Method Article

Een geoptimaliseerde sequentiële isolatie van crypten en mesenchymale stromale cellen uit varkens-darmweefsel

DOI:

10.3791/69429

⸱

December 19th, 2025

 , 
1Department of Animal and Avian Sciences, University of Maryland

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie biedt een stapsgewijs protocol voor de sequentiële isolatie van intestinale crypten en intestinale mesenchymale stromale cellen (iMSC's) uit porcine jejunale weefsels. De methode genereert 2D-enteroïde monolagen en iMSC's die geschikt zijn voor het ontwikkelen van reproduceerbare, fysiologisch relevante epitheel-stromale co-cultuurmodellen om cellulaire crosstalk tijdens intestinale homeostase en regeneratie te onderzoeken.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het intestinale epitheel werkt nauw samen met de onderliggende mesenchymale stromale cellen (iMSC's) om ontwikkeling, homeostase en regeneratie te reguleren. Gestandaardiseerde methoden om zowel epitheliale als stromale fracties sequentieel uit varkensweefsel sequentieel te isoleren zijn echter beperkt. Dit protocol beschrijft een geoptimaliseerd stapsgewijs proces om crypten en iMSC's te isoleren van hetzelfde jejunale segment van biggetjes. De methode gebruikt een op ethylenediamintetraazijnzuur/dithiothreitol (EDTA/DTT)-gebaseerde dissociatiebuffer om crypten vrij te geven, gevolgd door collagenase/dispase-vertering van de extracellulaire matrix om iMSC's te isoleren. Deze aanpak minimaliseert ruimtelijke variaties in de geïsoleerde cellen. De geïsoleerde crypts werden met succes gekweekt en vormden typische expanderende, tweedimensionale (2D) enteroïde monolagen op collageen-hydrogel-gecoate platen. De gekweekte iMSC's hechtten zich aan kweekkolven en drukten stromale markers uit zoals de bloedplaatjesafgeleide groeifactorreceptor alfa (PDGFRα) en cluster van differentiatie 81 (CD81), zoals bepaald door immunokleuring. Al met al levert dit geoptimaliseerde isolatieprotocol zowel epitheel- als stromale cellen uit hetzelfde varkenjejunale segment op, wat een reproduceerbare basis biedt voor toekomstig onderzoek waarbij intestinale organoïden en iMSC-co-kweeksystemen mechanismen worden verduidelijkt die epitheel-stromale interacties bij varkens regelen, een translationeel relevant model voor het repliceren van menselijke fysiologie en de vooruitgang boeken in dierwetenschappen.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het intestinale epitheel is een dynamisch weefsel dat continu zelfvernieuwing en differentiatie ondergaat om de homeostase van de intestinale gezondheid te behouden en regeneratie na slijmvliesbeschadigingente bevorderen 1,2. Intestinale epitheelcellen ontstaan uit darmstamcellen (ISC's) en interageren met diverse micro-omgevingsfactoren 3,4,5,6,7,8. De subepitheliale compartimenten, voornamelijk de lamina propria en muscularis mucosa, bestaan uit diverse celpopulaties uit verschillende lijnen9. Onder deze celpopulaties produceren intestinale mesenchymale stromale cellen (iMSC's), waaronder fibroblasten en myofibroblasten, trofische en groeifactoren die de ISC-stamvorm, proliferatie en differentiatie moduleren om de epitheliale homeostase en regeneratiete reguleren.

Om deze cellulaire interacties te bestuderen, hebben recente studies nieuwe benaderingen ontwikkeld om mogelijke werkingsmechanismen te ontrafelen die het overlappen van intestinale epitheelcellen en iMSC's aansturen. Co-kweeksystemen die organoïden combineren met stromale of immuuncellen hebben ons begrip van epitheel-subepitheliale cellulaire interacties tijdens ontwikkeling, regeneratie, geneesmiddelenscreening en ziektemodelleringvergroot. De meeste co-kweekstudies van organoïden hebben echter muisweefsels gebruikt, die vaak niet effectief de menselijke fysiologie en ziektefenotypes nabootsen, waardoor hun klinische translationele relevantie beperktis 18.

