Snelle magnetische microbead-methode voor efficiënte zuivering van neutrofielen met lage dichtheid

Summary

Neutrofielen met lage dichtheid (LDN) nemen aanzienlijk toe bij verschillende ziekten. LDN worden meestal geïsoleerd door middel van celsortering. We presenteren een praktische methode om zuiver en levensvatbaar LDN te verkrijgen. Na dichtheidsgradiëntcentrifugatie van perifeer bloed worden cellen geïncubeerd met magnetische microbeads en vervolgens wordt LDN gescheiden door magnetische kolommen.

Abstract

Neutrofielen, belangrijke leukocyten van aangeboren immuniteit, worden van oudsher beschouwd als een homogene celpopulatie. Niettemin heeft recent bewijs aangetoond dat neutrofielen in verschillende subpopulaties voorkomen. Een van die subpopulaties zijn neutrofielen met een lage dichtheid (LDN). LDN wordt in kleine aantallen aangetroffen in het bloed van gezonde personen, maar hun aantal neemt aanzienlijk toe bij ziekten zoals systemische lupus erythematosus, auto-immuunziekten, kanker en infecties. In deze gevallen kan LDN deelnemen aan de pathogenese van de ziekte. De enige manier om LDN te isoleren is door middel van dichtheidsgradiëntcentrifugatie van perifeer bloed. Na centrifugatie wordt LDN echter gecoördineerd met mononucleaire cellen. Het bestuderen van deze neutrofielensubpopulatie is dus een uitdaging. Er is geen standaardmethodologie om LDN te scheiden van mononucleaire cellen. Doorgaans worden LDN gescheiden door celsortering in een flowcytometer. Deze methode vereist echter lange sorteertijden (uren) om voldoende zuivere cellen te verkrijgen voor verdere functionele studies. Dit heeft ernstige gevolgen voor de levensvatbaarheid en functie van cellen. Hier stellen we een praktische methode voor om in korte tijd grote hoeveelheden zuiver en levensvatbaar LDN te verkrijgen. Na dichtheidsgradiëntcentrifugatie wordt de mononucleaire celfractie geïncubeerd met anti-CD66b magnetische microbeads en vervolgens wordt LDN in < 30 minuten gescheiden door magnetische kolommen. Gezuiverd LDN (CD66b⁺ -cellen) worden gelabeld met monoklonale antilichamen tegen CD10, CD11b, CD14, CD15, CD16b, CD33, CD62L, CD66b en CD98, en worden geanalyseerd door middel van flowcytometrie ter bevestiging. Gezuiverd LDN is volledig functioneel, zoals blijkt uit hun vermogen om reactieve zuurstofsoorten te produceren en om neutrofiele extracellulaire vallen te vormen. Deze nieuwe zuiveringsmethode resulteert in LDN met een hoge zuiverheid (meer dan 90%) en levensvatbaarheid (meer dan 96%) in een korte periode. Deze methode kan gemakkelijk worden opgeschaald om grote aantallen puur LDN te verkrijgen om LDN-functies bij verschillende ziekten te evalueren door middel van biochemische of andere omics-analyse.

Introduction

Neutrofielen, de overheersende leukocyten in menselijk bloed¹, zijn belangrijke deelnemers aan het aangeboren immuunsysteem. Ze komen in grote aantallen aan in weefsels met een ontsteking of infectie². Daar activeren neutrofielen verschillende effectorfuncties, zoals fagocytose ^3,4, degranulatie ^5,6 en de vorming van neutrofiele extracellulaire vallen (NET's)⁷. Bovendien nemen neutrofielen ook deel aan de adaptieve immuunrespons^8<....

Protocol

Alle procedures in dit protocol volgen de richtlijnen van de Human Research Bioethics Committee van het Instituto de Investigaciones Biomédicas - Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM). Alle deelnemers gaven geïnformeerde toestemming.

1. Isolatie van perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC) en neutrofielen uit menselijk bloed

1. Verkrijg ongeveer 10 ml bloed van een gezonde volwassen vrijwilliger door middel van venapunctie. Voeg 10 E/ml heparine toe als antistollingsmiddel.
   LET OP: Gooi de naald weg in een afvalcontainer voor biologisch gevaarlijke naalden. Spuiten en andere materialen....

