Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Modellering van tumor-geassocieerde macrofagen in vitro: De rol van uitgescheiden factoren in de dynamica van tumormicro-omgevingen

453 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/69406

⸱

30 december 2025

 ,  ,  , 
1Instituto de Farmacología, Facultad de Medicina, Universidad de Buenos Aires, 2Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET), 3Instituto de Medicina Experimental (IMEX), CONICET, Academia Nacional de Medicina

In dit artikel

Samenvatting

Dit manuscript presenteert een in vitro protocol voor het genereren van tumor-geassocieerde macrofagenachtige cellen door menselijke monocyten bloot te stellen aan geconditioneerde media van tumorcellijnen.

Samenvatting

Macrofagen vertonen opmerkelijke plasticiteit, waardoor ze verschillende functionele toestanden kunnen verwerven als reactie op diverse omgevingssignalen. In solide tumoren vormen ze vaak de meest voorkomende populatie van immuuncellen binnen de tumormicro-omgeving, waar ze worden aangeduid als tumor-geassocieerde macrofagen (TAM's). TAMs werken nauw samen met kwaadaardige cellen, wat actief tumorprogressie, angiogenese en immuunontwijking bevordert. Tumorcellen kunnen macrofagen herprogrammeren via direct cel-cel contact en een breed scala aan uitgescheiden factoren, waardoor hun polarisatie wordt gevormd richting pro-tumorale fenotypen. Om deze TAM-polarisatiemechanismen in vitro te bestuderen, stellen we een methode voor waarbij menselijke monocyten worden blootgesteld aan oplosbare factoren die aanwezig zijn in tumorcellijn-geconditioneerde media. Dit protocol maakt de generatie van TAM-achtige macrofagen onder gecontroleerde omstandigheden mogelijk, waardoor de analyse van fenotypische en functionele veranderingen veroorzaakt door tumorafgeleide signalen mogelijk wordt. Onze aanpak biedt een reproduceerbaar en fysiologisch relevant model om tumor-macrofaaginteracties te onderzoeken, verdiept ons begrip van macrofagenherprogrammering en ondersteunt onderzoek naar nieuwe therapeutische strategieën in kankerimmunologie en immunotherapie.

Inleiding

Macrofagen zijn multifunctionele aangeboren immuuncellen waarvan de opmerkelijke plasticiteit hen in staat stelt diverse fenotypes aan te nemen als reactie op omgevingssignalen1. Binnen solide tumoren worden macrofagen vaak de meest voorkomende populatie van immuuncellen en differentiëren ze zich tot tumor-geassocieerde macrofagen (TAMs)2. Deze cellen worden actief geherprogrammeerd door de tumormicro-omgeving om tumorgroei te ondersteunen, angiogenese te bevorderen, metastasen te faciliteren en effectieve antitumor-immuunresponsen te onderdrukken. Tumorcellen drijven deze polarisatie aan via zowel directe cel-celinteracties als een complex repertoire van afgescheiden factoren, waaronder cytokinen, chemokinen en groeifactoren, die de transcriptie- en functionele programma's van macrofagen hervormen3. Deze dynamische wisselwerking ondersteunt de centrale rol van TAMs in de kankerbiologie en benadrukt de plasticiteit van macrofagen als zowel een uitdaging als een kans voor therapeutische interventie2.

De klinische relevantie van TAMs wordt steeds meer erkend: hun overvloed in tumoren correleert vaak met een slechte prognose en resistentie tegen therapieën 4,5. Daardoor zijn TAMs6 uitgegroeid tot aantrekkelijke therapeutische doelwitten. Strategieën gericht op het blokkeren van hun rekrutering, het remmen van hun overleving of het herprogrammeren van hen naar inflammatoire en tumoricidale fenotypen worden momenteel onderzocht6. Het begrijpen van de mechanismen waarmee tumorafgeleide factoren macrofagen polariseren tot TAMs is daarom essentieel voor het ontwikkelen van effectieve immunotherapieën. Hoewel een blokkade van immuuncontrolepunten bij veel kankers groot succes heeft getoond, blijft de effectiviteit bij andere beperkt7. Het combineren van T-celgerichte therapieën, zoals anti-Programmed Cell Death Protein 1 (PD-1) of anti-Programmed Cell Death Ligand 1 (PDL-1) antilichamen, met macrofagenherprogrammeringsstrategieën kan de algehele antitumor-immuunrespons versterken.

Traditionele experimentele modellen om TAM-biologie te bestuderen omvatten in vivo muiskankermodellen, die een complexe en fysiologisch relevante omgeving bieden8. Deze modellen hebben fundamentele inzichten gegeven in TAM-werving en -functie. Echter, significante verschillen tussen soorten in immuunsignalering, tumorbiologie en macrofagenontogenese kunnen de directe vertaling naar menselijke ziektenbeperken 9,10. Bovendien maakt de complexiteit van in vivo systemen het lastig om specifieke signaalroutes of moleculaire gebeurtenissen die de polarisatie van macrofagen aandrijven, te isoleren en te bestuderen.

