Methodenartikel

Fluorescentie-gebaseerde calciumbeeldvorming in primaire epitelkweken van de menselijke luchtweg met behulp van geautomatiseerde celsegmentatie

247 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/69470

⸱

22 mei 2026

 ,  , 
1Molecular Medicine, Hospital for Sick Children, 2Department of Biochemistry, University of Toronto, 3Department of Physiology, University of Toronto

In dit artikel

Samenvatting

Levendcelbeeldvorming van calciumsignalering wordt uitgebreid gebruikt om calciummobilisatie te bestuderen in stabiele cellijnen die in monolagen zijn gekweekt. Dit protocol beschrijft fluorescentiebeeldvorming van calciumsignalering in levende cellen met behulp van levende-celkleurstoffen op complex, primair weefsel, en maakt ook gebruik van machine learning-software om de fluorescentieintensiteit van duizenden individuele cellen gelijktijdig te kwantificeren, waardoor analyses worden gestroomlijnd.

Samenvatting

Calciumsignalering is cruciaal in tal van biologische processen, wat de noodzaak versterkt om methoden te ontwikkelen om calciumflux in primair weefsels te bestuderen. De studie van calciumsignalering bij een enkelcelresolutie in complexe primaire epitheelculturen is uitdagend en daarom blijft slecht onderzocht. Deze studie presenteert methoden die zijn aangepast voor het monitoren van levende calciumsignalering in primaire luchtwegepitelculturen en nieuwe benaderingen voor analyses gebaseerd op machine learning. Met patiëntafgeleide primaire luchtwegepitelculturen, gedifferentieerd bij ALI (lucht-vloeistofinterface), geladen met een extrinsieke fluorescerende indicatorkleurstof, werd calciummobilisatie gemeten op enkelcelresolutie met behulp van een epifluorescentiemicroscoop. We hebben een nieuwe software ontwikkeld die machine learning-gebaseerde celsegmentatie gebruikt om fluorescentieintensiteiten toe te wijzen aan verschillende cellen in de loop van de tijd. Over het algemeen maken de aangepaste beeldvormingsopstelling en software een snelle en onbevooroordeelde aanpak mogelijk voor het analyseren van individuele cellen binnen de primaire epitheelculturen. Het hier gepresenteerde stapsgewijze protocol zal toekomstige studie van calcium in individuele cellen en celtypen die de primaire epitheelculturen vormen, mogelijk maken.

Inleiding

Veranderingen in intracellulaire calciummobilisatie bepalen een breed scala aan cellulaire processen, waaronder veranderingen in genexpressie en modulatie van aangeboren immuunresponsen 1,2. Intracellulaire calciumniveaus kunnen worden veranderd door afgifte uit intracellulaire calciumvoorraden, zoals het endoplasmatisch reticulum en mitochondriën 1,2,3. Extracellulaire calciuminstroom in de intracellulaire ruimte kan ook cytosolisch calcium veranderen via zowel passief als actief transport2. Levende celbeeldvorming van calciummobilisatie wordt voornamelijk getest met intracellulaire kleurstoffen of genetisch gecodeerde kleurstoffen, GCaMP (Green Calcium-activated Multimer/Protein)4. Algemeen in de literatuur zijn AM (acetoxymethyl) geconjugeerde kleurstoffen, die het in staat stellen dat de kleurstof het plasmamembraan 5,6,7,8 kan doordringen. Bij het binnendringen van de cel wordt de AM-helft gesplitst door endogene intracellulaire esterases, en krijgt de kleurstof een negatieve lading, waardoor deze wordt gevangen in de cytosolische ruimte9. Door deze toegevoegde lading kan de kleurstof worden uitgepompt door plasmamembraanresidente organische anionkanalen. Daarom wordt probenecide, een remmer van organische anion-effluxtransporters, toegevoegd om cellulaire efflux van de kleurstof te voorkomen en het optimale cytosolische signaal10,11 te behouden. Studies maken vaak gebruik van Fura-2 AM, een ratiometrische kleurstof, en Fluo-4AM, een intensitometrische kleurstof, om calciumsignalering te testen op stabiele cellijnen die in een monolaag zijn gekweekt. Deze studie maakt gebruik van een protocol dat is aangepast voor epifluorescentiebeeldvorming van meerlaagse culturen die aan de lucht-vloeistofgrens zijn gekweekt met behulp van de recent ontwikkelde intensitometrische calciumkleurstof Cal-520 AM, die een verhoogde gevoeligheid heeft ten opzichte van Fluo-4 AM. Het is daarom geschikt om subtiele signalen robuust te visualiseren met een enkele celresolutie uit complexe primaire epitheelculturen. De huidige literatuur is rijk aan live calciumbeeldvorming van bulkresponsen van stabiele cellijnen. Het is echter nu algemeen bekend dat in vivo weefsels een divers cellulair landschap vormen dat verschillende celtype-specifieke rollen ondersteunt bij het handhaven van weefselhomeostase 12,13,14,15. Ondanks deze algemene kennis blijven de mechanismen waarmee verschillende celtypen calciumsignalen coördineren en de calciumionhomeostase reguleren onbekend. Daarom zullen de hier gepresenteerde methoden het mogelijk maken om calciumsignalering in één cel te detecteren en de doorvoer van downstream-analyses in primaire luchtwegweefsels te verbeteren.