In de meeste muriene intestinale isolatieprotocollen worden epitheel- en stromale cellen verkregen uit afzonderlijke weefselsegmenten, wat monsters kan opleveren die iets andere kenmerken vertonen en mogelijk de reproduceerbaarheid beïnvloeden in experimenten19,20. Momenteel zijn er geen gestandaardiseerde, geoptimaliseerde protocollen voor het isoleren van varkensachtige darmcrypten en iMSC's uit hetzelfde weefselmonster. Bovendien hebben praktische beperkingen bij het verkrijgen van geschikte menselijke darmmonsters ertoe geleid dat veel onderzoekers vertrouwen op mismatched celtypen van verschillende organen (zoals menselijke enteroïden met huidfibroblasten) om epitheliale-mesenchymale cellulaire crosstalk te evalueren, wat mogelijk de interpretatie van data kan verstoren 21,22,23.

Hoewel een recent gepubliceerd protocol voor menselijke darmbiopsie crypts isoleerde en fibroblasten verkregen via uitgroei uit het overgebleven epitheel-ontblootte weefsel, ontbreken vergelijkbare gestandaardiseerde benaderingen bij varkens24. Varkens worden gebruikt als geschikt diermodel voor translationeel onderzoek vanwege hun anatomische en fysiologische gelijkenis met mensen 2,18,25,26,27,28,29. Daarom presenteert deze methode een sequentieel isolatieprotocol dat intestinale crypten en iMSC's uit hetzelfde varkens-jejunale segment terugwint, gebaseerd op de fysiologische, anatomische en morfologische structuur van de darm 4,30. De procedure biedt een reproduceerbaar kader voor het isoleren van zowel crypts als iMSC's, geschikt voor toekomstige porcine darmkweekstudies.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een segment van 5 cm werd ontleed van het verwijderde proximale jejunum van 21 dagen oude biggen die werden gehuisvest in de varkensfaciliteit van de University of Maryland, College Park. De procedure (R-JUN-22-30) die werd gebruikt om het biggetje te offeren, volgde richtlijnen voor dierenverzorging en gebruiksbeleid die zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van de universiteit. Voordat de isolatiestappen worden uitgevoerd, wordt het protocoloverzicht weergegeven in Figuur 1, en de lijst van reagentia en apparatuur die worden gebruikt voor de sequentiële isolatie van de varkens-darmcrypten en iMSC's is opgenomen in de Materiaaltabel.

1. Pre-isolatie voorbereidingsfase

  1. Bereid 30 ml wasbuffer voor per 5 cm weefselsegment in 50 mL conische buizen.
  2. Pas het volume aan op basis van het aantal verzamelde weefselmonsters.
    OPMERKING: Kijk in Tabel 1 voor de samenstelling van de wasbuffer. Alle weefselvoorbereidingen en celisolatiestappen worden op een werkbank uitgevoerd.