Results

Neutrofielen met lage dichtheid (LDN) bij gezonde personen vertegenwoordigen ongeveer 5% van de PBMC (Figuur 2A). Het hier beschreven protocol levert doorgaans puur (> 90%) LDN. Cellen worden ook efficiënt hersteld (opbrengst ongeveer 98%) met een hoge levensvatbaarheid (> 95%; Figuur 2B). Ter vergelijking: LDN werd ook gezuiverd door fluorescerend-geactiveerde celsortering, zoals eerder beschrev.......

Discussion

Over het algemeen werden neutrofielen gezien als homogene cellen. Recent bewijs heeft echter aangetoond dat neutrofielen kunnen bestaan als cellen met verschillende activeringstoestanden en/of meerdere fenotypes. Er kunnen dus verschillende subpopulaties van neutrofielen bestaan 13,14,15. Eén subpopulatie van neutrofielen, de neutrofielen met lage dichtheid (LDN), heeft grote belangstelling gekr.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-Citrulline rabbit polyclonal antibody	AbCam	ab100932	1/50 dilution
96-well tissue culture plate	Costar; Corning, Inc.	3596
Alexa Fluor 488 anti-human CD11b mouse IgG1 antibody	BioLegend	301317	0.25 μg/mL
Alexa Fluor 647 anti-human CD66b mouse IgM antibody	BioLegend	305109	0.05 μg/mL
Anti-Mouse IgG (H+L) goat antibody, Alexa Fluor 488	Invitrogen - Thermo Fisher Scientific	A-11001	1/50 dilution
Anti-Neutrophil Elastase mouse monoclonal IgG1 antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-55549	10 µg/mL
Anti-Rabbit IgG (H+L) donkey antibody, Alexa Fluor 555	Invitrogen - Thermo Fisher Scientific	A-31572	1/50 dilution
APC anti-human CD62L mouse IgG1 antibody	BioLegend	304809	0.03 μg/mL
APC/Cyanine7 anti-human CD14 mouse IgG1 antibody	BioLegend	367107	0.25 μg/mL
Attune NxT flow cytometer	Thermo Fisher Scientific, Inc.	(blue/red lasers)
Bovine serum albumin (BSA) Fraction V	MP Biomedicals	810025
Brilliant Violet 510 anti-human CD33 mouse IgG1 antibody	BioLegend	366609	0.30 μg/mL
DAPI	Calbiochem/EMD Millipore	268298
Dextran T500	Pharmacosmos A/C	5.51005E+11
Dihydrorhodamine-123	Anaspec, Inc.	AS-85711
FACS cell sorter	Becton Dickinson	Model FACSAria
Fetal bovine serum (FBS)	Gibco	16000-044
Ficoll-Paque	Merck KG	GE 17-1440-03
FITC anti-human CD98 mouse IgG1 antibody	BioLegend	315603	0.30 μg/mL
FlowJo Software	Becton Dickinson	Version 10, 2019
Fluorescence inverted microscope	Olympus	Model IX-70
Heparin	Inhepar - PiSA Farmaceutica	3660149	5000 UI/mL
Hepes	Sigma Aldrich	H7006
MACSprep Chimerism CD66b Microbeads	Miltenyi Biotec	130-111-552
Magnet	Miltenyi Biotec	130-042-102
Magnetic separation column	Miltenyi Biotec	130-042-201
Microcentrifuge	Eppendorf	Model 5415C
Microplate reader	BioTek Instruments	Model Synergy HT
Paraformaldehyde	Sigma Aldrich	158127
PE anti-human CD10 mouse IgG1 antibody	BioLegend	312203	0.05 μg/mL
PE anti-human CD16b mouse IgG2a antibody	BD Pharmingen	550868	1/40 dilution
PE/Cyanine5 anti-human CD15 mouse IgG1 antibody	BioLegend	323013	0.25 μg/mL
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)	Sigma Aldrich	P8139
poly-L-Lysine	Sigma Aldrich	P2658
Refrigerated centrifuge	Eppendorf	Model 5702R
RPMI-1640 tissue culture medium	Gibco	23400-021
SYTOX Green	Molecular Probes, Inc.	S-7020
Tween-20	Sigma Aldrich	P2287
Vectashield	Vector Laboratories	H-1000