Method Article

Snelle magnetische microbead-methode voor efficiënte zuivering van neutrofielen met lage dichtheid

DOI:

10.3791/69407

⸱

November 11th, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Departamento de Inmunología, Instituto de Investigaciones Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neutrofielen met lage dichtheid (LDN) nemen aanzienlijk toe bij verschillende ziekten. LDN worden meestal geïsoleerd door middel van celsortering. We presenteren een praktische methode om zuiver en levensvatbaar LDN te verkrijgen. Na dichtheidsgradiëntcentrifugatie van perifeer bloed worden cellen geïncubeerd met magnetische microbeads en vervolgens wordt LDN gescheiden door magnetische kolommen.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neutrofielen, belangrijke leukocyten van aangeboren immuniteit, worden van oudsher beschouwd als een homogene celpopulatie. Niettemin heeft recent bewijs aangetoond dat neutrofielen in verschillende subpopulaties voorkomen. Een van die subpopulaties zijn neutrofielen met een lage dichtheid (LDN). LDN wordt in kleine aantallen aangetroffen in het bloed van gezonde personen, maar hun aantal neemt aanzienlijk toe bij ziekten zoals systemische lupus erythematosus, auto-immuunziekten, kanker en infecties. In deze gevallen kan LDN deelnemen aan de pathogenese van de ziekte. De enige manier om LDN te isoleren is door middel van dichtheidsgradiëntcentrifugatie van perifeer bloed. Na centrifugatie wordt LDN echter gecoördineerd met mononucleaire cellen. Het bestuderen van deze neutrofielensubpopulatie is dus een uitdaging. Er is geen standaardmethodologie om LDN te scheiden van mononucleaire cellen. Doorgaans worden LDN gescheiden door celsortering in een flowcytometer. Deze methode vereist echter lange sorteertijden (uren) om voldoende zuivere cellen te verkrijgen voor verdere functionele studies. Dit heeft ernstige gevolgen voor de levensvatbaarheid en functie van cellen. Hier stellen we een praktische methode voor om in korte tijd grote hoeveelheden zuiver en levensvatbaar LDN te verkrijgen. Na dichtheidsgradiëntcentrifugatie wordt de mononucleaire celfractie geïncubeerd met anti-CD66b magnetische microbeads en vervolgens wordt LDN in < 30 minuten gescheiden door magnetische kolommen. Gezuiverd LDN (CD66b+ -cellen) worden gelabeld met monoklonale antilichamen tegen CD10, CD11b, CD14, CD15, CD16b, CD33, CD62L, CD66b en CD98, en worden geanalyseerd door middel van flowcytometrie ter bevestiging. Gezuiverd LDN is volledig functioneel, zoals blijkt uit hun vermogen om reactieve zuurstofsoorten te produceren en om neutrofiele extracellulaire vallen te vormen. Deze nieuwe zuiveringsmethode resulteert in LDN met een hoge zuiverheid (meer dan 90%) en levensvatbaarheid (meer dan 96%) in een korte periode. Deze methode kan gemakkelijk worden opgeschaald om grote aantallen puur LDN te verkrijgen om LDN-functies bij verschillende ziekten te evalueren door middel van biochemische of andere omics-analyse.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neutrofielen, de overheersende leukocyten in menselijk bloed1, zijn belangrijke deelnemers aan het aangeboren immuunsysteem. Ze komen in grote aantallen aan in weefsels met een ontsteking of infectie2. Daar activeren neutrofielen verschillende effectorfuncties, zoals fagocytose 3,4, degranulatie 5,6 en de vorming van neutrofiele extracellulaire vallen (NET's)7. Bovendien nemen neutrofielen ook deel aan de adaptieve immuunrespons8. De klassieke kijk op neutrofielen beschouwt ze als homogene cellen die in het beenmerg worden geproduceerd met vooraf bepaalde reacties 9,10. Recente studies tonen echter aan dat neutrofielen heterogene cellen zijn met meerdere fenotypische en functionele toestanden onder zowel gezonde als ziektetoestanden 11,12,13,14,15.