We maken gebruik van onze eerder gepubliceerde en rigoureus gevalideerde primaire epitheliale kweekmodellen van het menselijk neusepitheel als hulpmiddel om levendcel, cytosolisch calcium in een biologisch relevanter model 16,17,18 in beeld te brengen. Kort gezegd worden epitheelcellen geïsoleerd uit neusborstels van de patiënt en gekweekt op een semipermeabel membraan in een transwell, dat in een kweekput wordt opgehangen om een lucht-vloeistofinterface (ALI) te behouden. Deze grens, gecombineerd met gespecialiseerde media, is rigoureus getest met orthogonale technieken op de aanwezigheid van verschillende celtypen 16,17,18. Bovendien is aangetoond dat de huidige methoden vertaalbaar zijn naar primaire bronchiale culturen die op een vergelijkbare manier zijn gekweekt als onze primaire neusculturen19.

Dit artikel introduceert een aangepaste methode om levende calciumsignalering te meten en te analyseren met een enkelcelresolutie in deze primaire luchtwegepitelculturen. Deze meerlaagse culturen zijn moeilijk te visualiseren met microscopie; De huidige opzet stelt ons echter in staat om ons betrouwbaar te richten op enkele lagen binnen de meerlaagse culturen, waardoor we calciummobilisatie uit deze specifieke lagen kunnen detecteren. Deze opstelling heeft verschillende voordelen, namelijk dat er geen perfusiesysteem nodig is, wat vaak kostbaar en moeilijk aan te passen is tenzij gespecialiseerde microscopen worden gebruikt. Epifluorescentiemicroscopie is toegepast, wat een verbeterde temporele resolutie biedt in vergelijking met confocale beeldvorming. Het gebruik van lichtgevende diodes (LED's) minimaliseert fototoxiciteit ten opzichte van laser-gebaseerde confocale systemen. Extrinsieke intensiometrische kleurstoffen worden gebruikt in het hier gepresenteerde protocol omdat ze snelle, relatieve veranderingen in calcium over de gehele celpopulatie mogelijk maken en compatibel zijn met de meeste fluorescentiemicroscopie-opstellingen. Dit is gunstig ten opzichte van gewone ratiometrische kleurstoffen, die diepe ultraviolet (UV) excitatie vereisen die op veel microscopen niet beschikbaar is. Bovendien vereist GCaMP transfectie of transductie, wat de techniek versterkt voor gerichtere calciumbeeldvorming in specifieke celtypen. Door lage transductie- en transfectie-efficiënties in primaire epitheelculturen is de techniek slecht geschikt voor het monitoren van de gehele celpopulatie.

Daarnaast ontwikkelde deze studie nieuwe, gespecialiseerde machine learning-gebaseerde software die single-cell segmentatie mogelijk maakt op basis van live nucleaire kleuring. De software kan vervolgens fluorescentieintensiteitswaarden voor elke cel over de tijd registreren. Aanvankelijk werd een stabiele epitheelcellijn (Calu-3) gebruikt voor methodeoptimalisatie. Vervolgens werden deze methoden vertaald om eencellige calciummobilisatie in primaire epitheelculturen te bestuderen. Variabelen zoals concentratie van calciumkleurstof en probenecide, timing van incubatiestappen, evenals de beeldvormingsopstelling werden geoptimaliseerd. Hier wordt calciumsignalering geregistreerd met een framerate van 0,2 fps (frames per seconde), wat geschikt is voor het monitoren van calciumsignalering. De framerate kan worden verhoogd om snellere calciumtransiëntente meten. De optimale variabelen werden vervolgens toegepast en verder geoptimaliseerd in meer ingewikkelde primaire neuskweekjes.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

De reagentia en de gebruikte apparatuur worden vermeld in de Materiaaltabel.