2. Fase van de voorbereiding van darmweefsel

  1. Plaats het verwijderde darmweefsel in de 30 ml washbuffer in 50 mL conische buizen.
    OPMERKING: De verwijderde weefsels kunnen een uur voor gebruik in een koude wasmachine worden geplaatst.
  2. Spoel het weefsel 3× met een gekoelde wasbuffer met een 21 G spuit om de luminale inhoud te verwijderen.
  3. Plaats het weefsel op een gesteriliseerd polystyreenschuimoppervlak en verwijder voorzichtig het mesenterische en vetweefsel van de serosa.
  4. Snijd het weefsel longitudinaal met een chirurgisch mes om het lumen te openen (Figuur 2A).
  5. Breng het gedeeltelijk gereinigde dissectieve weefsel over in een verse wasbuffer en was twee keer, of totdat de buffer helder is.
  6. Plaats het weefsel in de wasbuffer in een 100 mm petrischaal en snijd het in stukken van 10-15 mm met een nieuw chirurgisch mes (Figuur 2B,C). Deze stap vergroot het oppervlak dat aan de verteringsbuffer wordt blootgesteld.
  7. Breng het gemalen weefsel over in een nieuwe 50 mL kegelvormige buis.
  8. Was voorzichtig met een wasfilter en laat het gemalen weefsel ongeveer 30 seconden door de zwaartekracht bezinken (Figuur 2D).
  9. Aspireer voorzichtig het supernatant, zodat er alleen genoeg reserve overblijft om de weefselstukken in de conische buis te bedekken.
  10. Epitheliale dissociatiefase
    1. Voeg 30 mL voorverwarmde epitheliale dissociatiebuffer toe (Tabel 2) en incubeer 20-30 minuten bij 37 °C in een statisch kralenbad of een schudbadwater van ongeveer 9 × g.
    2. Schud de buis voorzichtig elke 15 minuten om de afgifte van de crypten uit het epitheelmembraan te vergroten.
    3. Laat het weefsel bezinken en aspireer voorzichtig het supernatant met een serologische pipet, zodat er alleen genoeg buffer overblijft om het beliggende weefsel in de kegelvormige buis te bedekken.
    4. Voeg 30 mL verse wasbuffer toe aan het bezonken weefsel en schud krachtig om de villi, cryptes en vuil vrij te maken (Figuur 3A). Laat de weefselresten zakken en giet vervolgens voorzichtig de wash buffer supernatant, die de zwevende cryptsegmenten bevat, via een 100 μm celfilter in een nieuwe 50 mL conische buis.
      1. Herhaal het proces waarbij je verse wasbuffer aan het overgebleven weefsel toevoegt en drie keer decanteert (3×). Pipetteer 10 μL wasbuffer met de crypten in een 100 mm petrischaal en onderzoek de cryptdichtheid onder een stereomicroscoop.
        OPMERKING: Houd elke washbuffer crypts bevattend na elke wash.
    5. Na de derde wash zou de washbuffer met de crypts vrij moeten zijn met minimaal vuil (Figuur 3B).
      OPMERKING: Bewaar de weefselresten met de extracellulaire matrix (ECM) in de conische buis voor latere iMSC-isolatieprocessen.
    6. Centrifugeer de crypte-suspensie op 150 × g gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur om de cryptfragmenten te pelleten.
    7. Aspireer en suspendeer de cryptpellet opnieuw in een epitheliale kweekmedium.
    8. Centrifugeer de opnieuw opgehangen crypten opnieuw op 150 × g gedurende 2 minuten om de cryptfragmentpellet te verzamelen.
    9. Voeg epitheliale kweekmedium toe om de crypts opnieuw te suspenderen en pipetteer 5× met een pipettip van 1.000 μL.
    10. Zaad ongeveer 100 resuspendeerde crypts op voorvoorbereide collageen type 1 hydrogel-gecoate 6-well platen om de crypts te cultiveren en uit te breiden tot tweedimensionale (2D) enteroïde monolagen.