Daarentegen bieden in vitro modellen eenvoudigere en gecontroleerde omstandigheden om deze mechanismen te ontleden. De meest gebruikte benadering houdt in dat humane monocyten-afgeleide macrofagen worden gepolariseerd met gedefinieerde stimuli: Interferon gamma (IFN) en bacteriële lipopolysaccharide (LPS) om pro-inflammatoire macrofagen (M1) te genereren, of Interleukine 4 (IL-4) en interleukine 10 (IL-10), of dexamethason om verschillende anti-inflammatoire macrofagen (M2) subtypes 11,12,13,14 te verkrijgen. Deze modellen hebben geholpen bij het identificeren van moleculaire markers en transcriptieprogramma's die geassocieerd zijn met canonieke macrofagenpolarisatiestaten. Toch slagen ze er niet in om de complexe, multifactoriale omgeving te repliceren die macrofagen in tumoren voorkomen, waar polarisatie het gevolg is van de gelijktijdige invloed van talrijke oplosbare mediatoren, metabole signalen en cel-tot-cel interacties15,16. Hoewel de klassieke M1/M2-classificatie nuttig blijft om macrofagenfunctionele toestanden te beschrijven, is het nu duidelijk dat er veel meer macrofagenpopulaties bestaan dan eerder werd gedacht. Het werk van de groep van Dr. Ginhoux en anderen, met behulp van single-cell transcriptomische benaderingen, heeft de brede diversiteit van macrofagen subsets aangetoond die zowel onder fysiologische omstandigheden als bij ziektevoorkomen 17,18. Dit benadrukt dat TAMs, hoewel vaak beschreven als lijkende M2-achtige profielen, niet strikt gelijkwaardig zijn aan macrofagen die uitsluitend met canonieke cytokines worden onderscheiden; ze delen bepaalde kenmerken, maar vertonen ook duidelijke en contextafhankelijke verschillen.

Om deze kloof te overbruggen, presenteren we een in vitro protocol dat TAM-achtige polarisatie modelleert door humane monocytenafgeleide macrofagen bloot te stellen aan geconditioneerd medium verzameld uit tumorcellijnen. Deze methode vangt de invloed van het tumorsecretoom vast, een rijke mix van cytokines, chemokines en groeifactoren die door kankercellen worden uitgescheiden. Het biedt daarmee een relevant en experimenteel toegankelijk systeem om de fenotypische en transcriptionele herprogrammering van macrofagen te onderzoeken als reactie op tumor-afgeleide oplosbare factoren. In tegenstelling tot eerdere benaderingen, waarbij monocyten direct werden blootgesteld aan tumorgeconditioneerde media, richt dit protocol zich specifiek op de herprogrammering van macrofagen, waardoor het gedrag van de residente macrofagen binnen de tumormicro-omgevingbeter wordt weerspiegeld 19,20. Daarnaast bevat het een geoptimaliseerd en eenvoudig panel van oppervlaktemarkers om macrofagenpolarisatie te beoordelen met flowcytometrie, wat eenvoudig te implementeren is en kan worden uitgebreid volgens de behoeften van de onderzoeker14,21. Tot slot, aangezien is aangetoond dat M-CSF monocyten stimuleert richting een M2-achtig fenotype 10,15,22,23,24, hebben we dit bewust weggelaten om te waarborgen dat eventuele waargenomen macrofagenpolarisatie specifiek het gevolg is van blootstelling aan tumorcellijn-afgeleide geconditioneerde media.

Deze benadering heeft verschillende sterke punten: het behoudt de reproduceerbaarheid en eenvoud van in vitro systemen, gebruikt primaire menselijke cellen voor grotere translationele relevantie, en weerspiegelt de heterogene, multifactoriele aard van de tumormicro-omgeving beter dan enkel-cytokine modellen 25,26,27,28. Bovendien faciliteert het vergelijkende studies van macrofagenresponsen op geconditioneerde media van verschillende tumortypen of genetisch gemodificeerde kankercellen, en dient het als platform om farmacologische middelen te testen die de TAM-polarisatie kunnen veranderen. Naast de algemene toepasbaarheid kan deze methode worden aangepast aan verschillende tumormodellen door geschikte cellijnen te selecteren of het aandeel geconditioneerde media aan te passen. Desalniettemin moeten gebruikers zich ervan bewust zijn dat variabiliteit tussen gezonde donoren en tumorcellijnen de reproduceerbaarheid kan beïnvloeden, wat het belang van zorgvuldig experimenteel ontwerp en standaardisatie onderstreept.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Perifere bloedmonsters werden genomen van gezonde donoren na geïnformeerde toestemming in overeenstemming met de Verklaring van Helsinki. Dit protocol werd goedgekeurd door de Commissie voor Institutionele Ethiek van de Universiteit van Buenos Aires. Zie de Tabel van Materialen voor details over alle materialen en reagentia die in dit protocol worden gebruikt.

OPMERKING: Houd steriele omstandigheden gedurende het hele protocol, werk in een Biosafety level 2 (BSL-2) kast, en zorg voor cellevensvatbaarheid >90%. Voor de verwijdering moet al het biologische afval eerst worden gedesinfecteerd door ten minste 30 minuten te weken in een oplossing van 10% natriumhypochloriet, en vervolgens in de juiste biohazard-container te worden geplaatst.

