Modellering van hersenmetastase: gestandaardiseerde analyse van metastatische kolonisatie en histologische groeipatronen door stereotactische intracorticale injectie

Samenvatting

De stereotactische intracraniële injectietechniek maakt precieze en gelokaliseerde implantatie van tumorcellen in de muiscortex mogelijk, waardoor het een krachtig model is voor het bestuderen van metastatische kolonisatie van de hersenen.

Samenvatting

Hersenmetastasen zijn een veelvoorkomende en verwoestende complicatie van gevorderde solide tumoren, vaak geassocieerd met een slechte prognose, neurologische achteruitgang en een verminderde levenskwaliteit. De incidentie van falen in het centrale zenuwstelsel (CZS) en neurologische dood neemt snel toe, maar de mechanismen die de laatste stadia van hersenmetastase aansturen, zoals secundaire verspreiding, herkolonisatie en de bijdrage van het histologisch groeipatroon (HGP) als potentiële vervangingsparameter, blijven slecht begrepen.

Het gestandaardiseerde stereotactische intracorticale injectiemodel maakt precieze en reproduceerbare implantatie van tumorcellen, of gemengde populaties inclusief stromale of immuuncomponenten, direct in de hersenschors van de muis mogelijk. Dit protocol ondersteunt ook de creatie van een preklinisch weefselarchief, dat een robuust platform biedt voor het onderzoeken van essentiële aspecten van de kolonisatie van het NERVOUS Zenuwstelsel, zoals: metastatische uitgroei, HGP-specifieke groeidynamiek en pathofysiologische mechanismen die bijdragen aan neurologisch falen. Daarnaast ondersteunt dit model farmacologische tests in een reproduceerbare, klinisch relevante context.

In tegenstelling tot systemische injectiemethoden (bijvoorbeeld staartvene of intracardiale), die geoptimaliseerd zijn voor het bestuderen van vroege metastatische stappen maar leiden tot variabele en vaak lage concentratiepercentages van hersenkolonisatie, zorgt het stereotactische model voor consistente, hersenspecifieke metastatische groei en maakt het het mogelijk om late stadia van de uitzaaiing van het centrale zenuwstelsel te onderzoeken. In vergelijking met ex vivo systemen zoals organoïden of hersenslice-culturen, behoudt het in vivo stereotactische model vascularisatie, systemische signalering en de volledige complexiteit van het immuunlandschap van de hersenen, wat langdurige studies van tumorprogressie en therapeutische respons ondersteunt.

Door een reproduceerbaar en klinisch relevant platform te bieden, bevordert ons model het vermogen van het vakgebied om prognostische markers te identificeren, therapeutische strategieën te verkennen en de mechanismen van laatstadia-hersenmetastasen te begrijpen.

Inleiding

Hersenmetastasen zijn een veelvoorkomende en verwoestende complicatie bij patiënten met solide tumoren, vaak geassocieerd met een slechte prognose, significante neurologische achteruitgang en een verminderde levenskwaliteit ^1,2,3. In het bijzonder zijn falen van het centrale zenuwstelsel (CZS) en neurologische dood steeds frequentere uitkomsten geworden bij kankers zoals long-, borst- en melanoom 4,5,6,7. Contras-uitval in de context van hersenmetastasen kan ontstaan door verschillende mechanismen, waaronder lokaal mass effect, peritumoraal oedeem, intracraniële bloeding en meningeale verspreiding, die onafhankelijk of synergetisch kunnen werken en uiteindelijk leiden tot neurologische dood⁸.

Ondanks het klinische belang blijven de pathofysiologische mechanismen die ten grondslag liggen aan het falen van het CZS en de laatste stadia van metastasische progressie nog slecht begrepen. Processen zoals alternatieve verspreiding, secundaire verspreiding en herkolonisatie zijn zelden het onderwerp van toegewijd onderzoek⁸. Zowel klinische als preklinische studies beperken hun analyses vaak tot eindpunten zoals het aantal hersenmetastasen, de grootte of de algehele overleving (OS), waardoor cruciale mechanistische inzichten en de werkelijke oorzaken van neurologische achteruitgang en dood over het hoofd worden gezien.

In deze context hebben wij en anderen verschillende histologische groeipatronen (HGP's) geïdentificeerd in hersenmetastasen die correleren met klinische uitkomsten ^9,10,11. Drie belangrijke HGP's zijn beschreven: i) niet-infiltratief, gemarkeerd door een goed afgebakende tumorgrens die vaak wordt omgeven door een reactieve astrocytische rand; ii) epitheliale infiltratie, waarbij clusters tumorcellen het aangrenzende hersenparenchym binnendringen zonder astrocytische containment; en iii) diffuse infiltratie, gekenmerkt door wijdverspreide infiltratie van enkele tumorcellen of kleine clusters, wat een uitgebreide astrogliose^10,12 veroorzaakt.

