Methodenartikel

Een vergelijkende benadering voor kwantitatieve celtellingsstudies in zeer verschillende zoogdierhersenen

DOI:

10.3791/69446

⸱

16 januari 2026

 ,  ,  ,  , 
1Neuroscience Institute Cavalieri Ottolenghi, 2Department of Veterinary Sciences, University of Turin, 3Department of Anthropology and Center for the Advanced Study of Human Paleobiology, The George Washington University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Moderne neurowetenschappen moeten verschillen onderzoeken tussen veel soorten, waaronder laboratoriumknaagdieren en mensen. Toch ontstaan er technische problemen wanneer groothersenzoogdieren betrokken zijn. Deze benadering richt zich op intersoortelijke variatie van neuronale populaties bij zeer verschillende zoogdieren, wat vergelijkbare resultaten oplevert die in kaart kunnen worden gebracht om evolutionaire patronen te onthullen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De meeste neurobiologische studies worden uitgevoerd op laboratoriumknaagdieren. Ondanks veel overeenkomsten tussen zoogdierhersenen bestaan er ook belangrijke verschillen, die misleidend kunnen zijn in de vertaling. Duidelijke verschillen tussen soorten zijn gevonden in hersenplasticiteit, met name neurogenese. Verschillende neurogene processen kunnen veel voorkomen door evolutionaire afwegingen, waarbij variatie tussen hersenstructuren en zoogdieren wordt getoond en het potentieel voor plasticiteit verschuivt bij uiteenlopende soorten, zoals muizen en mensen. Het vergelijken van sterk verschillende soorten roept meerdere kwesties op: vergelijkende studies ondervinden technische moeilijkheden wanneer grote hersenen betrokken zijn; Het gebruik van heterogene experimentele benaderingen door verschillende laboratoria kan de vergelijking van resultaten beperken; Heterogeniteit kan verband houden met verschillende tijdsverloop van neuro-ontwikkelingsprocessen bij zoogdieren, waardoor variabelen aan de vergelijking worden toegevoegd.

Om deze beperkingen aan te pakken, werd een benadering ontwikkeld om de intersoortvariatie van een populatie van laag II-corticale onvolwassen neuronen bij zoogdieren te bestuderen die sterk verschilden in hersengrootte, gyrencefalie, socio-ecologische niche en leeftijd. Ondanks enkele variabelen die niet volledig gestandaardiseerd kunnen worden, wordt een methode voorgesteld die verminderde heterogeniteit bij het verzamelen van hersenen combineert met het vaststellen van gemeenschappelijke anatomische structuren als referentiepunten voor het tellen van cellen op overeenkomstige hersenniveaus. Verkregen gegevens (bijv. celdichtheden) kunnen worden gekoppeld aan fylogenetische bomen om evolutionaire patronen te onthullen en geanalyseerd op covariantie met neuroanatomische kenmerken (bijv. hersengrootte, corticaal oppervlak). Deze benadering heeft opmerkelijke variatie aangetoond in het aantal corticale onvolwassen neuronen tussen fylogenetische groepen en covariatie met hersengrootte ontdekt. De methode kan ook worden gebruikt om verschillen te kwantificeren in verschillende ontwikkelingsstadia binnen dezelfde soort en kan worden uitgebreid naar andere diverse zoogdieren en biologische processen om vergelijkbare resultaten in kaart te brengen die een nauwkeurigere kwantificering van verschillende celpopulaties in volwassen hersenen mogelijk maken ter ondersteuning van plasticiteit.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neurowetenschappelijk onderzoek gebruikt grotendeels inteeltmuizen en ratten om resultaten naar mensen te vertalen. Ondanks veel moleculaire, cellulaire en zelfs anatomische overeenkomsten bestaan er ook belangrijke intersoortelijke verschillen, wat misleidend kan zijn voor de interpretatie van preklinische gegevens 1,2. Hoewel vergelijkende studies nodig zijn, worden ze belemmerd door technische en praktische moeilijkheden wanneer grote hersenen betrokken zijn (bijvoorbeeld van een gemiddelde van 0,5 g bij muizen naar 1300 g bij mensen; Figuur 1A). Bovendien kunnen heterogene experimentele benaderingen door verschillende laboratoria de vergelijking van resultaten, vooral kwantitatieve analyses, beperken, wat soms controverses oproept. Dit is het geval van structurele plasticiteit van de hersenen, met speciale aandacht voor neurogene processen 3,4,5, een onderwerp dat van belang is voor het begrijpen van ontwikkelingsneuroplasticiteit en hersenreparatie 6,7.

Recente ontdekkingen op het gebied van hersenplasticiteit suggereren sterk dat er tijdens de evolutie aanzienlijke verschillen zijn ontstaan in het voorkomen, de snelheid en de anatomische locatie van verschillende typen neurogene processen8. Een voorbeeld hiervan is de duidelijke afname van stamcelgedreven neurogenese bij volwassen groothersenzoogdieren vergeleken met laboratoriumknaagdieren 5,9,10, waarschijnlijk gekoppeld aan verschillende uitbreiding van hersengebieden en functioneren als aanpassing aan ecologische druk 7,8, evenals aan verschillende neuro-ontwikkelingstijdverloop11,12. De snelheid van neurogenese lijkt aanzienlijk te verschillen tussen muizen en mensen, wat de kwestie van vertaling13 oproept.