Onder verschillende subpopulaties van neutrofielen hebben de neutrofielen met lage dichtheid (LDN) veel belangstelling getrokken vanwege hun intrinsieke eigenschappen en omdat ze bij verschillende ziekten in aantal toenemen 16,17,18. LDN werd in 1986 gevonden in het bloed van patiënten met systemische lupus erythematosus (SLE)19. Ze werden gedetecteerd na het proces voor het scheiden van leukocyten in een dichtheidsgradiënt20,21. Na centrifugatie van bloed of leukocytenrijk plasma op een dichtheidsmedium (bijv. Ficoll-Paque), vormen monocyten en lymfocyten (bekend als perifere mononucleaire bloedcellen [PBMC]) een band in het bovenste deel (lage dichtheid) van de buis. Neutrofielen bezinken op de bodem van de buis. Onder de PBMC werden ook enkele neutrofielen gevonden; dit zijn LDN (Figuur 1). Kleine hoeveelheden LDN zitten in het bloed van gezonde personen22. Het LDN-aantal neemt echter aanzienlijk toe bij aandoeningen met meerdere immunosuppressie en chronische ontstekingen, waaronder SLE23,24, sepsis25, psoriasis26, astma27, juveniele idiopathische artritis28, anti-neutrofiel cytoplasmatisch antilichaam (ANCA)-geassocieerde vasculitis29, HIV-infectie30, malaria31 en tuberculose32. Hoewel het LDN-aantal bij alle genoemde pathologieën toeneemt, is LDN meestal bestudeerd in de context van SLE17. LDN uit het bloed van SLE-patiënten lijkt een groter vermogen te hebben om NET's te vormen33, om grote hoeveelheden pro-inflammatoire mediatoren af te scheiden34 en om T-cellen te activeren24. Bij andere aandoeningen, zoals kanker, wordt echter gemeld dat LDN bestaat uit rijpe en onrijpe neutrofielen35, met T-celonderdrukkende eigenschappen 36,37,38. Evenzo wordt gemeld dat LDN bij COVID-19-patiënten de proliferatie van T-cellen onderdrukt39, maar in tegenstelling tot SLE lijkt LDN minder NET te produceren39. Daarom zijn de oorsprong, samenstelling en functionele eigenschappen van LDN nog steeds controversieel.

Omdat LDN samen met PBMC worden gevonden, is het bestuderen ervan technisch ingewikkeld. Om de LDN-eigenschappen in verschillende pathologieën volledig te onderzoeken, is het noodzakelijk om ze te zuiveren. Een veelgebruikte procedure voor LDN-scheiding is het sorteren van fluorescerende cellen 22,40,41,42,43,44,45. Het sorteren van cellen vereist echter veel tijd voor celscheiding. Dit kan leiden tot celverlies of een laag herstel als de sorteertijd niet voldoende is. Bovendien worden cellen blootgesteld aan overmatige stress, wat zorgt voor wisselende resultaten bij het bestuderen van de functie van deze cellen. Een lange sorteertijd verhoogt ook de kosten van experimentele procedures en vereist gespecialiseerd personeel.

Hier presenteren we een snelle en efficiënte methode om in zeer korte tijd grote aantallen zuiver en levensvatbaar menselijk LDN te verkrijgen. Na dichtheidsgradiëntcentrifugatie wordt LDN gescheiden door magnetische celsortering (MACS; Figuur 1). Het grote voordeel van deze zuiveringsmethode is dat LDN wordt gescheiden met een hoge zuiverheid (meer dan 90%) en levensvatbaarheid (meer dan 96%). Ook zijn gezuiverde LDN volledig functioneel, zoals blijkt uit hun vermogen om reactieve zuurstofspecies (ROS) te genereren en NET's vrij te geven. Dit protocol kan eenvoudig worden geïmplementeerd in elk laboratorium dat geïnteresseerd is in de biologie van neutrofielen om LDN snel te scheiden van het bloed van mensen met meerdere ziekten om deze cellen verder te bestuderen.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle procedures in dit protocol volgen de richtlijnen van de Human Research Bioethics Committee van het Instituto de Investigaciones Biomédicas - Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM). Alle deelnemers gaven geïnformeerde toestemming.

