EasyFiji: Een grafische interface voor gebruiksvriendelijke fluorescentiebeeldverwerking in Fiji

Summary

EasyFiji is een grafische gebruikersinterface-plugin voor Fiji (ImageJ) die een zorgvuldig samengestelde suite van fluorescentiebeeldvisualisatie- en verwerkingstools biedt die vaak door life scientists worden gebruikt.

Abstract

Fiji (Fiji Is Just ImageJ) is een uitgebreid en uitbreidbaar open-source beeldverwerkingspakket dat veel wordt gebruikt door de bioimage-analysegemeenschap. Voor niet-computationele life scientists vereist het handmatig omgaan met de vele mogelijkheden van Fiji echter het leren en navigeren door een diep gelaagd menusysteem. Bovendien zijn sommige commando's standaard gedrag niet ideaal voor fluorescentiebeeldweergave en -verwerking. Om de efficiëntie te verhogen voor levenswetenschappers die werken met fluorescentiemicroscopiebeelden, hebben we EasyFiji ontwikkeld, een samengestelde grafische gebruikersinterface (GUI) plugin voor Fiji. Elk EasyFiji-commando wordt uitgevoerd via tooltip-enhanced knoppen en schuifregelaars en vertoont altijd kanaalspecifieke uitvoering, zoals vereist voor fluorescentiebeelden. Commando's die pixelintensiteiten veranderen zijn ook one-click onuitvoerbaar om interactievere verwerking mogelijk te maken en kunnen automatisch worden opgenomen en opgeslagen als tekst voor registratie. Een afbeeldingsinformatiepaneel toont instellingen die cruciaal zijn voor beeldinterpretatie. Er zijn ook nieuwe functies voor beeldrendering en bleekcorrectie beschikbaar. De plugin is vrij beschikbaar op GitHub en als Fiji Update Site. Dit protocol beschrijft de stappen om de interface van EasyFiji te gebruiken voor visualisatie en verwerking van fluorescentiemicroscopiebeelden.

Introduction

Fiji (Fiji is Just ImageJ) is een uitgebreid en uitbreidbaar open-source beeldverwerkingspakket dat veel wordt gebruikt door de bioimage-analysegemeenschap ^1,2. Fiji's grote codebase van algemene algoritmen, samen met de macrotaal en plugin-interface, kan gemakkelijk worden ingezet door computationele analisten om een oplossing te bieden voor vrijwel elk probleem van beeldverwerking of analyse. Voor life science-gebruikers met weinig rekenervaring kunnen FIJI's >1.100 commando's, verspreid over een diep gelaagd dropdownmenu, ontzettend complex zijn om effectief te navigeren en te gebruiken. Er zijn verschillende benaderingen gehanteerd om het handmatige gebruik van Fiji te vereenvoudigen. De zoekbalk van Fiji is een alternatief voor menunavigatie en biedt toegang tot uitstekende hulpdocumentatie, maar alleen als de gebruiker de naam van het benodigde algoritme kent. De werkbalkknoppen van Fiji kunnen worden aangepast om snelle toegang te bieden tot door de gebruiker gedefinieerde commando's, maar deze procedure vereist het schrijven van een macrocode en vooruitzien welke commando's het meest nuttig zullen zijn. De ActionBar-plugin biedt een zelfstandig grafisch gebruikersinterface (GUI)-venster met aanpasbare en organiseerbare arrays van knoppen, maar ook hier zijn coderen en ervaring vereist om de knoppen effectief te vullen³. Geen van deze oplossingen voldoet aan de behoeften van levenswetenschappers met weinig ervaring in beeldverwerking.