Klinisch gezien zijn infiltratieve HGP's geassocieerd met significant slechtere prognose vergeleken met niet-infiltratieve patronen ^9,10,11. Bovendien lijken HGP's belangrijke aspecten van tumorgroeidynamiek en mechanismen te weerspiegelen die leiden tot neurologische dood. Hoewel niet-infiltratieve metastasen doorgaans als één enkele laesie uitbreiden en vitale structuren in de hersenen beperken, vertonen infiltratieve laesies secundaire verspreiding (beginnend bij de bestaande laesie en niet bij de primaire tumor) binnen het centrale zenuwstelsel, wat bijdraagt aan wijdverspreide schade en volledige orgaanvernietiging (ongepubliceerde gegevens). Infiltratieve laesies kunnen ook opnieuw de meningeale hersenvlies koloniseren, wat bijdraagt aan meningeale metastase en het ziekteverloop verder bemoeilijkt^10,13. Ondanks hun klinische relevantie blijven de HGP's van hersenmetastasen en de laatste stadia van CNS-kolonisatie, inclusief secundaire verspreiding en herkolonisatie van hetzelfde orgaan, onderbelicht, grotendeels vanwege het ontbreken van geschikte experimentele modellen.

Om deze kloof te dichten, presenteren we een stereotactisch intracraniële injectiemodel dat precieze, reproduceerbare implantatie mogelijk maakt van tumorcellen of cellulaire mengsels bestaande uit tumorcellen en één of meer niet-tumorceltypen in de hersenschors van experimentele muizen. Dit model overwint belangrijke beperkingen van systemische metastasemodellen en biedt een robuust platform voor het onderzoeken van essentiële aspecten van de kolonisatie van het NERVOUS (CZS), zoals: interacties tussen tumor-immuuncellen tijdens kolonisatie¹⁴, de impact van vooraf behandelde cellulaire mengsels¹⁵, metastaserende uitgroei¹⁶, HGP-specifieke groeidynamiek en pathofysiologische mechanismen die bijdragen aan neurologisch falen (ongepubliceerde gegevens). Daarnaast ondersteunt dit model farmacologische tests in een reproduceerbare en klinisch relevante context^14,15.

Dit protocol biedt een gedetailleerd methodologisch kader voor de implementatie van het stereotactische injectiemodel om HGP's bij hersenmetastase te bestuderen. Het ondersteunt ook de ontwikkeling van een gestructureerd preklinisch monsterarchief en een digitale weefselbibliotheek voor systematisch onderzoek van de colonisatiebiologie in het late stadium van het CNS. Ons doel is het mogelijk maken van de identificatie van prognostische en potentieel voorspellende biomarkers, bij te dragen aan de ontwikkeling van verbeterde therapeutische strategieën en ons vermogen te vergroten om acute en chronische reacties van het hersenparenchym en het immuunsysteem te voorspellen. Met deze aanpak streven we ernaar een gestandaardiseerd platform te bieden voor een systematische studie van de kolonisatie van het NERVOUS en de metastatische progressie.

Protocol

Alle dierprocedures die in dit protocol worden beschreven, zijn uitgevoerd in overeenstemming met institutionele richtlijnen en goedgekeurd door de regering van Neder-Franken (vergunningsnummer: RUF-55.2.2-2532-2-1678). Dit protocol is ontworpen voor de stereotactische intracorticale injectie van tumorcellen bij syngene volwassen muizen (10-12 weken oud) als model voor metastatische kolonisatie van de hersenen. Eventuele wijzigingen in het protocol moeten worden besproken met de aangewezen dierenwelzijnsfunctionaris.

