 en 8 voordat het volgens lokale regelgeving als anorganisch chemisch afval werd behandeld. De reagentia en de gebruikte apparatuur worden vermeld in de Materiaaltabel.

1. Micropipetnaaldfabricage voor somatische celisolatie

  1. Selecteer borosilicaatglascapillairen (1,0 mm O.D. × 0,78 mm I.D. × 100 mm).
  2. Gebruik een micropipettrekker om fijnpuntige haarvaten te produceren. Stel het snijpunt aan om de tipdiameter te variëren.
  3. Steek de capillair in de trekker en vergrendel deze stevig.
  4. Verwijder de micropipet voorzichtig na het trekken en plaats hem horizontaal op de microforge.
  5. Lijn de verwarming en micropipet uit binnen het gezichtsveld van de microscoop.
  6. Zoek het snijpunt met behulp van het oculair-richtkruis (Figuur 1A, B).
  7. Breng de micropipettip in contact met de glazen parel (op de verwarmingsfilament).
  8. Verhoog de hitte geleidelijk totdat de punt in de kraal smelt.
    1. Zet de verwarming uit.
    2. Laat de punt aan de kraal hechten en losmaken.
      OPMERKING: Het is niet nodig om de micropipet te buigen; het kan in zijn rechte vorm worden gebruikt. Als de operator deze verkiest, kan er echter een hoek ontstaan (Figuur 1C).
  9. Glad de punt niet, want deze stap is niet nodig voor de procedure.
  10. Maak de pipetpunten schoon door elke tip achter elkaar ~10 seconden onder te dompelen in:
    1. 20% waterstoffluoridezuur (HF).
      VOORZICHTIG: Zoutwaterstoffluoride is zeer giftig en corrosief. Gebruik de persoonlijke beschermingsmiddelen die door de leverancier zijn aangegeven. Leg de nadruk op het gebruik van oog- en gezichtsbescherming, handschoenen en een laboratoriumjas, en werk altijd in een dampkap.
    2. Steriel dubbel gedestilleerd water.
    3. Absolute ethanol.
      OPMERKING: Om het reinigen van pipetpunten te vergemakkelijken, bereid de hierboven genoemde oplossingen voor in 15-mL steriele Corning-buizen.
  11. Droog micropipetten in een oven op 50 °C.
  12. Bewaar micropipetten in een steriele container.

2. Microaspiratie-opstelling

  1. Controleer of het microaspiratiesysteem in goede staat is, met de microaspiratiejoystick gecentreerd op het bedieningspaneel.
  2. Voor systemen die olie gebruiken, zorg ervoor dat er geen luchtbellen in het systeem zitten, omdat deze de bewegingsprecisie kunnen beïnvloeden.
  3. Plaats de somatische celaspiratie-micropipette in de vasthoudende manipulator aan de dominante handzijde van de operator.
    OPMERKING: Vervang de micropipet door een nieuwe als de punt verstopt raakt tijdens somatische celverzameling.

3. Ontdooien en verdunning van cryopreserveerd paardensperma

  1. Haal de rietjes uit vloeibare stikstof, laat ze 10 seconden aan de lucht blootstellen en ontdooi 30 seconden bij 37 °C.
  2. Eerste spermaverdunning: Neem een monster van het ontdooide sperma (250 μL) en verdun met 1,0 mL DMEM/F12 medium, aangevuld met 10% foetaal rundserum, 0,1 mg/mL rundereserumalbumine, 12,5 μM β-mercaptoethanol en 1% antibioticum-antimycoticum.
    1. Incubeer het mengsel op 37 °C gedurende 30 minuten.
  3. Tweede spermaverdunning: Neem 25 μL uit de eerste verdunning, verdun het in 975 μL 1x DPBS aangevuld met 0,1 mg/mL poly(vinylalcohol) (PVA) of polyvinylpyrrolidon (PVP), deponeer het in een 1,5 mL microcentrifugebuis en meng voorzichtig.
    1. Houd dit mengsel gedurende het hele celverzamelproces op 37 °C.