1. Isolatie van perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC) en neutrofielen uit menselijk bloed

  1. Verkrijg ongeveer 10 ml bloed van een gezonde volwassen vrijwilliger door middel van venapunctie. Voeg 10 E/ml heparine toe als antistollingsmiddel.
    LET OP: Gooi de naald weg in een afvalcontainer voor biologisch gevaarlijke naalden. Spuiten en andere materialen die in contact komen met bloed moeten in een zak worden gedaan en worden geautoclaveerd voordat ze worden weggegooid.
  2. Voeg in een conische centrifugebuis van 15 ml 2 ml 6% dextran T500 toe in PBS. Voeg vervolgens 10 ml bloed toe door het langs de zijkant van de buis af te tappen. Keer de buis een paar keer om om het bloed en de dextraan te mengen.
  3. Laat de buis 45 minuten rusten, terwijl de erytrocyten bezinken. Het leukocytenrijke plasma verschijnt boven de erytrocytenlaag.
  4. Voeg in een andere centrifugebuis van 15 ml 5 ml dichtheidsgradiëntmedium toe. Piket het plasma voorzichtig, zonder de erytrocyten aan te raken, en leg het op het medium. Er moeten twee afzonderlijke fasen worden gevormd.
  5. Centrifugeer de buis bij 516 x g gedurende 20 minuten bij 4 °C. Mononucleaire cellen (PBMC) vormen een band tussen plasma en de middelste lagen. Neutrofielen vormen aan de onderkant een pellet (Figuur 1).
  6. Isolatie van PBMC
    1. Elimineer door aspiratie van het plasma bovenop de PBMC zonder de cellen aan te raken. Verzamel de cellen uit de band tussen het plasma en het medium. Zorg ervoor dat u zo min mogelijk medium aspireert.
    2. Plaats de cellen in een conische centrifugebuis van 50 ml. Voeg 20 ml PBS toe. Centrifugeer de buis bij 400 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
    3. Zuig het bovenstaande voorzichtig op en schraap het buisje om de cellen te scheiden. Voeg 10 ml koude PBS toe om de cellen opnieuw te suspenderen. Tel de PBMC met behulp van een Neubauer-kamer.
      OPMERKING: Gebruik geen pipet om de cellen opnieuw te suspenderen, omdat dit de cellen kan beschadigen.
  7. Isolatie van neutrofielen
    1. Verwijder het kleurgradiëntmedium. Scheid de cellen door de buis te schrapen en voeg 10 ml koude PBS toe.
    2. Doe de cellen in een verse centrifugebuis van 50 ml en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 400 x g bij 4 °C. Zuig het bovenstaande op en scheid de cellen zoals beschreven in stap 1.6.3.
  8. Om resterende erytrocyten te verwijderen, voegt u 10 ml koude hypotone oplossing toe (0,2% NaCl, 1% BSA, 20 mM Hepes, pH = 7,4) en mengt u voorzichtig gedurende precies 1 minuut.
  9. Voeg snel 10 ml koude hypertone oplossing toe (1,6% NaCl, 1% BSA, 20 mM HEPES, pH = 7,4) om de oplossing isotoon te maken.
  10. Tel de neutrofielen met behulp van een Neubauer-kamer (zuiverheid > 95%). Pellet de cellen door te centrifugeren zoals in stap 1.6.2. en suspendeer ze opnieuw in koude PBS. Houd de buis op ijs.
    OPMERKING: Er wordt gemeld dat de halfwaardetijd van neutrofielen in vitro 8 - 12 uur 46,47,48 is. In onze ervaring met dit protocol behouden neutrofielen hun functies gedurende ongeveer 6 tot 8 uur.

2. Zuivering van neutrofielen met lage dichtheid (LDN)

  1. Centrifugeer PBMC bij 400 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Verwijder het bovenstaande en suspendeer de cellen in 120 μL koudwasbuffer (1% BSA in PBS).
  2. Voeg 35 μL CD66b magnetische microbeads toe. Incubeer het mengsel in het donker bij 4 °C gedurende 30 min. Meng voorzichtig elke 10 minuten om celaggregatie te voorkomen.
  3. Voeg 1 ml koude wasbuffer toe. Plaats de cellen in een microcentrifuge en draai gedurende 3 minuten op 400 x g .
  4. Verwijder supernatant, scheid de celpellet door de buis te schrapen en suspendeer de cellen opnieuw in 1 ml wasbuffer.
  5. Plaats een magnetische scheidingskolom op een magneet. Voeg 0,5 ml wasbuffer toe aan de kolom en laat het door de kolom gaan.
  6. Breng cellen (1 ml) over op de kolom. Laat de buffer druppelsgewijs door de kolom gaan.
  7. Voeg 0,5 ml wasbuffer toe aan de kolom en laat het doortrekken. Voeg nog eens 0,5 ml wasbuffer toe aan de kolom.
  8. Verwijder de kolom van de magneet en plaats deze in een microcentrifugebuis. Voeg 1 ml wasbuffer toe aan de kolom.
  9. Plaats de zuiger bovenop de kolom en oefen voorzichtig druk uit om de cellen te lueren. Verwijder de zuiger en plaats de kolom op een nieuwe microcentrifugebuis.
  10. Voeg nog eens 1 ml wasbuffer toe. Plaats de zuiger bovenop de kolom en oefen voorzichtig druk uit om de cellen te lueren.
  11. Plaats beide buisjes in een microcentrifuge en draai ze 3 minuten op 800 x g . Resuspendeer ten slotte de cellen (LDN) uit beide buisjes in 1 ml koude PBS. Blijf op ijs.
    OPMERKING: De eerste 2 ml doorstroom bevat de rest van de PBMC. Deze cellen kunnen worden gebruikt voor andere onderzoeken.

3. Veelkleurige flowcytometrie

  1. Resuspendeer gezuiverde cellen bij 1 x 106 cel/ml in labelbuffer (1% FBS in PBS). Voeg 250 μL cellen toe aan een microcentrifugebuis van 1,5 ml.
  2. Voeg de overeenkomstige antilichamen tegen neutrofiele membraanmoleculen toe (voor details, zie Materiaaltabel). Incubeer de cellen gedurende 30 minuten bij 4 °C en bescherm ze tegen licht.
  3. Voeg 1 ml PBS toe. Plaats de buisjes in een microcentrifuge en draai ze 3 minuten op 800 x g .
  4. Zuig de supernatant op, breek de celpellet door op de buis te tikken en suspendeer de cellen in 0,5 ml 1% paraformaldehyde.
  5. Houd de cellen bij 4 °C beschermd tegen licht, totdat ze worden geanalyseerd door middel van flowcytometrie. Analyseer cellen door middel van flowcytometrie, waarbij 10.000 gebeurtenissen per monster worden vastgelegd. Voer celsortering uit zoals eerder beschreven22.
    LET OP: Paraformaldehyde is irriterend voor de huid en de luchtwegen. Zorg ervoor dat je de dampen niet inademt.