1. Tumorcellijnkweek en conditioneringsmediabereiding

  1. Ontdooi de MDA-MB-231 drievoudig negatieve menselijke borstkankercellijn (of andere geselecteerde tumor) uit vloeibare stikstofopslag. Dompel de cryobuizen met cellijnen onmiddellijk onder in een waterbad van 37 °C en draai het flesje voorzichtig om een snelle en gelijkmatige ontdooiing te garanderen. Verwijder het flesje direct als het grotendeels ontdooid is.
  2. Breng de ontdooide cellen over in een 15 mL centrifugatiebuis met 5 mL steriele fosfaatgebuffte zoutoplossing (PBS). Centrifugeer de celsuspensie op 400 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (RT).
    OPMERKING: Het ontdooiproces moet snel worden uitgevoerd om de levensvatbaarheid van de cel te behouden.
  3. Gooi het supernatant voorzichtig weg en suspendeer de celpellet snel opnieuw in 1 mL verse complete Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) met een hoge glucoseconcentratie (4,5 g/L) en 10% foetaal rundvleesserum (FBS), 4 mM Glutamine en 1 mM natriumpyruvat. Tel de cellen in de resuspendeerde pellet en voer de volgende tweestapsseriële verdunning uit:
    1. Bereid eerst een 1:5 cel suspensieverdunning voor in een steriel DMEM-medium en vervolgens (1:2) met de levensvatbaarheidskleurstof Trypan Blue om een uiteindelijke verdunning van 1:10 te verkrijgen.
    2. Gebruik een lichtmicroscoop om de levensvatbare cellen binnen de Neubauer hemocytometer (of telkamer) te tellen. Tel levensvatbare cellen (alleen cellen die de blauwe kleurstof uitsluiten) en bepaal het gemiddelde aantal levensvatbare cellen per groot hoekvierkant.
    3. Bereken de uiteindelijke concentratie met de volgende formule: Cellen/mL = (Gemiddelde cellen per vierkant) x (Verdunningsfactor) x 10.000.
      OPMERKING: Suspendeer de cellen opnieuw in een gewenst volume van volledig DMEM-medium om een uiteindelijke concentratie van 1x 10 à5cellen/mL te verkrijgen.
  4. Zaad 2,5 x 10 van5 tot 5,0 x 105 cellen in een T25-kweekfles met 5 ml complete DMEM-medium. Houd de kweek op 37 °C in een bevochtigde broedmachine met 5%CO2 totdat de vereiste celdichtheid voor oogst is bereikt.
  5. De volgende dag na het zaaien controleer je de celhechting onder een microscoop. Als meer dan 50% van de cellen drijft (wat op celdood wijst), aspireer dan voorzichtig het oude medium en vervang het door 2,5 mL verse, voorverwarmde medium.
  6. Monitor de celgroei dagelijks. Wanneer de kweek ongeveer 90% confluentie bereikt (naar schatting 2,3 x 106 cellen in een T25-kolf), zijn de cellen meestal binnen 5 dagen klaar om gesubcultureerd te worden (gesplitst). Om de cellen in een verhouding van 1:8 te splitsen, volg je deze stappen:
    1. Verwijder het gebruikte medium met een steriele Pasteur-pipet.
    2. Spoel de celmonolaag één keer af met 3 ml steriele 1x PBS om het resterende serum te verwijderen, dat trypsine remt. Aspireer en gooi 1x PBS weg.
    3. Voeg 1 mL 0,25% trypsine - 1 mM ethyleendiaaminetetraazijnzuuroplossing (EDTA) toe aan de cellen en incubeer bij 37 °C, 5% CO2 in een bevochtigde broedmachine gedurende 3 minuten om de cellen los te maken.
      OPMERKING: De optimale incubatietijd met trypsine/EDTA hangt af van de specifieke cellijn en kan aangepast moeten worden. Controleer de cellen onder de microscoop na 3 minuten om zeker te zijn dat ze volledig losstaan.
    4. Neutraliseer de enzymatische activiteit door 3 mL volledig DMEM-medium toe te voegen. Onmiddellijk daarna pipeteert u voorzichtig op en neer om de cellen volledig los te maken en te suspenderen.
  7. Breng 3,5 mL celsuspensatie over in een 15 mL conische buis en centrifugeer deze 5 minuten op 400 x g bij RT.
  8. Verwijder voorzichtig het supernatant en suspendeer de celpellet opnieuw in 1 mL vriesmedium (dat 90% FBS plus 10% dimethylsulfoxide (DMSO) moet bevatten. Overbrengen en aliquoteren van de celsuspensie in cryoviale cellen, zodat een concentratie van 5 x 10à 5 cellen per buis wordt gegarandeerd voor toekomstig gebruik.
    1. Het invriezen moet geleidelijk worden afgekoeld door de cryovials in een Mr. Frosty (of vergelijkbare invriescontainer met gecontroleerde snelheid) te plaatsen. Breng de container over in een vriezer van -80°C en laat de cellen een nacht invriezen. Cellen kunnen enkele dagen op -80°C worden gehouden, maar moeten daarna worden overgezet naar vloeibare stikstof voor langdurige opslag.
      OPMERKING: Houd gedetailleerde gegevens bij van celpassages en gebruik vroege passages voor experimenten. Het wordt aanbevolen om cellen met minder dan 20 doorgangen te gebruiken.
  9. Zodra nieuwe culturen weer ~90% confluentie bereiken, aspireer en verzamel je supernatant in een 15 mL conische buis. Als je de cultuur wilt laten voortbestaan, vervang dan het verzamelde volume door een frisse, complete DMEM-medium.
    1. Centrifugeer het verzamelde supernatant op 400 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C om te pelleten en cellulair afval te verwijderen. Bewaar het supernatant (het geklaarde geconditioneerde medium) en gooi het pelletje weg.
  10. Aliquot het gezuiverde geconditioneerde medium in porties van 1 mL, labelen de buizen en bewaren ze op -20 °C tot gebruik.
    OPMERKING: Voor kwaliteitscontrole houd altijd een registratie bij van de datum van het verzamelen van de geconditioneerde media en of de aliquot eerder is ontdooid. Het wordt sterk aangeraden om te voorkomen dat dezelfde aliquot meer dan twee keer ontdooi. Gebruik bovendien de geconditioneerde binnen een maand na de vriesdatum om de optimale activiteit te garanderen.

