Methodenartikel

Peroxisoomkleuring in zoogdiercellen met behulp van peroxisoomspecifieke probes

DOI:

10.3791/69405

⸱

19 december 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Biological Sciences, University of Southampton, 2The Mina and Everard Goodman Faculty of Life Sciences, Bar-Ilan University, 3Biosciences, Faculty of Health and Life Sciences, University of Exeter, 4Institute of Bioengineering, Faculty of Life Sciences, Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL), 5Biomolecular Screening Facility, Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL), 6Conquest

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

PeroxiSPY-probes worden gebruikt om peroxisomen in zoogdiercellen te detecteren. Hier demonstreren we hoe de probes worden gebruikt om peroxisomen in levende en gefixeerde cellen te kleuren.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Peroxisomen zijn alomtegenwoordige organellen met essentiële rollen in de menselijke gezondheid, en hun disfunctie leidt tot een spectrum van genetische aandoeningen. Visualisatie van peroxisomen is essentieel om peroxisoomdysfunctie te identificeren; de vooruitgang is echter beperkt door het ontbreken van peroxisoomspecifieke probes. Door PeroxiSPY te ontwikkelen, peroxisoomspecifieke probes die natuurlijke peroxisoommetabolieten nabootsen, maakten we realtime detectie, tracking en kwantificering van peroxisoomdynamiek in levende zoogdiercellen mogelijk. Daarnaast onthullen de toepassingen van deze techniek op patiëntcellen met peroxisoomaandoeningen pathologische fenotypen. Hier bieden we een gedetailleerd protocol voor de detectie van peroxisomen in levende zoogdiercellen, evenals voor de detectie van peroxisomen na kleuring in gefixeerde cellen. We demonstreren hoe peroxisomen in levende cellen kunnen kleuren met peroxisoomspecifieke probes, met de nadruk op de voorbereiding van cellen, timing van de procedure, reproduceerbaarheid en probleemoplossing. Deze probes maken snelle, specifieke en niet-toxische detectie van peroxisomen in levende cellen mogelijk, waarmee ze een unieke, kwantitatieve methode bieden om de functie van peroxisoom en de disfunctie ervan bij peroxisoomgerelateerde aandoeningen te beoordelen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het peroxisoom is het meest voorkomende eukaryote organel, met sommige cellen die meer dan duizend peroxisomen1. Hun functies zijn cruciaal voor de ontwikkeling van organismen en metabole aanpassing 1,2, wat blijkt uit een reeks menselijke peroxisoomaandoeningen, meestal ongeneeslijke neurodegeneratieve en neurometabole aandoeningen bij jonge kinderen 3,4. Voor zover wij weten, was er eerder een gebrek aan selectieve methoden om peroxisomen te labelen in levende cellen en weefsels. Deze instrumenten zijn van onschatbare waarde voor onderzoek en diagnostische toepassingen, omdat ze directe en kwantitatieve metingen van verschillende aspecten van peroxisoomvorming en functie6 mogelijk maken. Deze probes zijn veelzijdig genoeg om enerzijds een kwantitatieve meting van peroxisoomfunctie in cellen te geven, en anderzijds kunnen ze worden ingezet in translationele effectiviteitstests of als diagnostiek voor peroxisoomaandoeningen6. PeroxiSPY-kleuring is een snelle, specifieke, niet-cytotoxische techniek voor niet-invasieve detectie van peroxisoomen in levende. Hier beschrijven we hoe peroxisomen in zoogdiercellijnen gekleurd kunnen worden met peroxisoomprobes (de sondes hebben ook specifieke peroxisomale kleuring aangetoond in zebravisembryo's, maar zijn niet geschikt voor kleuring van peroxisomen in plant-Arabidopsis thaliana-cellen 6). De kleuring kan in minder dan 10 minuten worden uitgevoerd. De sonde kan vervolgens urenlang worden gedetecteerd of worden vastgezet met een paraformaldehydefixatieprotocol voor verdere immunokleuring.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Kleuring van levende cellen