      OPMERKING: Controleer de collageen-hydrogel-gecoate plaatvoorbereiding in Tabel 3. De uiteindelijke collageen type 1 concentratie moet 1,0 mg/mL zijn. Vermijd het plateren van te dichte cryptes of puinfragmenten om gist- of schimmelbesmetting te voorkomen. Antibioticum-antimycoticum (anti-anti) in de wasbuffer en kweekmedium moeten bescherming bieden.
    11. Onderzoek cellen onder een omgekeerde fasecontrastmicroscoop voordat je incubeert bij 37 °C in een bevochtigde 5% CO2-incubator.
    12. Vervang het kweekmedium binnen 12 uur na het zaaien om drijvend vuil te verwijderen en bacteriële besmetting te verminderen.
    13. Kweek de enteroïden met behulp van epitheelkweekmedium (Tabel 4) en vervang het medium om de dag tot ongeveer dag 8, wanneer de uitgebreide 2D-monolagen ≥85% confluentie bereiken voor subculturing.
  11. Extracellulaire matrix dissociatiefase
    OPMERKING: Ga verder met het isolatieproces met de overgebleven weefselfragmenten die de extracellulaire matrix in de kegelvormige buis bevatten (Figuur 3C en Figuur 4A).
    OPMERKING: Hoewel EDTA in de epitheliale dissociatiebuffer de collagenaseactiviteit kan remmen, verwijderen de voorgaande drie wasstappen alle EDTA en DTT. Daarom zou de collagenase-activiteit in het volgende proces niet beïnvloed moeten worden.
    1. Fijn het resterende weefsel opnieuw in kleine stukjes voordat je de iMSC's in de lamina propria isoleert.
    2. Voeg 25 mL extracellulaire verteringsbuffer toe (Tabel 5) aan het weefsel en incubeer in een statisch kraalbad gedurende 15-20 minuten bij 37 °C (Figuur 4B).
    3. Schud krachtig na de incubatie.
      OPMERKING: Het supernatant wordt troebel met minder zwevende weefselfragmenten. Pipette 10 μL van het supernatant onder een omgekeerde microscoop om de dichtheid van de iMSC's in het supernatant te onderzoeken. Blijf het weefsel in het kralenbad nog 15 minuten incuberen als de waargenomen iMSC-dichtheid laag is.
    4. Dekanteer het supernatant voorzichtig (direct na het krachtige schudden in stap 2.2.3) via een 100 μm celfilter in een nieuwe kegelvormige buis om vuil te minimaliseren.
    5. Centrifugeer de celsuspensie op 280 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur om de iMSC's te pelleten.
    6. Aspireer het supernatant en suspendeer de iMSC's opnieuw in mesenchymale kweekmedium (zie iMSC-kweekmedia in Tabel 6).
    7. Centrifugeer de opnieuw gesuspendeerde iMSC's opnieuw op 280 × g gedurende 5 minuten om de dissociatiebuffer af te spoelen.
    8. Aspiraat en hersuspendeer de iMSC's in mesenchymale kweekmedium.
    9. Plaats de iMSC's in een T75-kweekkolf met ongeveer 5 × 10 à5 cellen per kolf.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat de geplateerde cellen ongeveer 60% van het oppervlak van de kolf bedekken, omdat mesenchymale cellen een matige tot hoge zaaidichtheid vereisen voor optimale groei.
    10. Vervang het kweekmedium binnen 12 uur na het opmaken om overtollig vuil te verwijderen en bacteriële besmetting te voorkomen.
    11. Onderzoek fibroblast-achtige cellen onder een omgekeerde fasecontrastmicroscoop op dag 2 na het zaaien.
      OPMERKING: Vervang het medium van mesenchymale cultuur om de dag. De iMSC's zouden ongeveer 85% confluentie moeten bereiken en klaar zijn voor subcultivatie op dag 4.