1. Onderhoud en cultivatie van Calu-3-cellen

  1. Houd Calu-3-cellen in T-25-kolven in EMEM-kweekmedia aangevuld met 20% FBS en 1% penicilline/streptomycine. Verwarm het medium voor en vervang het om de dag (5 mL/fles).
  2. Wanneer cellen voor 70% samenvloeien in de kolf, aspireer dan het medium in de kolf.
  3. Was de kolf met 5 mL 1x fosfaatgebuffte zoutoplossing (PBS).
  4. Voeg 1 ml TrypLE direct toe aan de cellen gedurende 10-15 minuten bij 37 °C, 5%CO2. Zorg ervoor dat alle cellen van de bodem van de kolf zijn losgeraakt en gedissocieerd zijn in een single-cell suspensie.
  5. Neutraliseer de reactie met 4 mL verse kweekmedia (stap 1.1), en meng de cellen goed met een serologische pipet om een gelijkmatige zaaiing te garanderen.
  6. Plat de cellen op een 96-wellplaat met 90%-100% confluentie (ongeveer 40.000 cellen per put).
    1. Voeg om putten te zaaien 200 μL/put goed gemengde celsuspensie toe.
    2. Laat de cellen een nacht aan de 96-wellplaat hechten.
  7. Vervang het medium elke dag (200 μL/put) totdat het klaar is voor experimenten.
  8. Houd 2-5 dagen na confluentie binnen putten in om te beginnen met experimenteren voordat je experimenten uitvoert om differentiatie mogelijk te maken.

2. Protocol voor het laden van Calu-3 cellen met Cal 520 AM of Fluo-4 AM

VOORZICHTIG: Fluo-4 AM en Cal-520 AM worden opgelost in DMSO, wat als gevaarlijk wordt beschouwd. Probenecide wordt als acuut gevaar vermeld. Draag alsjeblieft handschoenen en een labjas bij het hanteren van chemicaliën om contact met de huid te voorkomen. Doe alle chemicaliën weg in aangewezen afvalbakken.

  1. Op de dag van het experiment verwijder je media uit de putten door te pipetteren en spoel je cellen tweemaal (200 μL/put) in een voorverwarmde calciumbuffer (140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl 2 en 10 mM Hepes, aangepast naar pH 7,38 (NaOH) 291 mOsm), om dode cellen te verwijderen.
  2. Incubeer cellen met 200 μL/well van een cocktail van 3 μM Cal-520 AM, 2,5 mM probenecide en 1:5000 Hoechst nucleaire kleuring in calciumbuffer (stap 2.1) gedurende 1 uur in een incubator ingesteld op 37°C en 5%CO2.
    1. Voor Fluo-4 AM-experimenten incubeer je cellen met 200 μL/put van een cocktail van 3 μM Fluo-4 AM, 2,5 mM probenecide en 1:5000 Hoechst nucleaire kleuring in calciumbuffer (stap 2.1) gedurende 1 uur bij 37 °C en 5%CO2.
      OPMERKING: Houd de tubes kleurstof in het donker door ze af te dekken met aluminiumfolie.
  3. Tijdens de incubatie bereid je thapsigargine voor in calciumbuffer (stap 2.1). Pas de concentraties van tussenliggende voorraad aan om de juiste eindconcentraties binnen de put te waarborgen.
    OPMERKING: Hier wordt 50 μL geneesmiddel toegevoegd aan 100 μL van de bestaande calciumbuffer. Daarom werd een 3x tussenvoorraad van 6 μM voorbereid.
  4. Na 1 uur aspireer je de kleurstof door te pipetteren en spoel je extracellulaire kleurstof twee keer weg met calciumbuffer (stap 2.1) (200 μL/put).
  5. Voeg na washes 100 μL/put van 2,5 mM probenecide toe die is verdund in calciumbuffer (stap 2.1) om de kleurstof in de cytoplasmatische ruimte te behouden.
  6. Wikkel de plaat in aluminiumfolie om hem tegen licht te beschermen. De cellen zijn nu klaar om te beelden.

