Netwerkfarmacologie en experimentele in-vitrocelstudie voor het onderzoeken van het therapeutisch potentieel van thiazolonderivaten bij rhabdomyosarcoom

Samenvatting

We presenteren een studie die systematisch het therapeutisch potentieel van thiazolonderivaten tegen rhabdomyosarcoom onderzoekt op basis van netwerkfarmacologie en computationele chemie, met validatie en evaluatie uitgevoerd door middel van in vitro celexperimenten.

Samenvatting

Rhabdomyosarcoom (RD) is een kwaadaardige tumor afkomstig van rhabdomyoblasten, die een ernstige bedreiging vormt voor de gezondheid van kinderen en adolescenten. Op basis van het potentieel van thiazolonderivaten in een verscheidenheid aan biologische activiteiten, is deze studie bedoeld om de mechanismen van thiazolonderivaten in de behandeling van RD systematisch te onderzoeken door netwerkfarmacologie en in vitro celexperimenten te combineren. Door middel van netwerkfarmacologie werden gegevens met hoge doorvoer geïntegreerd om de potentiële doelwitten van thiazolon te voorspellen. Bovendien werd AutoDock Vina-software gebruikt om de bindingsenergie van de verbinding en het doeleiwitmolecuul te berekenen, waardoor de signaalroute met betrekking tot RD werd onthuld. Ten slotte verifieerden in vitro celexperimenten het tumoronderdrukkende effect van de verbindingen verder. Netwerkfarmacologie werd gebruikt om de doelen van thiazolonderivaten bij de behandeling van RD te analyseren, en 172 doelgenen werden uiteindelijk verkregen door te combineren en te dedupliceren. Vijf eiwitdoelen met een lage bindingsenergie werden gescreend door koppeling tussen de verbinding en het doeleiwitmolecuul, PIK3CD, AKT1, GSK3B, HSP90AB1 en ITGB1. De resultaten van in vitro celkweekexperimenten toonden aan dat een specifiek thiazolonderivaat een significant remmend effect had op RD-cellijnen, wat een wetenschappelijke basis bood voor de ontdekking van nieuwe doelwitten en effectieve verbindingen voor de behandeling van RD. Deze studie onthulde de mechanismen van thiazolonderivaten bij de behandeling van RD door een combinatie van netwerkfarmacologie en in vitro experimenten en bood een nieuw perspectief voor toekomstige geneesmiddelenontwikkeling en behandelingsstrategieën.

Inleiding

Rhabdomyosarcoom (RD), een zeer agressief pediatrisch wekedelensarcoom dat een aanzienlijke bedreiging vormt voor de gezondheid van kinderen, met beperkte therapeutische opties. Epidemiologische studies geven aan dat RD weliswaar relatief lage incidentiecijfers vertoont, maar dat de hoge maligniteit en slechte prognose aanzienlijke klinische uitdagingen met zich meebrengen. RD wordt ingedeeld in vier verschillende histologische subtypen: embryonaal, alveolair, spoelcel/scleroserend en pleomorf, waarbij embryonaal rhabdomyosarcoom (ERMS) de meest voorkomende vorm is ^1,2,3. De huidige therapeutische strategieën voor nieuw gediagnosticeerde ERMS-patiënten met een laag risico omvatten voornamelijk chirurgische resectie van gelokaliseerde tumoren in combinatie met chemotherapeutische middelen, waaronder vincristine, dactinomycine en cyclofosfamide. Patiënten met een hoog risico krijgen doorgaans geïntensiveerde chemotherapieregimes met meerdere middelen die ifosfamide en etoposide ^4,5 bevatten. Hoewel de multimodale benadering die chirurgie, chemotherapie en radiotherapie combineert, effectief is gebleken bij het bereiken van lokale tumorcontrole en het uitroeien van micrometastasen⁵, blijven er aanzienlijke uitdagingen. De substantiële toxiciteitsprofielen van de huidige chemotherapeutische middelen, waaronder neurotoxiciteit en onomkeerbare nier- en blaasbeschadiging⁶, vormen bijzondere risico's voor pediatrische en adolescente patiënten. Bovendien onderstrepen de inherente heterogeniteit van RD en de neiging tot terugval de kritieke noodzaak om effectievere en gerichtere therapeutische middelen te ontwikkelen⁷.