Naast problemen met de gebruikersinterface vereisen veel levenswetenschappers die met fluorescentiemicroscopiebeelden werken kanaalspecifieke weergave- en verwerkingsprocedures. Sommige veelgebruikte Fiji-commando's zijn echter standaard niet kanaalbewust. Gebruikers willen bijvoorbeeld pseudo-gekleurde kanalen op een even opvallende manier samen weergeven, of specifiek gebieden met vergelijkbare intensiteit tussen kanalen markeren, of het grijstintencontrast van een morfologisch signaal behouden terwijl er ook fluorescentie wordt weergegeven. In elk van deze gebruiksgevallen verbergt Fiji's RGB-composietrenderingstechniek de gewenste informatie op perceptueel niveau. Bij het verwerken van multikanaals afbeeldingen, worden native Fiji-beeldfilters (d.w.z. Process | filters), ofwel alleen het actieve 2D-bitvlak verwerken of alle bitvlakken in het afbeeldingsvenster (d.w.z. de 'stack' zoals gedefinieerd door klasse ImageStack). Het eerste gedrag verwerkt niet over de z- of t-dimensie voor een bepaald kanaal, terwijl het tweede gedrag vrijwel altijd onjuist is, omdat elk kanaal een uniek kleuringpatroon en signaal-ruisverhouding bevat, waardoor kanaalspecifieke verwerkingsparameters nodig zijn. De correctiecommando's voor bleekmiddel in het inheemse Fiji (Afbeelding | Aanpassen | Bleekcorrectie) werken verkeerd wanneer ze worden toegepast op multikanaals fluorescentiebeelden, omdat ze opnieuw corrigeren over de hele ImageStack, waar kanaalgegevens worden verweven, in plaats van te corrigeren over de z- of t-dimensie binnen elk kanaal individueel.

Om deze problemen aan te pakken voor levenswetenschappers die werken met fluorescentiemicroscopiebeelden, hebben we EasyFiji ontwikkeld, een zorgvuldig samengestelde en begeleide grafische gebruikersinterface-plugin voor Fiji. EasyFiji is een samengestelde set thematisch georganiseerde commando's die kanaalbewuste rendering en verwerking mogelijk maken. Vier genoteerde panelen, Weergeven, Verwerken, Opslaan en Afbeeldingsinformatie, elk bevatten thematisch gerelateerde verzamelingen van tooltip-verbeterde knoppen en schuifregelaars voor het uitvoeren van commando's. Andere gemakken zijn onder meer een ongedaan maken-functionaliteit voor interactieve verwerking, een eenvoudige, platte tekstrecorder die automatisch pixel-modificerende acties samen met een afbeelding kan opslaan, en een geformatteerde weergave van verwervingsinstellingen die belangrijk zijn voor beeldinterpretatie. EasyFiji biedt ook nieuwe tools voor beeldrendering en blekcorrectie. EasyFiji ondersteunt geen kwantitatieve beeldanalyse of batchverwerkingsfuncties, omdat deze procedures alleen met hulp van een deskundige bioimage-analist moeten worden uitgevoerd. Hoewel EasyFiji van ontwerp beknopt is, zijn alle native Fiji-commando's altijd beschikbaar via het native Fiji-menusysteem. Wij geloven dat het doelgroepgerichte ontwerp⁴ van EasyFiji het gebruik van Fiji onder life scientists zal vergroten. Hier presenteren we het ontwerp, de implementatie en toepassing van EasyFiji op fluorescentiemicroscopiebeelden. De plugin is eenvoudig te installeren via een Fiji-updatesite (https://imagej.github.io/list-of-update-sites/ en https://imagej.net/plugins/EasyFiji_plugin), terwijl open-source code via GitHub kan worden gedownload; De plugin en broncode zijn vrij beschikbaar (https://github.com/stjude/EasyFiji).

Protocol

Dit protocol beschrijft hoe je EasyFiji installeert en gebruikt.

1. Om EasyFiji te installeren...

1. Download de nieuwste versie van Fiji (>1.54g) die geschikt is voor het besturingssysteem en installeer deze in een map waartoe de gebruiker lees-/schrijftoegang heeft (zie de Materiaaltabel voor een link naar de Fiji downloadsite).
2. Start Fiji en navigeer naar Help | Update... In de menubalk.
3. Klik in het Updater-venster op Websites beheren. Selecteer EasyFiji uit de lijst en klik op Apply and Close. EasyFiji wordt automatisch geïnstalleerd en Fiji wordt automatisch bijgewerkt met toekomstige releases van EasyFiji.
4. Fiji opnieuw opstarten. Selecteer EasyFiji in het Fiji Plugins-menu.
   OPMERKING: EasyFiji is volledig compatibel met veel oudere versies van Fiji en is voornamelijk compatibel met ImageJ. Gedetailleerde informatie over compatibiliteit en afhankelijkheid is te vinden op de EasyFiji GitHub wikipagina (https://github.com/stjude/EasyFiji) en de wikipagina van EasyFiji ImageJ.net (https://imagej.net/plugins/EasyFiji_plugin#quick-start). Feedback kan worden gegeven via de GitHub-pagina of de EasyFiji-thread op het Image.sc forum (https://forum.image.sc/t/announcing-easyfiji-a-user-friendly-gui-plugin-for-fiji/117617) (zie Materiaaltabel voor links naar deze bronnen).