1. Preoperatieve procedures

1. Acclimatisatie van dieren
   OPMERKING: Muizen moeten minimaal 7 dagen geacclimatiseerd zijn vóór de start van de experimentele procedures.
   1. Onderhoud proefdieren in groepen onder standaard laboratoriumomstandigheden (22 ± 2 °C, 50-60% relatieve luchtvochtigheid, 12 uur licht/donker cyclus) met ad libitum toegang tot voedsel en water.
   2. Om het welzijn te bevorderen en stress te verminderen, bied milieuverrijking in de vorm van nestmateriaal, schuilplaatsen en knagende blokken.
   3. Hanteer dieren eenmaal per dag (3-5 minuten per sessie) tijdens de acclimatisatieperiode om ze vertrouwd te maken met menselijk contact. Daarnaast voert u oefenprocedures uit die belangrijke aspecten van de aanstaande operatie simuleren, zoals wegen en blootstelling aan de anesthesie-opstelling, zonder invasieve interventie uit te voeren. Deze sessies zijn bedoeld om de dieren te laten wennen aan de procedurele omgeving en stressgerelateerde variabiliteit te minimaliseren.
2. Lichamelijk onderzoek (pre-operatieve gezondheidscontrole)
   OPMERKING: Voorafgaand aan tumorcelinjectie moeten alle dieren een grondig fysiek en neurologisch onderzoek ondergaan om bestaande afwijkingen die niet met het onderzoek te maken hebben uitgesloten. Dieren met tekorten of afwijkingen moeten uit de studie worden uitgesloten. Het lichamelijk onderzoek kan de dag voor de injectie worden uitgevoerd.
   1. Voer een volledig lichamelijk onderzoek uit waarbij de algehele gezondheid wordt beoordeeld, inclusief de conditie van de vacht, houding, ademhaling, loop, lichaamsgewicht en algemeen gedrag.
   2. Evalueer de neurologische functie met behulp van de Hanging Wire Test om gripsterkte en coördinatie te beoordelen. Om de Hanging Wire Test uit te voeren, hang je een horizontale draad (ongeveer 2 mm in diameter) tussen twee steunen, met ontsnappingsplatforms aan de uiteinden ongeveer 30 cm boven een gevoerd oppervlak. Plaats de muis in het midden van de draad en laat hem de draad met zijn voorpoten vastgrijpen. Laat de muis los en begin meteen met timen. Beëindig de proef wanneer de muis een van de platforms bereikt of valt. Beschouw een muis als succesvol als hij het platform binnen 60 seconden bereikt; registreer als een mislukking als het binnen deze tijdslimiet valt of het perron niet bereikt.
3. Voorbereiding van werkstations
   1. Op de dag van de operatie (dag 0) richt u vier speciale werkstations op zoals hieronder beschreven om een efficiënte workflow te garanderen en de steriele techniek gedurende de hele procedure te behouden.
      OPMERKING: Gebruik steriele chirurgische materialen (onderlagen, gaaskompressen, hechtingen, enz.) en autoclaveerde chirurgische instrumenten (scalpel, pincet, schaar, spatel, enz.).
      1. Werkstation #1 - Pre-operatieve diervoorbereiding: Gebruik dit werkstation om de muizen te wegen, de anesthesieoplossing voor te bereiden en de narcose toe te dienen. Bereid een schoon oppervlak voor met een weegschaal, twee kooien met beddengoed (wijs er één aan voor verdoofde muizen), een 1 ml spuit gevuld met de verdovingsoplossing en oogzalf.
      2. Werkstation #2 - Pre- en postoperatie-opstelling: Gebruik dit werkstation om de hoofdhuidincisie uit te voeren, de schedel af te sluiten en de wond te hechten. Bereid een schoon oppervlak voor met een scalpel, een 10 mL spuit met 0,9% NaCl, botwas, een spatel, hechtmateriaal, pincet en schaar, wattenstaafjes, desinfectiemiddel (70% ethanol), een 1 mL spuit met pijnstillers en een warmtekussen of een vergelijkbaar verwarmingsplatform.
      3. Werkstation #3 - Tumorcelvoorbereiding: Gebruik dit werkstation om de tumorceloplossing voor te bereiden vóór de inenting. Bereid een schoon oppervlak voor met een koelbox met een 10 μL Hamilton-spuit en een Eppendorf-buis met celsuspensie in Extracellulaire Matrix (ECM)-medium, een pipet met 100 μL tips voor het resuspenderen van cellen, en drie vaten voor het reinigen van de Hamilton-spuit na tumorcelinoculatie met gedestilleerd water, 70% ethanol en 0,9% NaCl.
      4. Werkstation #4 - Stereotactische injectie: Gebruik dit werkstation om de stereotactische tumorcelinjectie in de hersenschors uit te voeren. Bereid een schoon oppervlak voor met het stereotactische frame voor kleine dieren, een precisie-tandboor, grote tangen en wattenstaafjes.
4. Bereiding van tumorcelsuspensie
   OPMERKING: Alle procedures voor de voorbereiding van de tumorcel-suspensie moeten worden uitgevoerd in een gecertificeerde biologische veiligheidskast (klasse II kap) met passende persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM), waaronder labjas, handschoenen en oogbescherming, om sterieliteit te waarborgen en personeel te beschermen tegen mogelijke blootstelling aan biohazards.
   1. Trypsiniser cellen met 1 ml trypsine 1x EDTA.
      OPMERKING: Het wordt aanbevolen om tumorcellen te gebruiken in de exponentiële groeifase.
   2. Bepaal de celtelling nauwkeurig met behulp van een geschikte telmethode (bijv. hemocytometer of geautomatiseerde celteller).
   3. Bereid een celsuspensatie voor met 1 x 10^{3 cellen} in 3 μL ECM-medium per dier. Gebruik een 2:1-mengsel van ECM en een standaard kweekmedium met 10% FCS en andere supplementen indien nodig. Schaal het suspensievolume en celaantal op volgens het aantal dieren (bijvoorbeeld, voor 10 muizen, bereid 10 × 10³ cellen voor in 30 μL ECM-medium).
      OPMERKING: Het aantal geïnjecteerde cellen moet zorgvuldig worden getitreerd voor elke cellijn.
   4. Houd de celsuspensie op ijs tot injectie, maximaal 2 uur.