4. Detectie van reactieve zuurstofspecies (ROS)

  1. Voeg in een microcentrifugebuis van 1,5 ml 2,5 x 105 cellen toe. Plaats de buisjes in een microcentrifuge en draai gedurende 3 minuten op 800 x g .
  2. Zuig de supernatant op, schraap de buis om de cellen te scheiden en suspendeer de cellen in 100 μL 15 μM dihydrorhodamine 123 in PBS.
  3. Incubeer de cellen beschermd tegen licht bij 37 °C gedurende 20 minuten. Voeg 1 ml PBS toe.
  4. Plaats de buisjes in een microcentrifuge en draai gedurende 3 minuten op 800 x g . Zuig het supernatant op, schraap het buisje om de cellen te scheiden en suspendeer ze opnieuw in 100 μl 50 nM phorbol 12-myristaat 13-acetaat (PMA) in PBS.
  5. Incubeer de cellen beschermd tegen licht bij 37 °C gedurende 45 minuten. Voeg 1 ml PBS toe.
  6. Plaats de buisjes in een microcentrifuge en draai ze 3 minuten op 800 x g . Zuig de supernatant op, schraap de buis om de cellen te scheiden en suspendeer ze opnieuw in 0,5 ml 1% paraformaldehyde in PBS.
  7. Houd de cellen bij 4 °C beschermd tegen licht totdat ze worden geanalyseerd door middel van flowcytometrie. Analyseer cellen door middel van flowcytometrie, waarbij 10.000 gebeurtenissen per monster worden vastgelegd.

5. Visualisatie van neutrofiele extracellulaire vallen (NET's)

  1. Plaats dekglaasjes in putjes van een plaat met 12 putjes en bedek ze met 10 μg/ml poly-L-lysine. Incubeer de plaat een nacht bij 4 °C en schud zachtjes.
  2. Verwijder de poly-L-Lysine en was de dekglaasjes met PBS, waarbij u de plaat 5 minuten op kamertemperatuur incubeert met zacht roeren. Was de dekglaasjes nog twee keer met PBS.
  3. Verwijder de PBS en laat de dekglaasjes drogen door de plaat 2 uur in een laminaire afzuigkap te plaatsen.
  4. Resuspendeer LDN bij 1 x 106 cel/ml in RPMI-1640 medium met 5% FBS. Neem 350 μL (3,5 x 105 cellen) van de celsuspensie en doe deze in een putje van de plaat met 12 putjes met de dekglaasjes.
  5. Bewaar de plaat 30 minuten in een 5% CO2 -incubator bij 37 °C. Voeg 3,5 μL 5 μM PMA verdund in PBS toe aan elk putje (de uiteindelijke PMA-concentratie is 50 nM).
  6. Bewaar de plaat 4 uur in een 5% CO2 -incubator bij 37 °C. Voeg 350 μL 8% paraformaldehyde toe aan PBS en bewaar de plaat een nacht in een 5% CO2 -incubator bij 37 °C.
  7. Plaats een transparante folie over een reageerbuisstandaard zoals eerder beschreven49, zodat er putjes worden gevormd op de buisgaten.
  8. Vul elk putje met de verschillende oplossingen om de dekglaasjes te wassen of te bevlekken, zodat ze een grote druppel vormen. Verwijder de dekglaasjes en leg ze 5 minuten ondersteboven op een druppel water. Was de dekglaasjes op dezelfde manier nog drie keer met water.
  9. Plaats de dekglaasjes ondersteboven op een druppel blokkeerbuffer (5% BSA in PBS) en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
  10. Breng de dekglaasjes over op een druppel van het overeenkomstige primaire antilichaam (bv. anti-elastase of anti-citrulline) in blokkeerbuffer en incubeer gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur.
  11. Was dekglaasjes 2x in 0,01% Tween-20 in PBS. Breng de dekglaasjes over op een druppel van het overeenkomstige secundaire antilichaam in een blokkeerbuffer die 150 nM DAPI bevat en incubeer gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht.
  12. Was dekglaasjes 2x in 0,01% Tween-20 in PBS. Plaats een druppel antifade montagemedium op een glazen dia en leg de dekglaasjes ondersteboven.
  13. Dicht dekglaasjes rond de omtrek af met nagellak. Bewaar gemonteerde objectglaasjes bij 4 °C, beschermd tegen licht. Visualiseer NET's met behulp van een fluorescentiemicroscoop.