2. Gebruik van het EasyFiji-displaypaneel

OPMERKING: Zoals te zien is in Figuur 1A, ondersteunt het displaypaneel fluorescentiekanaal-pseudokleuring met behulp van kleurproefknoppen, intuïtieve contrastaanpassingsknoppen en nieuwe opties voor perceptueel gekalibreerde multikanaals beeldweergaven. Native Fiji-commando's voor 3D/4D-beeldprojectie en herslicing zijn ook inbegrepen. Tabel 1 documenteert de correspondentie tussen EasyFiji-commando's en inheemse Fiji-commando's.

1. Stel de kleur of zichtbaarheid van een kanaal in (Displaypanel , Channel Color-sectie ).
   1. Selecteer het gewenste kanaal met de kanaalschuifregelaar van het afbeeldingsvenster.
   2. Druk op een kleurproeftoets om een nieuwe kleurzoektabel (LUT) toe te wijzen.
   3. Druk op de zwarte proeflapknop om het scherm van een kanaal uit te schakelen.
   4. Druk op de AllChs-knop om alle kanalen tegelijk weer te geven.
   5. Druk op de EachCh-knop om elk kanaal sequentieel weer te geven, door de kanaalschuif in het afbeeldingsvenster te scrollen.
2. Stel kanaalcontrast in binnen of tussen afbeeldingen in (Display Panel, sectie Channel Contrast ).
   1. Om het weergavebereik van een kanaal (contrast) te wijzigen, selecteer je het kanaal met de kanaalschuif onderaan het afbeeldingsvenster.
   2. Verplaats de display gain schuifregelaar om de pixelintensiteit van het beeld (waarde rechts getoond) aan te geven die als de helderste waarde op het scherm wordt weergegeven.
      OPMERKING: We gebruiken de term displayversterking om deze actie te beschrijven omdat het ervoor zorgt dat het kanaal lineair helderder wordt, analoog aan het effect van het veranderen van de versterking op een detector tijdens beeldverkrijgen.
   3. Druk op de resetknop voor de display gain om de maximaal mogelijke pixelintensiteit van het kanaal (bepaald door de bitdiepte) als de helderste waarde op het scherm weer te geven.
   4. Verplaats de display-offset schuifregelaar om de pixelintensiteit van het beeld (waarde rechts getoond) aan te geven die als donkerste waarde op het scherm wordt weergegeven.
      OPMERKING: We hebben de term display offset gebruikt om deze actie te beschrijven omdat het het zwartniveau van het beeld bepaalt, analoog aan het effect van het instellen van de offset op een detector tijdens beeldverwerving.
   5. Druk op de display-offset reset knop om de pixelintensiteit van het beeld nul in te stellen op de donkerste waarde op het scherm.
   6. Druk op de AutoCh-knop om automatisch de display gain en offset aan te passen.
   7. Druk op de AutoAll-knop om automatisch de gain en offset van het display voor alle kanalen aan te passen.
   8. Druk op de Propagate-knop om de beeldversterking en -offset-instellingen van het actieve beeld over te zetten naar alle andere open beelden met hetzelfde aantal kanalen.
3. Maak een multikanaals display aan (Display Panel, Channel Views sectie).
   1. Om twee fluorescentiekanalen samen als kleurenbeeld te renderen, gebruik je de FF-voorvoegde knoppen (fluorescentie met fluorescentie). Om fluorescentiekanaal(s) en een morfologisch grijstintenkanaal samen als kleurenbeeld te renderen, gebruik je de FG-voorvoegde knop (fluorescentie met grijswaarden). Renderings worden aangemaakt in een nieuw afbeeldingsvenster.
      OPMERKING: Voordat je een Channel View aanmaakt, pas eerst de display gain en offset voor elk kanaal aan zodat het signaal van interesse het dynamisch bereik van het display overspant (sectie 2.2) en pas je deze versterkingen en offset toe met de Apply Gain en Offset knoppen in het tabblad Verwerkingen (sectie 3.2.3). Renderings zullen niet optimaal zijn als de versterkingen en offsets niet worden aangepast en toegepast.
   2. Druk op de FFColoc-knop om een kleurweergave te produceren van twee fluorescentiekanalen die als gele pixels wordt gemarkeerd, waarbij de intensiteit in beide kanalen vergelijkbaar is (binnen 25%).
      OPMERKING: Pixels met verschillende intensiteiten tussen kanalen worden weergegeven in grijstinten. Gele pixels wijzen op correlatie-gebaseerde colocalisatie⁵ wanneer het signaal van belang op elk kanaal het dynamisch bereik van het display overspant.