2. Intraoperatieve procedures

1. Muizenanesthesie
   1. Weeg elke muis met een precisieweegschaal en bereken het benodigde volume verdoving op basis van het lichaamsgewicht.
   2. Dien het berekende volume anestheticum intraperitoneaal toe.
      OPMERKING: Gebruik een anesthesieregime dat de hele procedure dekt (ongeveer 2 uur). Bijvoorbeeld: Ketamine 10% (ketaminehydrochloride, 100 mg/mL; 100 mg/kg lichaamsgewicht) gecombineerd met Domitor (medetomidinehydrochloride, 1 mg/mL; 0,25 mg/kg lichaamsgewicht), of een gelijkwaardig protocol.
   3. Zodra de verdoving voldoende diepte is bevestigd, plaats je de muis op een voorverwarmde warmtemat (gehouden op 37-38 °C) ter ondersteuning van de thermoregulatie en breng je oogzalf aan om het hoornvlies te beschermen tegen uitdroging.
      OPMERKING: Controleer voldoende verdovingsdiepte door voorzichtig in de achterpoot te knijpen met een tang. Ga alleen door met de operatie als er geen ontwenningsreflex wordt waargenomen.
2. Hoofdhuidvoorbereiding en incisie
   1. Dien preoperatief lidocaïne toe om lokale verdoving te geven op de incisieplaats. Gebruik een 1% lidocaïneoplossing (5 mg/mL) en injecteer ongeveer 0,05-0,1 mL subcutaan langs de geplande incisielijn. Laat de verdoving minstens 2-3 minuten werken voordat je doorgaat met de incisie op de hoofdhuid.
   2. Desinfecteer de hoofdhuid grondig met een jodiumoplossing.
   3. Span de huid strak en maak een middenlijninsnijding van ongeveer 3-4 mm langs de schedel met een steriel scalpel.
   4. Met hetzelfde scalpel schraap je voorzichtig het periost weg om het schedeloppervlak bloot te leggen.
3. Stereotactische frame-opstelling, coördinatenidentificatie en craniotomie
   1. Zet de kop van de muis vast in het stereotactische frame met oorbanden.
   2. Met behulp van de stereotactische arm lokaliseer je Bregma (het snijpunt van de coronale en sagittale schedelhechtingen) en beweeg je de stereotactische arm 2 mm vooraan en 1 mm lateraal (rechts) naar de injectieplaats in de frontale cortex zoals aangegeven in Figuur 1B en markeer je deze met een chirurgische marker.
      OPMERKING: Als er een bloedvat aanwezig is op de beoogde injectieplaats, kan de locatie tot 0,5 mm worden aangepast om bloeding te voorkomen.
   3. Boor voorzichtig door de schedel met een precisie-tandboor, waarbij je voorzichtig bent dat je de dura mater niet doorboort.
   4. Bevestig de opening door voorzichtig met een steriele tang te voelen of het doorbreek doorgaat.
4. Tumorcelinjectie
   OPMERKING: Werk snel tijdens deze stap, omdat ECM bij kamertemperatuur begint te stollen, wat de nauwkeurigheid en consistentie van de injectie kan verstoren.
   1. Suspendeer de tumorcelsuspensie grondig opnieuw door op en neer te pipetteren om een gelijkmatige verdeling te garanderen.
      OPMERKING: Vermijd vortexen om de vorming van luchtbellen te voorkomen.
   2. Laad 3 μL van de celophanging in een 10 μL Hamilton-spuit en plaats deze in het stereotactische frame met de juiste houder.
   3. Plaats de spuitnaald voorzichtig boven het maalgat.
      OPMERKING: Zorg dat de afschuining van de naald naar links wijst om de reproduceerbaarheid tijdens de injectie te verbeteren.
   4. Steek de naald verticaal in het hersenweefsel tot een diepte van 3,5 mm. Zodra deze diepte is bereikt, trek je de naald langzaam 0,5 mm terug om reflux van de celsuspensie tijdens en na injectie te voorkomen.
   5. Injecteer de 3 μL tumorcelsuspensie langzaam gedurende een periode van 1 minuut. Nadat het hele volume is toegediend, houd je de naald nog eens 2 minuten op zijn plaats zodat de cellen en ECM kunnen bezinken en het risico op reflux wordt geminimaliseerd.
   6. Trek voorzichtig de spuit terug en haal de muis uit het stereotactische frame.
5. Hechting en herstel van narcose
   1. Spoel de schedel voorzichtig af met een steriele 0,9% NaCl-oplossing.
   2. Droog en dicht het maalgat met botwas.
   3. Sluit de hoofdhuidincisie met 3 tot 4 hechtingen, waarbij elke hechting met drie strakke knopen dicht bij de wondrand is vastgebonden voor een goede genezing.
   4. Markeer de oren van de muis met een passend oorpunchpatroon dat overeenkomt met het aangewezen identificatienummer.
   5. Breng oogzalf opnieuw aan indien nodig om het hoornvlies tijdens het herstel te voorkomen. Direct daarna zet je de muis terug in een voorverwarmde verwarmingsmat (gehouden op 37-38 °C) om de thermoregulatie te ondersteunen en een soepel herstel van de anesthesie te bevorderen.
      OPMERKING: Het wordt aanbevolen om muizen individueel te huisvesten tijdens het herstel om verwondingen door interacties tussen wakkere en herstellende dieren te voorkomen.
   6. Maak de Hamilton-spuit grondig schoon en desinfecteer door de naald en het vat drie keer achter elkaar te spoelen: eerst met gedestilleerd water, daarna met 70% ethanol, en tenslotte met steriele 0,9% NaCl-oplossing.
   7. Bewaar na het schoonmaken de Hamilton-spuit op ijs tot het volgende gebruik.