6. Detectie van neutrofiele extracellulaire vallen (NET's)

  1. Resuspendeer cellen bij 5 x 105 cellen/ml in 500 nM Sytox Green, verdund in RPMI-1640 medium met 5% FBS.
  2. Neem 100 μL (5 x 104 cellen) van de celsuspensie en doe deze in een putje van een weefselkweekplaat met 96 putjes.
  3. Bewaar de plaat 20 minuten in een 5% CO2 -incubator bij 37 °C. Voeg aan elk putje 20 μL 300 nM PMA verdund in RPMI-1640-medium toe (de uiteindelijke concentratie PMA is 50 nM).
  4. Breng de plaat over naar een voorverwarmde microplaatlezer. Incubeer de plaat gedurende 4 uur bij 35 °C en voer elke 5 minuten fluorescentiemetingen uit vanaf de onderkant van de plaat (met behulp van de excitatiefilters van 485 nm en de emissiefilters van 528 nm).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neutrofielen met lage dichtheid (LDN) bij gezonde personen vertegenwoordigen ongeveer 5% van de PBMC (Figuur 2A). Het hier beschreven protocol levert doorgaans puur (> 90%) LDN. Cellen worden ook efficiënt hersteld (opbrengst ongeveer 98%) met een hoge levensvatbaarheid (> 95%; Figuur 2B). Ter vergelijking: LDN werd ook gezuiverd door fluorescerend-geactiveerde celsortering, zoals eerder beschreven22...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Over het algemeen werden neutrofielen gezien als homogene cellen. Recent bewijs heeft echter aangetoond dat neutrofielen kunnen bestaan als cellen met verschillende activeringstoestanden en/of meerdere fenotypes. Er kunnen dus verschillende subpopulaties van neutrofielen bestaan 13,14,15. Eén subpopulatie van neutrofielen, de neutrofielen met lage dichtheid (LDN), heeft grote belangstelling gekr...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs stellen dat deze studie werd uitgevoerd zonder enige commerciële of financiële banden die als een potentieel belangenconflict zouden kunnen worden opgevat.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs danken César Díaz-Godínez (Instituto de Investigaciones Biomédicas-UNAM) voor zijn hulp bij fluorescentiemicroscopie om NET's te visualiseren. Dit onderzoek werd ondersteund door subsidie PAPIIT IN205523 van Dirección General de Asuntos del Personal Académico, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM), Mexico, en door subsidie CF-2023-I-610 van Secretaría de Ciencias, Humanidades, Tecnología e Inovación (Secihti), Mexico.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
 Anti-Citrulline konijn polyklonaal antilichaamAbCamab1009321/50 verdunning
96-wells weefselkweekplaatCostar; Corning, Inc.3596
Alexa Fluor 488 anti-mens CD11b muis IgG1 antilichaamBioLegend3013170,25 μg/mL
Alexa Fluor 647 anti-mens CD66b muis IgM antilichaamBioLegend3051090,05 μg/mL
Anti-Muis IgG (H+L) geit antilichaam, Alexa Fluor 488Invitrogen - Thermo Fisher ScientificA-110011/50 verdunning
Anti-Neutrofiel Elastase muis monoklonaal IgG1 antilichaamSanta Cruz Biotechnologysc-5554910 µg/mL
Anti-Konijn IgG (H+L) ezel antilichaam, Alexa Fluor 555Invitrogen - Thermo Fisher ScientificA-315721/50 verdunning
APC anti-mens CD62L muis IgG1 antilichaamBioLegend3048090,03 μg/mL
APC/Cyanine7 anti-mens CD14 muis IgG1 antilichaamBioLegend3671070,25 μg/mL
Attune NxT flow cytometer Thermo Fisher Scientific, Inc.(blauwe/rode lasers)
Rundserum albumine (BSA) Fractie VMP Biomedicals810025
Brilliant Violet 510 anti-mens CD33 muis IgG1 antilichaamBioLegend3666090,30 μg/mL
DAPICalbiochem/EMD Millipore268298
Dextran T500Pharmacosmos A/C5.51005E+11
Dihydrorhodamine-123Anaspec, Inc.AS-85711
FACS celsorterBecton Dickinson Model FACSAria
Fetaal rundserum (FBS)Gibco16000-044
Ficoll-PaqueMerck KGGE 17-1440-03
FITC anti-mens CD98 muis IgG1 antilichaamBioLegend3156030,30 μg/mL
FlowJo SoftwareBecton DickinsonVersie 10, 2019
Fluorescentie-inverteermicroscoopOlympusModel IX-70
HeparineInhepar - PiSA Farmaceutica36601495000 UI/mL
HepesSigma AldrichH7006
MACSprep Chimerism CD66b MicrobeadsMiltenyi Biotec130-111-552
MagneetMiltenyi Biotec130-042-102
Magnetische scheidingskolomMiltenyi Biotec130-042-201
MicrocentrifugeEppendorfModel 5415C
MicroplaatlezerBioTek InstrumentsModel Synergy HT
ParaformaldehydeSigma Aldrich158127
PE anti-mens CD10 muis IgG1 antilichaamBioLegend3122030,05 μg/mL
PE anti-mens CD16b muis IgG2a antilichaamBD Pharmingen5508681/40 verdunning
PE/Cyanine5 anti-mens CD15 muis IgG1 antilichaamBioLegend3230130,25 μg/mL
Phorbol 12-myristaat 13-acetaat (PMA)Sigma AldrichP8139
poly-L-LysineSigma AldrichP2658
Gekoelde centrifugeEppendorfModel 5702R
RPMI-1640 weefselkweekmediumGibco23400-021
SYTOX GreenMolecular Probes, Inc.S-7020
Tween-20 Sigma AldrichP2287
VectashieldVector LaboratoriesH-1000