      WAARSCHUWING: De FFColoc-rendering is uitsluitend bedoeld voor data-exploratie of illustratiedoeleinden. Het is geen vervanging voor rigoureuze kwantificatie van colocalisatie met hulp van een expert.
   3. Druk op de FFMerge-knop om een kleurweergave te produceren van twee fluorescentiekanalen, waarbij het signaal in elk kanaal even waarneembaar is.
      OPMERKING: Bij elke pixel wordt de luminantie ingesteld volgens het signaal met de hogere intensiteit, terwijl de tint een functie is van de verhouding tussen de kanalen (volgens de concepten beschreven door Taylor et ^al.6). Zie ook de sectie Discussie.
   4. Druk op de FGMerge-knop om een kleurweergave te produceren van fluorescentiekanaal(s) en een grijstintenkanaal, waarbij de kleur van de fluorescentiekanalen behouden blijft, terwijl het contrast van het grijstintenkanaal behouden blijft.
      OPMERKING: Het grijswaardenkanaal is doorgaans een niet-fluorescerende modaliteit met morfologische informatie, zoals DIC, fasecontrast of elektronenmicroscopie.
   5. Druk op de Montage-knop om de kanalen op te splitsen in individuele afbeeldingen, ze automatisch over het scherm te tegelen en hun visualisatie te synchroniseren.
   6. Druk op de SyncWins-knop om de visualisatie van meerdere afbeeldingen van hetzelfde type te synchroniseren.
4. Maak 2D-weergaven van een 3D z- of t-stack (Display Panel, Stack Views sectie).
   OPMERKING: Elke rendering wordt weergegeven in een nieuw afbeeldingsvenster.
   1. Druk op de MIP-knop om een projectie met maximale intensiteit te creëren.
      OPMERKING: De intensiteit op elke locatie in het resulterende 2D-beeld komt overeen met de intensiteit van de meest intense pixel langs de^3e dimensie in de 3D-afbeelding. Deze procedure kan ruis accentueren, dus het kan nuttig zijn om de stack glad te maken (zie tabblad Verwerking ) voordat een MIP wordt gemaakt.
   2. Druk op de SIP-knop om een somintensiteitsprojectie te maken.
      OPMERKING: De intensiteit op elke locatie in het resulterende 2D-beeld komt overeen met de som van de intensiteiten langs de^3e dimensie in het 3D-beeld. Deze procedure behoudt de totale intensiteit, wat resulteert in een minder ruisend beeld dan bij elke enkele snee.
   3. Druk op de Ortho-knop om een orthogonale slices-viewer te creëren, die interactief de drie orthogonale vlakken van een 3D-stapel (bijv. xy, xz, yz) rendert die elkaar kruisen op de huidige cursorlocatie.
   4. Druk op de Kymo-knop om een kymograaf te maken.
      OPMERKING: Een kymograaf is een 2D-afbeelding waarbij de verticale (y-) as overeenkomt met de derde dimensie van een stack (meestal t-), en de horizontale (x-) as overeenkomt met positie langs een lijn die door de gebruiker op de invoerstack is getrokken. Wanneer de^{derde dimensie} tijd is, wordt een kymograaf gebruikt om beweging te illustreren of te kwantificeren.
      Deze knop is gebaseerd op de KymographBuilder-plugin⁷ die bij Fiji wordt geleverd, maar moet apart worden gedownload als je ImageJ gebruikt.
5. Stel diverse opties in (Display Panel).
   1. Druk op de Dup-knop om het actieve afbeeldingsvenster binnen Fiji te dupliceren. Er verschijnt een nieuw afbeeldingsvenster.
      OPMERKING: Teken een rechthoekig interessegebied (ROI) op de afbeelding met de Fiji's Rectangle ROI-tool , en de Dup-knop snijdt bij tot aan de ROI-grens. Specificeer kanaal-, z- en/of t-bereiken om de dimensionaliteit van het gedupliceerde beeld te hervormen.
   2. Druk op de ToClip-knop om de actieve afbeelding zoals die op het scherm staat te kopiëren naar het systeemklembord. Om de afbeelding in een andere applicatie te plakken (om dia's voor te bereiden of foto's te bewerken), zet je de andere applicatie actief en selecteer je plakken (Ctrl+V op Windows of Cmd+V op Mac).
   3. Druk op de |--um--| knop om een schaalbalk als overlay op de afbeelding te tonen. Schakel de |--um--| knop om de schaalbalk te verwijderen.