3. Immunocytochemie-assay

  1. Kweek ongeveer 5.000 iMSC's per put in een 96-wells plaat met mesenchymal kweekmedium gedurende 2-3 dagen totdat de cellen ongeveer 80% samenvloeiing bereiken.
  2. Aspireer het medium voorzichtig en spoel de gekweekte iMSC's twee keer af met 100 μL van 1× PBS/put bij kamertemperatuur31. Alle verwijzingen naar de immunokleuringskits zijn opgenomen in de Materiaallijst.
  3. Voeg 100 μL 4% paraformaldehyde (PFA) toe per put om de gekweekte iMSC's te fixeren en incubeer op een statisch werkblad bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
  4. Was de vaste gekweekte iMSC's twee keer met 100 μL 0,1% Tween-20/PBS (PBST) gedurende elk 5 minuten, en permeabiliseer vervolgens met 100 μL 0,5% Triton X-100/PBS gedurende 30 minuten.
  5. Voeg 100 μL 5% bovin serumalbumine (BSA)/PBST toe per put om niet-specifieke binding op de vaste cellen te blokkeren.
    OPMERKING: Laat het 1 uur op kamertemperatuur staan voordat je twee keer wast met 100 μL PBST voor elk 5 minuten.
  6. Voeg 100 μL verdunde primaire antilichamen (1:250; d.w.z. 1 μL primaire antistof in 250 μL antistofverdunner) toe aan elke put en incubeer de cellen een nacht bij 4 °C. De primaire gebruikte antilichamen zijn PDGFRα en CD81.
    OPMERKING: Integreer negatieve controleputten door alleen antistofverdunner toe te voegen zonder primaire antistoffen.
  7. Op de tweede dag spoel je de primaire antilichamen twee keer af met 100 μL PBST gedurende 5 minuten per persoon.
  8. Verdun de secundaire antilichamen in 1× PBS met de volgende verhoudingen: Alexa Fluor Plus 555 (1 μL:100 μL), Alexa Fluor Plus 647 (1 μL:100 μL) en DAPI (1 μL:800 μL).
  9. Contrastkleur de cellen met de verdunde secundaire antilichamen bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
  10. Was de cellen twee keer met 1× PBS gedurende elk 5 minuten.
  11. Voeg 100 μL montagemedium per put toe, bedek de plaat, wikkel hem in aluminiumfolie en bewaar tot 6 maanden bij 4 °C tot fluorescerende beeldvorming.