In deze context richt het onderzoek zich hier op een klasse van thiazolonderivaten met duidelijke farmacologische eigenschappen. Thiazolonderivaten vertonen significante ontstekingsremmende, antioxiderende en apoptoseregulerende activiteiten⁸, wat een brede biologische activiteit en een veelbelovend potentieel voor de ontwikkeling van geneesmiddelen aantoont ^9,10. Moleculaire docking-simulaties door Elgubbi et al. onthulden sterke bindingsaffiniteiten van thiazolonderivaten aan belangrijke doelen zoals humaan koolzuuranhydrase IX (CA IX), een hypoxie-induceerbaar enzym dat tot overexpressie komt in agressieve tumoren, wat een mechanisme suggereert voor hun antiproliferatieve effecten¹¹. De computationele studie verduidelijkt de moleculaire interacties tussen thiazolonderivaten en kanker-geassocieerde eiwitten. In 2024 rapporteerden El-Helw et al. dat thiazolonderivaten op basis van benzoquinoline een krachtige activiteit vertonen tegen kankercellijnen, waarbij thiazolethione- en thiazol-analogen de hoogste werkzaamheid vertonen¹². Mechanistische studies ^10,13 suggereren dat deze verbindingen de levensvatbaarheid van tumorcellen verstoren via dubbele routes: (1) inductie van oxidatieve stress via de modulatie van de antioxidantroute en (2) directe remming van proliferatie. Deze bevindingen benadrukten het brede farmacologische profiel van thiazolonen, inclusief ontstekingsremmende en antimicrobiële eigenschappen. Met name verbindingen zoals pioglitazon¹⁴ en troglitazon¹⁵ worden voornamelijk gebruikt bij de behandeling van diabetes type 2¹⁶, terwijl 4-thiazolonderivaten antiproliferatieve effecten vertonen tegen leukemiecellen¹⁷ (Figuur 1). Deze verbindingen vertonen niet alleen een significante therapeutische belofte in klinische studies, maar richten zich ook specifiek op meerdere celsignaleringsroutes, waaronder de remming van de proliferatie van tumorcellen, inductie van apoptose en regulatie van de celcyclus. De antikankermechanismen van thiazolonderivaten omvatten verschillende signaalroutes die de groei en overleving van tumorcellen effectief belemmeren door kritieke routes te moduleren, zoals de PI3K/Akt- en NF-KB-routes. Bovendien hebben thiazolonderivaten ook regulerende effecten op de micro-omgeving van de tumor vertoond, waaronder de remming van angiogenese en modulatie van immuunresponsen¹⁸. De veelzijdige mechanistische werking van thiazolonderivaten positioneert ze als ideale kandidaten voor de ontwikkeling van nieuwe kankertherapieën.

