Methodenartikel

Bepaling van microbiële biomassa in de bodem met behulp van Digital Droplet PCR (ddPCR)

DOI:

10.3791/69467

⸱

24 april 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Geography, Faculty of Environment, Science and Economy, University of Exeter

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie presenteert een snelle ddPCR-methode om de microbiële biomassa van de bodem en de verhoudingen tussen schimmel en bacteriën te kwantificeren. Hoewel ddPCR-afgeleide microbiële biomassakoolstof slechts een zwakke correlatie vertoont met schattingen van chloroformfumigatie, biedt de methode een gevoelige, schaalbare moleculaire benadering om de microbiële abundantie te beoordelen zonder extra bodemmonsters of het gebruik van harde bodem.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De bodem vertegenwoordigt de grootste terrestrische bron van organische koolstof, maar er is in de afgelopen twee eeuwen meer dan 133 Gt koolstof uit bodems verloren. Nauwkeurige kwantificering van microbiële biomassa in de bodem, met name schimmels en bacteriën, de belangrijkste afbrekers die koolstof- en nutriëntencyclus aandrijven, is essentieel voor het begrijpen van ecologisch functioneren en gezondheid van de bodem. Conventionele benaderingen, waaronder chloroformfumigatie-extractie en PLFA-analyse, worden beperkt door hoge monstervereisten en onzekerheden die samenhangen met het omzetten van biochemische markers naar microbiële biomassaschattingen. Hier presenteren we een geoptimaliseerde workflow voor het kwantificeren van bacteriële en schimmelabundantie in bodem met behulp van digitale druppels PCR (ddPCR) gericht op de 16S- en 18S rRNA-genen. De methode maakt absolute kwantificering van microbiële genkopieën mogelijk, omzetting naar celnummers met behulp van genkopiecorrectiefactoren en daaropvolgende schatting van microbiële biomassakoolstof. We pasten dit protocol toe op bodems uit vijf wereldwijd verspreide landbouwsystemen die verschillen in bodemtextuur, landgebruik en organisch materiaalgehalte. ddPCR-afgeleide schattingen werden vergeleken met conventionele chloroformfumigatieschattingen van microbiële biomassa koolstof. ddPCR leverde hoogresolutie-kwantificatie van microbiële abundantie en leverde bredere en gevoeligere schattingen van F:B-verhoudingen over bodemtypen heen dan volledige genoomsequencing. Hoewel ddPCR-afgeleide MBC slechts een zwakke correlatie vertoonde met chloroformfumigatiewaarden, biedt deze methode een effectieve moleculaire benadering voor het beoordelen van microbiële biomassa en ecologische indicatoren zoals de F:B-ratio. Dit protocol biedt een reproduceerbare en schaalbare strategie om microbiële abundantiemetingen te integreren met samenstellingsanalyses om de bodemgezondheidsbeoordeling te bevorderen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De bodem is de grootste terrestrische organische koolstofpool en bevat meer koolstof dan vegetatie en atmosferische koolstof samen1. Meer dan 133 gigaton (Gt) koolstof is in de afgelopen 200 jaar uit bodems verloren gegaan en voortdurende inspanningen om de koolstofvoorraden van de bodem te herstellen en te behouden zijn van vitaal belang voor de wereldwijde bodemgezondheid2. Gezien de enorme koolstofopslagcapaciteit van bodems is het nauwkeurig bepalen van de belangrijkste bijdragers aan deze koolstofvoorraden fundamenteel3. Microben spelen een fundamentele rol in de nutriëntencyclus in de bodem, en microbiële biomassa vormt een aanzienlijk onderdeel van de organische koolstof in de bodem (SOC)3. Schimmels en bacteriën zijn de belangrijkste afbrekers in bodemomgevingen en zijn essentieel in de biogeochemische cycli van deze ecosystemen 4,5. In bacteriëel gedomineerde bodem verloopt de afbraak van organisch materiaal en de mineralisatie van voedingsstoffen veel sneller dan in een schimmel-gedomineerde5. De schimmel-bacteriële (F:B) verhouding wordt steeds vaker gebruikt als indicator voor bodemgezondheid 6,7; daarom is een nauwkeurige beoordeling van zowel schimmels als bacteriën cruciaal.

Microbiële biomassaschattingen in bodems zijn vaak afhankelijk van disruptieve chemische behandelingen, zoals chloroformfumigatie8. Andere benaderingen richten zich selectief op de actieve microbiële gemeenschap via technieken zoals substraat-geïnduceerde respiratie of fosfolipidvetzuuranalyse (PLFA). PLFA-analyse is veel gebruikt om de samenstelling van microbiële gemeenschappen te beoordelen en de F:B-verhouding te schatten. Significante variatie in celgrootte tussen verschillende schimmel- en bacteriesoorten zorgt echter voor onzekerheid bij het omzetten van PLFA-concentraties naar biomassa- of populatiegebaseerde F:B-verhoudingen, waardoor dergelijke schattingen mogelijk onbetrouwbaar zijn10. Andere methoden, zoals flowcytometrie, kunnen worden gebruikt om de monsterdoorvoer te verhogen voor het bepalen van de bacteriële abundantie in bodems; hun nauwkeurigheid kan echter worden verminderd doordat niet-microbiële deeltjes vergelijkbare grootte, vorm en autofluorescentiekenmerken hebben als de microben11. Chloroformfumigatie vereist een relatief grote hoeveelheid grond (>10 g) om microbiële biomassa te schatten, terwijl een monstergrootte van 500 mg bodem voldoende is voor DNA-gebaseerde methoden bij extracties met commerciële kits. Een eerdere vergelijking tussen DNA-gebaseerde methoden en chloroformfumigatie toonde aan dat hoewel beide benaderingen in staat waren microbiële biomassa te schatten, het gebruik ervan samen een robuustere beoordeling van bodemmicrobiële biomassa12 opleverde.

Microbiële gemeenschapsbeoordelingen zijn een onderbenutte maatstaf voor bodemgezondheid die het potentieel heeft om de manier waarop we bodems meten en begrijpen te transformeren13. Metabarcoderingsbenaderingen worden conventioneel gebruikt om de microbiële gemeenschap in de bodem te bepalen, waarbij de relatieve bacteriële abundanties worden beoordeeld door het amplifizeren van gebieden van het 16S rRNA-gen, terwijl schimmeltaxa worden getarget met het 18S rRNA-gen of het intern getranscribeerde spacer (ITS) gebied14. Metabarcoderingsbenaderingen voor schimmels kunnen vertrouwen op verschillende genomische doelgebieden, wat de diversiteit en abundantie van de geïdentificeerde schimmelsoorten beïnvloedt. De ongelijke ITS-lengte tussen schimmelsoorten kan bevorderen tot voorkeursamplificatie en sequencing, waardoor hun abundantie onjuist wordt schat, wat leidt tot een onjuiste beoordeling van schimmelgemeenschappen15. De Fungiquant-primers zijn ontwikkeld om specifieke variabele regio's binnen het 18S rRNA-gen te targeten die een uitgebreide dekking van diverse schimmels en specificiteit vertonen in vergelijking met andere eukaryoten.