4. RNA-isolatie en qPCR-assay

  1. Extractie van het totale mRNA uit iMSC's die zijn gekweekt in T75-kolven met behulp van de zure guanidiniumthiocyanaat-fenol-chloroform scheidingstechniek.
    OPMERKING: Bepaal de RNA-concentratie en zuiverheid met behulp van een spectrofotometer.
  2. Reverse transcrib totaal mRNA naar cDNA om te gebruiken als sjabloon voor de quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR) assay om amplificatieplots te verifiëren voor de geselecteerde Sus scrofa-genprimer, GAPDH (vooraan: ATCCTGGGCTACGAGGAC; omgekeerd: AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG), zoals gerapporteerd in eerdere studies 2,28.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tijdens epitheliale dissociatie chelaat ethyleendiamintetraazijnzuur (EDTA) calciumionen om calciumafhankelijke cel-celadhesies te verstoren, terwijl dithiothreitol (DTT) disulfidebruggen in mucineglycoproteïnen splijt om mucolyse te bevorderen. Het gecombineerde gebruik van een chelaterende verbinding (EDTA) en een reducerend middel (DTT) maakt het mogelijk om crypten uit het epitheelmembraan effectief vrij te maken zonder de structuur van de extracellulaire matrix (ECM)te verstoren 2,32

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het isoleren van intestinale crypten en iMSC's uit hetzelfde varkens-jejunale segment biedt een nieuwe benadering om weefselsegmentspecifieke cellulaire en functionele kenmerken te behouden. Dit is cruciaal omdat darmweefsels regionale en ruimtelijke identiteiten vertonen, zoals aangetoond in eerdere varkensstudies 2,36,37,38. Eerdere organoïde studies bij vark...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs waarderen financiële steun van het MAES Competitive Grant Program aan de University of Maryland, College Park, VS.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.5M EDTAPromegaPR-V4231
1 M HEPES bufferThermoFisher15630080Voor bereiding van collageen hydrogel platen
1000 uL pipet tipsAlkali Scientific FT1000104027-530
10x PBSInvitrogenAM9624Voor bereiding van collageen hydrogel platen
1N sodium hydroxideThermoSS266-1Voor bereiding van collageen hydrogel platen
1x HBSSThermoFisher14025092
1X PBSHycloneSH30256FS
4 % paraformaldehyde (PFA)ThermoFisherAAJ61899AK
50 mL conische buisjesThermoFisher12-565-271
6 wel platenFisherbrandFB012927
7.5% Sodium Bicarbonate SolutionCorningMT25035CIVoor bereiding van collageen hydrogel platen
Advance DMEM/F12 Gibco 12634-010
Alexa fluor plus 647InvitrogenA32728Secundaire antilichaam
Alexa plus 555 - A32732 InvitrogenA32732Secundaire antilichaam
AluminiumfolieReynoldshttps://www.amazon.com/dp/B00M8ZEAW4?ref=fed_asin_title&th=1
ANTI-ANTIGibco15240096
B27ThermoFisher12587010
BSAFisherbrandBP1600-100
CD81 Proteinintech66866-1-igPrimair antilichaam
Cell Culture Grade WaterHycloneSH30529FSVoor bereiding van collageen hydrogel platen
Collageen, Type 1Corning356236Voor bereiding van collageen hydrogel platen
Collageinase IVGibco17104019
Corning 100 mm petrischaalCorning07-202-011
Cryostor cell cryopreservation mediaStemcell Technologies7930
cryovial voor cellen Fisherbrand1050026
Dako antilichaam diluentDako/AgilentPart number: S302283-2Primair antilichaam diluent
Dako fluorescent montage mediaDako/AgilentPart number: S302380-2
DAPIPromocell/VWR10180-470DNA kleuring
Dispase IIRoche4942078001
DMEM, hoge glucoseCorningMT10013CV
DTTSigma646563
EGFPeprotech315-09
FBS (HI)Avantor1300-500H
GastrineAnaspecAS-64149
GentamicinMP BiomedicalsICN1676045
GlutaMaxThermoFisher35050061
HEPESThermoFisher15630-080
Omgekeerde fluorescente microscoopNikonECLIPSE Ti2Fluorescente beeldvorming
Omgekeerde fase-contrast microscoopNikonEclipse TS100Voor beeldvorming van gekweekte cellen 
iScript Advanced cDNA Synthese KitBio-Rad1725038RT-PCR kit
iTaq Universal SYBR Green SupermixBio-Rad1725122qPCR kit
LWRN conditioneel mediaATCCCRL-3276LWRN media werd volgens het ATCC-proces in huis bereid
N-acetyl cysteïneMP Bio194603
Nanodrop 2000 spectrofotometerThermoFisherND 2000
NicotinamideSigmaN0636-100G
Optische 384-Well Platen met streepjescodeApplied Biosystems4483285qPCR kit
PDGFRαAbcamab230457Primair antilichaam
Prostaglandine E2 (PGE2)Cayman chemical 14010
QuantStudio 5Applied BiosystemA28570qPCR instrument
SB202190LC LaboratoriesS-1700
Stereo microscoopNikon SMZ745
T 75 flesFisherbrandFB012937
Triton X100FisherbrandPI85111
Trizol reagens Invitrogen15596026
Tween 20, 100% Nonionische DetergentiBio-rad1706531
Y27632ApexBioA3008-200