In eerder onderzoek hebben we thiazolonderivaten efficiënt geconstrueerd met aangrenzende chirale centra door middel van een door koper gekatalyseerde distale asymmetrische propargyleringsreactie. Met behulp van propargylesters en thiazolonen als substraten werd de reactie gekatalyseerd door CuI in aanwezigheid van een fenylgesubstitueerde pyridine bis (oxazoline) ligand. Door de reactiecondities te optimaliseren, bereikten we een hoge efficiëntie in de synthese van deze thiazolonderivaten¹⁹. Netwerkfarmacologie, als een systeembiologische benadering, onthult complexe interacties tussen geneesmiddelen, doelen en ziekteroutes, en brengt een revolutie teweeg in het begrip en de ontwikkeling van therapieën voor complexe ziekten zoals kanker²⁰. Deze studie heeft tot doel om de potentiële therapeutische waarde van nieuwe thiazolonderivaten bij de behandeling van RD te onthullen. Door middel van geïntegreerde netwerkfarmacologie en cellulaire experimenten zullen verbindingen met superieure activiteit worden geïdentificeerd, die multi-target therapeutische effecten kunnen uitoefenen door vijf kerndoelen coördinerend te reguleren, waaronder PIK3CD en AKT1, waardoor belangrijke signaalroutes zoals PI3K-Akt worden beïnvloed. Moleculaire docking en moleculaire dynamica simulaties zullen worden gebruikt om bindingskarakteristieken tussen de verbinding en doeleiwitten aan te tonen. Bovendien zal een voorlopig structuur-activiteitsrelatiemodel worden opgesteld, dat een referentie vormt voor latere structurele optimalisatie. Dit werk biedt niet alleen nieuwe kandidaat-moleculen voor de ontwikkeling van geneesmiddelen voor rhabdomyosarcoom, maar benadrukt ook de positieve rol van multidisciplinaire strategieën bij het onderzoeken van multi-target therapeutische mechanismen van geneesmiddelen.

Protocol

Alle procedures voor netwerkfarmacologie werden uitgevoerd in overeenstemming met de Guidelines for Network Pharmacology Evaluation Methods²¹. De uitgebreide workflow voor netwerkfarmacologie die in dit onderzoek is toegepast, wordt schematisch geïllustreerd in figuur 2.

Synthese van thiazolonderivaten
De thiazolonderivaten in deze studie werden gesynthetiseerd in ons eerdere werk¹⁹, door middel van een door koper gekatalyseerde asymmetrische propargyleringsreactie op afstand. De reactie gebruikte CuI als katalysator en een chiraal Pybox-ligand (L1) als de stereocontrolekern, in een DIPEA-basis en methanoloplosmiddelsysteem bij -10 °C gedurende 48 uur, waardoor een hoge enantioselectieve koppeling tussen propargylesters en thiazolonen werd bereikt. Het doelproduct werd verkregen met een opbrengst tot 89%, een enantiomere verhouding (er) van 97,8:2,2 en een diastereomere verhouding (dr) van 17,8:1. Voor gedetailleerde informatie over de synthesemethoden van deze reeks verbindingen verwijzen wij u naar eerdere studies¹⁹. Deze methode toonde een brede toepasbaarheid van het substraat aan, geschikt voor aryl (ortho-, meta-, parasubstituenten), alifatische ketens en propargylesters met gefuseerde ring, evenals verschillende gesubstitueerde thiazolonen, met opbrengsten variërend van 51% tot 98%. Deze strategie construeert voor het eerst efficiënt multi-chiraal thiazolonkaders in een eenstapsproces, wat een zeer selectieve en ongecompliceerde benadering biedt voor de synthese van chirale geneesmiddelmoleculen met aanzienlijke potentiële toepassingen in de medicinale chemie.

Farmacologische voorspelling van het netwerk
Doelvoorspelling van het thiazolonderivaat: De structurele representaties van thiazolonderivaten werden gegenereerd met behulp van KingDraw-software en de bijbehorende structurele bestanden werden vervolgens geconverteerd naar SMILES ID via Open Babel-software. Om potentiële therapeutische doelen te voorspellen aan de hand van RD, hebben we een uitgebreide computationele benadering gebruikt met behulp van drie verschillende databases voor het voorspellen van doelen: SwissTargetPrediction (http://swisstargetprediction.ch/), TargetNet (http://targetnet.scbdd.com) en SuperPred (https://prediction.charite.de). Voor de TargetNet-analyse hebben we een streng filtercriterium geïmplementeerd door genen te selecteren met een waarschijnlijkheid > 0. In de SuperPred-database hebben we strengere selectieparameters toegepast, waarbij we alleen die genen behielden met een modelnauwkeurigheid > 90% en een waarschijnlijkheid > 60%, wat zorgt voor zeer betrouwbare doelvoorspellingen.