De meeste bacteriën en schimmels hebben meer dan één kopie van het beoogde gen, wat leidt tot vertekende schattingen van het celtelling. Bovendien hebben schimmels vaak multinucleaire cellen met variabele aantallen kernen per cel6. Er is aanzienlijke variatie in rRNA-genkopienummers zowel binnen als tussen taxonomische groepen, doorgaans minder dan 15 kopieën bij prokaryoten, en wordt geraamd op tussen 28 en 511 voor schimmels17. Door deze variatie worden moleculaire technieken die worden gebruikt om microbiële gemeenschapsstructuren te analyseren als semi-kwantitatief beschouwd, omdat ze de schatting van de relatieve soortenhoeveelheid in een gemeenschap18 kunnen vertekenen. Gemeten genkopienummers (GCN) worden routinematig omgezet in celabundanties met behulp van het geschatte gemiddelde GCN in de taxonomische groep van belang 18,19,20.

Sommige studies hebben metagenomische benaderingen gebruikt, omdat ze verschillende voordelen bieden ten opzichte van metabarcoding, waaronder het elimineren van amplificatiebias en de mogelijkheid om de gehele microbiële gemeenschap grondig te onderzoeken21. Daarnaast maken ze gelijktijdige vergelijking van schimmel- en bacteriële samenstellingen mogelijk, evenals hun onderlinge relaties22. Over het algemeen wordt RT qPCR vaak gebruikt om microbiële inhoud en functie23 te detecteren. qPCR heeft beperkingen in vergelijking met digitale druppel-PCR (ddPCR) voor absolute kwantificatie vanwege de gevoeligheid voor remmers, omdat het een externe standaard24 vereist.

ddPCR is een baanbrekende technologie die gebaseerd is op het opdelen van individuele amplificatiereacties in afzonderlijke druppels. Het sjabloon wordt vervolgens door PCR in elke druppel als een afzonderlijke reactie versterkt. ddPCR heeft een lage gevoeligheid voor enzymatische remmers, betere precisie, herhaalbaarheid, gevoeligheid en stabiliteit in bacteriële en schimmelkwantificatie dan qPCR25. Bovendien is het een methode die kan worden gebruikt voor absolute kwantificatie van bacteriën en schimmels in bodem5. Omdat ddPCR afhankelijk is van hetzelfde geëxtraheerde DNA dat wordt gebruikt om microbiële samenstellingsverschuivingen te beoordelen, kunnen abundantiegegevens van ddPCR direct worden gekoppeld aan gemeenschapssamenstellingsgegevens26 en worden gebruikt om de microbiële biomassa van de bodem te kwantificeren.

Deze studie biedt een methodologie voor de kwantificering van schimmels en bacteriën in bodems met behulp van digitale druppel-PCR (ddPCR). Deze geoptimaliseerde methode werd toegepast op bodems van vijf verschillende wereldwijde locaties en landgebruik. Monsterlocaties werden geselecteerd om een breed spectrum aan bodemeigenschappen, milieuomstandigheden en beheerspraktijken te omvatten, waardoor de robuustheid en algemener aanpak over diverse omgevingen heen geëvalueerd konden worden. Deze gegevens maakten het mogelijk de F:B-verhouding te bepalen als moleculaire bioindicator van de ecologische kwaliteit van de bodem. Ten slotte werd een vergelijking uitgevoerd van de geschatte microbiële biomassa tussen de microbiële ddPCR-gegevens en conventionele chloroformfumigatiemethoden.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een overzichtelijk schema van deze protocollen is weergegeven in Figuur 1. De reagentia en de gebruikte apparatuur staan vermeld in de Materiaaltabel.

1. Bodembemonstering

  1. Verzamel samengestelde topbodemmonsters (0–20 cm) van vijf wereldwijde locaties, met drie monsters van willekeurig geselecteerde punten binnen een gebied van 25 m vanaf elke locatie.
    OPMERKING: Alle monsters zijn verzameld uit landbouwsystemen die representatief zijn voor het regionale landgebruik waarin ze zich bevonden. De bodemtextuur werd gekarakteriseerd met laserdiffractie, gemeten met een laserdiffractie-deeltjesgrootte-analyzer (Tabel 1). Monsters werden bij omgevingstemperatuur vervoerd en opgeslagen bij 4 °C tot verdere analyse.

2. DNA-extractie

OPMERKING: Voer de DNA-extractie uit met een soil DNA-extractiekit volgens de instructies van de fabrikant. De kamertemperatuur voor alle stappen was 20 °C.

  1. Draai de 2 mL kraalklopbuis kort om te controleren of de kralen onderaan zijn neergezakt. Voeg 100 mg aarde en 800 μL Oplossing CD1 toe. Vortex kort om te mengen.
  2. Homogeniseer monsters grondig met een bead mill homogenizer, waarbij monsters 40 s gelyseerd zijn bij 6 m s−1.
  3. Centrifugeer een kraalklopbuis voor mechanische cellyse op 15.000 x g gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur.
  4. Breng het supernatant over naar een schone microcentrifugebuis van 2 mL.
    OPMERKING: Het supernatant kan nog steeds bodemdeeltjes bevatten.
  5. Voeg 200 μL Solution CD2 toe en laat vortex 5 seconden draaien.
  6. Centrifugeer op 15.000 x g gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur.
  7. Breng tot 700 μL supernatant over in een schone microcentrifugebuis van 2 mL, waarbij je de pellet vermijdt. De pellet moet zichtbaar zijn.
  8. Voeg 600 μL Solution CD3 toe en vortex 5 s.
  9. Laad 650 μL van het lysaat op een spinkolom en centrifugeer op 15.000 x g gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur.
  10. Verwijder de doorstroom-flow en herhaal stap 2.9 om te controleren of al het lysaat door de spinkolom is gegaan.
  11. Plaats de spinkolom in een schone 2 mL opvangbuis.
  12. Voeg 500 μL Solution EA toe aan de spinkolom. Centrifugeer op 15.000 x g gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur.
  13. Verwijder de doorstroomleiding en plaats de spinkolom terug in dezelfde 2 mL opvangbuis.
  14. Voeg 500 μL Oplossing C5 toe aan de spinkolom. Centrifugeer op 15.000 x g gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur.
  15. Verwijder de doorstroomleiding en plaats de spinkolom in een nieuwe 2 mL opvangbuis.
  16. Centrifugeer tot 16.000 x g gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur.
  17. Plaats de spinkolom in een nieuwe 1,5 mL elutionbuis.
  18. Voeg 50–100 μL Oplossing C6 toe aan het midden van het witte filtermembraan.
  19. Centrifugeer op 15.000 x g gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur. Gooi de spinkolom weg en bewaar de elue bij -20 °C.