Aan de andere kant is een nieuw soort "neurogenese zonder deling" vertegenwoordigd door neuronen die geblokkeerd zijn in gestopte rijping (zogenaamde onrijpe of sluimerende neuronen 14,15,16,17,18,19) verondersteld te stijgen van kleinhersenen naar groothersenen soorten 20,21. Interessant is dat de stamcelonafhankelijke populatie van onvolwassen neuronen zich bevindt in de hersenschors (een locatie van hoge-orde cognitie bij gyrencefale soorten22,23) en ver van de canonieke neurogene locaties, die vooral verbonden zijn met olfactie en ruimtelijke navigatie, die van groot belang zijn bij lissencephalische soorten 7,8. Deze verschillen tussen hersenstructuren en zoogdiersoorten gaan verder dan puur vergelijkende interesse, omdat ze relevant kunnen zijn in vertaling door het potentieel voor plasticiteit bij muizen en mensen te verschuiven. Om deze redenen is het cruciaal om op een "vergelijkbare manier" te beoordelen in hoeverre de verschillen een fylogenetische variatie vertegenwoordigen bij zeer verschillende zoogdieren, met speciale aandacht voor laboratoriumknaagdieren en primaten.

Een recent ontwikkelde benadering om de intersoortvariatie van een populatie van laag II corticale onvolwassen neuronen (cIN's) bij zoogdieren te bestuderen die sterk verschillen in hersengrootte, gyrencefalie en socio-ecologische niche 22,24,25 wordt beschreven. Deze methode is gebaseerd op drie principes: i) het overwegen van verschillende (diverse) zoogdiersoorten die parallel verwerkt worden met dezelfde procedures; ii) het minimaliseren van variabelen die niet volledig gestandaardiseerd kunnen worden in zeer verschillende hersenen (fixatieprocedure, postmortale interval, leeftijd) en het aanpakken van de soortspecificiteit van antilichamen voor immunocytochemie door gebruik te maken van breed gedeelde kenmerken van de celpopulatie die wordt bestudeerd als interne positieve controles; en iii) het vaststellen van overeenkomstige anatomische structuren als referentiepunten voor het uitvoeren van celtelling op overeenkomstige hersenniveaus van verschillende soorten (Figuur 1B en Figuur 2). Gegevens verkregen (bijv. celdichtheden) door het tellen van cellen die zijn geïdentificeerd met de goed gevestigde marker doublecortin (DCX 15,17,26) kunnen worden gemapt op fylogenetische bomen om evolutionaire patronen te onthullen en geanalyseerd op covariantie met verschillende parameters, zoals hersengrootte, gyrencefalie en corticale oppervlakte.

Figuur 1
Figuur 1: Verwerking van zeer verschillende zoogdierhersenen om de verspreiding en hoeveelheid cIN's in de corticale mantel te beoordelen. (A) Zoogdieren die tot verschillende soorten en orden behoren, worden gekenmerkt door sterk verschillende hersengroottes en graden van gyrencefalie en corticale expansie. Brain-iconen gereproduceerd met de BioRender-licentie. (B) Representatieve Toluidineblauw gekleurde coronale doorsneden gesneden uit hersenen van zeer verschillende grootte en corticale mantelverlenging. Histologisch gekleurde seriële doorsneden (cryostat-snit, coronal, 40 μm dik) worden gebruikt om de belangrijkste neuroanatomische structuren van elke diersoort te identificeren (zie Figuur 3); Let op de opmerkelijke verschillen in hersengrootte en corticale omtrek. De diereniconen in paneel A zijn met toestemming van La Rosa et al.22 gereproduceerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Ten slotte, aangezien alle plastische processen over het algemeen progressief afnemen met de leeftijdvan 27,28 jaar, is een extra kwestie in vergelijkende neuroplasticiteit het beoordelen van de verschillende tijdsverloop van zo'n reductie, die mogelijk gerelateerd zijn aan verschillende tijdsverloop van neuroontwikkelingsprocessen bij zoogdieren 12,29,30. Sterker nog, het bestaan van snelrijpende (muis) versus langzaam rijpende soorten (primaten) is een andere reden waarom het meest voorkomende modelsysteem, de laboratoriummuis, beperkt is in het oplossen van uitdagingen in de biomedische wetenschappen. De hier beschreven methode kan ook nuttig zijn om celpopulaties op verschillende leeftijden over de levensduur van elke soort te bekijken en vervolgens de resulterende trends tussen soorten te vergelijken. Fylogenetische variatie in de cIN-dichtheid, evenals verschillen in hun persistentie door de leeftijd heen, werden gevonden tussen kleinhersenen en groothersenen22,28.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle dierbehandelingen voldeden aan de relevante nationale en institutionele regelgeving. Muizenweefsels werden verkregen van het Neurowetenschappelijk Instituut Cavalieri Ottolenghi (NICO), Orbassano, Italië, met toestemming van het Italiaanse Ministerie van Volksgezondheid (RRID: MGI:3696370), met dank aan Serena Bovetti en Charles River Laboratories. Naakte molrattenweefsels werden direct na euthanasie verzameld aan de Queen Mary University of London (VK) volgens Schedule 1 van de Animals (Scientific Procedures) Act 1986. Konijnenexperimenten volgden de Europese Gemeenschappen Richtlijn 86/609/EU en de Italiaanse wetgeving (DL.vo 116/92), met goedkeuring van het Italiaanse Ministerie van Volksgezondheid (autorisatie 66/99-A). Schapen- en paardenhersenen werden postmortaal verkregen uit een commercieel slachthuis onder Richtlijn 86/609/EEG en continue veterinaire supervisie. Hondenhersenen werden postmortem geleverd door MarshallBio Laboratories (Lyon, Frankrijk) met de benodigde autorisaties; kattenhersenen werden postmortem verzameld aan de Universiteit van Padua tijdens routinematige diagnostische necropsies met toestemming van de eigenaar. Alle procedures volgden EU- en Italiaanse wetgeving. Chimpanseemonsters werden behandeld volgens de internationale richtlijnen van de Council for International Organizations of Medical Sciences (CIOMS) en volgens vergunning A5761-01 van National Institutes of Health-Office of Laboratory Animal Welfare (NIH-OLAW) (voor details over elke diersoort en experiment zie aanvullende tabel 1 en referentie 22,25).