2. Isolatie van perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's)

OPMERKING: PBMC's worden geïsoleerd uit 40 mL perifeer bloed dat anticoaguleerd is met 3,8% natriumcitraat. De isolatie wordt uitgevoerd met behulp van een Ficoll-Hypaque dichtheidsgradiënt (1077) en centrifugatie. Dit hele protocol moet onder steriele omstandigheden worden uitgevoerd in een BSL2-kast.

  1. Aliquot het antistollings perifere bloedmonster in een 15 mL of 50 mL conisch buisje vóór de komende centrifugatiestap.
  2. Centrifugeer bloedmonsters op lage snelheid, 200 × g gedurende 15 minuten bij RT om de bloedcomponenten te scheiden. Dit proces levert bloedplaatjesrijk plasma (PRP) op als bovenste laag en de cellulaire fractie (rode en witte bloedcellen) eronder. Gebruik een centrifugeinstelling met versnelling: 4 en vertraging: 2, wanneer het maximum 5 is.
  3. Na centrifugering aspireer je het supernatant (de bovenste fractie), dat is de PRP, en breng het over in een nieuwe steriele buis.
    OPMERKING: Indien nodig voor latere experimenten kan de verzamelde PRP opnieuw worden gecentrifugeerd op 600 × g bij RT gedurende 10 minuten (maximale versnelling en vertraging) om de bloedplaatjes te verwijderen, en het plasma zonder bloedplaatjes op te slaan bij -20 °C voor andere assays.
  4. De cellulaire onderlaag die wordt verkregen bij de initiële centrifugatie in stap 2 moet voorzichtig worden verdund tot een eindvolume van 2 tot 3 keer met behulp van steriele, kamertemperatuur 1x PBS. Homogeniseer zacht door de resulterende suspensie te inverteren en gebruik deze voor de Ficoll-Hypaque dichtheidsgradiëntcentrifugatie.
  5. Doseer 15 mL Ficoll-Hypaque op kamertemperatuur in een steriele 50 mL buis.
  6. Laag voorzichtig en langzaam 30 ml verdund bloed over de Ficoll-Hypaque, zodat de twee fasen niet mengen.
  7. Centrifugeer de Ficoll-bloed gelaagde buis 25 minuten op 600 × g bij RT. Stel de centrifuge in zonder rem (acceleratie: 1; Vertraging: 0).
  8. Gebruik een steriele Pasteur-pipet om minstens 4 mL van de verkregen bovenste fractie weg te gooien om morsen te voorkomen. Gebruik vervolgens dezelfde pipet om de witte ring met de PBMC's terug te winnen die gevormd is tussen de bovenste fractie en de Ficoll-Hypaque transparante fractie. Vermijd het verzamelen van Ficoll met de PBMC-ring.
  9. Breng de PBMC-ring van de buis over naar een steriele 15 mL centrifugebuis met minstens 3 mL 1x PBS.
  10. Vul de 15 mL buis met meer 1x PBS en centrifugeer op 600 × g (maximale acceleratie en vertraging) gedurende 10 minuten bij RT.
  11. Verwijder het supernatant door inversie, vul opnieuw met 1x PBS en centrifugeer op 600 × g (maximale acceleratie en vertraging) gedurende 10 minuten bij RT.
  12. Verwijder het supernatant en suspendeer de PBMC-pellet opnieuw in 2 tot 3 mL steriel 1x PBS plus 2% hitte-geïnactiveerde FBS (1x PBS-2% FBS), en verhoog dan het volume naar 10 mL. Tel de cellen, bereid een 1:5 cel suspensie, verdund in steriele koude 1x PBS en vervolgens (1:2) in 0,4% Trypan Blue om een uiteindelijke verdunning van 1:10 te verkrijgen. Gebruik een celkamer op een lichtmicroscoop zoals beschreven in stap 1.3.2 voor het tellen.
  13. Draai de PBMC-ophanging terug op 300 × g gedurende 5 minuten bij 8-10 °C. Susseer de cellen opnieuw in een gewenst volume steriel, koud 1x PBS-2% FBS om een uiteindelijke concentratie van 108cellen /mL te verkrijgen. Laat deze cellen op 4 °C staan tot de volgende stap.
    OPMERKING: Op dit moment kunnen verzamelde PBMC's worden ingevroren in een cryogene buis met 10 à8 cellen/mL in vriesmedium (90% FBS-10% DMSO). Bewaar het bij -80 °C in een Mr. Frosty-container 's nachts zodat de cellen langzaam kunnen bevriezen. De volgende dag zet je de cellen in een opslagdoos en laat je ze een paar dagen op -80 °C staan, of ga je over in een vloeibare stikstoftank voor een lange opslagperiode of ga je door met het protocol.