3. Postoperatieve procedures

1. Postoperatieve analgesie
   1. Dien pijnstillers subcutaan toe terwijl de muis nog onder narcose is om directe pijnverlichting na de operatie te garanderen.
      OPMERKING: Gebruik pijnstillers die geschikt zijn voor dit type procedure. Bijvoorbeeld Carprofen met 10 mg/kg lichaamsgewicht.
   2. Zodra de muis volledig wakker is en weer normaal motorisch functioneert, plaats je hem in een schone kooi met vers beddengoed. Houd het dier kort in de gaten op normaal gedrag en ademhalingspatronen.
   3. Na volledig herstel geef je pijnstillende middelen via drinkwater (bijv. metamizol bij 200 mg/kg lichaamsgewicht) gedurende minstens 24 uur na de operatie.
      OPMERKING: Om de waterinname te stimuleren, zoet je het drinkwater met 0,5% sucrose. Wikkel drinkflessen in aluminiumfolie om de oplossing tegen licht te beschermen en vervang ze dagelijks. Label elke fles om de inname van pijnstillers bij te houden. Als pijnstillers niet via water worden ingenomen of als er pijn wordt waargenomen, dien dan elke 12 uur Carprofen (10 mg/kg lichaamsgewicht) subcutaan toe tot volledig herstel.
2. Muismonitoring
   1. Houd alle muizen elke 24 uur nauwlettend in de gaten gedurende de eerste 48 uur na de operatie, waarbij je motorische functies en gedrag evalueert. Vanaf dag 3 houd je muizen minstens elke 3 dagen in de gaten, inclusief het meten van het lichaamsgewicht.
   2. Als tekenen van stress of abnormaal gedrag worden waargenomen (bijvoorbeeld verminderde motorische activiteit, ongewoon gedrag), voer dan de Hanging Wire Test uit, zoals eerder beschreven. Als de muis de test doorstaat, blijf dan monitoren en herhaal de test om de dag.
   3. Euthanaseer muizen onmiddellijk (zie sectie 3.4) zodra ze een van de vooraf gedefinieerde humane eindpunten bereiken: gewichtsverlies > 20% ten opzichte van het initiële lichaamsgewicht (dag 0), niet slagen voor de Hanging Wire Test, of aanhoudende matige stress tot 48 uur.
3. Therapeutische behandeling (optioneel)
   1. Na volledig postoperatief herstel kan een therapeutisch regime worden gestart, afhankelijk van het experimentele ontwerp. Indien het geval is, definieer dan het tijdstip van de behandeling duidelijk in het studieprotocol en pas het monitoringsplan aan om de verwachte effecten en mogelijke bijwerkingen van de therapeutische interventie weer te geven.
      OPMERKING: De behandeling mag pas beginnen als de dieren normaal gedrag vertonen, een stabiel gewicht hebben en geen tekenen van postoperatieve stress tonen.
4. Euthanasie en weefselverzameling
   OPMERKING: Muizen moeten onmiddellijk worden geëuthanaseerd zodra ze aan vooraf bepaalde humane eindpunten voldoen of op aangewezen experimentele tijdstippen, zoals vereist door de specifieke onderzoeksdoelstellingen.
   1. Doof de muis met een geschikte methode (zie stap 2.1.2).
   2. Open de thoracale holte en voer transcardiale perfusie uit met 10-20 ml ijskoude steriele 0,9% NaCl, gevolgd door 10-20 mL ijskoude 4% paraformaldehyde (PFA).
      OPMERKING: Als vers weefsel nodig is voor latere toepassingen (bijvoorbeeld RNA-isolatie of FACS), laat dan de PFA-perfusiestap weg.
   3. Verzamel de hersenen en andere organen van interesse.
      OPMERKING: De organen kunnen worden ingevroren in vloeibare stikstof, gefixeerd in formaline voor FFPE-verwerking, of direct worden gebruikt voor downstream analyses.
5. Gestructureerde postmortemanalyse
   OPMERKING: Om metastatische groei te bevestigen en bijbehorende histopathologische kenmerken te karakteriseren, dient een postmortemanalyse van het hersenweefsel te worden uitgevoerd met zowel native (vers bevroren) als gefixeerde (FFPE) monsters.
   1. Weefseldissectie
      1. Dissectieer de hersenen op het niveau van de injectieplaats, zoals aangegeven in het schema in Figuur 1C.
      2. Bewaar het voorste deel voor vers bevroren (FF) verwerking. Verdeel dit deel in geïnjecteerde (i.) en niet-geïnjecteerde (n.i.) hemisferen.
      3. Bewaar het centrale gedeelte voor formalinefixatie en paraffine-inbedding (FFPE).
      4. Verwijder het achterste deel, inclusief het cerebellum en de hersenstam.
   2. Monsterverwerking
      1. Vries het voorste deel in vloeibare stikstof en bewaar FF-monsters bij -80 °C tot verder gebruik.
      2. Bevestig het centrale deel in 5-7 mL 4% PFA bij kamertemperatuur gedurende 48 uur voordat je FFPE verwerkt.
         OPMERKING: PFA-fixatie moet worden uitgevoerd met een chemische dampkap terwijl het juiste PBM wordt gedragen om blootstelling aan giftige dampen te voorkomen.
   3. Kwantificering van metastatische belasting (FF-monsters)
      1. Isoleer het totale RNA met behulp van een geschikte extractiekit of protocol dat geoptimaliseerd is voor hersenweefsel.
         OPMERKING: RNA-isolatie moet worden uitgevoerd in een biologische veiligheidskast met behulp van geschikte PBM om besmetting en blootstelling aan gevaarlijke reagentia te voorkomen.
      2. Voer kwantitatieve PCR (qPCR) uit met een tumorcel-specifieke marker, zoals Ck8.
         OPMERKING: Aanvullende doelen (bijv. immuun- of stromale celmarkers) kunnen worden beoordeeld door geschikte genmarkers te selecteren. RNA-sequencing (RNA-seq) kan worden gebruikt als alternatief voor transcriptoom-brede analyse.
      3. Bereken de relatieve tumorlast door het gen van belang (GOI, bijvoorbeeld Ck8) te normaliseren met een huishoudelijk gen (HK).
   4. Histologische analyse (FFPE-monsters)
      1. Inbed formaline-gefixeerd weefsel in paraffine.
      2. Snijdt monsters in plakken van 3 μm dik met behulp van een microtoom.
         OPMERKING: Gebruik van microtoom moet worden uitgevoerd door getraind personeel met geschikt PBM, waarbij de mesbeschermer wordt gebruikt wanneer niet wordt gesneden en de messen in scherpe containers wordt weggegooid om de veiligheid te waarborgen.
      3. Voer standaard hematoxyline- en eosinekleuring (H&E) kleuring en immunohistochemie (IHC) uit met relevante antilichamen, zoals Ck8 (tumorcellen), Cd3 (T-cellen), Iba1 (microglia/macrofagen) en Gfap (astrocyten).
         OPMERKING: H&E- en IHC-procedures moeten worden uitgevoerd in een goed geventileerde ruimte of dampkap om veiligheid te waarborgen en blootstelling aan chemicaliën te voorkomen.
      4. Scan alle gekleurde dia's digitaal met een hoge-resolutie dia-scanner om een digitale weefselbibliotheek op te bouwen.
      5. Beoordeel het histologische groeipatroon (HGP) van de hersenmetastase volgens het gepubliceerde protocol^10,12.