  1. Celcultuurvoorbereiding voor live-celbeeldvorming (duur: 24 uur)
    OPMERKING: De studie volgde de standaard celkweekprotocollen voor alle experimenten. Cellijnen werden behouden in DMEM of DMEM/F12 voor SH-SY5Y, aangevuld met 10% foetaal rundereserum (FBS), 1% penicilline/streptomycine, bij 37 °C en 5%CO-2. Sommige beeldvormingssystemen zijn gevoelig voor de samenstelling van het medium. Als de microscoop het signaal van fenolrood in het medium detecteert, gebruik dan fenolroodvrije alternatieven. Daarnaast, als de microscoop niet is uitgerust met eenCO2-kamer , vervang dan het medium door een medium met HEPES (pH 7,4).
    1. Een dag voor het experiment splitst je de cellen in een glasplat om de volgende dag een samenvloeiing van 30-70% te bereiken.
      OPMERKING: In dit protocol werden 4-well 35 mm platen gebruikt.
      1. (Kritisch) Gebruik geen uitgehongerde of gestreste cellen om te splitsen voor het experiment. Zorg ervoor dat de cellijnen regelmatig verse mediawissels ondergaan (minstens elke 2-3 dagen) en gesplitst worden voordat ze 90% confluentie bereiken. Het doel is een gezonde cellijn te hebben om een uniforme kleuring te garanderen.
        OPMERKING: Sommige cellen, bijvoorbeeld stamcellen, vereisen een glascoating met een geschikte laag, bijvoorbeeld matrigel, die de kleuring niet belemmert.
  2. Voorbereiding van de beeldvormingsopstelling (duur: 1 uur)
    OPMERKING: Het in beeld brengen van organellen en organeldynamiek vereist een hoge ruimtelijke resolutie. Voor dit protocol werd een confocale microscoop gebruikt met een GaAsP-fotomultipliermodule, eenCO2-kamer en een temperatuurregelapparaat. De beeldvorming werd uitgevoerd met een bidirectionele galvanometer-scanning mode met een CFI Plan Apo Lambda 60x olie NA 1.42 objectief, en een 561 nm laser (50 mW) werd gebruikt voor de 555 probe. Gebruik een 640 nm laser of iets gelijks voor de 650 probe. Peroxisomen werden zichtbaar in menselijke cellijnen. De incubatietijd met de probes kan verschillen per cellijn. Het wordt aanbevolen om de timing te optimaliseren door cellen op verschillende tijdstippen na het kleuren te visualiseren (Figuur 2A).
    1. Start het confocale systeem. Zorg ervoor dat deCO-2 en temperatuur (37 °C) gedurende 20 minuten gestabiliseerd zijn voordat de kleuring wordt gestart en de cellen in de microscoop worden gebracht.
      OPMERKING: (Kritisch) Het is essentieel om te verifiëren dat cellen gedurende het hele experiment gezond blijven door visuele inspectie en dat de pH en temperatuur van het medium worden gehandhaafd. Dit kan worden bereikt door regelunits te gebruiken voor parameters en visueel de mediakleur te inspecteren, als fenolrood wordt gebruikt. Daarvoor kunnen temperatuur- enCO2-regelaars worden gebruikt.
    2. Stel de confocale microscoopsoftware in. Start de software en zet de 561 nm laser aan voor de 555 probe kleuring. Pas de parameters van acquisitie en laservermogen aan. Dit protocol gebruikt 1% laservermogen, HV (versterking) van 100, en een resolutie van 1024 1024 pixels met 3 zoom om de cellen te fotograferen.
  3. Peroxisoomkleuring (Duur: 1-5 min)
    1. Pipette een aliquot van de probe voor een uiteindelijke werkconcentratie van 1 μM, bijvoorbeeld voor 0,5 mL media, pipet 0,5 μL van de probe.