Voorspelling van RD-doelen: Op basis van de GeneCards-database (https://www.genecards.org/) en de OMIM-database (https://omim.org/) hebben we gezocht naar Rhabdomyosarcoom. Voor de gegevens afkomstig uit de GeneCards-database hebben we de resultaten gefilterd met een score van meer dan 20 om genen te verkrijgen die geassocieerd zijn met rhabdomyosarcoom.

Constructie en analyse van eiwit-eiwitinteractie (PPI)-netwerken: De potentiële doelwitten van thiazolonderivaten en de genen geassocieerd met RD werden doorsneden. De potentiële doelwitten voor de behandeling van humaan embryonaal rhabdomyosarcoom door thiazolonderivaten werden geüpload naar de STRING-database (https://www.string-db.org/) voor een zeer betrouwbare analyse van de PPI-doelrelatie (eiwit-eiwitinteractie). Het PPI-netwerk is opgebouwd in Cytoscape-software (http://www.cytoscape.org/) en de kerndoelen zijn gescreend op basis van diplomawaarden.

Netwerkconstructie van de verbinding-ziekte-doelwitroute: Het geneesmiddel-doelwit-routenetwerk kan duidelijk de doelen van verbindingen en ziekten zien en de routes die bij deze doelen betrokken zijn, om mogelijke belangrijke doelen en routes voor samengestelde therapie voor RD te identificeren. Bouw eerst de netwerktabel en de attributentabel in de spreadsheet. De inhoud van de netwerktabel omvat voornamelijk de correspondentie tussen de verbinding en het kerndoelwit, de correspondentie tussen het kerndoel en de betrokken route, en de correspondentie tussen RD en de hoofdroute. De inhoud van de attribuuttabel is voornamelijk het classificeren en benoemen van alle informatie in de netwerktabel. Open daarna de Cytoscape-software, upload de netlist naar de laadlocatie, stel het startpunt en eindpunt in, upload de attribuuttabel en wijzig ten slotte de afbeeldingsvorm.

Geïntegreerde functionele annotatie en netwerkfarmacologische analyse - Construction Gene Ontology (GO) Enrichment, Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG): GO- en KEGG-verrijkingsanalyse van kerndoelen werd uitgevoerd door de DAVID-database (https://david.ncifcrf.gov/). Volgens de volgorde van P-waarde van klein naar groot, werden de top 10 items in biologisch proces (BP), cellulaire component (CC) en moleculaire functie (MF) in GO geselecteerd voor analyse, en de top 20 items in KEGG werden geanalyseerd, en de GO- en KEGG-bubbelkaarten van kerndoelen werden gemaakt op basis van het online micro-bio-informatieplatform.

Moleculaire docking: Kerndoeleiwitten werden geselecteerd uit de PDB-database (https://www.rcsb.org/) en de structurele bestanden van de kerndoelen werden gedownload. Aanvankelijk werden de eiwitten gedehydrateerd met behulp van PyMol-software, gevolgd door de scheiding van liganden en receptoren. Vervolgens werden de eiwitten gehydrogeneerd met behulp van ADFRSuite-software en werden de gridbox-parameters voor de AutoDock moleculaire docking-software verkregen. De pdbqt-bestanden van thiazolidinonderivaten en kerndoeleiwitten werden voorbereid met behulp van AutoDock Vina-software. Vervolgens werden moleculaire docking-simulaties van thiazolonderivaten en kerndoeleiwitten uitgevoerd. Ten slotte werden de moleculaire dockingmodellen gevisualiseerd met behulp van PyMol-software.