Resultaten

Het stereotactische injectieprotocol (Figuur 1) kan worden toegepast op zowel syngene als xenograft-muismodellen, inclusief wildtype- of genetisch gemodificeerde stammen, afhankelijk van de wetenschappelijke vraag. Elke geschikte cellijn die in de hersenen kan groeien, kan worden gebruikt. Voorbeelden van muistumorcellijnen die de hersenen kunnen koloniseren zijn, maar niet beperkt tot, de borsttumorcellen 4T1 en 410.4, de colorectale kankercellen CMT93 en de melanoomcellijn B16-F10. De tijd die tumorcellen nodig hebben om metastasen in de hersenen te vestigen varieert per cellijn, variërend van enkele dagen tot enkele weken, en de penetrantie varieert eveneens. We raden aan een model te gebruiken met ~70% penetrantie, wat betekent dat minstens 7 van de 10 dieren metastasen ontwikkelen binnen een maximale experimentele periode van 20 weken (Figuur 2A). Elke cellijn moet individueel worden geoptimaliseerd en het aantal geïnjecteerde cellen zorgvuldig worden getitreerd.

Als voorbeeld vergeleken we twee nauw verwante syngene modellen voor hersenmetastasen van borstkanker: 410.4 en de afgeleide 4T1. Ondanks hun genetische gelijkenis¹⁷ vertonen deze cellijnen duidelijk verschillend metastatisch gedrag en groeipatronen in de hersenen¹⁶. Hoewel beide een vergelijkbare metastatische last bereiken (Figuur 2B), vertoont elk een uniek tijdsverloop (Figuur 2C) en duidelijk onderscheidende HGP's (Figuur 2D). Om de kolonisatie-efficiëntie tussen verschillende cellijnen systematisch te beoordelen en te vergelijken, ontwikkelden we de Colonization Index, een wiskundige formule die het aantal geïnjecteerde cellen, mediane overlevingstijd en kolonisatiesucces integreert (Figuur 2E-G).

Bij het voor het eerst uitvoeren van de stereotactische injectie of het testen van een nieuwe cellijn is het essentieel om groeipatronen zorgvuldig te evalueren en uitkomsten te vergelijken tussen dieren, operaties en onderzoekers om reproduceerbaarheid te waarborgen. Een cruciale stap is de injectie van tumorcellen, waarbij lekkage van de celsuspensie kan optreden. Dit kan leiden tot misleidende tumorlokalisatie, met name het iatrogene zaaien van tumorcellen op de schedel en/of de meningen, wat mogelijk kan leiden tot vals-positieve meningeale metastase die geen echte intracerebrale kolonisatie is met daaropvolgende secundaire meningeale verspreiding. Deze scenario's zijn geïllustreerd in Figuur 3.