    2. Selecteer de put om te beitsen en label deze aan de buitenkant met een stiftpen.
    3. Vanuit de gekozen put pipetteer je het hele (0,5 mL) medium en doe het in een microcentrifugebuis met de probe aliquot uit stap 1.3.1.
      OPMERKING: Het is cruciaal om in deze stap al het materiaal uit de put te verwijderen om een uniforme beitsing te garanderen.
    4. Pipette drie keer omhoog en omlaag om het medium en de sonde te mengen. Aspireer het volledige mengsel in de pipet.
      OPMERKING: Mengen door vortexen kan worden gebruikt in plaats van pipetteren.
    5. Doeper het mengsel druppel voor druppel terug in de gekozen put, waarbij de pipet contact maakt met de wand van de put. Na het terugbrengen van het mengsel in de put, start je een timer van 10 minuten.
    6. Sluit het deksel, voeg een druppel dompelolie toe op het objectief (dit protocol gebruikt 60× olieobjectief) en plaats de plaat op de microscoop voor beeldvorming.
      OPMERKING: Het optimaliseren van de concentratie van de sonde per cellijn wordt aanbevolen om een uniforme kleuring te garanderen. Testen op 0,25, 0,5, 1 en 2 μM gedurende 5-20 minuten wordt aanbevolen; lagere concentraties kleuren meestal met een lagere achtergrond (Figuur 2A). Afhankelijk van de gevoeligheid van de cellijn en de microscoopdetector kunnen gekleurde cellen worden gefotografeerd van al 5 minuten na toevoeging van de sonde tot 24 uur na toevoeging. In sommige gevallen, bijvoorbeeld bij beeldvorming van stamcellen, kan de visualisatie van cellen meer dan 180 minuten na de toevoeging van de probe worden uitgevoerd zonder verandering in het signaal. Op elk moment kan het medium worden aangepast om de sonde te verwijderen. Dit leidt tot een geleidelijk verlies van de kleuring binnen ongeveer 30 minuten voor HEK293T cellen.
  4. Confocale beeldvorming van peroxisomen in levende cellen (duur: 10 min-3 uur)
    1. Zodra de plaat op de microscoop is geplaatst, stel je de focus aan op de cellen in de gekleurde put en begin je met beeldvorming.
    2. Zodra de cellen scherp zijn, pas je de versterking (HV- of detectorgevoeligheid) en laservermogensinstellingen aan volgens standaard confocale microscooprichtlijnen.
    3. Vind en positioneer (zoom in) op de groep cellen. Na het focussen op de cellen, pas je de opnameparameters aan op de vereiste beeldkwaliteit.
      1. Stel de beeldparameters in voor beeldverwording: 0,5-1% laservermogen, 100 HV (versterking) in NIS-Elements Software. Controleer of het beeld niet oververzadigd is (als dat zo is, verander dan intensiteit en versterking).
      2. Selecteer de scangrootte. Maakt 1024 1024 px-beelden, scansnelheid (1/2-1/4), lijngemiddelde (2), zoom (3) die geschikt zijn voor de beeldvorming die wordt uitgevoerd.
        OPMERKING: Peroxisomen bewegen tijdens beeldverwerving, wat kan resulteren in artefacten. Aanbevolen parameters zijn geoptimaliseerd om de bewegingssporen te minimaliseren terwijl voldoende beeldkwaliteit wordt gegarandeerd voor kwantificatie. Bij het maken van een time-lapse zorg ervoor dat interval, duur en lussen worden opgegeven voordat de video wordt gestart. De sondes zijn fotostabiel.
    4. Verwerf en sla alle afbeeldingen op met toegankelijke labels (hier wordt .nd2 NIS-Elements Nikon Software-formaat gebruikt).