1. Hersenen verzamelen

  1. Verzamel hersenen direct of van andere instellingen en weefselbanken, maar beschouw alleen de hele hersenronden. Stel samen met de instellingen de beste procedure op om hersenen uit de diersoort te halen, met oog op het verminderen van de schade aan de halfrond en het waarborgen van het minimale postmortale interval (PMI, zie NOOT hieronder) en snelle onderdompeling in de fixatieve oplossing na extractie.
    OPMERKING: Afhankelijk van de gevoeligheid van het betreffende antilichaam, wees je bewust van de PMI. Gezien de hoge gevoeligheid van doublecortin (DCX) voor degradatie, verzamel monsters met een PMI-bereik van 0-1 uur (behalve de chimpansee, die tot 14 uur PMI heeft, wat echter geen verandering in de kleuringskwaliteit veroorzaakte, Aanvullende Tabel 1).
  2. Gezien de grote variabiliteit in de levensduur van het dier, bepaal vooraf welke leeftijdsgroepen onder de verschillende zoogdieren die voor het onderzoek worden overwogen, om vergelijkbare gegevens te verkrijgen.
    1. Voor dit studieontwerp en om vergelijkbare leeftijdsgroepen vast te stellen, analyseer je informatie uit twee databases over diergeschiedenis en diversiteit: AnAge, een samengestelde database over veroudering en levensgeschiedenis bij dieren, en Animal Diversity Web, een online database over dierennatuurgeschiedenis, verspreiding, classificatie en natuurbeschermingsbiologie.
    2. Verdeel de levensduur van het dier in vier stadia (één prepuberaal en drie postpuberaal, namelijk "volwassen"), beginnend bij de classificatie door de American Veterinary Medical Association (AVMA) voor levensstadia bijhonden 31, waarbij de levensduur werd verdeeld in zes stadia: puppy, junior, volwassen, volwassen, senior, senior en geriatrisch.
    3. Door de senior- en geriatrische stadia te verdichten, en de volwassen en volwassen stadia, wordt deze terminologie toegepast: prepuberaal, jongvolwassen, middelbare leeftijd en senior/leeftijd22.

2. Fixatie en verwerking van hersenweefsel

OPMERKING: Fixatieprocedures kunnen verschillen afhankelijk van hersengrootte en ethische zorgen met betrekking tot bepaalde diersoorten (de meeste groothersenprimaten of paarden kunnen niet worden geprofundeerd en moeten na extractie worden vastgelegd door onderdompeling in de fixatieoplossing).

  1. Houd de hersenen volledig ondergedompeld in fixatieve oplossing (4% paraformaldehyde of 10% formaline wordt aanbevolen).
    OPMERKING: De tijd van fixatie varieert afhankelijk van de hersengrootte (bijv. 3 weken voor de hersenen van honden; 3 maanden voor het brein van paarden, Aanvullende Tabel 1). Vermijd een lage of overmatige tijd in de fixatieve oplossing om de integriteit van het betreffende antigeen te behouden.
  2. Snijd de gewenste hersenhelft in gelijke plakken (1-1,5 cm dik) met een liniaal (om een rechte snede uit te voeren) en een steekmes.
  3. Dompel hersenplakjes onder in fosfaatbuffer (PB) 0,1 M (28,49 g natriumfosfaatdibasisk en 7,8 g natriumfosfaatmonobas opgelost in gedestilleerd water, pH 7,4) en bewaar ze 24 uur onder zachte roering op een shaker. Indien nodig (zie NOOT hieronder), gooi de oplossing weg en vervang deze de volgende dag door een verse oplossing van PB 0,1 M, pH 7,4.
    OPMERKING: Het volume en aantal wasbeuten in PB 0,1 M variëren afhankelijk van de hersengrootte (bijv. 30 minuten voor muizenhersenen, 3 dagen voor paardenhersenen). Zorg ervoor dat de hersenen volledig in PB 0,1 M zijn ondergedompeld en dat formaline, bloed en weefselafval niet meer aanwezig zijn om washing te stoppen.
  4. Cryoprotect de plakjes door ze onder te dompelen in sucroseoplossingen met geleidelijk toenemende concentratie (10%, 20%, tot 30%) in PB 0,1 M, pH 7,4, en ze voorzichtig te laten bewegen op een shaker.
    OPMERKING: Het volume van sucroseoplossingen varieert afhankelijk van de hersengrootte. Zorg ervoor dat hersenen volledig in sucroseoplossingen zijn ondergedompeld en volledig zinken voordat ze in een verhoogde sucroseconcentratie worden gebracht.

3. Cryostaat snijden in het hele halfrond

  1. Verwijder hersenvliezen uit de hersensneden met een gebogen pincet om problemen tijdens het snijden te voorkomen.
  2. Doe de plakjes in inbeddingsmallen gevuld met optimale snijtemperatuur (OCT) compound. Als de plak de embedding-mal niet vult, snijd dan een vierkant stuk Parafilm dat iets groter is dan de hersenschijf en voeg OCT-medium toe aan het midden van het stuk, waarna je de plak bovenop de OCT legt.
  3. Bevries de plak door onderdompeling in 300 mL vloeibare stikstofgekoelde isopentaan bij -50 °C totdat het OCT-medium volledig wit wordt. Hersensneetjes kunnen op -80 °C worden bewaard voor langdurige opslag tot het snijden.
  4. Houd voor het doorsnijden van de hersenschijf minimaal 5 uur op -20 °C zodat het weefsel langzaam en homogeen dezelfde temperatuur als de cryostaat kan bereiken.
  5. Snijd de snee in 40 μm dikke seriële coronale secties met behulp van een cryostaat, waarbij een binnenkamertemperatuurbereik van -20 °C tot -25 °C wordt behouden.
  6. Verzamel vrij drijvende secties in 12-wellplaten en bewaar ze in cryoprotectieve oplossing (150 mL glycerol, 150 mL ethyleenglycol, 150 mL gedestilleerd water en 50 mL F-buffer [1,682 g natriumfosfaat monobase dihydraat en 0,385 g natriumhydroxide opgelost in gedestilleerd water, pH 7,4]) (1 mL/put, of meer om de secties volledig te bedekken bij grote hersenen) bij -20 °C tot de kleuring.
    OPMERKING: Sneden van het hele halfrond variëren afhankelijk van de hersengrootte. Grotere hersenen (bijv. chimpansees, paarden) moeten worden verdeeld in twee gelijke blokken (dorsaal en ventraal) om in de cryostaat verwerkt te worden. In dit geval kunnen vrijdrijvende secties worden verzameld in twee platen met 6 putjes. Een alternatief is het doorsnijden van hemisferen van groothersenige soorten met een schuifmicrotoom, waardoor grotere blokken mogelijk zijn.