3. Gebruik van het EasyFiji Process-paneel

OPMERKING: Zoals weergegeven in Figuur 1B, biedt de sectie Kanaalkenmerken van het Procespaneel schuifregelaar-gebaseerde beeldverwerkingscommando's met tooltips die kunnen worden gebruikt om de beeldweergave te verbeteren. De knop 'Ongedaan maken' maakt interactieve verwerking mogelijk. Afbeeldingsafmetingen kunnen worden aangepast met de knoppen Afmetingen wijzigen. De Action Table wordt gebruikt om als platte tekst Processing-commando's te loggen die de pixelintensiteitswaarden van afbeeldingen wijzigen. Het logboek kan vervolgens automatisch worden opgeslagen met de afbeelding met dezelfde titel (zie Opslaan-paneel).

1. Verander de ruimtelijke kenmerken van een afbeelding (Procespaneel , sectie Kanaalkenmerken wijzigen ).
   OPMERKING: Alle commando's zijn alleen van toepassing op het actieve kanaal, en de resultaten worden automatisch weergegeven in het originele afbeeldingsvenster. Er wordt geen nieuw afbeeldingsvenster aangemaakt.
   1. Beweeg de Smooth-schuifregelaar om een Gaussische wascherpte toe te passen, waardoor normaal verdeelde pixel-tot-pixel variatie (~shotruis en leesruis) wordt verminderd.
      1. Voor ~Nyquist-bemonsterde afbeeldingen (70-150 nm xy pixelgrootte), begin met schuifregelwaarden tussen 1,0 en 2,0.
      2. Voor een bepaalde pixelgrootte verhoog je de schuifwaarde naarmate de signaal-ruisverhouding (SNR) van de afbeelding afneemt.
      3. Gegeven een SNR, verhoog de schuifregelaar naarmate de pixelgrootte kleiner wordt.
      4. Voor beeldstacks pas je een 3D-gladmaking toe, waarbij de z-radius automatisch wordt ingesteld op een derde van de xy-straal, zoals passend voor Nyquist-bemonsterde data.
         OPMERKING: De schuifregelwaarde komt overeen met de standaardafwijking van een Gaussiaanse kernel, gemeten in pixels.
   2. Beweeg de Denoise-schuifregelaar om een mediaanfilter toe te passen, waardoor extreme uitschieters (camera hot pixels of PMT-thermionische emissies) worden verwijderd.
      OPMERKING: De schuifregelwaarde komt overeen met de radius van een boxkernel in pixels. Waarden tussen 0,5 en 1,0 zijn een goed uitgangspunt.
   3. Beweeg de Sharpen-schuif om een 2D-onscherp masker toe te passen, waardoor de wazigheid of waas, zoals veroorzaakt door onscherp licht, wordt verminderd. Scherper maken benadrukt ook geluid.
      OPMERKING: De schuifwaarde komt overeen met de standaardafwijking van een Gaussische kernel (in pixeleenheden) die wordt gebruikt om de schaal van de waas te definiëren. Voor ~Nyquist-gesamplede afbeeldingen (70-150 nm xy pixelgrootte) zijn schuifregelaars tussen 2.0 en 4.0 een goed uitgangspunt. De gewichtsparameter is vastgesteld op 0,6.
2. Verander pixelintensiteiten van afbeeldingen (Proces Panel, Kanaalintensiteiten aanpassen sectie).
   OPMERKING: Alle commando's gelden alleen voor het actieve kanaal en de resultaten worden automatisch weergegeven in het afbeeldingsvenster. Er wordt geen nieuw afbeeldingsvenster aangemaakt.
   1. Verplaats de Sub.Bkgd.-schuifregelaar om het 'rolling ball'-algoritme toe te passen, waardoor achtergrond (d.w.z. ruimtelijk geleidelijke intensiteitsveranderingen) wordt verwijderd.