4. Bereiding van gerechten voor het verzamelen van SC's

  1. Verzamel de SC's met twee deksels uit kweekschalen met een diameter van 35 mm.
  2. Bereid het eerste deksel als volgt voor (deksel #1, Figuur 2A).
    1. Neem 100 μL van de tweede spermadusverdun en deponeer deze in het midden van het ooglid (zie Figuur 2A).
    2. Maak een tweede microdruppel (10 μL) van 1x DPBS, aangevuld met 0,1 mg/mL PVA of PVP bovenop de eerste druppel (zie Figuur 2A).
    3. Bedek beide microdruppels volledig met paraffineolie om verdamping te voorkomen en om temperatuurstabiliteit te behouden tijdens het aspiratie van de SC.
  3. Bereid het tweede deksel voor om cellulair afval en bijbehorende spermatozoa te verwijderen (deksel #2, Figuur 2B).
    1. Plaats drie druppels van 30-50 μL 1x DPBS, aangevuld met 0,1 mg/mL PVA of PVP, in het midden van het deksel; Bedek ze niet met minerale olie.
      OPMERKING: Bereid deze kweekschotel pas nadat alle somatische cellen zijn geselecteerd om veranderingen in de fysisch-chemische eigenschappen van de DPBS-oplossing door luchtblootstelling te voorkomen.
  4. Voer alle microaspiratiestappen uit onder een omgekeerde microscoop bij kamertemperatuur. Vermijd plotselinge temperatuurwisselingen.

5. Microaspiratieprocedure voor het isoleren van SC's uit cryopreserved equine sperma

  1. Plaats het eerste deksel (deksel #1, Figuur 2A) op het microscooppodium, klaar om de SC's te verzamelen.
  2. Selecteer een micropipet met de juiste diameter om de SC's op te vangen en deze aan te sluiten op het mechanische aspiratiesysteem.
  3. Steek de micropipet voorzichtig in de microdrop en lijn deze uit met de onderkant van het deksel van de schaal. Zodra de pipet een geaspireerd kweekmedium heeft, begin je met het individuele vangen van SC's.
  4. Onderaan de schotel moeten verschillende celmorfologieën zichtbaar zijn (Figuur 3).
  5. Plaats de micropipettip naast elke SC en aspireer deze onder negatieve druk. Aspiraat alle ronde en langgerekte cellen, ongeacht hun grootte. Het aspiratievolume varieert tussen de opnames van SC's.
  6. Na het opvangen van 10 cellen deponeren we deze in de microdrop bovenop (10μL) (Figuur 2A). Herhaal deze stap totdat het vereiste aantal SC's voor het kloonexperiment is bereikt.
  7. Houd alle gevangen somatische cellen in deze microdrop gedurende het verzamelproces.
  8. Zodra het vereiste aantal SC's voor klonen is verkregen, voer je een eenvoudige wasprocedure uit met microdruppels om bijbehorende sperma, cellulair afval en microbiële verontreinigingen te verwijderen.
  9. Neem het deksel van het tweede gerecht en voer een sequentiële drie-stappen wasbeurt uit van de SC's (deksel #2, Figuur 2B):
    1. Vang de somatische cellen met een micropipet en plaats ze zorgvuldig op het oppervlak van de eerste druppel. Laat ze 3-5 minuten rusten (Figuur 2B; Drop #1).
    2. Herhaal stap 5.9.1 en doe ze in de tweede druppel (Figuur 2B; Drop #2).
    3. Herhaal stap 5.9.1 en zet de somatische cellen in de derde druppel (Figuur 2B; Drop #3).
  10. Als laatste stap worden de geïsoleerde somatische cellen afgezet in een laatste microdruppel, voorbereid voor later gebruik bij somatische celkernoverdrachtsprocedures (Figuur 4D).
    OPMERKING: Aspiraat SC's in het kleinst mogelijke medium volume tijdens elke hervangst om sperma, vuil en microbiële verontreinigingen te minimaliseren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tabel 1 toont aan dat de microaspiratietechniek somatische cellen efficiënt terugwint uit cryopreserved equine sperma, met vangstsnelheden variërend van 317,7 ± 9,60 tot 424,7 ± 33,65 cellen per uur over drie hengsten. Hengst #03 had de hoogste opbrengst, wat de effectiviteit van de methode aantoonde, zelfs met langdurig opgeslagen monsters. De gegevens geven aan dat de techniek consequent en effectief somatische cellen van sperma isoleert, en de gemiddelde vangstsnelhede...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Micromanipulatie van cellen en gameten heeft het mogelijk gemaakt complexe geassisteerde voortplantingstechnieken te vereenvoudigen. Voorbeelden hiervan zijn somatisch klonen door Handgemaakt Klonen21, geassisteerd uitkomen22, intracytoplasmatische sperma-injectie (ICSI)23 en pronucleaire microinjectie in zygoten24, onder andere.