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gehart, H., Clevers, H. Tales from the crypt: New insights into intestinal stem cells. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 16 (1), 19-34 (2019).
  2. Yin, L., et al. Changes in progenitors and differentiated epithelial cells of neonatal piglets. Anim Nutr. 8 (1), 265-276 (2022).
  3. Pastula, A., Marcinkiewicz, J. Cellular interactions in the intestinal stem cell niche. Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 67 (1), 19-26 (2019).
  4. Mccarthy, N., Kraiczy, J., Shivdasani, R. A. Cellular and molecular architecture of the intestinal stem cell niche. Nat Cell Biol. 22 (9), 1033-1041 (2020).
  5. Beumer, J., Clevers, H. Cell fate specification and differentiation in the adult mammalian intestine. Nat Rev Mol Cell Biol. 22 (1), 39-53 (2021).
  6. Pasztoi, M., Ohnmacht, C. Tissue niches formed by intestinal mesenchymal stromal cells in mucosal homeostasis and immunity. Int J Mol Sci. 23 (9), 5181(2022).
  7. Kraiczy, J., et al. Graded BMP signaling within intestinal crypt architecture directs self-organization of the Wnt-secreting stem cell niche. Cell Stem Cell. 30 (4), 433-449 (2023).
  8. Niec, R. E., et al. Lymphatics act as a signaling hub to regulate intestinal stem cell activity. Cell Stem Cell. 29 (7), 1067-1082 (2022).
  9. Paerregaard, S. I., et al. The small and large intestine contain related mesenchymal subsets that derive from embryonic gli1(+) precursors. Nat Commun. 14 (1), 2307(2023).
  10. Maimets, M., et al. Mesenchymal-epithelial crosstalk shapes intestinal regionalisation via Wnt and Shh signalling. Nat Commun. 13 (1), 715(2022).
  11. Ayansola, H., Mayorga, E. J., Jin, Y. Subepithelial stromal cells: Their roles and interactions with intestinal epithelial cells during gut mucosal homeostasis and regeneration. Biomedicines. 12 (3), 668(2024).
  12. Wang, Y., et al. Long-term culture captures injury-repair cycles of colonic stem cells. Cell. 179 (5), 1144-1159 (2019).
  13. Xia, X., et al. Mesenchymal stem cells promote healing of nonsteroidal anti-inflammatory drug-related peptic ulcer through paracrine actions in pigs. Sci Transl Med. 11 (516), eaat7455(2019).
  14. Zhang, W., et al. Dietary calcium and phosphorus amounts affect development and tissue-specific stem cell characteristics in neonatal pigs. J Nutr. 150 (5), 1086-1092 (2020).
  15. Zhou, J. Y., et al. Zinc l-aspartate enhances intestinal stem cell activity to protect the integrity of the intestinal mucosa against deoxynivalenol through activation of the Wnt/beta-catenin signaling pathway. Environ Pollut. 262, 114290(2020).
  16. Yang, S., et al. Organoids: The current status and biomedical applications. MedComm (2020). 4 (3), e274(2023).
  17. Zhao, Z., et al. Organoids. Nat Rev Methods Primers. 2 (1), 94(2022).
  18. Gonzalez, L. M., Moeser, A. J., Blikslager, A. T. Porcine models of digestive disease: The future of large animal translational research. Transl Res. 166 (1), 12-27 (2015).
  19. Nieuwenhuis, T. O., et al. Patterns of unwanted biological and technical expression variation among 49 human tissues. Lab Invest. 104 (6), 102069(2024).
  20. Pastula, A., et al. Three-dimensional gastrointestinal organoid culture in combination with nerves or fibroblasts: A method to characterize the gastrointestinal stem cell niche. Stem Cells Int. 2016, 3710836(2016).
  21. Kraski, A., et al. Structured multicellular intestinal spheroids (SMIS) as a standardized model for infection biology. Gut Pathog. 16 (1), 47(2024).
  22. Darling, N. J., Mobbs, C. L., Gonzalez-Hau, A. L., Freer, M., Przyborski, S. Bioengineering novel in vitro co-culture models that represent the human intestinal mucosa with improved Caco-2 structure and barrier function. Front Bioeng Biotechnol. 8, 992(2020).
  23. Freer, M., Cooper, J., Goncalves, K., Przyborski, S. Bioengineering the human intestinal mucosa and the importance of stromal support for pharmacological evaluation in vitro. Cells. 13 (22), 1859(2024).
  24. Meran, L., Tullie, L., Eaton, S., De Coppi, P., Li, V. S. W. Bioengineering human intestinal mucosal grafts using patient-derived organoids, fibroblasts and scaffolds. Nat Protoc. 18 (1), 108-135 (2023).
  25. Burrin, D., et al. Translational advances in pediatric nutrition and gastroenterology: New insights from pig models. Annu Rev Anim Biosci. 8, 321-354 (2020).
  26. Lunney, J. K., et al. Importance of the pig as a human biomedical model. Sci Transl Med. 13 (621), eabd5758(2021).
  27. Barnett, A. M., et al. Porcine colonoids and enteroids keep the memory of their origin during regeneration. Am J Physiol Cell Physiol. 320 (5), C794-C805 (2021).