3. Het opzetten van microscopie voor de Calu-3 stabiele cellijn

  1. Met behulp van de epifluorescentiemicroscoop uitgerust met een SuperFluor-objectief, een stabiele solid-state lichtbron en een CMOS-fluorescentiecamera (pixelgrootte 6,5 μm). De verlichtingsintensiteit is ingesteld op 500 mW.
  2. Plaats de plaat met cellen op het podium met de 96-well plaatadapter. Met Brightfield richt je je op de cellaag met een lage vergroting om de monolaag van cellen te vinden (gebruik 5-10x luchtobjectief).
    OPMERKING: Deze stap is optioneel, maar nuttig om efficiënt de eerste focus op de cellaag te krijgen.
  3. Zodra de cellaag is geïdentificeerd, gebruik je Brightfield en schakel je over op een hogere vergroting (20x luchtobjectief) en focus je opnieuw op de cellaag.
    OPMERKING: Zorg voor de juiste focus op de monolaag met Brightfield; Celgrenzen zouden duidelijk moeten zijn.
  4. Identificeer het calciumkleurstofsignaal met behulp van de GFP (475 nm LED). Zorg ervoor dat het LED-vermogen tussen 5%-10% valt om fotobleaching te voorkomen, en dat de belichtingstijd geschikt is om het basissignaal van groen te visualiseren zonder het signaal te oververzadigen, meestal tussen 300-500 ms.
    OPMERKING: Om reproduceerbaarheid en gelijkmatige kleurstofbelasting te waarborgen, analyseer je kwalitatief de cellaag; De meeste cellen zouden dezelfde helderheid moeten vertonen. Focus op gezichtsvelden met beperkte dode cellen, die intens fluoresceren voordat er een stimulerend middel wordt toegevoegd. De relatieve basisintensiteit van fluorescentie kan worden gemeten met Fiji (stap 7.9). De basisfluorescentievariatie tussen cellen zou dicht bij 10%-15% moeten liggen als de kleurstof gelijkmatig is geladen (stap 7.9).
  5. Identificeer de Hoechst nucleaire kleur met behulp van de DAPI (405 nm) LED. De LED-stroom zou tussen de 2%-5% moeten liggen met een belichtingstijd tussen 50-100 ms.
    OPMERKING: Als de cellen scherp zijn, zouden de kernen scherpe contouren moeten hebben. Zorg ervoor dat het nucleaire signaal niet verzadigd raakt, omdat kernen het groene kanaal kunnen verstoren.

4. Het verkrijgen van live calciumvideo

  1. Start een livevideo met een interval van 1 frame elke 5 seconden (0,2 fps) gedurende een duur van 10 minuten.
    OPMERKING: Leg elk fluorescerende kanaal (DAPI 405 nm en GFP 475 nm) op bij elk frame vast.
  2. Zodra de video is begonnen, laat dan een baseline-lezing van 5 minuten in voordat je agonisten toevoegt.
  3. Voeg met een P200-pipet 50 μL thapsigargine toe op een 3x tussenliggende voorraad aan de put met 100 μL 2,5 mM probenecide in calciumbuffer (stap 2.1). Sussie voorzichtig 1-2 keer in de put om te zorgen dat het medicijn gelijkmatig wordt verspreid. Lees verder 5 minuten na de toevoeging van thapsigargin.
    OPMERKING: De stap om medicijn toe te voegen is cruciaal; De pipettip mag de plaat niet raken om het scherpstelvlak te verschuiven. Laat in plaats daarvan de pipettip drijven zodat deze alleen contact maakt met de buffer binnen de put. Als medicijnen te krachtig worden gemengd, kunnen cellen zich losmaken van de plaat en het signaal verstoren.
    OPMERKING: Let goed op het kader waarin het medicijn is toegevoegd voor downstream analyse.
  4. Bewaar de video en de snapshot die voor het experiment zijn genomen. Ga door met data-analyse.