3. Kwantificering van gezuiverd DNA

OPMERKING: Gezuiverd DNA is gekwantificeerd met behulp van een fluorometer en een dubbelstrengs (dsDNA) Broad Range (BR) assaykit volgens de instructies van de fabrikant.

  1. Bereid een werkende oplossing voor met een buffer-tot-reagensverhouding van 199:1.
  2. Voeg 10 μL van elke DNA-standaard toe aan 190 μL van de werkoplossing.
  3. Voeg 1–20 μL gezuiverd DNA toe aan 180–199 μL werkoplossing. Het uiteindelijke volume moet 200 μL zijn. Vortex en incubeer standaard- en DNA-monsters bij omgevingstemperatuur gedurende 2 minuten.
  4. Analyseer de standaarden vóór de DNA-monsters op de fluorometer met behulp van de instructies op het scherm.

4. Keuze van primer

  1. Voor de analyse van bodemmicro-organismen worden specifieke primers geselecteerd op basis van relevante referenties. Voor bacteriën werden 16S rRNA-primers gebruikt(25,27), en voor schimmels 18S rRNA-primers16.
  2. Voer amplificatie uit met behulp van de DNA-bindende kleurstof-gebaseerde real-time PCR (qPCR) mastermix en een thermische cycler. De primersequenties zijn weergegeven in Tabel 2.

5. Microbiële kwantificatie met ddPCR

  1. Ontdooien en vortexen allemaal met reagentia op ijs.
  2. Stel de ddPCR-reactie als volgt op: 0,1 μL (10 μM) voorwaarts en 0,1 μL (10 μM) omgekeerde 16S of 18S primer, 10 μL ddPCR Evagreen Supermix, 0,5 ng template DNA X μL, met nucleasevrij water (NFW) om het eindreactievolume aan te passen naar 22 μL. Creëer een negatieve regeling door NFW toe te voegen in plaats van het sjabloon voor elke kolom.
  3. Plaats de DG8 in de cartridgehouder.
  4. Plaats in totaal 20 μL van het reactiemengsel in de monsterholtes in de cartridge.
  5. Voeg 70 μL Droplet Generation Oil voor Evagreen toe aan de cartridge met het label 'olie'.
  6. Plaats de cartridge in de druppelgenerator en bedek de cartridge met een pakking.
  7. Breng 40 μL van de gegenereerde druppels over naar een 96-put (semi-skirt) plaat voor PCR-versterking.
  8. Dicht de 96-vel plaat met de plaatsealer (temperatuur, 180 °C voor 5 s).
  9. Gebruik de volgende cyclusomstandigheden met een verwarmd deksel ingesteld op 105 °C.
    OPMERKING: (a) Bacteriën: 98 °C gedurende 5 minuten, 40 cycli van; 94 °C voor 30 s, 61°C voor 60 s, 5 min bij 4 °C, 10 min bij 98 °C. (b) Schimmels: 95 °C voor 5 minuten, 40 cycli van; 95 °C voor 30 s, 55 °C voor 1 minuut, 72 °C voor 30 s, 5 minuten bij 4 °C en 5 min bij 90 °C.
  10. Breng de 96-well-plaat over naar de plaatlezer.
  11. Evalueer de kopieerconcentratie van elke put met QuantaSoft versie 1.2. Pas de drempel van de amplitude aan om negatieve en positieve druppels te scheiden.
  12. Bereken het aantal genkopieën per ng DNA in de reactie door kopieën/μL te vermenigvuldigen met het uiteindelijke reactievolume (20 μL) en te delen door de totale template-DNA-invoer in de reactie als volgt: (kopieert μL-1 x reactievolume) / Totale DNA-invoer in de reactie.
  13. Bereken het totale aantal genkopieën per ng geëxtraheerd DNA door de genkopieën per ng te vermenigvuldigen met het totaal geëxtraheerd DNA (ng) als volgt: (genkopieën per ng x totaal geëxtraheerd DNA).
  14. Bereken de genkopieën per gram door het totale aantal genkopieën per ng DNA te delen door de hoeveelheid drooggewicht van de bodem die bij de extractie is verwerkt (g), als volgt:
    genkopieën per gram = (totale genkopieën per ng DNA geëxtraheerd / gram drooggewicht van de bodem (GDW) van de in de extractie verwerkte bodem).
  15. Bereken het celaantal per gdw door de genkopieën om te zetten met behulp van het gemiddelde genkopienummer (GCN) volgens de vergelijking:
    Celtelling = genkopieën per gram / Gemiddelde genkopieën cel-1).
  16. Converteer de celnummers naar Microbial biomassa koolstof (MBC) met behulp van de volgende vergelijking:
    MBC voor 16S (mg C g-1 grond) = cellen gdw-1 × (100 fg cel-1) × 10−15 (g fg-1) × 103(mg g-1)28
    MBC voor 18S (mg C g-1 grond) = cellen gdw-1 × (6 fg cel-1) x 10−12 (g fg-1) × 103 (mg g-1)29
    Het volledige proces wordt uitgelegd in Figuur 2.
    OPMERKING: De gemiddelde 16S rRNA-genkopie (gemiddelde ± SD) voor 46 bacteriële phyla20 werd berekend en gebruikt als correctiefactor voor bacteriën, met een eindwaarde van 2,48. Voor schimmels werd het genkopienummer berekend met een correctiefactor van 113 volgens Lofgren et al.17. Microbieel biomassakoolstof (MBC) werd geschat op basis van ddPCR-afgeleide celtellingen, met behulp van veronderstelde cellulaire koolstofinhoud van 100 fg per bacteriële cel28, en 6 pg per schimmelcel29.