      OPMERKING: De schuifregelaar is de straal van de rollende bal in pixels, dus grotere waarden trekken minder totale achtergrond af. De waarde hangt af van de beeldinhoud, maar moet over het algemeen ≥2x groter zijn dan de grootte (gemeten in pixels) van de te behouden kenmerken. Waarden tussen 10 en 20 zijn vaak een goed beginpunt.
   2. Verplaats de Gamma-schuif om de visualisatie van zwakkere signalen gemengd met helderdere signalen te verbeteren, zoals nodig kunnen zijn om fijne structuren te benadrukken wanneer ze met grote structuren worden gemengd.
      OPMERKING: Na normalisatie wordt de waarde van elke pixel verhoogd tot een macht (exponent) gegeven door de waarde van de schuifregelaar. De waarde hangt af van de beeldinhoud, maar waarden tussen 0,6 en 0,8 zijn vaak een goed uitgangspunt.
      VOORZICHTIG: Beelden waarbij gamma is aangebracht, kunnen niet worden gebruikt voor intensiteitskwantificatie.
   3. Druk op de knop Apply Gain en Offset: ToCh, of ToAll, om het beeldbereik (zoals gespecificeerd door de displayversterkings- en offsetschuifregelaars in het displaypaneel) toe te wijzen op het volledige bereik van intensiteiten dat door de bitdiepte van het beeld wordt geleverd.
      OPMERKING: Dit proces staat ook bekend als het toepassen van de zoektabel (LUTs). De weergaveversterking en offset moeten op deze manier worden toegepast voordat kanaalweergaven in het weergavepaneel worden aangemaakt.
   4. Gebruik de Intensity Correction-knoppen om te corrigeren voor artefactual intensiteitsveranderingen over de z- of t-dimensies van 3D-beelden, zoals veroorzaakt door fotobleek, aberraties of lichtverstrooiing.
      OPMERKING: De actie wordt alleen toegepast op het actieve kanaal. Lokale en globale correcties kunnen sequentieel worden toegepast op dezelfde dataset. Zie de sectie Resultaten voor verdere uitleg van de onderliggende methoden.
   5. Druk op de Global-knoppen om te corrigeren voor geleidelijke verliezen van signaalintensiteit die optreden over de gehele z- of t-dimensie, terwijl de meeste biologisch gedreven intensiteitsveranderingen behouden blijven. Er zijn twee opties:
      1. Druk op de GlobalL-knop om z-stacks te corrigeren waarbij de eerste slices donker of zwart kunnen zijn, en het totale intensiteitsverlies van het eerste naar het laatste frame is mild (<50%). Het algoritme modelleert het intensiteitsverlies als een lineaire trend en past vervolgens een correctiefactor toe op elke snee, zodat de helling van de fitlijn nul wordt.
      2. Druk op de GlobalP-knop om tijdreeksen te corrigeren waarbij de eerste frames het helderst zijn en het totale intensiteitsverlies van het eerste naar laatste frame aanzienlijk is (50%-95%). Het algoritme modelleert het intensiteitsverlies als een^2-orde polynomiale trend en past vervolgens een correctiefactor toe op elke snede zodat de fitcurve wordt omgezet in een lijn met een helling van nul.
   6. Druk op de Local-knop om gelokaliseerde, abrupte veranderingen in signaalintensiteit te corrigeren, terwijl geleidelijke veranderingen behouden blijven.