5. Protocol voor het laden van primaire luchtwegcellen met Cal 520 AM of Fluo-4 AM

  1. Op de dag van het experiment verwijder je basolaterale media uit de transput en was je de apicale en basolaterale zijde van de insert twee keer met 750 μL basolateraal en 300 μL apikal van de calciumbuffer (stap 2.1).
  2. Incubeer de cellen met 600 μL basolateraal en 200 μL apikal van de Cal-520 AM of Fluo-4 AM kleurstoffen gedurende 1 uur bij 37 °C en 5%CO2. Bereid de kleurstof op dezelfde manier voor als voor de Calu-3 cellen, voor Cal-520 AM, 3 μM Cal-520 AM, 2,5 mM probenecide en 1:5000 Hoechst in calciumbuffer (stap 2.1). Voor Fluo-4 AM, 3 μM Fluo-4 AM, 2,5 mM probenecide en 1:5000 Hoechst in dezelfde calciumbuffer.
  3. Tijdens de incubatieperiode bereid thapsigargine voor op een intermediaire voorraad van 3× voor een eindconcentratie van 2 μM (6 μM tussenvoorraad).
  4. Daarna aspireer je de kleurstof en was je de cellen twee keer met 300 μL apikale en 750 μL basolaterale buffer met calcium (stap 2.1).
  5. Na de washes voeg je 100 μL apikale en 500 μL basolaterale 2,5 mM probenecide toe in calciumbuffer (stap 2.1).
  6. Houd de transmissie goed binnen de plaat en wikkel de plaat in folie. De cellen zijn nu klaar voor beeldvorming.

6. Het opzetten van microscopie voor de primaire neusinserts

  1. Koop een glazen bodem Petrischaal geschikt voor beeldvorming, pincet en dun afplaktape. Zorg ervoor dat de Petrischaal schoon is door hem snel af te vegen met 70% ethanol en volledig te laten drogen.
  2. Plaats de glazen petrischaal in de kleine ronde adapter voor de epifluorescentiemicroscoop.
  3. Met een pincet plaats je het inzetstuk voorzichtig in het midden van de glazen bodemschaal.
    OPMERKING: Wees voorzichtig dat je de buffer niet morst, die in het apicale compartiment van de insert is geplaatst.
  4. Om te voorkomen dat de inzetplaat beweegt tijdens het toevoegen van medicijnen, gebruik je afplaktape om de bovenkant van het plastic van de inzetplaat aan de zijkanten van de glazen bodemschaal vast te zetten.
  5. Plaats de adapter met het inzetstuk bevestigd op het niveau van de microscoop en begin met het focussen op de cellen met het 10x lucht brightfield-objectief.
  6. Identificeer het calciumkleurstofsignaal met behulp van de GFP (475nm LED). Zorg ervoor dat het LED-vermogen tussen 5%-10% ligt om fotobleaching te voorkomen, en dat de belichtingstijd geschikt is om het basissignaal van groen te visualiseren zonder het te oververzadigen, meestal tussen 300-500 ms.
    OPMERKING: Zie de NOTITIE onder stap 3.4 om een correcte belasting van calciumkleurstoffen te garanderen.
  7. Identificeer de Hoechst nucleaire kleur met behulp van de DAPI (405 nm) LED. De LED-stroom zou tussen de 2%-5% moeten liggen met een belichtingstijd tussen 50-100 ms.
    OPMERKING: Als de cellen scherp zijn, zouden de kernen duidelijke, gedefinieerde contouren moeten hebben. Focus op de meest apicale cellaag. Stel de z-as van de microscoop aan om het hoogste brandpuntsvlak te identificeren waar cellen scherp scherp blijven. Zorg ervoor dat de kernen geen verzadiging van het signaal bereiken, omdat het nucleaire signaal het groene kanaal kan verstoren.
  8. Om de live calciumvideo te verkrijgen, volg stap 5.1-5.4. Voeg tijdens de toevoegingsstap het medicijn in het midden van de insert toe en suspensie langzaam opnieuw met een P200-pipet.
    OPMERKING: Let goed op het kader waarin het medicijn is toegevoegd voor downstream analyse.