Moleculaire dynamica-simulatie: Het PDB-bestand werd geconverteerd naar GROMACS-compatibel GRO-formaat met behulp van het amber99sb-ildn-krachtveld en het TIP3P-watermodel:
gmx pdb2gmx -f Pro.pdb -o Pro_temp_H.gro -ff amber99sb-ildn -water tip3p -ignh
Een kubisch periodiek grensvak werd toegevoegd met een afstand van 1,2 nm van het eiwit:
GMX Editconf -F Pro_temp_H.gro -o Pro_temp_H_box.gro -C -d 1.2 -BT kubus
De doos was gevuld met TIP3P watermoleculen:
GMX Solvate -cp Pro_temp_H_box.gro -o Pro_temp_H_box_water.gro -p topol.top
Het systeem werd geneutraliseerd door toevoeging van Na-ionen:
gmx grompp -f ionen.mdp -c Pro_temp_H_box_water.gro -p topol.top -ionen.tpr
gmx genion -s ionen.tpr -o Pro_temp_H_box_water_ion.gro -p topol.top -neutraal
Energieminimalisatie werd uitgevoerd:
gmx grompp -f minim.mdp -c Pro_temp_H_box_water_ion.gro -p topol.top -o em.tpr
gmx mdrun -v -deffnm em
NVT-equilibratie werd uitgevoerd:
gmx grompp -f nvt.mdp -c em.gro -r em.gro -p topol.top -o nvt.tpr
GMX mdrun -Deffnm nvt -v
NPV-evenwicht werd uitgevoerd:
gmx grompp -f npt.mdp -c nvt.gro -r nvt.gro -t nvt.cpt -p topol.top -o npt.tpr
GMX MDRun -Deffnm NPT -V
De simulatie van de productie moleculaire dynamica werd opgestart:
gmx grompp -f md.mdp -c npt.gro -t npt.cpt -p topol.top -o md_0_1.tpr
GMX mdrun -deffnm md_0_1 -v

Na voltooiing van de simulaties werden de resulterende trajecten geanalyseerd met behulp van Visual Molecular Dynamics (VMD) en PyMOL, en werd de bindingsvrije energieanalyse tussen de eiwitten en liganden van kleine moleculen uitgevoerd met behulp van het g_mmpbsa-programma.

Beoordeling van de effecten van geneesmiddelen op de levensvatbaarheid van RD-cellen
RD-cellen (embryonale rhabdomyosarcoomcel; STR geauthenticeerd) in de logaritmische groeifase werden getrypsiniseerd om een celsuspensie te creëren met een concentratie van 1 x10⁵ cellen/ml. Deze suspensie werd vervolgens in een plaat met 96 putjes gezaaid met een dichtheid van 1 x 10⁴ cellen/putje (100 μL per putje) en geïncubeerd bij 37 °C met 5% CO₂ om celhechting mogelijk te maken. Na hechting werd het medium vervangen door 100 μL serumvrij medium dat 1% FBS bevatte, en de cellen werden gedurende 12 uur uitgehongerd. Vervolgens werd het medium vervangen door 100 μl van het betreffende medium dat verschillende concentraties van de teststof bevatte. Controleputjes werden behandeld met een oplosmiddelhoudend medium of een normaal medium, en blanco putjes die alleen het overeenkomstige medium zonder cellen bevatten, werden opgenomen. De platen werden geïncubeerd bij 37 °C met 5% CO₂ gedurende 24 uur (de duur werd door voorlopige experimenten vastgesteld als optimaal voor het observeren van het maximale remmende effect van deze klasse van verbindingen op RD-cellen. Dat wil zeggen, de tijd die nodig is om de OD-waarde van de celdichtheid ongeveer 1,0 te laten bereiken.). Daarna werd 10 μL CCK-8-oplossing aan elk putje toegevoegd en werden de platen nog 1-4 uur geïncubeerd. Ten slotte werd de extinctie bij 450 nm gemeten met behulp van een microplaatlezer. De met oplosmiddel behandelde cellen dienden als controlegroep en de lege putjes werden gebruikt voor basislijncorrectie. De levensvatbaarheid van de cellen werd berekend op basis van de extinctiemetingen.