De ontwikkeling van effectieve metho...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat zij geen belangenconflicten hebben.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs bedanken het Laboratorium voor Voortplantingsbeheer, afdeling Landbouw en Dierproductie, Universidad Autónoma Metropolitana-Xochimilco (UAM-X), voor hun technische en logistieke ondersteuning.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
2 beta MercaptoethanolSIGMAM7522Somatisch celcultuur
1x DPBSGIBCOREF-21600010Somatisch cel manipulatie
Absolute ethanolHYCELEL CRISOL 50181-1L73Voor het vervaardigen van pipetten
Antibioticum-antimycoticum 100xINVITRO SA. MéxicoSomatisch celcultuur
Borosilicaat haarvaten (1,0 mm O.D. × 0,78 mm I.D. × 100 mm Lengte)HARVARD APPARATUS, USAEC1-30-0035Voor het vervaardigen van pipetten
BSASIGMAA3311Somatisch celcultuur
DMEM/F12 mediumGIBCOREF-12500-062Somatisch celcultuur
Cryo-bewaarde paarden sperma monsterDe cryo-bewaarde sperma monsters werden verkregen van een commerciële distributeur en waren al meer dan 19 jaar in vloeibare stikstof bewaard. Alle bevroren paarden sperma monsters werden verkregen van commerciële distributeurs die geautoriseerd waren door de relevante veterinaire autoriteiten in Mexico, in overeenstemming met de Mexicaanse officiële norm NOM-027-ZOO-1995, Zoösanitaire Proces van Sperma van Huisdieren.
OogstukHulpmiddel voor het vervaardigen van pipettenVereist materiaal
Fetaal runder serumGIBCOREF-26140-079Somatisch celcultuur
FluorwaterstofzuurSIGMA-ALDRICH339261Voor het vervaardigen van pipetten
Inverteerbare optische microscoopEclipse, TE 200NIKONMicromanipulatie van somatische cellen
Laboratorium drogerHulpmiddel voor het vervaardigen van pipettenVereist materiaal
MicrosoldeertoestelHulpmiddel voor het vervaardigen van pipettenVereist materiaal
Micromanipulatorset voor Inverteerbare MicroscoopMicromanipulatie van cellenVereist materiaal
Micropipet aftrekkerP-97, SUTTER INSTRUMENTHulpmiddel voor het vervaardigen van pipettenGebruik de volgende instellingen—Verwarming: 720; Trek: 30; Snelheid: 50; Tijd: 220; Druk
Mineraal olieSIGMAM8410Somatisch cel manipulatie
Nunclon cel cultuur schaaltjes, diam. × H 35 mm × 10 mmNUNCLONNunc 153066
PVASIGMAP8136Somatisch celcultuur
PVPSIGMAP5288Somatisch celcultuur
Trypan blauw oplossing 0,4%GIBCOREF- 15250061Cel kleurstof