Figuur 2
Figuur 2: Het verwerken van sterk verschillende hersenen volgens dezelfde procedure en het omgaan met variabelen die niet gestandaardiseerd kunnen worden. In de hierboven beschreven methode worden alle gestandaardiseerde procedures op dezelfde manier uitgevoerd (algemene fixatie, het snijden van seriële coronale secties van dezelfde dikte in het hele halfrond, algemene immunocytochemische procedures, celtelling). Figuur gemaakt met BioRender (https://app.biorender.com/). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

4. Histologische kleuring

  1. Kies seriële coronale secties (1 sectie van de 12). Om deze afstand te verkrijgen, kies je alle secties van één put uit de 12-put plaat. Gebruik ze om een volledige weergave van het hele halfrond te verkrijgen en als referentie om coronale doorsneden te selecteren op verschillende vergelijkbare hersenniveaus tussen de verschillende bestudeerde soorten (zie sectie 5). Bevestig ze op 1% gelatiniseerde glaasjes. Laat ze een paar uur drogen.
  2. Bereid de volgende oplossingen voor (150 mL/oplossing): ethanol 50%, 70%, 96%, 100%, Xylol en Toluidine Blue.
  3. Kleuringsprotocol: Plaats de glaasjes in toenemende concentraties ethanol (50%-100%), 1 minuut elk bij 50%-70%, 2 minuten elk bij 96%-100%, en vervolgens 1 minuut over in een xyloloplossing.
  4. Plaats de glaasjes in omgekeerde volgorde: xyoloplossing gedurende 1 minuut en daarna dalende concentraties ethanoloplossingen (100%-50%), 2 minuten elk op 100%-96%, 1 minuut elk op 70%-50%.
  5. Plaats de glaasjes in 150 mL gedistilleerd H2O (2 min).
  6. Plaats de dia's in de Toluidine Blue-kleuroplossing (5-10 minuten). Na deze stap verschijnen gekleurde delen donkerblauw.
    OPMERKING: De tijd waarop secties in de oplossingen voor histologische kleuring worden bewaard, kunnen verschillen afhankelijk van de soort. Test hersensecties van de betreffende soort om het optimale kleuringsprotocol vast te stellen.
  7. Spoel de slides 1 minuut af met 150 ml gedestilleerd H2O.
  8. Ga verder met de differentiatiestap door de glaasglaasjes in toenemende concentraties ethanol (70%-100%) te plaatsen gedurende 1 minuut bij 70%, 2 minuten elk bij 96%-100%, en vervolgens over te brengen naar een xyloloplossing voor 1 minuut en 30 seconden. Tijdens deze stappen verschuiven de secties van donkerblauw naar hemelsblauw.
  9. Zorg dat de secties nog nat zijn na de laatste xyolstap voordat je het deksel doorschuift met montagemedium (als ze drogen, spoel ze dan 5 seconden af in een xyoloplossing). Laat de slides daarna een paar dagen drogen.