      OPMERKING: Dergelijke veranderingen kunnen worden veroorzaakt door het bleken van enkele vlakken binnen een grotere z-stack of door fluctuaties in het excitatievermogen (flikkering). Het algoritme modelleert biologisch relevante intensiteitsveranderingen als een polynoom van de vierde orde en past vervolgens een correctiefactor toe om ervoor te zorgen dat de mediane intensiteit van elk frame gelijk is aan de waarde van de aangepaste kromme.
   7. Druk op de Equalize-knop om de mediane signaalintensiteit van elk frame gelijk te maken, vergelijkbaar met de Fiji 'simple ratio' bleekcorrectiemethode.
      WAARSCHUWING: Equalize kan nuttig zijn voor visualisatiedoeleinden wanneer alle andere methoden falen, maar het zal biologisch relevante variaties in mediane intensiteit wissen en kan dus niet worden gebruikt in combinatie met intensiteitskwantificatie.
3. Verander de dimensionaliteit van een afbeelding (Procespaneel , sectie Afmetingen wijzigen ).
   OPMERKING: Deze commando's gelden voor alle kanalen in het afbeeldingsvenster en kunnen niet worden teruggedraaid met de Ongedaan maken-knop .
   1. Druk op de Rotate-knop om de afbeelding te draaien, bijvoorbeeld wat nodig kan zijn om de anatomische assen van een embryo of weefsel op de pagina of het scherm uit te lijnen.
   2. Druk op de Crop-knop om de xy-afmetingen van de afbeelding te verkleinen. Zoek naar de rechthoekige ROI-tool die automatisch wordt geselecteerd, en let op de prompt om een ROI te tekenen op de afbeelding die voor het bijsnijden wordt gebruikt.
   3. Druk op de Subset-knop om een nieuwe image stack aan te maken uit een subset van de niet-xy dimensies van de invoerafbeelding.
      OPMERKING: Dit wordt gebruikt om kanalen te verwijderen en/of om slices in z of t af te kappen.
4. Noteer de verwerkingscommando's die op een afbeelding worden toegepast (Procespaneel, sectie Acties Recorden).
   OPMERKING: Het doel van de Action Recorder is om acties automatisch als platte tekst te registreren en vervolgens de afbeelding op te slaan met de toegepaste acties, die de pixelintensiteit veranderen. Het logboek is handig zodat de gebruiker niet handmatig aantekeningen hoeft te maken of de invoer van de Fiji-macrorecorder hoeft te ontcijferen. Commando's die de pixelintensiteit niet veranderen, worden niet gelogd.
   1. Druk op de Rec-knop om het opnemen van het commando te starten.
      OPMERKING: Het knopoppervlak geeft 'AAN' aan wanneer de recorder opneemt. Uitgevoerde commando's en bijbehorende parameters verschijnen in de Actietabel. Commando's die 'ongedaan' zijn, worden uit de tabel verwijderd.
   2. Druk op de Clr-knop om de Actietabel te verwijderen.
   3. Druk op de opslaan-knop om de Actietabel als tekstbestand op te slaan. Als acties die op meerdere afbeeldingen zijn toegepast zijn vastgelegd, worden deze acties gegroepeerd op basis van de afbeeldingstitel wanneer het tekstbestand wordt opgeslagen.
      OPMERKING: Of sla een afbeelding op via het opslaan-paneel (sectie 4 hieronder). Vink het vakje Save Actions aan en alle acties die op de afbeelding worden toegepast, worden automatisch opgeslagen als tekstbestand met de naam en het pad van het bestand.