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pandey, A., Gupta, S. C., Gupta, N. Comparative potential of cultured skin fibroblast, cumulus, and granulosa cell to produce somatic cell nuclear transfer (SCNT) preimplantation embryos in buffaloes (Bubalus bubalis) in relation to gene expressions. Cell Reprogram. 12 (3), 357-368 (2010).
  2. Galli, C., Duchi, R., Moor, R. M., Lazzari, G. Mammalian leukocytes contain all the genetic information necessary for the development of a new individual. Cloning. 1 (3), 161-170 (1999).
  3. Olsson, P. O., Yeonwoo, J., Park, K., Yoo, Y. M., Hwang, W. S. Live births from urine derived cells. PLoS One. 18 (1), e0278607(2023).
  4. Vignon, X., et al. Developmental potential of bovine embryos reconstructed from enucleated matured oocytes fused with cultured somatic cells. C R Acad Sci III. 321 (9), 735-745 (1998).
  5. Nel-Themaat, L., et al. Isolation, culture and characterisation of somatic cells derived from semen and milk of endangered sheep and eland antelope. Reprod Fertil Dev. 19 (4), 576-584 (2007).
  6. Kjelland, M. E., Liu, J., Hyatt, D., Kraemer, D. Collection, isolation, and culture of somatic cells from avian semen. Avian Biol Res. 6 (4), 255-260 (2013).
  7. Nel-Themaat, L., et al. Cloned embryos from semen. Part 1: in vitro proliferation of epithelial cells on embryonic fibroblasts after isolation from semen by gradient centrifugation. Cloning Stem Cells. 10 (1), 143-160 (2008).
  8. Liu, J., et al. Evaluation of culture systems for attachment and proliferation of epithelial cells cultured from ovine semen. Anim Reprod Sci. 115 (1-4), 49-57 (2009).
  9. Liu, J., et al. Embryo production and possible species preservation by nuclear transfer of somatic cells isolated from bovine semen. Theriogenology. 74 (9), 1629-1635 (2010).
  10. Saini, M., et al. Isolation and culture of epithelial cells from stored buffalo semen and their use for the production of cloned embryos. Reprod Fertil Dev. 31 (10), 1581-1588 (2019).
  11. Brom-de-Luna, J. G., Canesin, H. S., Wright, G., Hinrichs, K. Culture of somatic cells isolated from frozen-thawed equine semen using fluorescence-assisted cell sorting. Anim Reprod Sci. 190, 10-17 (2018).
  12. Ramos, B., Rodríguez, A. A., Rosales, A. M., Montiel, A. J., Hernández, J. E. Identification of somatic cell populations in cryopreserved equine semen as a source of donor nuclei for somatic cloning: preliminary results. Reprod Fertil Dev. 37 (1), (2025).
  13. Moulavi, F., et al. Interspecies somatic cell nuclear transfer in Asiatic cheetah using nuclei derived from post-mortem frozen tissue in absence of cryo-protectant and in vitro matured domestic cat oocytes. Theriogenology. 90, 197-203 (2017).
  14. Wakayama, S., Ito, D., Ooga, M., Wakayama, T. Production of mouse offspring from zygotes fertilized with freeze-dried spermatids. Sci Rep. 12 (1), 18430(2022).
  15. Wakayama, S., Ito, D., Hayashi, E., Ishiuchi, T., Wakayama, T. Healthy cloned offspring derived from freeze-dried somatic cells. Nat Commun. 13 (1), 3666(2022).
  16. Loi, P., Fulka, J., Hildebrand, T., Ptak, G. Genome of non-living cells: Trash or recycle. Reproduction. 142 (4), 497-503 (2011).
  17. Wakayama, S., Wakayama, T., Wells, D. N. Encyclopedia of Life Sciences. , 1-10 (2023).
  18. Lanza, R., et al. Extension of cell life-span and telomere length in animals cloned from senescent somatic cells. Science. 288, 665-669 (2000).
  19. González-Bermúdez, B., Guinea, G. V., Plaza, G. R. Advances in micropipette aspiration: applications in cell biomechanics, models, and extended studies. Biophys J. 116 (4), 587-594 (2019).
  20. Hochmuth, R. M. Micropipette aspiration of living cells. J Biomech. 33 (1), 15-22 (2000).
  21. Vajta, G., et al. Production of a healthy calf by somatic cell nuclear transfer without micromanipulators and carbon dioxide incubators using the handmade cloning (HMC) and the submarine incubation system (SIS). Theriogenology. 62 (8), 1465-1472 (2004).