2. Kleuring van vaste cellen

  1. Celcultuurvoorbereiding voor live-celbeeldvorming (duur: 24 uur)
    OPMERKING: Standaard celkweekprotocollen werden voor alle experimenten gevolgd. Huh7-cellen werden behouden in DMEM/F12, aangevuld met 10% FBS, 1% penicilline/streptomycine, bij 37 °C en 5%CO-2.
    1. Een dag voor het experiment splits je de cellen in een plaat met dekfolies om de volgende dag een samenvloeiing van 30-70% te bereiken.
      OPMERKING: Zaad 50.000 cellen/put in 12-wellplaten met 18 mm coverslips, of 15.000 cellen/put in 24-well platen met 13 mm coverslips.
  2. Peroxisoomkleuring (Duur: 1-5 min)
    1. Verdunn de probe met nieuw medium tot een uiteindelijke werkconcentratie van 4 μM in een lege, lichtgevoelige microcentrifugebuis, bijvoorbeeld, voor 0,5 mL media, pipet 2 μL van de probe (standaardoplossing: 1 mM).
    2. Selecteer de put om te beitsen en label hem aan de buitenkant met een stiftpen.
    3. Uit de gekozen put aspireer je alle (0,5 mL) van het medium en vervang je dit door het probemedium uit stap 2.2.1. Doseer het sondemedium druppel voor druppel in de gekozen put, zodat de pipet contact maakt met de wand van de put.
    4. Na het terugvoegen van het mengsel in de put, incubeer je de cellen op 37 °C gedurende 10-15 minuten.
      OPMERKING: Vanaf dit moment zijn de cellen lichtgevoelig en moeten ze worden bedekt met aluminiumfolie.
  3. Post-kleuring fixatie en beeldvorming van peroxisomen in gefixeerde cellen
    1. Na het kleuren verwijder je voorzichtig het medium en was je de cellen twee keer met fosfaatgeboterde zoutoplossing (PBS).
    2. Breng 4% paraformaldehyde (PFA) oplossing aan in PBS op kamertemperatuur gedurende 20 minuten.
    3. Verwijder PFA voorzichtig in een speciaal aangewezen afvalcontainer. Was cellen één keer met PBS.
      WAARSCHUWING: PFA is giftig en moet worden afgevoerd volgens institutionele regelgeving.
    4. Om verder te gaan met immunofluorescentie, volgt u de onderstaande stappen
      1. Voeg 0,5% Triton-X toe (verdund in PBS) om de cellen te permeabiliseren. Laat het 2,5 minuut gaan.
      2. Verwijder Triton-X voorzichtig. Was cellen twee keer, gedurende 10 minuten met PBS.
      3. Blokkeer met 5% bovine serumalbumine (BSA) oplossing in PBS gedurende 20 minuten op kamertemperatuur of een nacht op 4 °C.
      4. Ga door met de standaard immunofluorescentieprocedure.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

PeroxiSPY-probes zijn ontworpen om natuurlijke substraten van peroxisomen na te bootsen - vertakte en zeer langketenvetzuren5. Daarom zal kleuring resulteren in een adenosinetrifosfaat (ATP) Binding Cassette Subfamily D (ABCD)-afhankelijke import van de probes uit het cytoplasma in peroxisomen 5,6,7. Afhankelijk van de celmetabole toestand kan het ATP-afhankelijke ABCD-transport de probes efficiënt en snel importeren, wat resulteert in een hoge peroxisoom-cytoplasmaverhouding van fluorescentieintensiteit (Figuur 1A). Belangrijke stappen om een hoge verhouding te waarborgen zijn onder andere het voorkomen van celuithongering door regelmatig celmedia te vervangen en cellen niet te laten groeien bij hoge confluentie.

Om de specificiteit van peroxisoomkleuring te verifiëren, wordt aanbevolen om verschillende controles op te nemen (Figuur 1B,C). Co-lokalisatieanalyse met een referentie peroxisomale marker, bijvoorbeeld een eiwitimportmarker - GFP-SKL (Figuur 1B,C). Bovendien, als peroxisoomdeficiënte cellijnen beschikbaar zijn, bijvoorbeeld PEX19 KO, zal de kleuring in die cellen ontbreken (Figuur 1B)5,8.

Peroxisoomprobes kunnen worden gebruikt om peroxisoomdichtheid te meten (Figuur 1C)5,9, en worden ontwikkeld om substraatimport, peroxisoomdynamiek en interacties te beoordelen. Voor kwantitatieve beeldvorming is het belangrijk om de kleuringsprocedure, het tijdstip van beeldverwerving (bijv. 10-20 minuten na de kleuring), de cellijnvoorbereiding en de parameters van de verwerving te standaardiseren. Sommige cellijnen vereisen optimalisatie van de probeconcentratie en de timing om de signaalintensiteit van de peroxisomen ten opzichte van de cytosolische achtergrond te verbeteren, bijvoorbeeld werken 250 nM en 20 minuten beter voor COS-7-cellen (Figuur 2A). Cellen metaboliseren de probes, wat leidt tot een geleidelijke vermindering van peroxisoomkleuring na verloop van tijd; echter, de verhouding van peroxisoom tot cytoplasma kan over 24 uur verbeteren (Figuur 2B). Daarnaast ontwikkelden we een fixatieprocedure die co-kleuring met antilichamen mogelijk maakt en later peroxisomen kan visualiseren (Figuur 2C,D).