3. CD14+ monocyten sorteren met behulp van magnetische kralen

OPMERKING: Gezuiverde CD14+ monocyten worden verkregen uit PBMC met behulp van een menselijke CD14+ positieve selectie magnetische sorteerkit11. Het celpercentage CD14+ in PBMC is donorafhankelijk, maar kan worden geschat op 10% (variërend van 5-20%). Pas het initiële aantal PBMC en de uiteindelijke reactievolumes aan op basis van het vereiste aantal monocyten voor je experiment. Het voorgestelde minimale reactievolume is 100 μL, zelfs bij verwerking van minder dan 1 × 107 PBMC .

  1. Voeg 10 μL van de positieve selectiecocktail toe voor elke 100 μL PBMC's, pipetteer omhoog en omlaag en laat het 15 minuten op ijs staan.
  2. Vortex de kralen voor 30 seconden voordat je het gebruikt. Voeg vervolgens 10 μL van de kralen toe per 100 μL PBMC-ophanging. Meng goed en laat het 15 minuten op ijs incuberen.
  3. Voeg 1x PBS - 2% FBS - 1 mM EDTA toe aan een eindvolume van 2,5 mL, meng de suspensie voorzichtig en plaats de buis op de magneet en incubeer 5 minuten.
  4. Draai de magneet om (zonder de buis te verwijderen) over een weggooibuis voor 2-3 seconden, zodat je elke schudbeweging vermijdt. Positieve cellen blijven in de buis.
  5. Haal de buis uit de magneet en voeg 1x PBS - 2% FBS -1 mM EDTA toe over de buiswanden tot een eindvolume van 2,5 mL.
  6. Steek de buis weer in de magneet en laat het 5 minuten incuberen.
  7. Draai de magneet om (zonder de buis te verwijderen) over een weggooibuis voor 2-3 seconden, zodat je elke schudbeweging vermijdt. Haal de buis uit de magneet en voeg 3 ml 1x PBS-2% FBS toe over de buiswanden om alle cellen terug te halen.
  8. Neem 10 μL om het aantal CD14+-cellen in een Neubauer-kamer met een lichtmicroscoop te tellen. Verdunn met Trypan Blue 1:2.
    OPMERKING: Bereken het aantal cellen volgens deze vergelijking: Aantal CD14+ cellen = media-aantal levende cellen per kwadrant x verdunningsfactor x 10,000.
  9. Plaats de CD14+ celsuspensie in een nieuwe steriele 15 mL buis en was de cellen door te centrifugeren op 600 × g (maximale versnelling en vertraging) gedurende 10 minuten bij 4 °C.
  10. Suspensie CD14+-cellen met een RPMI 1640 medium, aangevuld met 10% FBS en 1% penicilline-streptomycine (P/S) volledig medium in een handig volume om 2,5 x 106 cellen/mL te verkrijgen voor de volgende stap, rekening houdend met het aantal verkregen cellen.
    OPMERKING: Houd de CD14+ monocyten op ijs tot de volgende stap om te voorkomen dat deze cellen aan de plastic buiswand hechten.

4. Differentiatie van macrofagen

  1. Plat zuiverde CD14+ monocyten met 2,5 x 105 cellen die in 250 μL volledig RPMI-medium (10% FBS-1% PS) per put in een 48-goed behandelde plaat werden gezuiverd.
    OPMERKING: Het kan ook worden gedaan met de helft van het aantal cellen in een plaat met 96 goed behandeld.
  2. Voeg steriel water toe aan de omliggende lege putten om verdamping tijdens de plaatincubatie te verminderen.
  3. Incubeer cellen gedurende 5 dagen bij 37 °C met 5% CO₂ in een bevochtigde broedmachine zonder te storen, waarbij dagelijks wordt gemonitord op morfologie, differentiatie en levensvatbaarheid.
    OPMERKING: Hoewel M-CSF (25 ng/mL) kan worden toegevoegd voor differentiatie, bevestigen we dat ons protocol 10% hoogwaardige FBS alleen gebruikt om M0-macrofagen na vijf dagen kweek te verkrijgen. We raden specifiek aan M-CSF te vermijden vanwege het potentieel om monocyten te stimuleren richting een M2-achtig fenotype10,22.

5. Blootstelling van macrofagen aan geconditioneerde media en analyse

  1. Verwijder op dag 5 van differentiatie voorzichtig 50% (125 μL) van het medium uit elke put en vervang door of:
    1. 125 μL verse RPMI complete medium (controle),
    2. 125 μL tumorcellijn-geconditioneerde media (bijv. van MDA-MB-231), of
    3. 125 μL DMEM complete medium (regeling voor geconditioneerde media).
      OPMERKING: Voor de eerste optimalisatie met nieuwe tumorcellijnen, test een reeks geconditioneerde mediaconcentraties (bijv. 10%, 25% en 50%). Dit bereik wordt voorgesteld om de levensvatbaarheid van macrofagen en differentiatieveranderingen te waarborgen. Kies de hogere concentratie geconditioneerde media die een hoge macrofagenlevensvatbaarheid vertoont.
  2. Blijf incuberen tot dag 7.
    OPMERKING: Op dag 5 worden M0-macrofagen verkregen, waarna nog eens 2 dagen kweek in aanwezigheid van geconditioneerd medium voldoende is om de expressie van oppervlaktepolarisatiemarkers te induceren. Polarisatie-oppervlaktemarkers worden op vergelijkbare wijze bepaald door flowcytometrie bij het gebruik van gestandaardiseerde cytokines om M1- of M2-macrofagen 11,14 te genereren.
  3. Beoordeel dagelijks de levensvatbaarheid en morfologie van de macrofagen onder de microscoop.
    OPMERKING: Monitor de differentiatie van macrofagen dagelijks gedurende de 7-daagse kweekperiode. Celhechting wordt gebruikt als indicator voor een gezonde, levensvatbare kweek. Een hoger aandeel fusiforme cellen wijst op een verhoogde differentiatie en polarisatie in de behandelgroep voor conditioneringsmedia (CM), zoals weergegeven in Figuur 2.