7. Analyse met behulp van de Fiji-software

  1. Open de Fiji-applicatie en selecteer Bestand \ Open, upload het videobestand en behoud in het resulterende pop-upvenster alle standaardinstellingen.
  2. Indien gewenst, verander onder Afbeelding \ Aanpassen \ Helderheid/Contrast de helderheid en het contrast van de afzonderlijke fluorescentiekanalen om het meest optimale zicht op de cellen te krijgen.
  3. Om celtracering te vergemakkelijken, voeg je de nucleaire stain- of brightfield-kanalen samen met Image \ Colour \ Merge Channels en selecteer je de juiste bestanden voor elk individueel kanaal in de pop-up.
  4. Om specifieke cellen te traceren op basis van celgrenzen en nucleaire kleuring, gebruik je Analyze \ Tools \ ROI Manager en vink je zowel 'toon alle' als 'labels' af in de resulterende pop-up.
  5. Traceer zorgvuldig cellen met het vrijhandse selectiegereedschap en druk op t om een cel toe te voegen.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat cellen in alle 4 de hoeken en het midden van de video worden getraceerd.
  6. Zodra alle cellen nauwkeurig zijn getraceerd, klik je in het open tabblad met alle ROI's op Meer \ Multi Measure en druk je op OK op de resulterende pop-up.
  7. Kopieer het hele blad in de resulterende pop-up met de titel Resultaten naar een Excel-bestand.
    OPMERKING: Het resulterende blad zal 6 subkoppen bevatten (Area1, Mean1, Min1, Max1, IntDen1, RawIntDen1) voor elke ROI met een numerieke waarde na elk, die overeenkomt met de betreffende getraceerde cel. De belangrijke waarde voor downstream-analyse is het gemiddelde van elke ROI.
  8. Om de variatie in fluorescentieintensiteit te monitoren, bereken je de gemiddelde fluorescentie tijdens de basislijn voor elke cel en bereken je de procentuele variantie. Experimenten hebben doorgaans een variantie tussen de 20% en 30%.
    figure-protocol-1
  9. Normaliseer alle metingen door de gemiddelde intensiteitswaarden te delen door de eerste meting van de basislijn voor elk van de getraceerde cellen.
  10. Maak een extra kolom aan voor tijd in seconden, waarbij het eerste frame overeenkomt met frame 0 en de daaropvolgende tijdspunten met 5 toenemen, wat overeenkomt met het interval van 0,2 fps.
  11. Kopieer de data naar een analyse- en grafieksoftware en genereer een curve van verandering in fluorescentie ten opzichte van de basislijn in de tijd.
    OPMERKING: Om single-cell maxima-plots te genereren, gebruik je de =MAX()-functie in Excel om het frame te vinden waarbij de maximale fluorescentieintensiteit voor elke cel wordt bereikt en plot je met GraphPad Prism.

8. Analyse met behulp van de Calciumsuite

  1. Open het videobestand met Fiji en volg stappen 8.1 en 8.2.
  2. Zodra de nucleaire en groene kanalen geoptimaliseerd zijn voor weergave, dupliceer je één frame van de video door te klikken op Image \ Duplicate. In de resulterende pop-up selecteert u Duplicate Hyper stack. Binnen dezelfde pop-up, onder kanalen, typ 1. Sla het op als een PNG-afbeeldingsbestand.
  3. Herhaal stap 9.2 en onder kanalen, type 2.
    Voeg de twee afbeeldingen samen door stap 8.3 te volgen. Upload de afbeelding in de Cell-Pose GUI (Graphical User Interface) om een celmasker te genereren.
  4. Upload het beeld in de Cell-pose GUI en segmenteer met behulp van de nucleaire kleuring (Kanaal 1) en cytoplasmatische kleuringen (Kanaal 2) door het Cyto3-model te selecteren.
  5. Sla de afbeelding op als een PNG-bestand, open het PNG-bestand in Fiji en zet het om naar een TIFF-bestand.
    OPMERKING: Cell-pose GUI produceert een zwart-wit PNG-bestand.
  6. Open zowel het maskerbestand als het videobestand in de Calcium Suite door te slepen en neer te zetten, en klik vervolgens op Gegevens analyseren om een downloadbare grafiek te genereren, evenals een downloadbaar .csv bestand met genormaliseerde en ruwe intensiteitswaarden voor alle cellen die door de software worden geteld.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Om calciummobilisatie in levende cellen te meten, worden Calu-3-cellen of gedifferentieerde primaire neusculturen geïncubeerd met een intracellulaire kleurstof. De relatieve verandering in calciumafhankelijke signalen wordt gemeten als een toename in de mobilisatie van calcium, hetzij vanuit intracellulaire calciumvoorraden, hetzij vanuit de extracellulaire ruimte naar het cytosol. Een aanhoudende toename van calcium in het cytosol wordt weergegeven door een toename van fluorescentie nad...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Dit artikel heeft methoden gepresenteerd voor het analyseren van eencellige calciumsignalering in levende primaire neus- en bronchiale culturen, evenals een stabiele epitheelcellijn. Zowel de Cal-520 AM als de Fluo-4 AM calciumrapporteurs zijn nuttige calciumindicatoren in beide opstellingen. Cal-520 AM is gevoeliger omdat het een hogere quantumopbrengst van 0,75 heeft vergeleken met Fluo-4 AM van 0,16 en een iets hogere affiniteit voor calcium (de Kd van Cal-520 AM is 320 nM en Fluo-4 A...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen concurrerende belangen.