Overlevingspercentage% = [(controlegroep-blanco)-(experimentele groep-blanco)]/(controlegroep-blanco) x 100%

Resultaten

In deze studie werden 13 thiazolonderivaten (verbindingen a-m; Figuur 3, Figuur 4) werden eerder gesynthetiseerd¹⁹ werden geselecteerd voor evaluatie van hun remmende activiteit tegen kankercellen (Figuur 5). Van deze verbindingen vertoonde verbinding m bij 100 μM het hoogste remmingspercentage tegen RD-cellen (embryonale rhabdomyosarcoomcel) (STR-geauthenticeerd)²². Latere experimente...

Discussie

Netwerkfarmacologie wordt vaak gebruikt om potentiële actieve moleculen in complexe componenten van de traditionele Chinese geneeskunde te voorspellen en te screenen, en om de synergetische mechanismen van multi-component, multi-target en multi-pathway acties in kruidenformuleringen op te helderen. In deze studie hebben we een netwerkfarmacologische benadering toegepast om systematisch het potentiële mechanisme van ons nieuw gesynthetiseerde thiazolonderivaat tegen RD te onderzoeken door...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
CCK-8 Assay Kit	Beyotime Biotechnology Co., Ltd.	C0038	Een kit gebruikt voor het meten van celviabiliteit en proliferatie op basis van de reductie van een wateroplosbaar tetrazoliumzout om een gekleurd product te vormen.
Clean Bench	Suzhou Antai Airtech Co., Ltd	SW-CJ-1FD	Een werkstation met gelaagde luchtstroom dat een steriele omgeving biedt voor het hanteren van celculturen en andere gevoelige materialen.
CO2 Incubator	Heal Force	HF90	Een temperatuur-, vochtigheid- en CO2-gecontroleerde omgeving wordt gebruikt voor celcultuur om optimale groeicondities te handhaven.
DMEM Hoge Glucose	cytiva	SH30022.01	Een celcultuurmedium met hoge glucoseconcentratie (4,5 g/L), geschikt voor een verscheidenheid aan celtypen, inclusief snel groeiende zoogdiercellen.
FBS	YEASEN	40130ES76	Een veelgebruikt supplement in celcultuurmedia, dat essentiële groeifactoren, hormonen en voedingsstoffen levert voor celproliferatie.
Inverteer Microscoop	OLYMPUS	IX51	Een microscoop ontworpen met de objectieflens onder het podium, waardoor observatie van celculturen in kolven of platen van onderen mogelijk is.
Microplate Reader	Diatek	DR-200Bs	Een instrument dat wordt gebruikt om biologische, chemische of fysische gebeurtenissen in microplatemonsters te detecteren door het meten van absorptie, fluorescentie of luminescentie.
PBS	Jinuo Biomedical Technology Co., Ltd.	GNM20012	Een bufferoplossing die veel wordt gebruikt in biologisch onderzoek voor het wassen van cellen, het verdunnen van oplossingen en het handhaven van pH-stabiliteit.
RD (Embryonaal Rhabdomyosarcoom Cel) (STR Geauthenticeerd)	Shanghai FuHeng Biotechnology Co., Ltd.	FH0712	De cellijn is geauthenticeerd door short tandem repeat (STR) analyse, bezit een goed gedefinieerde genetische achtergrond en duidelijke celidentiteit, waardoor de betrouwbaarheid en reproduceerbaarheid van experimentele gegevens wordt gewaarborgd.
RMPI Medium Gemodificeerd (1640)	cytiva	SH30809.01	Een veelgebruikt celcultuurmedium oorspronkelijk ontwikkeld voor menselijke leukocytencellen, wordt nu toegepast voor verschillende zoogdierceltypen.
Trypsin-EDTA	Jinuo Biomedical Technology Co., Ltd.	GNM25200	Een oplossing die wordt gebruikt om adherente cellen los te maken van cultuuroppervlakken door extracellulaire eiwitten te verteren en calciumionen te cheleren.