Figuur 1: Pre-, intra- en postoperatieve procedures voor de stereotactische intracorticale tumorcelinjectie bij muizen. Schematisch overzicht van de procedure. (A) De preoperatieve fase omvat de acclimatisatie van het dier, gezondheidsbeoordeling, voorbereiding van de operatieplaats en de suspensie van de tumorcel. (B) De intraoperatieve fase omvat de inductie van de anesthesie, een incisie op de hoofdhuid, plaatsing in het stereotactische kader, precieze craniotomie, injectie van tumorcellen in de hersenschors met behulp van stereotactische coördinaten, wondsluiting en herstel van de narcothesie. (C) De postoperatieve fase omvat toediening van pijnstillers, routinematige monitoring om het herstel na de operatie te beoordelen, de algemene gezondheidstoestand en de ontwikkeling van neurologische symptomen (Hanging Wire Test), gevolgd door euthanasie en orgaanoogst. Een gestructureerde postmortemanalyse is opgenomen om de metastatische belasting in vers ingevroren (FF) weefsel via qPCR te beoordelen en om histologische groeipatronen in FFPE-monsters uit een digitale diabibliotheek te evalueren. Belangrijke procedurele fasen worden opeenvolgend geïllustreerd om timing en chirurgische workflow te benadrukken. Afbeelding gemaakt in BioRender. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Representatieve resultaten van metastatische groei in muismodellen van hersenmetastase na stereotactische injectie van 4T1- en 410,4-borstkankercellen. (A) Macroscopische beelden die de afwezigheid van tumorgroei tonen bij ECM-geïnjecteerde controlemuisjes (Controle) en de aanwezigheid van zichtbare metastatische laesies bij muizen die tumorcel-ECM-suspenties kregen (Met). (B) Kwantificering van metastatische last bij ECM-geïnjecteerde controlemuizen (CTRL) en muizen met hersenmetastasen afkomstig van 4T1- en 410.4-borstkankercellen. De metastatische belasting werd beoordeeld met qPCR waarbij Ck8 als tumormarker werd gebruikt, met Gapdh en Pgk1 als huishoudende genen (HK). Gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde waarden met individuele datapunten. Statistische analyse werd uitgevoerd met eenrichtings-ANOVA, gevolgd door Dunnetts meervoudige vergelijkingstest (n = 5; ****P < 0,0001). (C) Kaplan-Meier overlevingscurves die de algehele overleving (OS) vergelijken van muizen die stereotactisch alleen met ECM zijn geïnjecteerd (controle, zwart), 4T1 (oranje) of 410,4 (blauwe) tumorcellen. Statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van de Log-rank (Mantel-Cox) test (4T1 versus 410,4; n = 10; ***P < 0,001). (D) Representatieve histologische beelden van hersenmetastasen afkomstig van 4T1- en 410.4-cellen, die verschillen in groeipatronen illustreren, inclusief respectievelijk cohort- en strengvormige infiltratieve epitheliale HGP's. Weefseldoorsneden werden gekleurd met een anti-cytokeratine 8-antilichaam. (E) Vergelijkende analyse van kolonisatie-efficiëntie met behulp van de Colonization Index (CI). CI-waarden van 4T1 (oranje) en 410,4 (blauw) worden weergegeven. (F) Formule die wordt gebruikt om de CI te berekenen. (G) Tabel die de parameters samenvat die in het CI voor beide modellen zijn opgenomen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Representatieve voorbeelden van succesvolle en suboptimale uitkomsten van stereotactische injectie. (A,C) Macroscopische beelden die metastatische groei op verschillende locaties tonen: (A) tumorgroei in de schedel en meningen als gevolg van een verkeerde injectie en lekkage van tumorcellen, en (C) succesvolle parenchymale metastase na de juiste intracorticale injectie. (B,D) Overeenkomstige histologische secties bevestigen (B) intrameningeale tumorgroei met daaropvolgende infiltratie in het hersenparenchym, en (D) secundaire verspreiding naar de meningen vanuit een gevestigde parenchymale metastase. Weefseldoorsneden werden gekleurd met een anti-cytokeratine 8-antilichaam. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

De stereotactische intracraniële injectietechniek maakt de precieze en gelokaliseerde afgifte van tumorcellen of cellulaire mengsels direct in de hersenschors van experimentele muizen mogelijk. In combinatie met een gestructureerde postmortale analyse is dit model bijzonder waardevol voor het bestuderen van late stadia van hersenmetastase, waaronder metastatische uitgroei, secundaire intra-orgaanverspreiding en de mogelijke doodsoorzaak. Daarentegen zijn systemische injectiemethoden (bijvoorbeeld staartven- of intracardiale injectie) beter geschikt om de vroege stappen van de metastatische cascade te onderzoeken, zoals het overleven van tumorcellen in de circulatie, extravasatie en zaaien in verre organen. Deze benaderingen zijn echter niet hersenspecifiek en leiden doorgaans tot lage en inconsistente percentages hersenkolonisatie: 18,19,20.

Systemische modellen tonen ook een hoge biologische variabiliteit, vooral wat betreft de hersengebieden die worden aangetast, waardoor therapeutische studies uitdagend zijn en grote diercohorten vereisen. Daarnaast ontwikkelen dieren vaak extracraniële metastasen, wat kan leiden tot vroegtijdige stopzetting van de proef¹⁹. Deze beperkingen verminderen hun bruikbaarheid aanzienlijk voor het bestuderen van metastases in een laat stadium van de hersenen. Bovendien zijn secundaire verspreiding en herkolonisatie bijzonder moeilijk te onderzoeken met systemische modellen, omdat het onderscheid maken tussen primaire verspreiding (afkomstig van de primaire tumor) en secundaire verspreiding (voortkomend uit een reeds gevestigde metastase) vrijwel onmogelijk is. Bovendien is een gestructureerde postmortemanalyse, vooral voor het beoordelen van macro-metastatische groei en de HGP's van hersenmetastasen, beperkt in deze situaties.

