Methodenartikel

Morfologische karakterisering van voorste regeneratie bij Diopatra claparedii

DOI:

10.3791/69421

⸱

13 maart 2026

 ,  ,  , 
1Faculty of Science and Marine Environment, Universiti Malaysia Terengganu, 2STEM Foundation Centre, Universiti Malaysia Terengganu

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol biedt een gericht kader om het anterieure regeneratieproces bij Diopatra claparedii te karakteriseren, en dient als een cruciale stap richting toekomstige regeneratieve studies.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Polychaeten beschikken over het vermogen om voorste en achterste segmenten te regenereren na een blessure of zelfamputatie, wat een hanteerbaar systeem biedt om wondherstel en weefselpatroon te bestuderen. Ter ondersteuning van vergelijkende en mechanistische studies in annelidregeneratie presenteert deze studie een protocol voor het induceren en karakteriseren van anterieure regeneratie bij Diopatra claparedii (D. claparedii). Het protocol beschrijft stappen voor het hanteren van het monster, immobilisatie en precieze amputatie, gevolgd door geplande observatiemomenten om de morfologische progressie tijdens de regeneratie te documenteren. D. claparedii werden voorzichtig uit hun buisjes verwijderd met een stok met stomp uiteinde en geïmmobiliseerd in 4% magnesiumchloride om ontspanning op te wekken. Anterieure amputatie werd uitgevoerd bij de vierdechaetiger onder een stereomicroscoop, en het regeneratieproces werd gemonitord op dag 1, 6, 15, 30 en 60 na amputatie. De procedure maakt consistente inductie van voorste regeneratie mogelijk en legt belangrijke morfologische kenmerken vast bij vroege wondsluiting, blastemavorming en segmentherstel. Door een reproduceerbare workflow en morfologische referentie voor D. claparedii te bieden, biedt dit protocol een praktische basis die toekomstige onderzoeken ondersteunt die morfologische waarnemingen relateren aan onderliggende cellulaire of moleculaire processen in annelidregeneratie.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Polychaeten vormen bijna 65% van alle beschreven oranje soorten, waardoor ze een van de meest diverse groepen mariene ongewerveldenzijn. Een recent bijgewerkte checklist van polychaete-soorten (Annelida) registreerde in totaal 57 soorten die behoren tot 47 geslachten verspreid over 30 families uit de Maleisische kustwateren, waarbij de meerderheid van de soorten (53 soorten) afkomstig is van het schiereilandMaleisië 2. Onder deze is Diopatra claparedii (D. claparedii) Grube, 1878, lokaal bekend als ruat sarung, een van de commercieel geëxploiteerde polychaetensoorten in Maleisië. Hij komt voornamelijk voor langs moddervlakten aan de westkust van het Maleisische schiereiland, waaronder locaties zoals Jeram Beach, Selangor 2,3.

D. claparedii behoort tot de familie Onuphidae en is een zittende, buisbewonende polychaet die bekendstaat om zijn vermogen om zowel de voorste als de achterste lichaamssegmenten te regenereren. Dit omvat componenten van het centrale en perifere zenuwstelsel4. Het goed gedefinieerde segmentale lichaamsplan en uitgesproken regeneratieve capaciteit maken D. claparedii tot een veelbelovend en hanteerbaar ongewervelden model voor het onderzoeken van weefselregeneratie in relatief complexe biologische systemen. De keuze van D. claparedii als modelorganisme voor regeneratiestudies is te danken aan zijn ecologische relevantie, regionale betekenis en de huidige hiaten in wetenschappelijke kennis over zijn regeneratieve capaciteit. Deze soort wordt commercieel geoogst en veel gebruikt als visaas in Maleisië, wat aangeeft dat hij goed bekend is bij lokale gemeenschappen en niet als zeldzaamwordt beschouwd 2,3. Het onderzoeken van regeneratie in D. claparedii heeft dus praktische en economische waarde, omdat de bevindingen kunnen helpen wetenschappelijke kennis te verspreiden naar lokale belanghebbenden en mogelijk strategieën kunnen informeren ter ondersteuning van populatieduurzaamheid door een beter begrip van regeneratieve mechanismen.

Daarnaast vertoont D. claparedii een specifieke geografische verspreiding in Zuidoost-Azië, met een bijzonder hoge vertegenwoordiging in Maleisische kustecosystemen 2,3. De meeste regeneratiestudies op polychaeten en andere anneliden hebben zich echter gericht op soorten uit Amerika of andere niet-Aziatische regio's 5,6. Zo heeft de goed bestudeerde Diopatra neapolitana (D. neapolitana), vaak gebruikt als regeneratieve biomarkersoort, een brede verspreiding over de Rode Zee, Indische Oceaan, Middellandse Zee en Atlantische Oceaan7. Daarom blijft regeneratieonderzoek naar anneliden die inheems zijn in Zuidoost-Azië, waaronder D. claparedii, beperkt.