5. Hersenniveauselectie en immunohistochemische kleuring

  1. Met behulp van de histologisch gekleurde secties uit sectie 4 als referentie, identificeer hersenniveaus op basis van specifieke neuroanatomische kenmerken: Niveau 1 (L1) - van de voorste opening van de laterale ventrikel tot L2; Niveau 2 (L2) - van het voorste begin van de interne capsule tot L3; Niveau 3 (L3) - van het voorste begin van de amygdala tot L4; Niveau 4 (L4) - van posterieure sluiting van de laterale ventrikel tot een extensie gelijkwaardig aan die van L2 (hetzelfde aantal seriële doorsneden van 40 μm dik; Figuur 3).
    OPMERKING: De hierboven genoemde neuroanatomische referenties hebben als doel de vergelijking mogelijk te maken van de hersenschors van hersenen van zeer verschillende grootte en gyrencefalie. Afhankelijk van het hersengebied van belang kunnen de anatomische kenmerken die als referentie worden gebruikt, veranderen.
  2. Kies drie gelijk verdeelde coronale secties van elk hersenniveau.
    OPMERKING: Het volume van elke buffer die in de volgende stappen wordt gebruikt, varieert afhankelijk van de hersengrootte (bijv. 0,5 mL/put voor muizensecties, 1,5 mL/put voor paardensecties). Zorg ervoor dat de vrij zwevende secties volledig door elke buffer worden bedekt.
  3. Was secties drie keer in PBS 0,01 M, pH 7,4, elk gedurende 5 minuten.
  4. Incubeer secties in endogene peroxidaseblokkerende oplossing (0,6% H2O2, 1% Triton X-100 in 0,01 M PBS, pH 7,4; 20 min) of voer antigeenwinning uit met citroenzuur (10 mM citroenzuur in gedestilleerd water aangevuld met 0,05% Tween 20, pH 6,0), 5 minuten bij 90 °C.
    OPMERKING: Afhankelijk van de fixatieprocedure/-tijd en het geïnteresseerde antigeen kan een antigeenpunctie nodig zijn om optimale kleuring te verkrijgen (buffer, temperatuur, pH en incubatietijd kunnen variëren afhankelijk van het geïnteresseerde antigeen).
  5. Was secties opnieuw in PBS 0,01 M, pH 7,4 (3 x 5 minuten wasbeurten).
  6. Incubeer secties in blokkerende oplossing (1-5% bovin serumalbumine (BSA), normaal serum, 1-1,5% Triton X-100 in 0,01 M PBS, pH 7,4; 90 min bij RT).
  7. Incubeer secties met primaire antistofoplossing (1-5% BSA, 2-3% normaal serum, 1-1,5% Triton X-100, primaire antistof in 0,01 M PBS, pH 7,4; 48 uur bij 4 °C onder zacht roeren).
    OPMERKING: Antilichamen tegen het geïnteresseerde antigeen kunnen verschillende resultaten geven qua kwaliteit van kleuring wanneer ze worden gebruikt in verschillende hersengebieden en bij verschillende soorten26. Een vergelijking tussen een set antilichamen van verschillende fabrikanten is nodig om het optimale instrument te kiezen dat gebruikt wordt in de verschillende soorten die voor de studie worden overwogen (om variabiliteit tussen monsters te verminderen).
  8. Herhaal de wasstap zoals beschreven in stap 5.3.
  9. Incubeer secties met secundaire biotinyleerde antilichaamoplossing (1-5% BSA, 2-3% normaal serum, 1-1,5% Triton X-100, secundair biotinyleerd antilichaam in 0,01 M PBS, pH 7,4; 2 uur bij RT).
    OPMERKING: De avidin-biotineperoxidase-complex methode wordt gebruikt voor het tellen van cellen op Neurolucida (zie sectie 6), omdat deze een dichte, langdurige neerslag geeft, waardoor scherpstellen door de dikte van de sectie heen kan worden tijdens het tellen. Immunofluorescentie- en confocale analyse kunnen ook worden gebruikt om dubbele/drievoudige immunokleuring uit te voeren om de cellen verder te karakteriseren (voor protocollen, zie Ref.22,25,32).
  10. Bereid avidin-biotine-peroxidasecomplex voor met behulp van de beschikbare kit.
    OPMERKING: Bereid avidine-biotineperoxidase-complexoplossing in Tris-HCl 0,05 M, pH 7,5 (die een stabiele pH biedt voor complexvorming) minstens 1 uur voor gebruik om complexvorming mogelijk te maken.
  11. Was secties twee keer in PBS 0,01 M, pH 7,4 (2 x 5 minuten wasbeurten), en één keer in Tris-HCl 0,05 M, pH 7,5 (5 min).
    OPMERKING: Omdat het avidine-biotine-peroxidasecomplex in oplossing is met Tris-HCl 0,05M, maakt spoelen met Tris-HCl 0,05 M het toepassen van het weefsel aan de oplossing.
  12. Incubeer secties in een avidin-biotine-peroxidasecomplex (1 uur bij RT).
  13. Wassecties in Tris-HCl 0,05 M, pH 7,5 (3 x 5 minuten wasbeurten).
  14. Onder een dampkap incubeer je secties in een 3,3'-diaminobenzidine (DAB) kleuringsoplossing (H2O2, DAB in Tris-HCl 0,05 M, pH 7,5) totdat de optimale kleuring is verkregen. Tijdens deze stap veranderen de secties van een transparante naar een bruin/bordeauxrode kleur.
    OPMERKING: De tijd om de optimale kleuring te verkrijgen varieert afhankelijk van de geanalyseerde soort (bijvoorbeeld bij DCX, 2-5 minuten voor muizensecties, 20-30 minuten voor paardensecties). Controleer elke 2 minuten de vlekken van de secties om overvlekken te voorkomen.
  15. Wassecties in PBS 0,01 M, pH 7,4 (3 x 5 minuten wasbeurten).
  16. Bevestig secties op een slide, als ze droog zijn, bedek je met een coverslip met montagemedium en laat de slides een paar dagen drogen.

Figuur 3
Figuur 3: Vaststellen van neuroanatomische hersenniveaus voor de studie van DCX+ onvolwassen neuronverdeling en -hoeveelheid in de hersenschors. Vier overeenkomstige neuroanatomische structuren (anterieure start van de laterale ventrikel [niveau 1, L1]; anterieure start van de interne capsule [L2]; anterieure start van de amygdala [L3]); achterste sluiting van de laterale ventrikel [L4]; aangeduid door rode cirkels) werden beschouwd als het vaststellen van vier overeenkomstige anterieure tot posterieure "hersenniveaus" bij alle onderzochte zoogdieren, om het cIN-getal in de cerebrale cortex op een "vergelijkbare" manier te bestuderen. (A) Een voorbeeld wordt gegeven voor laboratoriumknaagdieren (muis, links) en primaten (chimpansee, rechts). Drie coronale secties van elk hersenniveau (in totaal 12 secties; rode pijlpunten) worden overwogen voor celtelling over de gehele perimeter van laag II van elke coronale sectie (OPMERKING: alle secties bevatten neocortex, terwijl slechts enkele daarvan ook paleocortex bevatten). Deze benadering is erop gericht de analyses uit te voeren op corresponderende neuroanatomische niveaus in hersenen die sterk variëren in grootte. (B) Er wordt een voorbeeld gegeven voor de identificatie van het eerste niveau (L1) in histologisch gekleurde secties van zeer verschillende zoogdiersoorten. Hersen- en diericonen gemaakt met BioRender. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