  28. Gonzalez, L. M., Williamson, I., Piedrahita, J. A., Blikslager, A. T., Magness, S. T. Cell lineage identification and stem cell culture in a porcine model for the study of intestinal epithelial regeneration. PLoS One. 8 (6), e66465(2013).
  29. Stieler Stewart, A., Freund, J. M., Blikslager, A. T., Gonzalez, L. M. Intestinal stem cell isolation and culture in a porcine model of segmental small intestinal ischemia. J Vis Exp. (135), e57647(2018).
  30. Meran, L., Baulies, A., Li, V. S. W. Intestinal stem cell niche: The extracellular matrix and cellular components. Stem Cells Int. 2017, 7970385(2017).
  31. Mahe, M. M., et al. Establishment of gastrointestinal epithelial organoids. Curr Protoc Mouse Biol. 3 (4), 217-240 (2013).
  32. Koliaraki, V., Kollias, G. Isolation of intestinal mesenchymal cells from adult mice. Bio-Protocol. 6 (18), 1940(2016).
  33. Chang, C. W., et al. Mesenchymal stem cell seeding of porcine small intestinal submucosal extracellular matrix for cardiovascular applications. PLoS One. 11 (4), e0153412(2016).
  34. Chen, J., et al. Human intestinal organoid-derived PDGFRα+ mesenchymal stroma enables the proliferation and maintenance of Lgr4+ epithelial stem cells. Stem Cell Res Ther. 15 (1), 16(2024).
  35. Beaumont, M., et al. Intestinal organoids in farm animals. Vet Res. 52 (1), 33(2021).
  36. Wiarda, J. E., Becker, S. R., Sivasankaran, S. K., Loving, C. L. Regional epithelial cell diversity in the small intestine of pigs. J Anim Sci. 101, skac318(2023).
  37. Vermeire, B., Gonzalez, L. M., Jansens, R. J. J., Cox, E., Devriendt, B. Porcine small intestinal organoids as a model to explore etec-host interactions in the gut. Vet Res. 52 (1), 94(2021).
  38. Wiarda, J. E., Trachsel, J. M., Sivasankaran, S. K., Tuggle, C. K., Loving, C. L. Intestinal single-cell atlas reveals novel lymphocytes in pigs with similarities to human cells. Life Sci Alliance. 5 (10), e202201442(2022).
  39. Uniken Venema, W. T. C., et al. Gut mucosa dissociation protocols influence cell type proportions and single-cell gene expression levels. Sci Rep. 12 (1), 9897(2022).
  40. Schaaf, C. R., et al. A lgr5 reporter pig model closely resembles human intestine for improved study of stem cells in disease. FASEB J. 37 (6), e22975(2023).
  41. Joo, S. S., et al. Porcine intestinal apical-out organoid model for gut function study. Animals (Basel). 12 (3), 372(2022).
  42. Gomez-Martinez, I., et al. A planar culture model of human absorptive enterocytes reveals metformin increases fatty acid oxidation and export. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 14 (2), 409-434 (2022).
  43. Jacob, J. M., et al. Pdgfralpha-induced stromal maturation is required to restrain postnatal intestinal epithelial stemness and promote defense mechanisms. Cell Stem Cell. 29 (5), 856-868 (2022).
  44. Modina, S. C., et al. Stages of gut development as a useful tool to prevent gut alterations in piglets. Animals (Basel). 11 (5), 1412(2021).
  45. Tang, W., et al. Ileum tissue single-cell mRNA sequencing elucidates the cellular architecture of pathophysiological changes associated with weaning in piglets. BMC Biol. 20 (1), 123(2022).
  46. Dong, X., et al. Identification of optimal reference genes for gene expression normalization in human osteosarcoma cell lines under proliferative conditions. Front Genet. 13, 989990(2022).
  47. Mccarthy, N., et al. Distinct mesenchymal cell populations generate the essential intestinal BMP signaling gradient. Cell Stem Cell. 26 (3), 391-402 (2020).
  48. Mussard, E., et al. Culture of piglet intestinal 3d organoids from cryopreserved epithelial crypts and establishment of cell monolayers. J Vis Exp. (192), e64917(2023).
  49. Zhang, M., et al. Long-term expansion of porcine intestinal organoids serves as an in vitro model for swine enteric coronavirus infection. Front Microbiol. 13, 865336(2022).
  50. Benz, P., Plenge, M., Wagner, S., Mazzuoli-Weber, G. Two-dimensional porcine intestinal organoids reflecting the physiological properties of native gut. J Vis Exp. (215), e67666(2025).
  51. Lee, B. R., Ock, S. A., Park, M. R., Lee, M. G., Byun, S. J. Establishing porcine jejunum-derived intestinal organoids to study the function of intestinal epithelium as an alternative for animal testing. J Anim Reproduction Biotechnol. 39 (1), 2-11 (2024).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Crypt IsolationMesenchymal Stromal CellsPorcine Intestinal TissueSequential IsolationEDTA DTT DissociationCollagenase DigestionEnteroid MonolayersCollagen HydrogelStromal MarkersEpithelial Stromal Interactions
Video Coming Soon

Related Articles