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yvan-Charvet, L., Ng, L. G. Granulopoiesis and neutrophil homeostasis: A metabolic, daily balancing act. Trends Immunol. 40 (7), 598-612 (2019).
  2. Liew, P. X., Kubes, P. The neutrophil's role during health and disease. Physiol. Rev. 99 (2), 1223-1248 (2019).
  3. Rosales, C., Uribe-Querol, E. Phagocytosis: A fundamental process in immunity. Biomed Res Int. 2017, 9042851(2017).
  4. Uribe-Querol, E., Rosales, C. Phagocytosis: Our current understanding of a universal biological process. Front Immunol. 11, 1066(2020).
  5. Faurschou, M., Borregaard, N. Neutrophil granules and secretory vesicles in inflammation. Microbes Infect. 5 (14), 1317-1327 (2003).
  6. Lacy, P., Eitzen, G. Control of granule exocytosis in neutrophils. Front Biosci. 13, 5559-5570 (2008).
  7. Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nat Rev Immunol. 18 (2), 134-147 (2018).
  8. Rosales, C. Neutrophils at the crossroads of innate and adaptive immunity. J Leukoc Biol. 108 (1), 377-396 (2020).
  9. Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).
  10. Lawrence, S. M., Corriden, R., Nizet, V. The ontogeny of a neutrophil: Mechanisms of granulopoiesis and homeostasis. Microbiol Mol Biol. Rev. 82 (1), e00057-e00117 (2018).
  11. Aroca-Crevillén, A., Vicanolo, T., Ovadia, S., Hidalgo, A. Neutrophils in physiology and pathology. Annu Rev Pathol. 19, 227-259 (2024).
  12. Hellebrekers, P., Vrisekoop, N., Koenderman, L. Neutrophil phenotypes in health and disease. Eur J Clin Invest. 48 (Suppl 2), e12943(2018).
  13. Ng, L. G., Ostuni, R., Hidalgo, A. Heterogeneity of neutrophils. Nat Rev Immunol. 19 (4), 255-265 (2019).
  14. Qu, J., Jin, J., Zhang, M., Ng, L. G. Neutrophil diversity and plasticity: Implications for organ transplantation. Cell Mol Immunol. 20 (9), 993-1001 (2023).
  15. Rosales, C. Neutrophil: A cell with many roles in inflammation or several cell types. Front Physiol. 9, 113(2018).
  16. Silvestre-Roig, C., Fridlender, Z. G., Glogauer, M., Scapini, P. Neutrophil diversity in health and disease. Trends Immunol. 40 (7), 565-583 (2019).
  17. Carmona-Rivera, C., Kaplan, M. J. Low-density granulocytes in systemic autoimmunity and autoinflammation. Immunol Rev. 314 (1), 313-325 (2023).
  18. Ning, X., Wang, W. M., Jin, H. Z. Low-density granulocytes in immune-mediated inflammatory diseases. J Immunol. 2022, 1622160(2022).
  19. Hacbarth, E., Kajdacsy-Balla, A. Low density neutrophils in patients with systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, and acute rheumatic fever. Arthritis Rheum. 29 (11), 1334-1342 (1986).
  20. Böyum, A. Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood. Isolation of monuclear cells by one centrifugation, and of granulocytes by combining centrifugation and sedimentation at 1 g. Scand J Clin Lab Invest Suppl. 97, 77-89 (1968).
  21. García-García, E., Uribe-Querol, E., Rosales, C. A simple and efficient method to detect nuclear factor activation in human neutrophils by flow cytometry. J Vis Exp. (74), e50410(2013).
  22. Blanco-Camarillo, C., Alemán, O. R., Rosales, C. Low-density neutrophils in healthy individuals display a mature primed phenotype. Front Immunol. 12, 672520(2021).
  23. Midgley, A., Beresford, M. W. Increased expression of low-density granulocytes in juvenile-onset systemic lupus erythematosus patients correlates with disease activity. Lupus. 25 (4), 407-411 (2016).
  24. Rahman, S., et al. Low-density granulocytes activate T cells and demonstrate a non-suppressive role in systemic lupus erythematosus. Ann Rheum Dis. 78 (7), 957-966 (2019).
  25. Morisaki, T., Goya, T., Ishimitsu, T., Torisu, M. The increase of low-density subpopulations and CD10 (calla) negative neutrophils in severely infected patients. Surg Today. 22, 322-327 (1992).
  26. Lin, A. M., et al. Mast cells and neutrophils release IL-17 through extracellular trap formation in psoriasis. J Immunol. 187 (1), 490-500 (2011).
  27. Fu, J., Tobin, M. C., Thomas, L. L. Neutrophil-like low-density granulocytes are elevated in patients with moderate to severe persistent asthma. Ann Allergy Asthma Immunol. 113 (6), 635-640 (2014).
  28. Ramanathan, K., et al. Neutrophil activation signature in juvenile idiopathic arthritis indicates the presence of low-density granulocytes. Rheumatology (Oxford). 57 (3), 488-498 (2018).