6. Oogst macrofagen voor evaluatie van polarisatiemarkers door middel van flowcytometrie

OPMERKING: Optioneel, om de fenotypekarakterisering van tumor-geassocieerde macrofagen verder uit te breiden, isoleer RNA om de expressie van polarisatie-geassocieerde genen (bijv. TGM2, IRF-4 en CXCL10) te meten via kwantitatieve polymerasekettingreactie (qPCR) of verzamel de kweeksupernatanten voor het meten van canonieke cytokineproductie (bijv. TNFα, IL-6 en IL-10) met een enzymgebonden immunosorbentassay (ELISA) zoals gerapporteerd door onze groep11, 14.

  1. Verwijder door voorzichtig te aspireren met een steriele Pasteur-pipet of tip het totale kweekmedium van elke put en voeg 200 μL koude 1x PBS-2% FBS-1 mM EDTA-buffer toe voor celoogst.
  2. Incubeer 10 tot 15 minuten op ijs en voeg dan 200 μL 1x PBS-2% FBS toe om de EDTA-buffer te verdunnen. Verzamel de macrofagen door op en neer te pipetteren (nog steeds op ijs) gedurende nog eens 5 minuten totdat alle cellen losgeraakt zijn.
    OPMERKING: Deze stap is cruciaal om een goed aantal levensvatbare macrofagen te verkrijgen. Het is belangrijk dat de tijd onder EDTA-expositie niet meer wordt verlengd dan aanbevolen om de levensvatbaarheid van cellen te behouden. Controleer de cellen onder de microscoop na afronding van de procedure om te controleren of ze volledig losstaan.
  3. Verzamel macrofagen op een 1,5 mL microbuis en was ze met 1 mL 1x PBS-2% FBS door centrifugatie op 400 × g gedurende 5 minuten bij 8-10 °C.
  4. Suspendeer de macrofagen opnieuw met 200 μL 1x PBS-5% FBS en breng ze over in een 96-put ronde microplaat voor niet-specifieke blokking bij RT gedurende 15 minuten. Centrifugeer de cellen op 400 x g gedurende 5 minuten bij 8-10 °C.
  5. Gooi het supernatant weg door de plaat snel om te draaien.
  6. Bereid de juiste cocktail van direct geconjugeerde antilichamen voor in 1x PBS-2% FBS met een verdunningsfactor van 1:50 voor elk antilichaam. Kleur elk monster met 50 μL van de antilichaamcocktail en incubeer 30 minuten in het donker op ijs.
    OPMERKING: Antilichaamcocktail: CD11b-PE/Cy7 (200 μg/mL), CD64-AlexaFluor 647 (150 μg/mL), CD163-PerCP/Cy5,5 (200 μg/mL), HLADR-PE (40 μg/mL) en CD206-AlexaFluor 488 (400 μg/mL). De concentratie van pre-getinterde antistoffen wordt vermeld in Tabel 1; catalogusnummers zijn te vinden in de Materiaaltabel.
  7. Was de gekleurde macrofagen door 150 μL 1x PBS toe te voegen en centrifugeer op 400 × g gedurende 5 minuten bij 8-10 °C.
  8. Gooi het supernatant weg door de plaat snel om te draaien.
  9. Om de cellevensvatbaarheid te meten, voeg je 100 μL van de fixeerbare levensvatbaarheidskleurstof Zombie Violet toe (1:1.000 in 1x PBS) en breng je 30 minuten in het donker op ijs.
  10. Was de gekleurde cellen door 100 μL 1x PBS toe te voegen en te centrifugeren op 400 x g gedurende 5 minuten bij 8-10 °C. Herhaal de wasprocedure met 200 μL 1x PBS.
  11. Herstel het door de celpellet opnieuw te suspenderen met 20 μL vers bereid 1% paraformaldehyde en deze 20 minuten op ijs en in het donker te incuberen.
    OPMERKING: 1% paraformaldehyde werd gebruikt voor fixatie, zonder permeabilisatie. Optioneel: Het commerciële fixatieve component (uit de BD-fixatie/permeabilisatiekit) kan ook worden gebruikt voor deze stap11.
  12. Was cellen door 180 μL 1x PBS-2% FBS toe te voegen en centrifugeer op 400 x g gedurende 5 minuten bij 8-10 °C. Herhaal de wasprocedure met 200 μL 1x PBS-2% FBS.
  13. Verwijder supernatant door plaatinversie en suspendeer de pellet opnieuw in 200 μL 1x PBS om naar de flowcytometrieapparatuur te brengen voor meting.
    OPMERKING: Als gekleurde en gefixeerde monsters niet op dezelfde dag met flowcytometrie kunnen worden uitgevoerd, bewaar ze dan op 4 °C en bescherm ze tegen licht. Analyseer de monsters zo snel mogelijk in de volgende dagen.
  14. Analyseer flowcytometrieresultaten met behulp van FlowJo-software. De gatingstrategie begint met het uitsluiten van puin met behulp van voorwaartse en zijwaartse verstrooiing (FSC/SSC). Selecteer vervolgens levende macrofagen als CD11b⁺ Zombie Violet-cellen .
    OPMERKING: Omdat autofluorescentie in macrofagen donorafhankelijk is, is het essentieel om controles te gebruiken die van dezelfde donor zijn afgeleid voor elk experiment.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