Eerdere studies met polychaeten hebben verschillende en reproduceerbare stadia van regeneratie aangetoond, waaronder wondsluiting, blastemavorming en segmentale weefseldifferentiatie 7,8. Hoewel moleculaire studies op D. claparedii eerder zijn gerapporteerd, zijn onderzoeken die zich specifiek richten op regeneratie schaars. Bovendien heeft bestaand werk zich vooral gericht op moleculaire karakterisering in plaats van experimentele regeneratieprotocollen. Bovendien vertoont D. claparedii zowel dedifferentiatie- als redifferentiatieprocessen, wat mechanismen weerspiegelt die meer vergelijkbaar zijn met die in hogere organismen9. Deze complexiteit in regeneratieve respons benadrukt de groeiende erkenning van polychaeten als waardevolle tussenliggende modellen, die effectief de kloof tussen eenvoudige ongewervelden en complexe gewervelden in regeneratiestudies overbruggen.

De huidige studie vult deze kloof aan door een regeneratieprotocol voor D. claparedii op te stellen en te optimaliseren, waarmee een robuust kader wordt geboden voor toekomstige functionele, ontwikkelings- en moleculaire onderzoeken naar regeneratie bij deze regionaal belangrijke polychaetesoort. Specifiek biedt dit protocol een betrouwbare benadering om de opeenvolgende stadia en onderliggende mechanismen van regeneratie bij polychaeten te onderzoeken. Dit maakt systematische observatie en karakterisering van belangrijke regeneratieve processen mogelijk, waaronder wondgenezing, blastemavorming en segmentatie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ethische verklaring

Deze studie is goedgekeurd door de Universiti Malaysia Terengganu Research Ethics Committee onder goedkeuringsnummer UMT/JKEPH/2026/173

1. Verzameling en habituatie van D. claparedii

  1. Vind D. claparedii in het moddervlakte van de estuariene getijdenzone (middelmatig getijdenniveau met middelfijn zand), dat dient als natuurlijke habitat.
  2. Graaf het bovenste deel van de polychaete-buizen uit door voorzichtig met een schop in het sediment te graven om schade aan de buizen te voorkomen.
  3. Bevestig de aanwezigheid van de worm in elke buis door de buis voorzichtig te knellen en te controleren op beweging of weerstand.
  4. Selecteer alleen exemplaren met een minimale ontspannen lichaamslengte van 5 cm.
    OPMERKING: Kies polychaeten op basis van lichaamslengte om schade aan de hantering te verminderen en fragmentatie tijdens het wegen te voorkomen.
  5. Verzamel sediment met een schop van dezelfde locaties om de milieuconsistentie in het laboratorium te behouden.
  6. Vervoer de verzamelde monsters naar het laboratorium in draagbare koelcontainers op kamertemperatuur. Bedek de slangen met een met zeewater bevochtigde handdoek om de vochtigheid te behouden en stress tijdens het transport te verminderen.
  7. In het laboratorium scheid je handmatig afval van het sediment en laat je het materiaal aan de lucht drogen onder direct zonlicht totdat het volledig droog is en vrij van restvocht.
  8. Verwijder of maak andere organismen (bijv. kleine krabben, schelpen of vreemde stoffen) schoon om ervoor te zorgen dat het sediment vrij is van verontreinigingen.
  9. Spoel de polychaete-buizen af met kunstmatig zeewater (ASW) om vuil en levende organismen die aan het oppervlak vastzitten te verwijderen.
    OPMERKING: Om ASW te maken, meng je 1/4 kop Instant Ocean Sea Salt in 1,9 L gedechloreerd gezuiverd water.
  10. Bereid aquaria voor met behulp van een plastic aquarium, met sediment van de oorspronkelijke locatie en vul met kunstmatige ASW, aangepast op 23-25 ppt zoutgehalte (Figuur 1). Houd de watertemperatuur gedurende de hele habituatieperiode consequent op 28 °C.
    OPMERKING: Het gebruikte ASW-volume was 58 L, bepaald op basis van de afmetingen van het aquarium: 61,5 cm (L) x 32 cm (W) x 33,5 cm (H).
  11. Overbreng D. claparedii in cilindrische plastic containers (7 cm in diameter, 15 cm hoog) die half gevuld zijn met sediment, met een dichtheid van één polychaet per container.
  12. Dompel de containers volledig onder in een aquarium met luchtige ASW. Laat de polychaeten zich graven en zich opnieuw vestigen.
  13. Voer de polychaeten 2-3 keer per week met zinkende visvoer, om gedurende de gewenningsperiode continu te voeden. Verwijder regelmatig overtollig voedsel om ophoping, schimmelgroei en besmetting te voorkomen.
  14. Habituatie werd beoordeeld aan de hand van gedragsobservaties, waarbij actieve verkenning (lichaamsbeweging) en voedselzoekgedrag (reactie op prikkels) een terugkeer naar normale fysiologische conditie aanduiden.
    OPMERKING: Geef een gewoonteperiode van twee weken voordat experimentele procedures worden gestart, zodat de wormen kunnen herstellen van stress of accidentele amputatie tijdens de verzameling.