6. Bodemmoleculaire analyse uit whole genome sequencing

  1. Bereid de sequencingbibliotheek voor volgens het Oxford Nanopore Technologies SQK-NBD114 protocol, met behulp van de Native Barcoding Kit 24 V14 (SQK-NBD114.24) (zie Materiaaltabel). Zorg ervoor dat je één barcode gebruikt, die in de kit wordt geleverd, voor elk monster.
  2. Sequencen de voorbereide bibliotheek met een Oxford Nanopore Technologies R10.4.1 flowcel.
  3. Voer basecalling uit in MinKnow tijdens de sequencing-run door het super accuracy (SUP) model te selecteren en barcode triming "AAN" te selecteren. Dorado-versie: 0.7.2+9ac85c6.
  4. Voer taxonomische classificatie uit van DNA-sequentieleesopdrachten met behulp van de taxonomische classificator Kraken2 (v2.1.3)30 tegen de NCBI niet-redundante eiwitdatabase (nr), betrouwbaarheid 0,05.
  5. Bekijk de Kraken2-rapportbestanden op totale classificaties van bacteriën en schimmels.
  6. Bereken de relatieve hoeveelheid bacteriën en schimmels voor elk monster.

7. Schatting van koolstof van microbiële biomassa in de bodem door chloroformfumigatie

  1. Weeg verse bodemmonsters in voorgewogen pannen en droog ze 24 uur in een oven op 105 °C.
  2. Bereken het bodemvochtgehalte door het droge bodemgewicht af te trekken van het verse grondgewicht en het verschil te delen door het verse bodemgewicht.
    Vochtgehalte (%) = ((W nat – Wdroog)/ Wdroog) × 100
  3. Gebruik het vochtgehalte om de droge stof van de bodem te berekenen.
    Droogstof (%) = 100 – Vochtgehalte (%)
  4. Voeg 5 g aarde toe aan twee afzonderlijke 50 mL centrifugebuizen, gelabeld als ongefumigeerd en fumigeerd.
  5. Voeg in totaal 25 mL van 0,5 M K2SO4 toe aan de ongefumigeerde gelabelde buis.
  6. Schud de ongefumigeerde monsters in een orbitale shaker gedurende 1 uur op kamertemperatuur.
  7. Voeg 2 mL ethanolvrije chloroform direct toe aan de grond in de buisjes die als fumiged zijn gelabeld. Sluit en sluit de deksels vast met parafilm, en incubeer 24 uur in het donker bij kamertemperatuur.
  8. Centrifugeer het ongefumigeerde monster gedurende 10 minuten op 2.500 x g bij kamertemperatuur.
  9. Dekanteer het supernatant uit het niet-fumigeerde monster, zeef door een 0,45 μm cellulosefilter en bewaar bij -20 °C.
  10. Verwijder de deksels van de gefumigeerde monsters en laat het 2 uur in de dampafzuigkap ventileren, voer dan de K2SO4-extractie uit (herhaal stappen 5-9) en bewaar bij -20 °C.
  11. Meet de koolstofconcentratie van het extract voor zowel 'gefumigeerde' als 'niet-fumigeerde' monsters, met behulp van een Total Organic Carbon-analyzer.
  12. Bereken microbiële biomassa koolstof (MBC) met de volgende vergelijking: MBC = (Fumigated C-inhoud-Niet-fumigated C-inhoud)/0,45. Normaliseer voor per gram droge bodem.

8. Schatting van het gehalte aan organische stof in de bodem

  1. Droog een porseleinen kroes in een koeloven op 105 °C gedurende 30 minuten en weeg deze na afkoeling tot 20 °C (WC).
  2. Doe tot 2 g aarde in de gedroogde kroes en weeg opnieuw.
  3. Droog de bodemmonsters in de gevulde smeltkroes in een luchtoven bij 105 °C gedurende 24 uur.
  4. Plaats het in een afgesloten droogapparaat om af te koelen en opnieuw te wegen (WZ).
  5. Verwarm een dempoven voor tot 550 °C en plaats vervolgens de kroes met de grond 4 uur in de oven.
  6. Verwijder de smeltkroes met aarde uit de oven en plaats deze in een droogmachine om af te koelen.
  7. Weeg de smeltkroes af met de grond (WA).
  8. Meet het percentage SOM door het verschil in drooggewicht voor en na de incubatie bij 550 °C te berekenen.
    SOMLOI = [(WS –W A)/(WS –WC)] × 100

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bodemmonsters werden verzameld op vijf locaties en het organische materiaalgehalte werd bepaald door verlies bij ontsteking. Het organisch materiaalgehalte varieerde van 3,38% tot 10,34% over elk van de gebruikte bodems (Tabel 1). DNA-extracties werden uitgevoerd op elk grondmonster in drievoudige uittrek, met resulterende DNA-opbrengsten variërend van 32 ng tot 4.590 ng per gram droge bodem (Figuur 3A).

De DNA-concentratie verschilde significant tussen bodems met variërend organisch materiaal (eenrichtings-ANOVA p < 0,0001, R2=0,97). De bodem met het laagste organisch materiaalgehalte, bodem A, vertoonde niet de laagste DNA-concentratie. Bodem E, die het hoogste organische materiaalgehalte had, had echter een significant hogere DNA-concentratie van alle andere bodems (A–D, p < 0,0001), terwijl bodem B de laagste had, wat significant verschilde van A en D (p < 0,05). Het ddPCR-protocol werd uitgevoerd op DNA dat uit elk van de bodemmonsters werd gezuiverd met behulp van de 16S en 18S rRNA genprimers. Het aantal genkopieën per gram drooggewicht van de bodem voor elk van de 16S (Figuur 3B) en 18S rRNA (Figuur 3C) genen werd bepaald met behulp van de ddPCR. Over alle bodemmonsters waren er minder kopieën van het 18S rRNA-gen dan van het 16S rRNA-gen. Tukey's post-hoc tests toonden aan dat bodem B de minste kopieën van 16S en 18S rRNA-genen had, met gemiddeld respectievelijk 8,8 x 107 en 4,6 x 106 genkopieën per gram droge bodem. Bodem E verschilde significant van alle andere bodems en vertoonde het grootste aantal 16S- en 18S rRNA-genkopieën met respectievelijk 4,4 x 109 en 2,5 x 109 genkopieën per gram droge bodem. Schimmelkopieën in bodems A–D verschilden niet significant van elkaar, terwijl bacteriële kopieën in bodem D significant verschilden van bodem B en E.