figure-results-1
Figuur 1: Levende celbeeldvorming van peroxisomen. (A) Schema van kleuring. (B) Confocale microscopie van WT en PEX19 KO HEK293T cellen die GFP-SKL overexpresseren en gekleurd met de rode peroxisoomprobe (1 μM gedurende 10 minuten). Schaalbalken - 1 μm en 10 μm. Het representatieve intensiteitsprofiel wordt getoond. (C) Confocale microscopie van humane fibroblasten die GFP-SKL overexpressen en gekleurd met PeroxiSPY (1 μM gedurende 10 minuten). Schaalbalken - 1 μm en 10 μm. Het representatieve intensiteitsprofiel wordt getoond. (D) Confocale microscopie van SW13 (bijniercortex), SH-SY5Y (neuroblasten), CCL-136 (myocyten), HaCat (keratinocyten), U2OS (osteoblasten) en HEK293T (menselijke embryonale nier) cellen gekleurd met de rode peroxisoomprobe (1 μM gedurende 10 minuten). Schaalbalken - 2 μm en 10 μm. Kwantificatie werd uitgevoerd met Fiji zoals eerder beschreven9 en toont het aantal peroxisomen per micron kwadraat, gemiddelde ± SEM, N = 100 cellen samengevoegd uit 3 biologische herhalingen, *** - p < 0,001, **** - p < 0,0001, Kruskal-Wallis Test. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Optimalisatie van peroxisoombeeldvorming en kleuring van vaste cellen. (A) Confocale microscopie van COS-7 (Afrikaanse groene apennier) cellen, gekleurd met de rode peroxisoomprobe volgens het protocol (1 μM gedurende 10 minuten; vóór optimalisatie) en onder geoptimaliseerde omstandigheden (250 nM voor 20 minuten; na optimalisatie). Schaalbalk - 10 μm. De gemiddelde pixelintensiteit van peroxisomen en cytosol werd gekwantificeerd met Fiji en uitgedrukt als een verhouding. N = 7 cellen (voor optimalisatie) en 21 cellen (na optimalisatie). Gemiddelde ± SEM, *** - p < 0,001, **** - p < 0,0001, Shapiro-Wilks test. (B) Confocale microscopie van HEK293T cellen, gekleurd met de rode peroxisoomprobe (1 μM) gedurende 15 minuten en 24 uur. Kwantificering toont de fluorescentieintensiteit van peroxisomen en cytoplasma, evenals de verhouding van peroxisoom tot cytoplasma, gemiddelde ± SEM, N = 680 peroxisomen samengevoegd uit 3 biologische herhalingen, **** - p < 0,0001, Shapiro-Wilks test. (C) Confocale microscopie van Huh7-cellen gekleurd met peroxisoomprobes met behulp van het fixatieprotocol. Peroxisomen werden samen gekleurd met het primaire anti-PEX14 antilichaam (1:100 in blokkerende oplossing, 1 uur incubatie bij RT) en secundair antilichaam (1:1000 in blokkerende oplossing, Geit anti-Rabbit Alexa Fluor 488, 1 uur incubatie bij RT). Representatieve confocale beelden worden getoond. Schaalbalken - 10 μm. (D) Kwantificatie toont de veranderingen in peroxisoomfluorescentieintensiteit tijdens fixatie en permeabilisatie die volgens het protocol op HEK293T cellen zijn uitgevoerd, gemiddelde ± SEM, N = 100 cellen samengevoegd uit drie biologische herhalingen, **** - p < 0,0001, Shapiro-Wilks-test. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze eenvoudige peroxisoomdetectie kan in minder dan 10 minuten in dierlijke cellen worden uitgevoerd. PeroxiSPY kleuring maakt visualisatie, kwantificering en tracering van peroxisomen in levende cellen mogelijk en is beschikbaar als een rode (Table of Materials) en een far-red probe5 (Table of Materials). De kleuring biedt een vergelijkbare peroxisoomvisualisatie als een klassieke peroxisoom-targeting signaal (PTS1)l-kleuring10 (Figuur 1B) zonder overexpressie. De fluoroforen zijn fotostabiel en kunnen worden gebruikt voor superresolutiebeeldvorming en langdurige verwerving van peroxisoomdynamiek onder verschillende experimentele omstandigheden 5,9,11. Daarnaast zijn de sondes gevoelig voor peroxisoomwerking; Daarom kunnen ze worden gebruikt om peroxisoompathologie5 te detecteren en te kwantificeren voor onderzoek en diagnostische toepassingen. Peroxisoomkleuring is afhankelijk van het peroxisoommetabolisme en het vermogen van peroxisoomen om vetzuren te importeren en oxideren. Het is daarom belangrijk om de concentratie en de timing van de gebruikte cellijnen te optimaliseren. Hier presenteren we een standaardprocedure die werkt voor de cellijnen die we hebben getest; de timing van kleuring kan echter worden verlengd tot 24 uur zonder verlies van de fluorescentie-intensiteitsverhouding van peroxisoom-cytoplasma (Figuur 2B).