In vergelijking met ex vivo systemen, zoals patiënt-afgeleide organoïden (PDO's) en organotypische hersenslice (co)-culturen 21,22,23,24, biedt de stereotactische injectie verschillende cruciale voordelen. Hoewel ex vivo modellen aspecten van de native hersenarchitectuur behouden en mogelijk residente en infiltrerende immuuncellen van patiënten of donoren kunnen bevatten, missen ze vascularisatie, systemische signalering en de volledige complexiteit van de in vivo tumormicro-omgeving, met name de verdere infiltratie van T-cellen of andere immuuncellen afgeleid van bloed- of beenmerg²³. Deze beperkingen beperken de toepassing tot kortetermijnstudies en vereenvoudigde omgevingen, zoals medicijntesten of basale metastatische cel-herseninteractietests. Daarentegen ondersteunt de stereotactische benadering langetermijnstudies naar tumorprogressie, immuunrespons en therapeutische interventie binnen een levend, intact organisme. Belangrijk is dat de evaluatie van neurologische symptomen als een humane eindpunt een klinisch relevante maatstaf van het begin van macro-metastatische symptomen mogelijk maakt. Dit maakt het model nog meer een weerspiegeling van het menselijke ziekteverloop, wat vooral waardevol is in translationeel onderzoek. Hoewel het gebruik van dieren betreft, wat ethische overwegingen oproept die voldoen aan de 3R's (Replacement, Reduction, and Refinement), kan dit model momenteel niet volledig worden vervangen door ex vivo alternatieven. Het vermogen om de volledige fysiologische context van hersenmetastase te repliceren maakt het onmisbaar voor het vergroten van ons begrip van metastatische dynamiek en de CNS-specifieke pathofysiologie.

Ondanks de vele voordelen kent het stereotactische injectiemodel enkele beperkingen waar rekening mee gehouden moet worden. Een belangrijke zorg is het mogelijke lekkage van de tumorcelsuspensie tijdens injectie, wat kan leiden tot misleidende groeipatronen. In het bijzonder kan onbedoelde hechting van tumorcellen aan de meningen leiden tot iatrogene meningeale metastase⁸, wat niet nauwkeurig het natuurlijke verloop van metastatische verspreiding in deze specifieke cellijn weerspiegelt. Om de betrouwbaarheid van de data te waarborgen, moeten de groeipatronen van een bepaalde tumorcellijn consequent worden vergeleken tussen dieren, chirurgische ingrepen en onderzoekers. Om tumorcellekkage te minimaliseren, stellen we voor om de extracellulaire matrix (ECM) te gebruiken, omdat de gelachtige consistentie en het vermogen om bij lichaamstemperatuur te stollen het een nuttig hulpmiddel maken. ECM brengt echter ook uitdagingen met zich mee, waaronder de noodzaak van snelle behandeling tijdens de injectie om voortijdige stolling te voorkomen. Een andere overweging in ons protocol is dat tumorcellen worden geïnjecteerd in een mengsel van ECM en serumhoudende media. Hoewel FBS de tumorcel-enplantatie versterkt door voedingsstoffen te leveren die normaal gesproken beperkt zijn in de hersenen, kan het ook ontstekingen bevorderen. Als dit een zorg is, kunnen serumvrije media of gebalanceerde zoutoplossingen (bijv. HBSS of PBS) als alternatief worden gebruikt.

Daarnaast is stereotactische injectie technisch veeleisender dan andere methoden, zoals intraveneuze (intraveneuze (IV) injectie. Het vereist specifieke training om reproduceerbaarheid te garanderen, en de procedure kost aanzienlijk meer tijd, doorgaans 15-30 minuten per dier in vergelijking met 3-5 minuten voor infuusinjecties. Deze langere duur beperkt het aantal dieren dat per sessie verwerkt kan worden, wat een uitdaging kan vormen voor therapeutische studies die grote cohorten vereisen om statistische kracht te bereiken. Deze beperking kan echter effectief worden aangepakt door injecties over meerdere dagen te verdelen, wat niet alleen de experimentele flexibiliteit en haalbaarheid verhoogt, maar ook waardevolle biologische variabiliteit introduceert, wat realistischere interindividuele verschillen weerspiegelt in zowel tumorcelgedrag als gastheerrespons.

Tot slot is het belangrijk op te merken dat dit model eerdere stappen van de metastatische cascade omzeilt, zoals eerder besproken. Het juiste experimentele model moet worden geselecteerd op basis van de onderzoeksvraag en de specifieke fase van metastase die wordt bestudeerd. Voor het onderzoeken van late-stadium hersenkolonisatie blijft de stereotactische intracorticale injectie de gouden standaard.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Animal ear punch pliers	LabArt
Bepanthen® eye and nose ointment	Bayer Vital GmbH	1578675
Bone wax	B.Braun	210434
Cotton swabs	Hartmann	143213
Cultrex Basement Membrane (ECM) Extract	B&D	3432-005-01
Disinfectant	B.Braun	107190
Drill Bit	Bilaney Consultants GmbH	D #76
Eye scissors	Hermle	501
Hamilton syringe (10µL volume)	VWR	5491135
Heating pad	Intergastro	258122
Mouse Nase/Tooth Bar Assay (900/1430)	Bilaney Consultants GmbH	DKI 926-B
Noyes eye scissors	Hermle	545
Paur 60° tip non noptore Mouse Ear Bars	Bilaney Consultants GmbH	DKI 922
Scalpel	PFM Medical AG	17027
Semkin standard forceps	Hermle	710
Seralon polyamide suture (DR-009, USP 7/0, EP 0.5)	Serag-Wiessner GmbH	V0053491
Stereotaxic Drill -Jacobs Chuck-18000rpm	Bilaney Consultants GmbH	DKI 1471-200-CE-A
Stereotaxic without Rat adaptor	Bilaney Consultants GmbH	DKI 963 % 920
Syringe Hdder for 5&10µl Hamilton	Bilaney Consultants GmbH	DKI 1772-F1
TC Needleholders Mayo-Heear 160mm	Hermle	6425