6. Celtelling

  1. Open de Neurolucida-software op het werkstation en plaats de diparaat onder de microscoop met het geselecteerde doel voor celtelling.
    OPMERKING: Voor DCX+ celtellingen werd een 20x doel gebruikt.
  2. Bij lage vergroting (bijv. 4x) tekent u de omtrek van corticale laag II met het Freehand contourlijn-instrument in het Trace-menu van de software, om de lengteperimeter te verkrijgen (zowel paleocortex als neocortex).
  3. Selecteer de voorkeurssymbolen voor celtelling op de Markers-werkbalk, aanwezig aan het linkerdeel van het scherm. Voor deze analyse telt je verschillend twee verschillende cellen in elk interessegebied (paleocortex, neocortex) afhankelijk van hun morfologie (overeenkomend met verschillende rijpingstoestanden: type 1, met een kleine soma en een bipolaire vorm, soma diameterbereik van 3-9 μm; type 2, met een grotere soma en een complexe dendritische arborisatie, soma diameterbereik van 9-18 μm).
    OPMERKING: Voor deze analyse worden twee verschillende symbolen/celtypen geselecteerd voor elk regio van belang op de Markers-werkbalk. Het verdelen van de diameter van de soma in verschillende bereiken is cruciaal om de cellen nauwgezet te categoriseren zonder duidelijke morfologie, die zich mogelijk in een tussenstadium van rijping bevinden. Om overtelling te voorkomen, worden cellen die aan het bovenste oppervlak van de sectie zijn gesneden, uitgesloten van de analyse.
  4. Verzamel de gegevens voor de fylogenetische analyse uit drie verschillende regio's: paleocortex, neocortex en cerebrale cortex (de laatste verkregen door gegevens uit paleo- en neocortex op te tellen).
  5. Verzamel in een spreadsheetbestand de corticale laag twee perimeter (mm), die zichtbaar is in de Contour Measurements-toolbar van de software.
  6. Verzamel in dezelfde spreadsheet het aantal type 1- en type 2-cellen (zichtbaar in de Markers-werkbalk) en het totale aantal cellen (verkregen door het optellen van type 1 en type 2 cellen) in elk beschouwd hersengebied en hersenniveau (drie secties per niveau, in totaal 12 secties per specimen).
  7. Gebruik deze gegevens om voor elke sectie in elke regio de lineaire celdichtheid (aantal cellen/mm) en het percentage type 1- en type 2-cellen (type 1/type 2 celaantal gedeeld door het totale aantal cellen en vermenigvuldigd met 100) te verkrijgen.
  8. Bereken de mediane dichtheidswaarde (met behulp van de mediaanfunctie in de spreadsheet) van de 12 beschouwde secties/specimen, om de lineaire celdichtheid grafisch weer te geven. Gebruik de mediaan als centrale maat omdat de steekproef per groep relatief klein is (4 dieren per groep), en sommige groepen asymmetrische verdelingen vertonen (mediaan wordt minder beïnvloed door extreme waarden).
  9. Bereken het percentage type 1- en 2-cellen in elk exemplaar (met behulp van de hierboven beschreven formule) en verkrijg vervolgens de gemiddelde waarde van de percentages tussen de vier beschouwde exemplaren/soorten (met behulp van de Gemiddelde functie in de spreadsheet). Gebruik vervolgens de lineaire celdichtheid om fylogenetische analyses uit te voeren (zie sectie 7), en gebruik het totaal aantal cellen in elke coronale sectie om het totale aantal onvolwassen neuronen/hemisferen te schatten.
  10. Gebruik de Freehand contour-tool van Neurolucida Software om een lijn te trekken over de diameter van de soma loodrecht op de hoofdas. Door deze stap uit te voeren, bereken je de diameterlengte van ten minste 100 willekeurig geselecteerde DCX-positieve (DCX+) cellen van beide typen in elke soort (25 cellen/specimen) in elk hersengebied, om het soma-diameterbereik van type 1- en type 2-cellen te verkrijgen.

7. Fylogenetische analyses: Fylogenetische boomgeneratie

  1. Maak een lijst van de geanalyseerde soorten in Notepad met hun wetenschappelijke namen en upload deze vervolgens naar de site https://timetree.org/.
    OPMERKING De wetenschappelijke namen kunnen worden gecontroleerd via de site: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/taxonomy
  2. Exporteer het verkregen boombestand door op de knop naar Newick bestand te klikken.

8. Fylogenetische analyses: Tellen van data-integratie in de fylogenetische boom

  1. In aparte kolommen van een datasheet vermeld je alle geanalyseerde soorten en de bijbehorende gegevens waarmee gecorreleerd moet worden (in dit geval: volledige cortex DCX+ celdichtheid, neocortex DCX+ celdichtheid en paleocortex DCX+ celdichtheid). Als er per soort meerdere individuen beschikbaar zijn, bereken dan het gemiddelde van de mediane dichtheid voor de geselecteerde parameters.
  2. Download de Mesquite Project-software (https://www.mesquiteproject.org/) om de fylogenetische boom te combineren met de telgegevens.
    OPMERKING: Deze software vereist dat Java al aanwezig is op de computer.
  3. Open het Newick-bestand dat eerder door Timetree is opgeslagen door op Open File te klikken. Selecteer vervolgens de optie Simple Newick/Phylip Treefile . Behandel het bestand als tekst en sla het op als ".nex".
  4. Selecteer op de nieuwe pagina die opent Taxa&Bomen gevolgd door Nieuw Drie Venster, en selecteer Met Bomen uit Bron. Selecteer in het pop-upvenster Opgeslagen Boom en druk op OK. Er wordt een nieuw tabblad weergegeven genaamd Geïmporteerde Bomen .
  5. Verander grafisch de fylogenetische boom (bijv. lettertype, grootte, takken evenredig aan de lengte) in het Display-gedeelte .
  6. Voeg een nieuw tabblad toe op Mesquite, selecteer Voeg Voeg aan , gevolgd door Nieuwe Tekenmatrix en kies het aantal tekens (voor deze studie is aantal = 3, wat overeenkomt met de drie DCX+ celdichtheden). Behandel karakters als continue data.
    OPMERKING: Personages vertegenwoordigen de gegevens die gecorreleerd moeten worden met de fylogenetische boom.
  7. Kopieer in dit nieuw aangemaakte tabblad de gegevens die gecorreleerd zullen worden met de fylogenetische boom (deel 6.4) en sla deze op.
  8. Selecteer op het tabblad Geïmporteerde bomen Analyse:Boom en Trace Character History om een Parsimony Ancestral States-analyse uit te voeren.
  9. Sla het bestand op als PDF.