  22. Alteri, A., et al. Revisiting embryo assisted hatching approaches: A systematic review of the current protocols. J Assist Reprod Genet. 35 (3), 367-391 (2018).
  23. Briski, O., Salamone, D. F. Past, present and future of ICSI in livestock species. Anim Reprod Sci. 246, 106925(2022).
  24. Wall, R. J. Pronuclear microinjection. Cloning Stem Cells. 3 (4), 209-220 (2001).
  25. Selokar, N. L., et al. Hope for restoration of dead valuable bulls through cloning using donor somatic cells isolated from cryopreserved semen. PLoS One. 9 (3), e90755(2014).
  26. Selokar, N. L., et al. Buffalo (Bubalus bubalis) SCNT embryos produced from somatic cells isolated from frozen-thawed semen: Effect of trichostatin A on the in vitro and in vivo developmental potential, quality and epigenetic status. Zygote. 24 (4), 549-553 (2016).
  27. Guevorkian, K., Maître, J. L. Micropipette aspiration: A unique tool for exploring cell and tissue mechanics in vivo. Methods Cell Biol. 139, 187-201 (2017).
  28. Duah, E. K., et al. Production of hand-made cloned buffalo (Bubalus bubalis) embryos from nonviable somatic cells. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 52 (10), 983-988 (2016).
  29. Loi, P., et al. Nuclei of nonviable ovine somatic cells develop into lambs after nuclear transplantation. Biol Reprod. 67 (1), 126-132 (2002).
  30. Fahrudin, M., Otoi, T., Suzuki, T. Developmental competence of bovine embryos reconstructed by the transfer of somatic cells derived from frozen tissues. J Vet Med Sci. 63 (10), 1151-1154 (2001).
  31. Podico, G., et al. Single-layer colloid centrifugation as a method to process urine-contaminated stallion semen after freezing-thawing. J Equine Vet Sci. 87, 102910(2020).
  32. Zhang, Y. T., et al. Evaluation of porcine urine-derived cells as nuclei donor for somatic cell nuclear transfer. J Vet Sci. 23 (2), e40(2022).
  33. Mizutani, E., et al. Generation of cloned mice and nuclear transfer embryonic stem cell lines from urine-derived cells. Sci Rep. 6, 23808(2016).
  34. Long, S., Kenworthy, S. Round cells in diagnostic semen analysis: a guide for laboratories and clinicians. Br J Biomed Sci. 79, 10129(2022).
  35. Johanisson, E., Campana, A., Luthi, R., de Agostini, A. Evaluation of 'round cells' in semen analysis: a comparative study. Hum Reprod Update. 6 (4), 404-412 (2000).
  36. Graber, M., Lane, B., Lamia, R., Pastoriza-Munoz, E. Bubble cells: Renal tubular cells in the urinary sediment with characteristics of viability. J Am Soc Nephrol. 1 (7), 999-1004 (1991).
  37. Rahmanian, N., Bozorgmehr, M., Torabi, M., Akbari, A., Zarnani, A. H. Cell separation: Potentials and pitfalls. Prep Biochem Biotechnol. 47 (1), 38-51 (2017).
  38. Håård, M. Use of frozen stallion semen in Europe. Acta Vet Scand Suppl. 88, 123-127 (1992).
  39. Klug, E., Treu, H., Hillmann, H., Heinze, H. Results of insemination of mares with fresh and frozen stallion semen. J Reprod Fertil Suppl. 23, 107-110 (1975).
  40. Pukazhenthi, B., Comizzoli, P., Travis, A. J., Wildt, D. E. Applications of emerging technologies to the study and conservation of threatened and endangered species. Reprod Fertil Dev. 18 (1-2), 77-90 (2006).
  41. Swanson, W. F., Magarey, G. M., Herrick, J. R. Sperm cryopreservation in endangered felids: developing linkage of in situ-ex situ populations. Soc Reprod Fertil Suppl. 65, 417-432 (2007).
  42. Lagutina, I., Fulka, H., Lazzari, G., Galli, C. Interspecies somatic cell nuclear transfer: Advancements and problems. Cell Reprogram. 15 (5), 374-384 (2013).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Microaspiration TechniqueSomatic Cell IsolationCryopreserved Equine SemenNuclear Donor CellsSomatic Cell Nuclear TransferEquine CloningCell Morphology SelectionMicropipette AspirationSequential Cell WashingDiploid Cell Recovery

Gerelateerde artikelen