Whole genome shotgun (WGS) sequencing werd toegepast op DNA dat uit elk van de bodemmonsters was gezuiverd, en taxonomische classificaties werden uitgevoerd met Kraken2 tegen de NCBI nr-database. Het totale aantal DNA-sequentiemetingen geclassificeerd tegen bacteriën en schimmels werd gebruikt om de schimmel:bacteriële verhouding (F:B) voor elke bodem te berekenen en vergeleken met schimmel:bacteriële verhoudingen berekend uit genkopieën geschat door ddPCR (Aanvullende Figuur 1). De F:B-verhoudingen verkregen met ddPCR varieerden van 0,022 tot 0,66 over alle bodemmonsters en waren hoger dan die verkregen uit whole genome sequencing. Het hoogste gemiddelde F:B werd waargenomen in bodem E, met een F:B van 0,56 voor ddPCR en 0,038 voor de WGS-methoden. Bovendien werd er een groter bereik aan F:B-waarden geïdentificeerd in de bodemmonsters met ddPCR dan met WGS. Daarnaast werd een positieve correlatie waargenomen tussen de F:B-verhouding bepaald door de ddPCR-methode en WGS-gegevens (r = 0,59, R2 = 0,35, p = 0,019), zoals weergegeven in Aanvullende Figuur 1.

Een gemiddeld aantal genkopieën voor bacteriën en schimmels werd gebruikt om berekende genkopieën om te zetten naar het aantal bacterië- en schimmelcellen in de oorspronkelijke monsters (Aanvullende Figuur 2). Deze gegevens werden gecombineerd om het totale aantal microbiële cellen in de bodem te schatten (Figuur 3D) en verschilden significant tussen bodems (eenrichtings-ANOVA p < 0,0001). Tukey's paargewijze vergelijkingsanalyse toonde aan dat het hoogste microbiële gehalte werd waargenomen in bodem E, terwijl het laagste microbiële gehalte werd gevonden in monsters uit bodem B, wat significant verschilde van A, D en E.

Chloroformfumigatie werd uitgevoerd op elk grondmonster in drievoud om het totale microbiële biomassakoolstofgehalte (MBC) in elk monster te schatten (Figuur 4A). Tussen 3,6 en 9,6 mg koolstof per gram droge bodem werd geïdentificeerd over de gebruikte bodems, zonder significante verschillen tussen elk van de monsters (eenrichtings-ANOVA p = 0,266). Een gemiddeld koolstofgehalte voor bacteriële en schimmelcellen werd gebruikt om het door ddPCR geschatte aantal microbiële cellen om te zetten naar een geschatte totale microbiële biomassa koolstof. Deze ddPCR-afgeleide schattingen werden vergeleken met de chloroformfumigatiemethode (Figuur 4B). Om de relatie tussen MBC gemeten met chloroformfumigatie en de ddPCR-methode te beoordelen, werd een Pearson-correlatie uitgevoerd (n = 15). Er werd een positieve correlatie gevonden tussen de twee methoden (r = 0,43, R2 = 0,18, p-waarde = 0,05). Uitschieters uit bodem E, gekenmerkt door het hoogste organisch materiaalgehalte, droegen waarschijnlijk onevenredig bij aan dit marginaal significante resultaat (Figuur 4B).

figure-results-1
Figuur 1: Een overzicht van de verwerking van bodemmonsters. De figuur illustreert de moleculaire methoden die bodem-DNA gebruiken voor microbiële kwantificering en de conventionele methoden voor het meten van microbiële biomassa, koolstof en organisch materiaal in de bodem. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Stroomdiagram van het celtellingsproces van ddPCR-kopieën voor zowel 16S als 18S, tot de definitieve microbiële biomassa koolstofschatting, met stappen 5.11–5.16 van het protocol. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Microbiële kwantificatie van bodems. (A) De gemiddelde DNA-concentratie gezuiverd uit elk van de bodemmonsters. (B) Gemiddeld totaal aantal 16S rRNA-genkopieën per gram drooggewicht van de bodem met ddPCR. (C) Gemiddeld totaal aantal 18S rRNA-genkopieën per gram drooggewicht van de bodem met behulp van ddPCR. (D) Gemiddeld totaal aantal microbiële cellen per gram drooggewicht over bodemmonsters. Alle foutbalken tonen de standaardfout van het gemiddelde. Een eenrichtings-ANOVA en de daaropvolgende post-hoc test van Tukey voor paargewijze vergelijkingen werden uitgevoerd, en de significante verschillen worden weergegeven met behulp van compact letterdisplay (significantiedrempel = 0,05). Monsters worden geordend van laagste tot hoogste OM%. Bodemoorsprong (OM%) A: Nederland (3,38), B: Irak (5,14), C: China (6,41), D: VK (8,19) en O: VK (10,34). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Microbieel biomassakoolstof gemeten met chloroformfumigatie-extractie en gengebaseerde celschattingen. (A) MBC geëxtraheerd door chloroformfumigatie - gerangschikt van laag tot hoog organisch materiaalgehalte. Foutbalken tonen de standaardfout van het gemiddelde. Een eenrichtings-ANOVA en de daaropvolgende post-hoc test van Tukey voor paargewijze vergelijkingen werden uitgevoerd, en de significante verschillen worden weergegeven met behulp van compact letterdisplay (significantiedrempel = 0,05). (B) MBC geschat uit de celabundantie (cel GDW -1) afgeleid van ddPCR-genkopienummer en omgezet in biomassakoolstof, uitgezet tegen totale organische materie voor hetzelfde monster. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

VoorbeeldBodemoorsprongpHVochtgehalte %Organisch Materiaal%TextuurLandgebruik
ATexel, Nederland7.1619.043.38Zandige leemTuinbouw
BNajaf, Irak7.588.335.14Slibige leemRijst
CJiangxi, China4.118.456.41Slibige leemSesam/Raapzaad
DCambridge, VK6.8121.88.19Slibige leemTarwe
EExeter, VK5.4420.2710.34Slibige leemGrasland

Tabel 1: Fysisch-chemische eigenschappen en landgebruikskenmerken van vijf bodemmonsters (A–E), voor de bepaling van microbiële biomassa.

DoelBPVooroverAchterzijdeReferentie
16S rRNA1805′- ACTCCTACGGGAGGCAGCAG5′- ATTACCGCGGCTGCTGGGG(Le Geay et al., 2024; Ovreås et al., 1997)
18S rRNA3515′-GGRAAACTCACCAGGTCCAG5′-GSWCTATCCACCACGA(Liu et al., 2012)

Tabel 2: Primerparen geselecteerd om het 16S- en 18S-rRNA-gen te targeten met behulp van de ddPCR.