2. Regeneratie

  1. Selecteer chaetiger 4 als standaard amputatieplaats om consistente en succesvolle regeneratieresultatente garanderen 7,9.
    OPMERKING: De keuze van de amputatieplaats op de4e is gebaseerd op voorlopige bevindingen. Gebruik segment 10 alleen als dat nodig is, omdat het langzamer regenereert.
  2. Bereid een anesthesieoplossing voor met 4% (gewicht/volume) magnesiumchloride-hexahydraat (MgCl₂·6H₂O) in ASW (4 g MgCl₂·6H₂O in 1 L ASW).
  3. Duw de polychaet voorzichtig uit zijn buis met een stomp stokje dat in de voorste opening wordt gestoken.
    OPMERKING: Vermijd beschadiging van het lichaam tijdens het verwijderen.
  4. Dompel het polychaete vervolgens onder in de anesthesieoplossing totdat het volledig ontspannen en geïmmobiliseerd is (ongeveer 15 min).
  5. Amputeer bij chaetiger 4 met een gesteriliseerd scalpel onder een stereomicroscoop, zodat precisie en minimale weefselschade worden gegarandeerd (Figuur 1).
    OPMERKING: Draag altijd de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen en zorg goed voor het voorkomen van snijwonden bij het hanteren met een scalpel.
  6. Breng het achterste deel van de worm terug naar de oorspronkelijke buis met een tang, waarbij eerst het voorste uiteinde wordt ingebracht om het natuurlijke hergraven te vergemakkelijken.
  7. Na deze procedure monitort u de wormen dagelijks op gedragsveranderingen en fysieke conditie, waaronder tekenen van infectie, weefselbederf of sterfte.
    OPMERKING: Personen met abnormaal gedrag, zichtbare necrose of progressieve achteruitgang werden als onsuccesvol beschouwd in herstel en werden uitgesloten van verdere analyse.
  8. Houd voedsel in deze fase uit tot de regeneratie vordert, omdat het mondgebied ontbreekt door een voorste amputatie. Hervat het normale voedingsgedrag zodra de mond is ontwikkeld, ongeveer 60 dagen na amputatie (p.a).
    OPMERKING: Houd dezelfde omgevingsomstandigheden (zoutgehalte 23-25 ppt en de watertemperatuur consistent op 28 °C) gedurende het hele regeneratieproces.
  9. Maak beelden van succesvol geregenereerde polychaeten met een stereomicroscoop op bepaalde dagen (1, 6, 15, 30 en 60) per dag.
  10. Volledige regeneratiemonitoring na 60 p.a.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het regeneratieproces bij D. claparedii werd continu gemonitord tot volledige hoofdregeneratie. Het algehele regeneratiepatroon was vergelijkbaar met dat van D. neapolitana (Figuur 2). De wondsluiting op de amputatieplaats werd binnen 1 dag na de amputatie voltooid (p.a.). Op dag 6 p.a. werd een duidelijk gedefinieerde blastema waargenomen bij overlevende individuen, wat wijst op actieve weefselregeneratie. ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Anneliden, bestaande uit gesegmenteerde wormen die in zee, zoetwater en terrestrische omgevingen leven, beschikken over opmerkelijke regeneratieve vermogens op meerdere niveaus van biologische organisatie. Deze variëren van cellulaire reparatie en vernieuwing van kiemcellen tot structurele hergroei en, in sommige gevallen, volledige lichaamsregeneratie uit kleine lichaamsfragmenten 8,10. Het huidige protocol richt zich op de ante...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen concurrerende belangen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het onderzoekswerk werd ondersteund door de TAPE Talent and Publication Enhancement Research Grant (55269) toegekend aan SZA.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Kunstmatige ZeewaterInstant Ocean
Digitaal Draagbare Zoutgehalte HydrometerScionix
MgCl2·6H2OSigmaM2670
Scalpel
StereomicroscoopLeica Microsystem
TeraBits Compleet VisvoerTetra
Pincet