4. Het gebruik van het EasyFiji Save Panel

OPMERKING: Zoals weergegeven in Figuur 1C is het opslaan-paneel ontworpen om niet-experts te helpen bij het kiezen van het juiste afbeeldingsbestandsformaat voor hun beoogde toepassing. Wanneer het selectievakje Save Actions is aangevinkt, worden alle verwerkingsacties die op een afbeelding worden toegepast, zoals vermeld in de Actietabel, automatisch opgeslagen met de afbeelding, met dezelfde bestandsnaam en pad, maar dan met een extensie *.txt. Als meerdere afbeeldingen open zijn en parallel zijn verwerkt, worden alle acties die op alle afbeeldingen zijn uitgevoerd weergegeven in de Actietabel. Echter, alleen de acties die op de opgeslagen afbeelding worden toegepast, worden met die afbeelding opgeslagen. Het opgeslagen tekstbestand verschijnt in het bestandssysteem maar opent niet in Fiji. Indien gewenst kunnen tekstbestanden in Fiji worden geopend door het bestandsicoon naar de Fiji-werkbalk te slepen.

1. Sla een afbeelding op (Paneel opslaan , sectie Methoden opslaan ).
   1. Druk op de knop Raw Data om de afbeelding als een *.tif-bestand op te slaan, waarin exacte pixelwaarden, kanaalstructuur en wat metadata behouden blijven. Gebruik deze optie wanneer het doel is om een afbeelding verder te kwantificeren of te analyseren.
   2. Druk op de knop Opslaan voor presentatie om de afbeelding op te slaan zoals die momenteel wordt weergegeven met jpeg-compressie voor e-mail of gebruik in een diapresentatie.
      WAARSCHUWING: Deze optie mag nooit worden gebruikt voor het maken van cijfers of voor kwantitatieve analyse.
   3. Verplaats de Quality Level-schuifregelaar om het JPEG-compressieniveau in te stellen.
      OPMERKING: Grotere waarden komen overeen met een betere behoud van pixelintensiteiten en -features (en een grotere bestandsgrootte), maar nooit alle features worden behouden.
   4. Druk op de knop 'Figur opslaan ' om de afbeelding op te slaan zoals die momenteel wordt weergegeven in png-formaat dat compatibel is met andere grafische programma's (bijv. Photoshop, Illustrator, Publisher of GIMP). De afbeelding wordt opgeslagen zoals weergegeven op het scherm, maar kanalen en metadata worden niet behouden.
      VOORZICHTIG: Deze optie mag nooit worden gebruikt voor kwantificatie.
   5. Druk op de knop Opslaan als film om een afbeeldingsstapel op te slaan als een mov-formaat film die de segmenten sequentieel afspeelt (z of t).
      OPMERKING: Het afspelen van mov-bestanden op een Windows-gebaseerd besturingssysteem vereist de open source VLC Media Player.

5. Gebruik van het EasyFiji Image Info-paneel

OPMERKING: Zoals weergegeven in Figuur 1D, toont het Image Info-paneel platte tekstinstellingen voor leveranciersspecifieke acquisitie die cruciaal zijn voor beeldinterpretatie. Zie Tabel 2 voor een lijst van de typen confocale beeldformaten die momenteel worden ondersteund.

1. Druk op de Channel Info-knop om de acquisitie-instellingen te laden.
2. Zie de sectie Channel Info voor kanaalspecifieke acquisitie-instellingen, waaronder % laservermogen, lasergolflengte, emissiebandpass(en), versterking en pinhole-grootte.
3. Zie de sectie Systeemconfiguratie voor beeldbrede instellingen, waaronder system naam, doel, scanmodus, dwell-tijd en voxelgrootte.

Results

Pseudo-gekleurde weergaven van multikanaals fluorescentiebeelden kunnen worden gebruikt om de ruimtelijke of intensiteitsrelaties tussen signalen te illustreren; echter, het oorspronkelijke Fiji biedt alleen een RGB-composietrenderingstechniek die van nature kleur- en helderheidsniveau op perceptueel niveau verstoort. Om dit probleem te illustreren, gebruikt Figuur 2 een tweekanaalsafbeelding van N-Myc en RNA Polymerase II (RNAPolII). In

Discussion

Fiji is een open-source beeldverwerkings- en analysesoftware die zeer populair is onder beeldanalisten. De complexe menu-interface en soms onlogische gedragingen met betrekking tot het weergeven en verwerken van fluorescentiebeelden vormen echter uitdagingen voor niet-computationele levenswetenschappers. EasyFiji biedt life scientists een zorgvuldig georganiseerde set thematisch georganiseerde en tooltip-versterkte knoppen en schuifregelaars die consequent kanaalspecifiek gedrag vertonen...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
EasyFiji GitHub Site	Open Source		https://github.com/stjude/EasyFiji
EasyFiji Image.sc forum	Open Source		https://forum.image.sc/t/announcing-easyfiji-a-user-friendly-gui-plugin-for-fiji/117617
EasyFiji ImageJ.net site	Open Source		https://imagej.net/plugins/EasyFiji_plugin#quick-start
FIJI Software	Open Source		https://imagej.net/software/fiji/downloads
VLC Media Player	Open Source		https://www.videolan.org/vlc/