  29. Grayson, P. C., et al. Neutrophil-related gene expression and low-density granulocytes associated with disease activity and response to treatment in antineutrophil cytoplasmic antibody-associated vasculitis. Arthritis Rheumatol. 67 (7), 1922-1932 (2015).
  30. Cloke, T., Munder, M., Taylor, G., Müller, I., Kropf, P. Characterization of a novel population of low-density granulocytes associated with disease severity in HIV-1 infection. PLoS One. 7, e48939(2012).
  31. Rocha, B. C., et al. Type I interferon transcriptional signature in neutrophils and low-density granulocytes is associated with tissue damage in malaria. Cell Rep. 13 (12), 2829-2841 (2015).
  32. Deng, Y., et al. Low-density granulocytes are elevated in mycobacterial infection and associated with the severity of tuberculosis. PLoS One. 11 (4), e0153567(2016).
  33. Villanueva, E., et al. Netting neutrophils induce endothelial damage, infiltrate tissues, and expose immunostimulatory molecules in systemic lupus erythematosus. J Immunol. 187 (1), 538-552 (2011).
  34. Denny, M. F., et al. A distinct subset of proinflammatory neutrophils isolated from patients with systemic lupus erythematosus induces vascular damage and synthesizes type I IFNs. J Immunol. 184 (6), 3284-3297 (2010).
  35. Sagiv, J. Y., et al. Phenotypic diversity and plasticity in circulating neutrophil subpopulations in cancer. Cell Rep. 10 (4), 562-573 (2015).
  36. Sionov, R. V., Fridlender, Z. G., Granot, Z. The multifaceted roles neutrophils play in the tumor microenvironment. Cancer Microenviron. 8 (December), 125-158 (2015).
  37. Hassani, M., et al. On the origin of low-density neutrophils. J Leukoc Biol. 107 (5), 809-818 (2020).
  38. Vanhaver, C., et al. Immunosuppressive low-density neutrophils in the blood of cancer patients display a mature phenotype. Life Sci Alliance. 7 (1), e202302332(2023).
  39. Dwivedi, A., et al. Emergence of dysfunctional neutrophils with a defect in arginase-1 release in severe COVID-19. JCI Insight. 9 (17), e171659(2024).
  40. Cabrera, L. E., et al. Characterization of low-density granulocytes in COVID-19. PLoS Pathog. 17 (7), e1009721(2021).
  41. Dumont, B. L., et al. Low-density neutrophils and neutrophil extracellular traps (nets) are new inflammatory players in heart failure. Can J Cardiol. 40 (9), 1524-1535 (2024).
  42. Dumont, B. L., et al. Low-density neutrophils contribute to subclinical inflammation in patients with type 2 diabetes. Int J Mol Sci. 25 (3), 1674(2024).
  43. Jones, B. E., et al. Anca autoantigen gene expression highlights neutrophil heterogeneity, where expression in normal-density neutrophils correlates with anca-induced activation. Kidney Int. 98 (3), 744-757 (2020).
  44. Li, Y., et al. The proportion, origin, and pro-inflammation roles of low-density neutrophils in SFTS disease. BMC Infect. Dis. 19 (1), 109(2019).
  45. Martin, K. R., et al. Cd98 defines a metabolically flexible, proinflammatory subset of low-density neutrophils in systemic lupus erythematosus. Clin Transl Med. 13 (1), e1150(2023).
  46. Murphy, M. P., Caraher, E. Mcl-1 is vital for neutrophil survival. Immunol Res. 62 (2), 225-233 (2015).
  47. Nauseef, W. M. Neutrophils, from cradle to grave and beyond. Immunol Rev. 273 (1), 5-10 (2016).
  48. Pérez-Figueroa, E., Álvarez-Carrasco, P., Ortega, E., Maldonado-Bernal, C. Neutrophils: Many ways to die. Front Immunol. 12, 631821(2021).
  49. Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: How to generate and visualize them. J Vis Exp. (36), e1724(2010).
  50. Emmendörffer, A., Hecht, M., Lohmann-Matthes, M. L., Roesler, J. A fast and easy method to determine the production of reactive oxygen intermediates by human and murine phagocytes using dihydrorhodamine 123. J Immunol Methods. 131 (2), 269-227 (1990).
  51. Pioch, J., Blomgran, R. Optimized flow cytometry protocol for dihydrorhodamine 123-based detection of reactive oxygen species in leukocyte subpopulations in whole blood. J Immunol Methods. 507, 113308(2022).
  52. Liu, X., et al. Pad4 takes charge during neutrophil activation: Impact of pad4 mediated net formation on immune-mediated disease. J Thromb Haemost. 19 (7), 1607-1617 (2021).