Aanvullende Figuur 1: Een correlatie tussen de F:B-verhouding voor alle bodemmonsters, bepaald door de ddPCR-methode en WGS. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Figuur 2: Aantal cellen in verschillende bodemmonsters gemeten met de ddPCR-methode richt zich op: (A) bacteriën; en (B) schimmels. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bodemmicroben zijn de belangrijkste afbrekers in terrestrische ecosystemen en spelen een essentiële rol in nutriëntencyclus en als koolstofopslag in bodem. Ondanks het belang van bodemmicroben is het nauwkeurig kwantificeren van hun absolute hoeveelheid met genkopie-gebaseerde methoden een uitdaging. Dit komt door veel factoren, zoals het variabele aantal doelgenen in verschillende soorten. Deze studie toont aan hoe bodemmicrobiële biomassa kan worden gekwantificeerd met ddPCR door prokaryoten en eukaryoten te targeten met behulp van de respectievelijke 16S- en 18S-rRNA-gencoderingsregio's. De hoogste F:B-verhouding werd waargenomen in bodem E, waarbij dit monster ook het hoogste percentage organische stof had. De op één na hoogste F:B-verhouding werd gezien in monster C, wat correleerde met de hoge zuurgraad van deze bodems. Dit werd verwacht voor monsters C en E, omdat schimmelgroei toeneemt met een lagere pH31. Volledige genoomsequencing werd uitgevoerd op dezelfde DNA-extracten die werden gebruikt voor ddPCR-methoden. De F:B-verhouding tussen WGS en ddPCR werd vergeleken. De F:B-verhouding berekend op basis van WGS-gegevens was lager voor alle geanalyseerde monsters dan de F:B-verhouding berekend uit ddPCR-gegevens. De algemene trend van de F:B-verhouding tussen de monsters was echter visueel vergelijkbaar tussen beide methoden. Dit leverde hogere F:B-verhoudingen op bodemmonsters op in vergelijking met volledige genoomsequencing en toonde een grotere F:B-verhoudingsvariabiliteit tussen verschillende bodemtypen. De lagere F:B-verhouding die uit de WGS-gegevens werd waargenomen, wordt waarschijnlijk veroorzaakt door de verschillen in genoomgrootte tussen schimmels en bacteriën, en de schimmelsequenties kunnen ondervertegenwoordigd zijn zonder verrijking32. Bovendien toonde Bodem A, ondanks dat het het laagste organisch materiaalgehalte heeft, niet het laagste aantal microbiële kopieën en microbiële biomassa koolstof, wat benadrukt dat het organisch materiaalgehalte niet altijd direct gecorreleerd is met microbiële biomassa. Opmerkelijk is dat de waargenomen trends tussen de oorspronkelijke DNA-concentratie (Figuur 3A) en het totale aantal microbiële cellen (Figuur 3D) visueel vergelijkbaar waren, wat suggereert dat DNA-concentratie een goede proxy is voor microbiële biomassa.

ddPCR maakt nauwkeurige kwantificatie van genkopienummers in bodemmonsters mogelijk, en deze methode kan worden gebruikt om het totale aantal microbiële cellen te schatten. Er zijn echter beperkingen die in overweging moeten worden genomen. Het aantal 16S- en 18S-rRNA-genkopieën varieert sterk tussen microbiële taxa23. Als gevolg hiervan kan het gebruik van één enkele correctiefactor voor het aantal genkopieën leiden tot over- of onderschatting van de microbiële abundantie in een monster33. Deze beperking kan worden opgelost door voorkennis van de microbiële gemeenschap18 te integreren, gebruik te maken van gegevens van volledige genoomsequencing en passende genkopienummercorrecties toe te passen die representatief zijn voor de specifieke bodemmicrobiota. Hoewel moleculaire methoden nog steeds een schatting geven in plaats van een exacte telling, bieden ze een nauwkeurigere voorspelling van de microbiële abundantie. In combinatie met data van gemeenschapssamenstelling maakt deze benadering interpretaties mogelijk die verder gaan dan alleen relatieve abundantie19,34.

Microbieel biomassakoolstof (MBC), geschat met behulp van chloroformfumigatie, toonde geen significante verschillen tussen de geanalyseerde monsters, hoewel er grote graden van variatie in MBC werden waargenomen tussen monsters A–D. Daarentegen werden significante verschillen vastgesteld in het totale aantal microbiële cellen gemeten met de ddPCR-methode, wat aangeeft dat deze moleculaire benadering mogelijk een grotere resolutie biedt dan conventionele technieken. Het berekenen van microbiële biomassa koolstof uit microbiële celaantallen heeft echter zijn eigen beperkingen. Variabiliteit in celgrootte kan de omzetting van celtellingen naar biomassa beïnvloeden. Net als het gebruik van een enkele conversiefactor voor genkopieaantal, kan het gebruik van een enkele conversiefactor voor bacteriële en schimmelkoolstofinhoud leiden tot over- of onderschatting van microbiële biomassa koolstof.

Bovendien kunnen DNA-gebaseerde methoden bijzonder problematisch zijn in vergelijking tussen bodems die grote verschillen vertonen in de mate van dominantie tussen bacteriën en schimmels. Zowel DNA-opbrengst als GCN kunnen ook worden beïnvloed door de keuze van DNA-extractiemethode en primerontwerp35,36, waardoor cross-lab vergelijkingen moeilijk zijn37. Bovendien kunnen zowel GCN- als DNA-opbrengstmethoden kwetsbaar zijn voor overschatting door het zogenaamde "relic DNA", d.w.z. DNA in dode organismen of gebonden aan klei14,38. Hoewel ddPCR-methoden betere precisie en herhaalbaarheid hebben getoond, zijn enkele nadelen onder andere de ingewikkelde processen, hoge kosten en het gebruik van onspecifieke DNA-kleurstof bij gebruik van de Evagreen chemistry5. Dit kan zwakke vals-positieven veroorzaken, waardoor het moeilijk wordt om positieve druppels van negatieve druppels te onderscheiden, en een lichte drempelcorrectie kan de F:B-verhouding beïnvloeden wanneer genkopieën laagzijn op 14. Om het aantal monsters dat met deze ddPCR-methode verwerkt kan worden te vergroten, kan automatisering met vloeistofbehandelingsrobotica worden gebruikt voor DNA-extracties en reactie-opstelling39. Daarnaast maakt het nieuwe ddPCR-systeem grotere multiplexing mogelijk, waarbij druppels voor 96 monsters gelijktijdig worden gegenereerd.