We genereerden drievoudig-negatieve borstkankertumor-geassocieerde macrofagen (TAM)-achtige cellen door monocyt-afgeleide macrofagen te behandelen met 50% conditionerd medium (CM) uit de MDA-MB-231 cellijn. Monocyten werden gesorteerd uit perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC) van zes onafhankelijke gezonde donoren en gedifferentieerd volgens ons protocol. De CM-preparaat maakte gebruik van MDA-MB-231-cellen bij 90% confluentie (Figuur 1).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het hier beschreven protocol biedt een reproduceerbare en praktische benadering om tumor-geassocieerde macrofagenachtige polarisatie te bestuderen door humane monocytenafgeleide macrofagen bloot te stellen aan tumorcellijn-geconditioneerde media. Dit systeem vangt de invloed van oplosbare factoren die door tumorcellen worden uitgescheiden, waarvan bekend is dat ze een cruciale rol spelen bij macrofagen in de tumormicro-omgeving 7,9,10,15,19,20.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten om te melden.

Dankbetuigingen

Wij erkennen de financiële steun van het National Agency for the Promotion of Science and Technology (ANPCyT-FONCYT) via subsidies PICT 2021 I-INVI-00034 (aan DR), PICT 2021-I-A-00807 (aan E.A.C.S.) en PICT 2021-I-A-00716 (aan A.E.E.). Wij danken ook de Nationale Raad voor Wetenschappelijk en Technisch Onderzoek (CONICET) voor de subsidie PIP 2022-0763 en de Universiteit van Buenos Aires voor PIDAE 2022, toegekend aan A.E.E.

M.C.L. ontving een Legado Peruilh-beurs van de School of Medicine van de Universiteit van Buenos Aires en ontvangt een ANPCyT-FONCYT doctoraatsbeurs. D.R., E.A.C.S. en A.E.E. zijn carrièreonderzoekers bij CONICET.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Alexa Fluor 488 mouse anti-human  CD206 Antibody clone 15-2BioLegend, San Diego, CA, USA.Cat# 321113; RRID:AB_571874
Alexa Fluor 647 mouse anti-human CD64 Antibody clone 10.1BioLegend, San Diego, CA, USA.Cat# 305012; RRID:AB_528867
BD Cytofix/CytopermBD Biosciences, San Jose, CA, USACat# 554714fixatie-/permeabilisatiekit
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), hoge glucoseGibco Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA Cat# 11965092
EasySep Human CD14 Positive Selection Kit; EasySep Positive Selection Cocktail; EasySep magnetische Nanodeeltjes; Easy Sep MagnetSTEMCELL Technologies, Vancouver, CanadaCat# 18058
FACS Canto cytometer Becton Dickinson, Franklin Lakes, New Jersey, USA.
Fetal bovien serum, gekwalificeerd, Nieuw-Zeeland Gibco™ Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA Cat# 10091148
Ficoll-Paque PLUS CytivaGE Healthcare - Life Sciences, USACat# 17144003
FlowJoFlowJo LLC.RRID:SCR_008520
GraphPad Prism  GraphPad Software Inc.RRID:SCR_002798
Partec CyFlow space cytometer Sysmex Partec, Germany
PE anti-human HLA-DR Antibody clone L243BioLegend, San Diego, CA, USA.Cat# 307605; RRID:AB_314683
PE/Cy7 rat anti-mouse/human CD11b Antibody clone M1/70BioLegend, San Diego, CA, USA.Cat# 101216; RRID:AB_312799
PerCP/Cy5.5 mouse anti-human CD163 Antibody clone GHI/61BioLegend, San Diego, CA, USA.Cat# 333607; RRID:AB_1134006
RPMI 1640 MediumGibco Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA Cat# 11875119
Natriumpyruvaat-oplossingSigma-Aldrich Merck, San Luis, MO, USA. Cat#  S8636
Trypsin-EDTA (0,25%), fenolroodGibco Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA Cat# 25200056
Zombie Violet Fixable Viability KitBioLegend, San Diego, CA, USA.Cat# 423113