9. Fylogenetische analyses: Correlatie tussen hersengrootte en DCX+ celdichtheden

  1. Voeg in het eerder gemaakte datasheet een kolom toe met de hersengrootte van elke soort.
  2. Bereken de natuurlijke logaritme van de DCX+ celdichtheden en van de hersengrootte.
  3. Start het voorkeursstatistische softwarepakket (https://www.statskingdom.com/linear-regression-calculator.html) en voer een eenvoudige lineaire regressie uit
  4. Download de resultatenbestanden en sla residuals op als nieuwe kolommen in het datablad.
    OPMERKING: Residuen geven de afwijking van de datapunten van de regressielijn weer.
  5. Selecteer in het gegevensblad de kolom residuen en de kolom met de soortnamen. Ga vervolgens naar insert en kies de histogramgrafiek om de residuen grafisch weer te geven.

10. Fylogenetische analyses: Neocorticale extensie en neocorticale DCX+ celdichtheidscorrelatie

  1. Voeg in het eerder gemaakte datablad een kolom toe met de neocorticale laag II oppervlakgegevens van elke soort, en bereken de natuurlijke logaritmen.
  2. In de statistische software voert men eenvoudige lineaire regressie uit door de waarden van het oppervlak van logaritmisch neocorticale laag II als X-variabele en de logaritmische neocortex DCX+ celdichtheid als Y-variabele te gebruiken.
  3. Download de verkregen bestanden en sla de residuen op in een nieuwe kolom in het datablad, waar de residugrafiek kan worden gemaakt zoals in stap 9.5.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De DCX+-cellen in de hersenschors van alle bestudeerde soorten delen consequent een reeks kenmerken die wijzen op het bestaan van een goed bewaarde populatie van ongedifferentieerde neuronen (Figuur 4A). Kort gezegd zijn ze: (i) topografisch gerangschikt om een monolaag te vormen langs corticale laag II; (ii) de morfologische subtypen laten zien die zijn beschreven voor verschillende rijpingsstadia in onvolwassen neuronen, (a) met een grote prevalentie van kleine, unipolaire/bipolaire cellen...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De hier beschreven methode levert vergelijkbare kwantitatieve gegevens wanneer verschillende soorten worden beschouwd die sterk verschillen in hersengrootte en neuroanatomie. Het kan worden gebruikt om de consistentie van celpopulaties in de gehele hersenen van diverse zoogdieren te beoordelen, evenals om hun ontwikkeling in één soort te volgen over volgende stadia, van postnataal tot veroudering. Het begint met de aanname dat een relatief groot aantal hersenen (hele hemisferen) en soort...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij danken Matteo Piumatti en Chiara La Rosa voor hun bijdrage aan het definiëren van het hier gerapporteerde protocol voor corticale onvolwassen neuronen. Het werk werd ondersteund door Fondazione CRT - Cassa di Risparmio di Torino (subsidie RF=2022.0618) aan LB; PRIN2022 (subsidie 2022LB4X3N) aan LB; National Science Foundation (verleent: EF-2021785, DRL-2219759) en National Institutes of Health (verleent: NS092988, AG067419) aan CCS.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
10% formalinSigma-AldrichHT501128
2-methylbutaan Sigma-Aldrich320404Isopentaan
3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydraatSigma-AldrichD5637
4% paraformaldehydeSigma-Aldrich441244
Rund serumalbumineSigma-AldrichA9647
Citroenzuur SigmaC0759
DPX-bevestigingsmiddel voor histologieSigma-Aldrich 06522
EthanolMerck1.00983
EthyleenglycolSigma-Aldrich102466
GlycerolSigma-AldrichG7893
Waterstofperoxide-oplossingSigma-AldrichH1009
Killik - O.C.T. CompoundBio-optica 05-9801
Mesquite-softwareMesquite ProjectMesquite versie 3.81 (build 955)
Neo-mountSigma-Aldrich1.09016
Fosfaat gebufferd (PB)nanaOp maat gemaakt
Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS)nanaOp maat gemaakt
NatriumhydroxideRiedel-de Haen6213
Natriumfosfaat dibasisch dihydraatSigma-Aldrich71645
Natriumfosfaat monobasisch dihydraatSigma-Aldrich71500
SucroseSigma-AldrichS9378
Toluidine BlauwSigma-Aldrich89640
Triton X-100 Sigma-AldrichT8787
Tween 20Sigma-AldrichP9416
VECTASTAIN Elite ABC-HRP Kit Peroxidase (Standard)Vector LaboratoriesPK-6100
Xylol Sigma-Aldrich247642