Het is belangrijk op te merken dat alle metingen van microbiële biomassa schattingen zijn en gegeneraliseerde conversiefactoren omvatten om de getallen37 vast te stellen. Daarom moeten vergelijkingen tussen methoden met voorzichtigheid worden uitgevoerd, omdat het onbekend is welke het meest nauwkeurig zijn. Desondanks zijn chloroform-fumigatie-extractiemethoden de afgelopen decennia veel gebruikt, waarbij chloroformdampen worden gebruikt om de bodem te ontsmetten. Dit heeft veel zorgen opgeroepen vanwege de toxiciteit voor mensen en het milieu, evenals de effectiviteit bij het lyseren van microbiële cellenin de bodem. Daarnaast kan chloroformfumigatie leiden tot een overschatting van MBC geproduceerd uit niet-levende bronnen, zoals plantresidu41. Ten slotte is deze methode ook afhankelijk van relatief grote hoeveelheden bodem in vergelijking met andere moleculaire methoden die zeer weinig bodem vereisen (<500 mg).

Deze studie levert bewijs dat ddPCR-gebaseerde methoden voor het meten van bodemmicrobiële biomassa over verschillende bodems robuust zijn en niet worden beïnvloed door verschillende bodemtypes en potentiële inhibitoren. Het succes van deze methode wordt beïnvloed door het oorspronkelijke DNA-monster, en daarom is het waarborgen van effectieve DNA-zuivering uit de monsters cruciaal. Deze methode toont veelbelovende mogelijkheden voor microbiële detectie en kwantificatie in verschillende bodemtypen en texturen, en vult bestaande methoden voor microbiële biomassaschatting aan en maakt waardevolle toekomstige toepassingen mogelijk bij het monitoren van bodemgezondheid en schaalbaarheid voor regionale of wereldwijde microbioombewaking.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Auteurs geven geen belangenconflicten aan.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij danken Dr. Nina Lindstrom-Friggens, Dr. Liz Cressey, Dr. Joanna Zaragoza-Castells, Angela Elliott, Dr. Kees Jan van Groenigen en Prof. Iain Hartley. We willen ook de landeigenaren bedanken voor het leveren van de bodems voor deze studie. Dit onderzoek werd gefinancierd door Shell Research Ltd (CW648947-PT34767). De datasets die tijdens de huidige studie zijn gegenereerd, zijn beschikbaar in de NCBI Sequence Read Archive-repository PRJNA1305539.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Bettersizer S3 Plus Bettersize, ChinaBT-803
CentrifugeThermoscientific SL16 
Chloroform ThermoScientificL14759.AU 
ddPCR 96-Well PlatesBio-Rad, Watford, UK12001925
ddPCR Droplet Reader Oil Bio-Rad, Watford, UK1863004
Dessicator Davisil
DG8 Cartridge HolderBio-Rad, Watford, UK1863051
DG8 Cartridges for QX200/QX100 Droplet GeneratorBio-Rad, Watford, UK1864008
DG8 Gaskets for QX200/QX100 Droplet GeneratorBio-Rad, Watford, UKQ33265
DNeasy Power Soil pro kit Qiagen, Germany47017
double-stranded (dsDNA) Broad range (BR) assay kitInvitrogen, GermanyQ33230
FastPrep-24 5G MP Biomedicals, UK116005500
GridION Oxford Nanopore Technologies, UKGRD-MK1CAPX
K2SO4Merck, UK7778-80-5
Mag-Bind Magnetic beadsOmega Bio-tek, USAM1378-01
MinION flow cellOxford Nanopore Technologies, UKFLO-MIN114
Muffled furnaceCarbolite AAF1100
Native barcoding kit 24Oxford Nanopore Technologies, UKSQK-NBD114.24
PCR Plate Heat Seal, foil, pierceable Bio-Rad, Watford, UK1814040
PX1 PCR Plate SealerBio-Rad, Watford, UK1814000
Qubit FluorometerInvitrogen, GermanyQ33226
QX200 Droplet Digital PCR SystemBio-Rad, Watford, UK1864001
QX200 ddPCR EvaGreen SupermixBio-Rad, Watford, UK186-4033
QX200 Droplet Generation Oil for EvaGreen Bio-Rad, Watford, UK1864005
QXDx Droplet Generator Bio-Rad, Watford, UK12001049
SENSOQUEST LABCYCLER Geneflow, Germany1120280125