  53. Wang, Y., et al. Histone hypercitrullination mediates chromatin decondensation and neutrophil extracellular trap formation. J Cell Biol. 184 (2), 205-213 (2009).
  54. Alemán, O. R., Mora, N., Cortes-Vieyra, R., Uribe-Querol, E., Rosales, C. Transforming growth factor-β-activated kinase 1 is required for human fcγriiib-induced neutrophil extracellular trap formation. Front Immunol. 7, 277(2016).
  55. Kraaij, T., et al. A novel method for high-throughput detection and quantification of neutrophil extracellular traps reveals ROS-independent net release with immune complexes. Autoimmun Rev. 15 (6), 577-584 (2016).
  56. Sanchez Gonzalez, A., Bardoel, B. W., Harbort, C. J., Zychlinsky, A. Neutrophil methods and protocols. , Humana Press - Springer Science+Business Media. New York. (2014).
  57. Mishalian, I., Granot, Z., Fridlender, Z. G. The diversity of circulating neutrophils in cancer. Immunobiology. 222 (1), 82-88 (2017).
  58. Wright, H. L., Makki, F. A., Moots, R. J., Edwards, S. W. Low-density granulocytes: Functionally distinct, immature neutrophils in rheumatoid arthritis with altered properties and defective TNF signalling. J Leukoc Biol. 101 (2), 599-611 (2017).
  59. Bruger, A. M., et al. How to measure the immunosuppressive activity of mdsc: Assays, problems and potential solutions. Cancer Immunol Immunother. 68 (4), 631-644 (2019).
  60. Kimberly, R. P., Ahlstrom, J. W., Click, M. E., Edberg, J. C. The glycosyl phosphatidylinositol-linked FCγRIII PMN mediates transmembrane signaling events distinct from FCγRII. J Exp Med. 171 (4), 1239-1255 (1990).
  61. Rosales, C., Uribe-Querol, E. Fc receptors: Cell activators of antibody functions. Adv Biosci Biotech. 4, 21-33 (2013).
  62. Unkeless, J. C., Shen, Z., Lin, C. W., Debeus, E. Function of human fcγriia and fcγriiib. Semin Immunol. 7 (1), 37-44 (1995).
  63. Ghaemdoust, F., Keshavarz-Fathi, M., Rezaei, N. Natural killer cells and cancer therapy, what we know and where we are going. Immunotherapy. 11 (14), 1231-1251 (2019).
  64. Lanier, L. L., Le, A. M., Civin, C. I., Loken, M. R., Phillips, J. H. The relationship of CD16 (leu-11) and leu-19 (NKH-1) antigen expression on human peripheral blood NK cells and cytotoxic T lymphocytes. J Immunol. 136 (12), 4480-4486 (1986).
  65. Huizinga, T. W., et al. The pi-linked receptor fcriii is released on stimulation of neutrophils. Nature. 333 (6174), 667-669 (1988).
  66. Jongstra-Bilen, J., Harrison, R., Grinstein, S. Fcγ-receptors induce mac-1 (cd11b/cd18) mobilization and accumulation in the phagocytic cup for optimal phagocytosis. J Biol Chem. 278 (46), 45720-45729 (2003).
  67. Tak, T., et al. Human CD62Ldim neutrophils identified as a separate subset by proteome profiling and in vivo pulse-chase labeling. Blood. 129 (26), 3476-3485 (2017).
  68. Lakschevitz, F. S., et al. Identification of neutrophil surface marker changes in health and inflammation using high-throughput screening flow cytometry. Exp Cell Res. 342 (2), 200-209 (2016).
  69. Schröder, A. K., Uciechowski, P., Fleischer, D., Rink, L. Crosslinking of CD66 b on peripheral blood neutrophils mediates the release of interleukin-8 from intracellular storage. Hum Immunol. 67 (9), 676-682 (2006).
  70. Skubitz, K. M., Campbell, K. D., Skubitz, A. P. Cd66a, cd66b, cd66c, and cd66d each independently stimulate neutrophils. J Leukoc Biol. 60 (1), 106-117 (1996).
  71. Basic principle of magnetic cell separation. , Miltenyi Biotec. https://www.miltenyibiotec.com/UN-en/products/macs-cell-separation/basic-principle-of-magnetic-cell-separation.html?query=:relevance:allCategoriesOR:10000089 (2025).
  72. Connelly, A. N., et al. Optimization of methods for the accurate characterization of whole blood neutrophils. Sci. Rep. 12 (1), 3667(2022).
  73. Hardisty, G. R., et al. High purity isolation of low density neutrophils casts doubt on their exceptionality in health and disease. Front Immunol. 12, 625922(2021).
  74. Sørensen, O. E., Borregaard, N. Neutrophil extracellular traps - the dark side of neutrophils. J Clin Invest. 126 (5), 1612-1620 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Low Density NeutrophilsMagnetic MicrobeadsNeutrophil PurificationDensity GradientPeripheral BloodFlow CytometryMononuclear CellsReactive Oxygen SpeciesNeutrophil Extracellular TrapsCD66b Marker

Related Articles