De probes werden getest in veel zoogdiercellijnen (Figuur 1 en Figuur 2) en in Zebrafish Danio rerio cellen en embryo's5, waarbij ze specificiteit voor peroxisomen en gebruiksgemak vertoonden. Deze probes zijn niet getest in andere dierlijke cellijnen, en de omstandigheden, evenals de probe-concentraties, zullen hiervoor geoptimaliseerd moeten worden. De sondes kleuren geen peroxisomen in plantelijke Arabidopsis thaliana-cellen 5.

Hier worden enkele problemen en hun respectievelijke oplossingen voor probleemoplossing besproken. Als de peroxisoom-cytoplasma-verhouding te laag is (lage peroxisoomkleuring), zorg dan dat cellen vers gesplitst zijn en splits ze daarna opnieuw voor de kleuring. Gebruik 30-70% confluentie voor het kleuren. Optimaliseer de concentratie van de sonde (te hoge concentratie leidt tot het overschrijden van de peroxisoomcapaciteit om de sondes op te nemen) en de timing (zie bijvoorbeeld Figuur 2A). Gebruik een schaal met glazen bodem van 35 mm (beitsen in 96-wells platen is moeilijker vanwege het kleine mengvolume). Zorg ervoor dat de probes aan de microcentrifugebuis worden toegevoegd en grondig met het medium worden gemengd voordat ze aan de cellen worden toegevoegd. Verschillende cellijnen en verschillende omstandigheden hebben invloed op de kleuring. Tot slot zal het uitwassen van de sonde de achtergrond verminderen; het signaal zal echter geleidelijk verloren gaan, waardoor de tijd waarin beeldvorming effectief kan worden uitgevoerd wordt verminderd.

Als er geen zichtbare peroxisomen zijn, zorg er dan voor dat de probe met het medium is gemengd. Verhoog de concentratie van de probe (bijvoorbeeld tot 2 μM). Introduceer een extra peroxisomale marker om ervoor te zorgen dat peroxisomen zichtbaar zijn. Als er cel-tot-cel variatie is in de kleuring, is het belangrijk om alle media te verwijderen en grondig met de aliquot te mengen voordat het weer aan de cellen wordt toegevoegd. Dit zorgt voor een uniforme beitsing. Als er nog steeds variatie is, is het mogelijk dat de populatie van cellen heterogeen is in hun peroxisoom-substraatimportcapaciteit. Synchronisatie van cellen door regelmatige splitsing helpt bij een uniforme kleuring. Als er geen signaal wordt gedetecteerd, controleer dan of de laserinstellingen van de microscopen compatibel zijn met de excitatie-/emissieparameters van de probe. Als de achtergrond buiten de cel te fel is, spoel dan de probes uit om deze achtergrond te verwijderen; het signaal zal echter geleidelijk verloren gaan, waardoor het tijdsvenster waarin beeldvorming effectief kan worden uitgevoerd wordt verkort. Daarnaast kan fixatie worden gebruikt om de achtergrond te verminderen. Als het signaal na de fixatie zeer zwak is, controleer dan of het signaal verloren is na de optelling van Triton-X 100. Deze stap kan worden aangepast of verwijderd, afhankelijk van de downstream-toepassing. Verminder wasstappen.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