Dankbetuigingen

De auteurs willen de hulp van het kweken van het primaire neusweefsel door Tarini Gunawardena bedanken. Evenals Wu Shu van de University of Iowa voor het gul cultiveren en verzenden van de primaire bronchiale culturen. Evenals Gabrielle Langeveld en Dian Liu voor hulp bij analyse en ontwerp van beeldvormingsadapters. We willen ook de beeldvormingsfaciliteit van het Hospital for Sick Children bedanken. We erkennen ook financiering door Cystic Fibrosis Canada en de US Cystic Fibrosis Foundation.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
24-well plate Thermofisher 142475
24-well transwell inserts Corning CLS3470-48EA
96-well Flat Clear Bottom Black Polystyrene TC-treated MicroplatesCorning 3603
Cal-520 AMAAT Bioquest 21130Gedeeld en bewaard op -20°C, opgelost in DMSO
Calcium Suite SoftwareDe code kan worden aangevraagd door contact op te nemen met onze laboratoriumgroep
EMEM, 1xsWisent 320-005-CLBewaard bij 4°C 
Fetal Bovine Serum Wisent 080-450Gedeeld en bewaard op -20°C
Fluo-4 AM AAT Bioquest 20550Gedeeld en bewaard op -20°C, opgelost in DMSO
HEPESBioshopHEP001.5Bewaard bij kamertemperatuur
Hoechst Thermofisher H3570Bewaard bij 4°C 
Human Epithelial Colorectal Adenocarcinoma Cell Line ATCCHTB-55
Magnesium Chloride Sigma 7786-30-3Bewaard bij kamertemperatuur
micro-dish 35mm, low glass bottomIbidi 80137Bewaard bij kamertemperatuur 
Penicillin-Streptomycin SolutionWisent 450-200-ELBewaard bij 4°C
Phosphate-Buffered Saline (PBS)Wisent 3111-010-CLBewaard bij kamertemperatuur 
Potassium Chloride Sigma 7447-40-7Bewaard bij kamertemperatuur 
Probenecid ThermofisherP36400Gedeeld en bewaard op -20°C, wateroplosbaar 
Sodium Chloride Bioshop SOD004Bewaard bij kamertemperatuur 
Thapsigargin ThermofisherT7458Gedeeld en bewaard op -20°C Opgelost in DMSO 
TripLE Express Enzyme (1X), phenol red Thermofisher12605010Bewaard bij 4°C