Referenties

  1. Murray, P. J., et al. Macrophage activation and polarization: Nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 41 (1), 14-20 (2014).
  2. Goswami, S., Anandhan, S., Raychaudhuri, D., Sharma, P. Myeloid cell-targeted therapies for solid tumours. Nat Rev Immunol. 23 (2), 106-120 (2023).
  3. Christofides, A., et al. The complex role of tumor-infiltrating macrophages. Nat Immunol. 23 (8), 1148-1156 (2022).
  4. Umakoshi, M., et al. Macrophage numbers in the marginal area of sarcomas predict clinical prognosis. Sci Rep. 13 (1), 1290(2023).
  5. Toor, S. M., et al. Myeloid cells in circulation and tumor microenvironment of breast cancer patients. Cancer Immunol Immunother. 66 (6), 753-764 (2017).
  6. Chen, Y., et al. Targeting tumor-associated macrophages: A potential treatment for solid tumors. J Cell Physiol. 236 (5), 3445-3465 (2021).
  7. Caverzan, M. D., et al. Exploring monocytes-macrophages in immune microenvironment of glioblastoma for the design of novel therapeutic strategies. Brain Sci. 13 (4), 542(2023).
  8. Anfray, C., Ummarino, A., Calvo, A., Allavena, P., Torres Andon, F. In vivo analysis of tumor-associated macrophages in the tumor microenvironment. Methods Mol Biol. 2614, 93-108 (2023).
  9. Linde, N., Gutschalk, C. M., Hoffmann, C., Yilmaz, D., Mueller, M. M. Integrating macrophages into organotypic co-cultures: A 3D in vitro model to study tumor-associated macrophages. PLoS One. 7 (7), e40058(2012).
  10. Karimova, A. F., et al. In vitro functional assays to assess the reciprocal interplay between tumor cells and macrophages. FASEB J. 38 (13), e23730(2024).
  11. Carrera Silva, E. A., Errasti, A. E. Reprograming model of human monocyte-derived macrophages for in-vitro assays. J Vis Exp. (218), e67651(2025).
  12. Colado, A., et al. The kinase inhibitors R406 and GS-9973 impair T cell functions and macrophage-mediated anti-tumor activity of rituximab in chronic lymphocytic leukemia patients. Cancer Immunol Immunother. 66 (4), 461-473 (2017).
  13. Colado, A., et al. Effect of the BTK inhibitor ibrutinib on macrophage- and gammadelta T cell-mediated response against Mycobacterium tuberculosis. Blood Cancer J. 8 (11), 100(2018).
  14. Nowak, W., et al. Pro-inflammatory monocyte profile in patients with major depressive disorder and suicide behaviour and how ketamine induces anti-inflammatory M2 macrophages by NMDAR and mTOR. EBioMedicine. 50, 290-305 (2019).
  15. Gattas, M. J., et al. A heterotypic tridimensional model to study the interaction of macrophages and glioblastoma in vitro. Int J Mol Sci. 22 (10), 5105(2021).
  16. Risnik, D., et al. Immunoregulatory effects of lurbinectedin in chronic lymphocytic leukemia. Cancer Immunol Immunother. 69 (5), 813-824 (2020).
  17. Mulder, K., et al. Cross-tissue single-cell landscape of human monocytes and macrophages in health and disease. Immunity. 54 (8), 1883-1900.e5 (2021).
  18. Silvin, A., et al. Dual ontogeny of disease-associated microglia and disease inflammatory macrophages in aging and neurodegeneration. Immunity. 55 (8), 1448-1465.e6 (2022).
  19. Maeda, A., Digifico, E., Andon, F. T., Mantovani, A., Allavena, P. Poly(I:C) stimulation is superior than imiquimod to induce the antitumoral functional profile of tumor-conditioned macrophages. Eur J Immunol. 49 (5), 801-811 (2019).
  20. Ummarino, A., Anfray, C., Maeda, A., Andon, F. T., Allavena, P. In vitro methods to evaluate macrophage polarization and function in cancer. Methods Mol Biol. 2614, 81-91 (2023).
  21. Carestia, A., et al. Platelets promote macrophage polarization toward pro-inflammatory phenotype and increase survival of septic mice. Cell Rep. 28 (4), 896-908.e5 (2019).
  22. Vogel, D. Y., et al. Human macrophage polarization in vitro: Maturation and activation methods compared. Immunobiology. 219 (9), 695-703 (2014).
  23. Ferrer, M. F., et al. Junin virus triggers macrophage activation and modulates polarization according to viral strain pathogenicity. Front Immunol. 10, 2499(2019).
  24. Ortiz Wilczynski, J. M., et al. The synthetic phospholipid C8-C1P determines pro-angiogenic and pro-reparative features in human macrophages restraining the proinflammatory M1-like phenotype. Front Immunol. 14, 1162671(2023).
  25. Dunsmore, G., et al. Timing and location dictate monocyte fate and their transition to tumor-associated macrophages. Sci Immunol. 9 (97), eadk3981(2024).
  26. Wang, X., Chen, J., Jia, G. From dichotomy to diversity: Deciphering the multifaceted roles of tumor-associated macrophages in cancer progression and therapy. Cancer Biol Med. 21 (2), 132-138 (2023).
  27. Hochstadt, J., Martinez Pacheco, S., Casanova-Acebes, M. Embracing diversity: Macrophage complexity in cancer. Trends Cancer. 11 (4), 351-364 (2025).
  28. Xu, J., et al. Dual roles and therapeutic targeting of tumor-associated macrophages in tumor microenvironments. Signal Transduct Target Ther. 10 (1), 268(2025).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

MacrofagepolarisatieIn Vitro ModelleringMonocytendifferentiatieGeconditioneerde MediaTumor-macrofaaginteractiesMacrofaagherprogrammeringKankerimmunologie
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.