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brenowitz, E. A., Zakon, H. H. Emerging from the bottleneck: benefits of the comparative approach to modern neuroscience. Trends Neurosci. 38 (5), 273-278 (2015).
  2. Bolker, J. A. Animal models in translational research: rosetta stone or stumbling block. Bioessays. 39 (12), 1-8 (2017).
  3. Moreno-Jiménez, E. P., Terreros-Roncal, J., Flor-García, M., Rábano, A., Llorens-Martín, M. Evidences for adult hippocampal neurogenesis in humans. J Neurosci. 41 (12), 2541-2553 (2021).
  4. Sorrells, S. F., et al. Positive controls in adults and children support that very few, if any, new neurons are born in the adult human hippocampus. J Neurosci. 41 (12), 2554-2565 (2021).
  5. Simard, S., Matosin, N., Mechawar, N. Adult hippocampal neurogenesis in the human brain: updates, challenges, and perspectives. Neuroscientist. 31 (4), 141-158 (2024).
  6. Bao, H., Song, J. Treating brain disorders by targeting adult neural stem cells. Trends Mol Med. 24 (12), 991-1006 (2018).
  7. Ghibaudi, M., Zanone, A., Bonfanti, L. Brain structural plasticity in large-brained mammals: not only narrowing roads. Neural Regen Res. 21 (5), 1669-1680 (2026).
  8. Bonfanti, L., La Rosa, C., Ghibaudi, M., Sherwood, C. C. Adult neurogenesis and "immature" neurons in mammals: an evolutionary tradeoff in plasticity. Brain Struct Funct. 229 (8), 1775-1793 (2024).
  9. Paredes, M. F., Sorrells, S. F., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Brain size and limits to adult neurogenesis. J Comp Neurol. 524 (3), 646-664 (2016).
  10. Parolisi, R., Cozzi, B., Bonfanti, L. Humans and dolphins: decline and fall of adult neurogenesis. Front Neurosci. 12, 497(2018).
  11. Snyder, J. S. Recalibrating the relevance of adult neurogenesis. Trends Neurosci. 42 (3), 164-178 (2019).
  12. Bonfanti, L., Charvet, C. J. Brain plasticity in humans and model systems: advances, challenges, and future directions. Int J Mol Sci. 22 (17), 9358(2021).
  13. Duque, A., Arellano, J. I., Rakic, P. An assessment of the existence of adult neurogenesis in humans and value of its rodent models for neuropsychiatric diseases. Mol Psychiatry. 27, 377-382 (2022).
  14. Gómez-Climent, M. A., et al. A population of prenatally generated cells in the rat paleocortex maintains an immature neuronal phenotype into adulthood. Cereb Cortex. 18 (10), 2229-2240 (2008).
  15. Rotheneichner, P., et al. Cellular plasticity in the adult murine piriform cortex: continuous maturation of dormant precursors into excitatory neurons. Cereb Cortex. 28 (7), 2610-2621 (2018).
  16. Sorrells, S. F., et al. Immature excitatory neurons develop during adolescence in the human amygdala. Nat Commun. 10 (1), 2748(2019).
  17. La Rosa, C., Parolisi, R., Bonfanti, L. structural plasticity: from adult neurogenesis to immature neurons. Front Neurosci. 14, 75(2020).
  18. Bonfanti, L., Seki, T. The PSA-NCAM-positive "immature" neurons: an old discovery providing new vistas on brain structural plasticity. Cells. 10 (10), 2542(2021).
  19. Benedetti, B., Couillard-Després, S. Why would the brain need dormant neuronal precursors. Front Neurosci. 16, 877167(2022).
  20. Luzzati, F., Bonfanti, L., Fasolo, A., Peretto, P. DCX and PSA-NCAM expression identifies a population of neurons preferentially distributed in associative areas of different pallial derivatives and vertebrate species. Cereb Cortex. 19 (5), 1028-1041 (2009).
  21. Palazzo, O., La Rosa, C., Piumatti, M., Bonfanti, L. Do large brains of long-living mammals prefer non-newly generated, immature neurons. Neural Regen Res. 13 (4), 633-634 (2018).
  22. La Rosa, C., et al. Phylogenetic variation in cortical layer II immature neuron reservoir of mammals. Elife. 9, e55456(2020).
  23. Sherwood, C. C., Gómez-Robles, A. Brain plasticity and human evolution. Annu Rev Anthropol. 46, 399-419 (2017).
  24. Piumatti, M., et al. Non-newly generated, "immature" neurons in the sheep brain are not restricted to cerebral cortex. J Neurosci. 38 (4), 826-842 (2018).
  25. Pattaro, A., et al. Phylogenetic variation of layer II cortical immature neurons in dog and horse confirms covariance with brain size and neocortical surface. Brain Struct Funct. 230 (6), 115(2025).
  26. Ghibaudi, M., et al. Consistency and variation in doublecortin and Ki67 antigen detection in the brain tissue of different mammals, including humans. Int J Mol Sci. 24 (3), 2514(2023).
  27. Ben Abdallah, N. M., Slomianka, L., Vyssotski, A. L., Lipp, H. P. Early age-related changes in adult hippocampal neurogenesis in C57 mice. Neurobiol Aging. 31, 151-161 (2010).
  28. Ghibaudi, M., et al. Age-related changes in layer II immature neurons of the murine piriform cortex. Front Cell Neurosci. 17, 1205173(2023).
  29. Workman, A. D., Charvet, C. J., Clancy, B., Darlington, R. B., Finlay, B. L. Modeling transformations of neurodevelopmental sequences across mammalian species. J Neurosci. 33 (17), 7368-7383 (2013).
  30. Charvet, C. J., de Sousa, A. A., Vassilopoulos, T. Translating time: challenges, progress, and future directions. Brain Res Bull. 221, 111212(2025).
  31. Bartges, J., et al. AAHA canine life stage guidelines. J Am Anim Hosp Assoc. 48, 1-11 (2012).
  32. Ghibaudi, M., et al. Multispecies characterization of immature neurons in the mammalian amygdala reveals their expansion in primates. PLoS Biol. 23 (8), e3003322(2025).
  33. Ghibaudi, M., Boda, E., Bonfanti, L. From mice to humans: a need for comparable results in mammalian neuroplasticity. Neural Regen Res. 20 (2), 464-466 (2025).
  34. Smulders, T. V. The relevance of brain evolution for the biomedical sciences. Biol Lett. 5, 138-140 (2009).
  35. Keck, T. Bridging theory and experiment in (statistical) learning. Curr Opin Neurobiol. 94, 103106(2025).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Comparative NeurobiologyMammalian Brain VariationCortical Immature NeuronsBrain PlasticityNeurogenesis DifferencesBrain Size ComparisonPhylogenetic AnalysisNeurodevelopmental ProcessesCell Population Quantification

Gerelateerde artikelen