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jobbágy, E. G., Jackson, R. B. The vertical distribution of soil organic carbon and its relation to climate and vegetation. Ecol Appl. 10 (2), 423-436 (2000).
  2. Sanderman, J., Hengl, T., Fiske, G. J. Soil carbon debt of 12,000 years of human land use. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (36), 9575-9580 (2017).
  3. He, Y., Li, J., Siemann, E., Li, B., Xu, Y., et al. Plant invasion increases soil microbial biomass carbon: meta-analysis and empirical tests. Glob Change Biol. 31 (3), e70109(2025).
  4. de Menezes, A. B., Richardson, A. E., Thrall, P. H. Linking fungal-bacterial co-occurrences to soil ecosystem function. Curr Opin Microbiol. 37, 135-141 (2017).
  5. Wang, D., et al. ddPCR surpasses classical qPCR technology in quantitating bacteria and fungi in the environment. Mol Ecol Resour. 22 (7), 2587-2598 (2022).
  6. Djemiel, C., et al. Biogeographical patterns of the soil fungal:bacterial ratio across France. mSphere. 8 (5), e0036523(2023).
  7. Bailey, V. L., Smith, J. L., Bolton, H. Fungal-to-bacterial ratios in soils investigated for enhanced C sequestration. Soil Biol Biochem. 34 (7), 997-1007 (2002).
  8. Vance, E. D., Brookes, P. C., Jenkinson, D. S. Microbial biomass measurements in forest soils: the use of the chloroform fumigation-incubation method in strongly acid soils. Soil Biol Biochem. 19 (6), 697-702 (1987).
  9. Frostegård, Å, Bååth, E., Tunlio, A. Shifts in the structure of soil microbial communities in limed forests as revealed by phospholipid fatty acid analysis. Soil Biol Biochem. 25 (6), 723-730 (1993).
  10. Cao, Z., Li, D., Han, X. The fungal to bacterial ratio in soil food webs, and its measurement. Acta Ecol Sin. 31 (20), 6050-6058 (2011).
  11. Frossard, A., Hammes, F., Gessner, M. O. Flow cytometric assessment of bacterial abundance in soils, sediments and sludge. Front Microbiol. 7, 903(2016).
  12. Joergensen, R. G., et al. A hitchhiker’s guide: Estimates of microbial biomass and microbial gene abundance in soil. Biol Fertil Soils. 60 (4), 457-470 (2024).
  13. Fierer, N., Wood, S. A., Bueno de Mesquita, C. P. How microbes can, and cannot, be used to assess soil health. Soil Biol Biochem. 153, 108111(2021).
  14. Laine, M. B., Taipale, S. J., Tiirola, M. Comparison of methods for assessing fungi-to-bacteria ratio of soil. Biol Fertil Soils. 61 (5), 941-954 (2025).
  15. De Filippis, F., Laiola, M., Blaiotta, G., Ercolini, D. Different amplicon targets for sequencing-based studies of fungal diversity. Appl Environ Microbiol. 83 (17), e00905-e00917 (2017).
  16. Liu, C. M., et al. FungiQuant: A broad-coverage fungal quantitative real-time PCR assay. BMC Microbiol. 12, 255(2012).
  17. Lofgren, L. A., et al. Genome-based estimates of fungal rDNA copy number variation across phylogenetic scales and ecological lifestyles. Mol Ecol. 28 (4), 721-730 (2019).
  18. Angly, F. E., et al. W. CopyRighter: A rapid tool for improving the accuracy of microbial community profiles through lineage-specific gene copy number correction. Microbiome. 2 (1), 11(2014).
  19. Kembel, S. W., Wu, M., Eisen, J. A., Green, J. L. Incorporating 16S gene copy number information improves estimates of microbial diversity and abundance. PLoS Comput Biol. 8 (10), e1002743(2012).
  20. Pan, P., Gu, Y., Sun, D. L., Wu, Q. L., Zhou, N. Y. Microbial diversity biased estimation caused by intragenomic heterogeneity and interspecific conservation of 16S rRNA genes. Appl Environ Microbiol. 89 (5), e0210822(2023).
  21. Chacón-Vargas, K., Torres, J., Giles-Gómez, M., Escalante, A., Gibbons, J. G. Genomic profiling of bacterial and fungal communities and their predictive functionality during pulque fermentation by whole-genome shotgun sequencing. Sci Rep. 10 (1), 15115(2020).
  22. Bahram, M., et al. Metagenomic assessment of the global diversity and distribution of bacteria and fungi. Environ Microbiol. 23 (1), 316-326 (2021).
  23. Smith, C. J., Osborn, A. M. Advantages and limitations of quantitative PCR (Q-PCR)-based approaches in microbial ecology: Application of Q-PCR in microbial ecology. FEMS Microbiol Ecol. 67 (1), 6-20 (2009).
  24. Hindson, B. J., et al. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Anal Chem. 83 (22), 8604-8610 (2011).
  25. Le Geay, M., Mayers, K., Küttim, M., Lauga, B., Jassey, V. E. J. Development of a digital droplet PCR approach for the quantification of soil micro-organisms involved in atmospheric CO2 fixation. Environ Microbiol. 26 (6), e16666(2024).
  26. Hansen, P. M., Semenova-Nelsen, T. A., Platt, W. J., Sikes, B. A. Recurrent fires do not affect the abundance of soil fungi in a frequently burned pine savanna. Fungal Ecol. 42, 100852(2019).
  27. Ovreås, L., Forney, L., Daae, F. L., Torsvik, V. Distribution of bacterioplankton in meromictic Lake Saelenvannet, as determined by denaturing gradient gel electrophoresis of PCR-amplified gene fragments coding for 16S rRNA. Appl Environ Microbiol. 63 (9), 3367-3373 (1997).
  28. Whitman, W. B., Coleman, D. C., Wiebe, W. J. Prokaryotes: The unseen majority. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (12), 6578-6583 (1998).
  29. Cheng, J. Y. W., Chan, C. K., Lee, C. T., Lau, A. P. S. Carbon content of common airborne fungal species and fungal contribution to aerosol organic carbon in a subtropical city. Atmos Environ. 43 (17), 2781-2787 (2009).
  30. Wood, D. E., Lu, J., Langmead, B. Improved metagenomic analysis with Kraken 2. Genome Biol. 20 (1), 257(2019).
  31. Rousk, J., Brookes, P. C., Bååth, E. Contrasting soil pH effects on fungal and bacterial growth suggest functional redundancy in carbon mineralization. Appl Environ Microbiol. 75 (6), 1589-1596 (2009).
  32. Xie, Z., Canalda-Baltrons, A., d’Enfert, C., Manichanh, C. Shotgun metagenomics reveals interkingdom association between intestinal bacteria and fungi involving competition for nutrients. Microbiome. 11 (1), 275(2023).
  33. Větrovský, T., Baldrian, P. The variability of the 16S rRNA gene in bacterial genomes and its consequences for bacterial community analyses. PLoS One. 8 (2), e57923(2013).
  34. Doyle, B., et al. Absolute quantification of prokaryotes in the microbiome by 16S rRNA qPCR or ddPCR. Nat Protoc. 20, 3471-3476 (2025).
  35. Frostegård, A., et al. Quantification of bias related to the extraction of DNA directly from soils. Appl Environ Microbiol. 65 (12), 5409-5420 (1999).
  36. Lee, E., Lim, H. J., Son, A. Discrepancies in qPCR-based gene quantification and their dependencies on soil properties, inhibitor presence, and DNA extraction kit types. RSC Adv. 15 (25), 19656-19664 (2025).
  37. Buell, Z. W., et al. Interrelationships among methods of estimating microbial biomass across multiple soil orders and biomes. Soil Biol Biochem. 208, 109844(2025).
  38. Carini, P., et al. Relic DNA is abundant in soil and obscures estimates of soil microbial diversity. Nat Microbiol. 2 (3), 16242(2016).
  39. Child, H. T., et al. Automated environmental metagenomics using Oxford nanopore sequencing. BMC Genomics. 26 (1), 835(2025).
  40. Paliaga, S., Laudicina, V. A., Muscarella, S. M., Said-Pullicino, D., Badalucco, L. Comparison of different methods for estimating microbial biomass in biochar-amended soils. Soil Biol Biochem. 203, 109733(2025).
  41. Setia, R., Verma, S. L., Marschner, P. Measuring microbial biomass carbon by direct extraction: comparison with chloroform fumigation-extraction. Eur J Soil Biol. 53, 103-106 (2012).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

BodemmicrobenddPCR kwantificering16S rRNA18S rRNAmicrobi le biomassa koolstofextractie van bodem DNAschimmel bacterieverhoudingbeoordeling van bodemgezondheid

Gerelateerde artikelen