LR bezit aandelen in Spirochrome AG. Alle andere auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij danken het School of Biological Sciences Imaging and Microscopy Centre (IMC) voor het bieden van toegang tot essentiële apparatuur. TA werd gefinancierd door de HFSP Long-term Fellowship (LT000559/2021-L), de University of Southampton, de Wessex Medical Research Innovation Grant en de European Leukodystrophy Association (ELA). De MS wordt ondersteund door het ELISIR-programma van de EPFL School of Life Sciences, de Foundation Bryn Turner-Samuels en Fondation Bios pour la recherche. CH werd gefinancierd door de zomerstudentship van de Royal Microscopical Society. REC wordt ondersteund door een Discovery Fellowship van de Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BB/Z514767/1). MSvA werd ondersteund door een zomervakantie studentship van de Biochemical Society.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
anti-PEX14 antibodyProteintech10594-1-AP
Confocal MicroscopeNikonA1rElk confocaal microscoop met een hoog NA objectief, bijv. 60x olie NA1.4
DMEMPan Biotech P04-03590celkweek media
Glass-bottom imaging platesCellvisD35C4-20-1.5-N
Goat anti-Rabbit Alexa Fluor 488 ABCAMab150081
HEK293TATCCCRL-3216 
PeroxiSPY555Spirochromehttps://spirochrome.com/product/peroxi_spy555/ https://doi.org/10.1038/s41467-024-48679-2
PeroxisPY650Spirochromehttps://spirochrome.com/product/peroxi_spy650/ https://doi.org/10.1038/s41467-024-48679-2

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kassmann, C. M. Myelin peroxisomes - essential organelles for the maintenance of white matter in the nervous system. Biochimie. 98, 111-118 (2014).
  2. van den Bosch, H., Schutgens, R. B., Wanders, R. J., Tager, J. M. Biochemistry of peroxisomes. Annu Rev Biochem. 61, 157-197 (1992).
  3. Aubourg, P., Wanders, R. Peroxisomal disorders. Handb Clin Neurol. 113, 1593-1609 (2013).
  4. Honsho, M., Okumoto, K., Tamura, S., Fujiki, Y. Peroxisome biogenesis disorders. Adv Exp Med Biol. 1299, 45-54 (2020).
  5. Korotkova, D., et al. Fluorescent fatty acid conjugates for live cell imaging of peroxisomes. Nat Commun. 15, 4314(2024).
  6. Bezman, L., Moser, H. W. Incidence of X-linked adrenoleukodystrophy and the relative frequency of its phenotypes. Am J Med Genet. 76 (5), 415-419 (1998).
  7. Visser, W. F., van Roermund, C. W., Ijlst, L., Waterham, H. R., Wanders, R. J. Metabolite transport across the peroxisomal membrane. Biochem J. 401 (2), 365-375 (2007).
  8. Matsuzono, Y., et al. Human PEX19: cDNA cloning by functional complementation, mutation analysis in a patient with Zellweger syndrome, and potential role in peroxisomal membrane assembly. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (5), 2116-2121 (1999).
  9. Borisyuk, A., Howman, C., Pattabiraman, S., Kaganovich, D., Amen, T. Protein Kinase C promotes peroxisome biogenesis and peroxisome-endoplasmic reticulum interaction. J Cell Biol. 224 (9), e202505040(2025).
  10. Gould, S. G., Keller, G. A., Subramani, S. Identification of a peroxisomal targeting signal at the carboxy terminus of firefly luciferase. J Cell Biol. 105 (6 Pt 2), 2923-2931 (1987).
  11. Lukinavicius, G., et al. A near-infrared fluorophore for live-cell super-resolution microscopy of cellular proteins. Nat Chem. 5 (2), 132-139 (2013).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Peroxisoomsondeslive cell imagingperoxisoomdynamiekfluorescente sondesperoxisoomdysfunctieimmunofluorescente kleuringperoxisoomkwantificatiekleuring van gefixeerde cellen

Gerelateerde artikelen