Referenties

  1. Bootman, M. D., Bultynck, G. Fundamentals of cellular calcium signaling: A primer. Cold Spring Harb Perspect Biol. 12 (1), a038802(2020).
  2. Jairaman, A., Prakriya, M. Calcium signaling in airway epithelial cells: Current understanding and implications for inflammatory airway disease. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 44 (4), 772-783 (2024).
  3. Sammels, E., Parys, J. B., Missiaen, L., De Smedt, H., Bultynck, G. Intracellular Ca2+ storage in health and disease: a dynamic equilibrium. Cell Calcium. 47 (4), 297-314 (2010).
  4. Mao, T., O'Connor, D. H., Scheuss, V., Nakai, J., Svoboda, K. Characterization and subcellular targeting of GCaMP-type genetically encoded calcium indicators. PLoS One. 3 (3), e1796(2008).
  5. Ren, C., et al. Melatonin protects RPE cells from necroptosis and NLRP3 activation via promoting SERCA2-related intracellular Ca2+ homeostasis. Phytomedicine. 135, 156088(2024).
  6. Dwivedi, R., et al. The TMEM16A blockers benzbromarone and MONNA cause intracellular Ca2+ release in mouse bronchial smooth muscle cells. Eur J Pharmacol. 947, 175677(2023).
  7. Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. Calcium imaging of cortical neurons using Fura-2 AM. J Vis Exp. 23, e1067(2009).
  8. Hirst, R. A., Harrison, C., Hirota, K., Lambert, D. G. Measurement of [Ca2+]i in whole cell suspensions using fura-2. Methods Mol Biol. 114, 31-39 (1999).
  9. Tsien, R. Y. A non-disruptive technique for loading calcium buffers and indicators into cells. Nature. 290 (5806), 527-528 (1981).
  10. Di Virgilio, F., Steinberg, T. H., Swanson, J. A., Silverstein, S. C. Fura-2 secretion and sequestration in macrophages. A blocker of organic anion transport reveals that these processes occur via a membrane transport system for organic anions. J Immunol. 140 (3), 915-920 (1988).
  11. Liao, J., et al. A novel Ca2+ indicator for long-term tracking of intracellular calcium flux. BioTechniques. 70 (5), 271-277 (2021).
  12. Kageyama, T., Ito, T., Tanaka, S., Nakajima, H. Physiological and immunological barriers in the lung. Semin Immunopathol. 45 (4), 533-547 (2024).
  13. Quach, H., et al. Early human fetal lung atlas reveals the temporal dynamics of epithelial cell plasticity. Nat Commun. 15 (1), 5898(2024).
  14. Deprez, M., et al. A single-cell atlas of the human healthy airways. Am J Respir Crit Care Med. 202 (12), 1636-1645 (2020).
  15. Prescott, R. A., et al. A comparative study of in vitro air-liquid interface culture models of the human airway epithelium evaluating cellular heterogeneity and gene expression at single cell resolution. Respir Res. 24 (1), 213(2023).
  16. Gunawardena, T. N. A., et al. Correlation of electrophysiological and fluorescence-based measurements of modulator efficacy in nasal epithelial cultures derived from people with cystic fibrosis. Cells. 12 (8), 1174(2023).
  17. Laselva, O., et al. Functional rescue of c.3846G>A (W1282X) in patient-derived nasal cultures achieved by inhibition of nonsense-mediated decay and protein modulators with complementary mechanisms of action. J Cyst Fibros. 19 (5), 717-727 (2020).
  18. Terrance, M., et al. Primary human nasal epithelial cell culture. Methods Mol Biol. 2725, 213-223 (2024).
  19. Karp, P. H., et al. An in vitro model of differentiated human airway epithelia. Methods for establishing primary cultures. Methods Mol Biol. 115, 115-137 (2002).
  20. Perniss, A., et al. A succinate/SUCNR1-brush cell defense program in the tracheal epithelium. Sci Adv. 9 (31), eadg8842(2023).
  21. Sehgal, P., et al. Inhibition of the sarco/endoplasmic reticulum (ER) Ca2+-ATPase by thapsigargin analogs induces cell death via ER Ca2+ depletion and the unfolded protein response. J Biol Chem. 292 (48), 19656-19673 (2017).
  22. Cal 520® AM. , AAT Bioquest Inc. https://www.aatbio.com/products/cal-520-am (2025).
  23. Fluo 4® AM. , AAT Bioquest Inc. https://www.aatbio.com/products/fluo-4-am?unit=20552 (2025).
  24. Zaderer, V., Hermann, M., Lass-Flörl, C., Posch, W., Wilflingseder, D. Turning the world upside-down in cellulose for improved culturing and imaging of respiratory challenges within a human 3D model. Cells. 8 (10), 1292(2019).
  25. Becker, M. E., et al. Live imaging of airway epithelium reveals that mucociliary clearance modulates SARS-CoV-2 spread. Nat Commun. 15 (1), 9480(2024).
  26. Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Lechleiter, J. D. Chemical calcium indicators. Methods. 46 (3), 143-151 (2008).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Fluorescentiemicroscopiecalciumsignaleringmachine learning analyseresolutie op enkelcelniveauthapsigarginstimulatiefluorescente indicatorkleurstofgeneratie van celmaskers

Gerelateerde artikelen