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Anderson, D. T. Embryology and Phylogeny in Annelids and Arthropods. International Series of Monographs in Pure and Applied Biology Zoology. 50, Elsevier. (2013).
  2. Razmi Shah, R. S. B., Ibrahim, Y. S., Villalobos-Guerrero, T. F., Sato, M. Updated Checklist of Polychaete Species (Annelida) Recorded from Malaysia, with Remarks on the Research History. Biodivers. Data J. 11, e110021(2023).
  3. Idris, I., Arshad, A. Checklist of Polychaetous Annelids in Malaysia with Redescription of Two Commercially Exploited Species. Asian J. Anim. Vet. Adv. 8, 409-436 (2013).
  4. Rouse, G., Pleijel, F. Polychaetes. , Oxford University Press. (2001).
  5. Lindsay, S. M., Jackson, J. L., Forest, D. L. Morphology of Anterior Regeneration in Two Spionid Polychaete Species: Implications for Feeding Efficiency. Invertebr. Biol. 127, 65-79 (2008).
  6. Whitford, T. A., Williams, J. D. Anterior Regeneration in the Polychaete Marenzelleria viridis (Annelida: Spionidae). Invertebr. Biol. 135, 357-369 (2016).
  7. Pires, A. Studying Annelida Body Regeneration under Environmental Stress in Diopatra neapolitana. Methods Mol. Biol. 2450, 195-206 (2022).
  8. Kozin, V. V., Filippova, N. A., Kostyuchenko, R. P. Regeneration of the Nervous and Muscular System after Caudal Amputation in the Polychaete Alitta virens (Annelida: Nereididae). Russ. J. Dev. Biol. 48 (3), 198-210 (2017).
  9. Nazri, M. U. I. A., Mahmud, M. H., Saidi, B., Mat Isa, M. N., Ehsak, Z., Ross, O., Idris, I., Ismail, W. I. W. Cellular and Molecular Profiles of Anterior Nervous System Regeneration in Diopatra claparedii Grube, 1878 (Annelida, Polychaeta). Heliyon. 7 (2), e06307(2021).
  10. Bely, A. E. Early Events in Annelid Regeneration: A Cellular Perspective. Integr. Comp. Biol. 54 (4), 688-699 (2014).
  11. Górska, B., Gromisz, S., Włodarska-Kowalczuk, M. Size Assessment in Polychaete Worms-Application of Morphometric Correlations for Common North Atlantic Taxa. Limnol. Oceanogr. Methods. 17, 254-265 (2019).
  12. Qu, F., Nunnally, C., Rowe, G. T. Polychaete Annelid Biomass Size Spectra: The Effects of Hypoxia Stress. J. Mar. Sci. 983521, (2015).
  13. Galasso, H. L., Richard, M., Lefebvre, S., Aliaume, C., Callier, M. D. Body Size and Temperature Effects on Standard Metabolic Rate for Determining Metabolic Scope for Activity of the Polychaete Hediste (Nereis) diversicolor. PeerJ. 6, e5675(2018).
  14. Kostyuchenko, R. P., Kozin, V. V. Comparative Aspects of Annelid Regeneration: Towards Understanding the Mechanisms of Regeneration. Genes. 12 (8), 1148(2021).
  15. Pugliese, C., Mazza, R., Andrews, P. L., Cerra, M. C., Fiorito, G., Gattuso, A. Effect of Different Formulations of Magnesium Chloride used as Anesthetic Agents on the Performance of the Isolated Heart of Octopus vulgaris. Front. Physiol. 26 (7), 610(2016).
  16. Vervoort, M., Gazave, E. Studying Annelida Regeneration using Platynereis dumerilii. Methods Mol. Biol. 2450, 207-226 (2022).
  17. Wibowo, E. S., Atang, A., Setiyono, E., Hana, H., Simanjuntak, S. B. I., Susilo, U., Sucharitakul, P., Apriyanti, Y., Pamungkas, J. Biological Aspects of Diopatra claparedii Grube, 1878 (Onuphidae, Polychaeta) Maintained at Different Salinity Levels. Ilmu Kelaut.: Indones. J. Mar. Sci. 30 (1), 1-6 (2025).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Regeneratie van polychaetenregeneratie van annelidenblasteemvormingherstel van segmentenstereomicroscopische observatiewondsluitingamputatieprotocol

Gerelateerde artikelen