Een neonataal intraveneus transplantatiemodel voor de beoordeling van immuunactiviteiten in het vroege leven tegen kankercellen

Samenvatting

Dit protocol demonstreert temporele veneninjectie voor intraveneuze toediening van kinderkankercellen aan neonatale muizen, waardoor precieze, reproduceerbare modellering van immuunresponsen in het vroege leven tegen kanker mogelijk is. De methode maakt het mogelijk om de impact van interventies, zoals immunomodulatie of therapie, te beoordelen wanneer deze tijdens de neonatale periode worden toegepast.

Samenvatting

Meer dan de helft van alle kinderkankers wordt in de baarmoeder geïnitieerd, met de progressie naar een overzichtelijke ziekte die zich voortzet gedurende de neonatale periode. Hoewel immunotherapieën nu nieuwe behandelopties bieden voor veel kinderen met kanker, is het nog onvolledig begrepen hoe immuniteit in het vroege leven de progressie van kanker en de therapierespons beïnvloedt. Om deze kloof aan te pakken, moet therapeutische interventies worden geëvalueerd tijdens de neonatale periode, wanneer immuunresponsen fundamenteel verschillen van die in latere kindertijd en volwassenheid.

Hier beschrijven we een neonataal transplantatiemodel dat integreert met bioluminescente in vivo beeldvorming om de impact van immunomodulatie in het vroege leven op kinderkankers te onderzoeken.

Temporale vene-injectie van luciferase-gelabelde cellen afkomstig van twee in baarmoederkankers bereikte reproduceerbare tumor-engraftment bij 1–2 dagen oude syngene ontvangen, zonder procedure-gerelateerde sterfte en met hoog procedureel succes, zoals bevestigd door bioluminescente beeldvorming. Met infectiegedreven immuunmodulatie als experimentele variabele tonen we vervolgens aan dat intraperitoneale infectie met muiscytomegalovirus vijf dagen na transplantatie resulteert in een duidelijke vermindering van de last van acute lymfoblastische leukemie (ALL), maar niet neuroblastoom (NB). Dit platform maakt het mogelijk om kankerspecifieke verschillen in respons op immunomodulatie in het vroege leven te bestuderen en benadrukt het belang van tumorcontext bij het modelleren van immuun-kankerinteracties in de vroege levensfase.

Gezamenlijk biedt deze methodologie een veelzijdig en zeer reproduceerbaar platform om neonatale immuunmechanismen te onderzoeken die relevant zijn voor kankerimmunosurveillance, infectiegedreven immuunmodulatie en therapeutische interventie. Naast ALL en NB kan deze benadering worden aangepast aan aanvullende pediatrische maligniteiten en immunomodulerende strategieën, ter ondersteuning van mechanistische studies en preklinische evaluatie van vroege kankerinterventies.

Inleiding

Recente ontwikkelingen in immunotherapie hebben de uitkomsten voor bepaalde kankerpatiënten aanzienlijk verbeterd, maar hun optimale toepassing bij jonge kinderen vereist een grondig begrip van hoe het zich ontwikkelende immuunsysteem kankercellen identificeert en uitroeit. Hoewel ongeveer 50% van de kinderkankers in de baarmoeder ontstaat, waaronder B-cel acute lymfoblastische leukemie (B-ALL) en NB, suggereert groeiend bewijs dat postnatale gebeurtenissen een cruciale invloed hebben op de evolutie van de ziekte en het klinische resultaat ^1,2.

Neonatale immuunresponsen verschillen kwantitatief en kwalitatief van die van volwassenen³. Bij afwezigheid van volledig ontwikkelde adaptieve immuniteit is de bescherming van pasgeborenen sterk afhankelijk van moederlijke antilichamen en aangeboren immuuncellen. Deze aangeboren effectoren zijn echter functioneel minder efficiënt dan hun volwassen tegenhangers vanwege cel-intrinsieke hypo-responsiviteit en versterkte activatie van immunosuppressieve routes, waardoor neonaten bijzonder vatbaar zijn voor infectie ^4,5,6. De impact van deze kenmerken op het vermogen van het onvolwassen immuunsysteem om effectieve antikankerreacties te leveren, is echter nog slecht begrepen.

Het modelleren van antikankerimmuniteit in het vroege leven vereist de precieze en reproduceerbare levering van kankercellen en immuunmodulatoren of pathogenen tijdens het korte postnatale venster, wanneer de immuunfunctie beperkt is. Temporale vene-injectie is een neonatale intraveneuze (IV) toedieningsmethode die het beste aan deze eisen voldoet en een hoog procedureel succes, lage sterfte, minimale omgangsstress en compatibiliteit met sequentiële interventies biedt, zoals infectie-uitdaging of therapeutische toediening 7,8,9,10.

In deze studie bouwden we voort op en pasten we eerder gevalideerde neonatale intraveneuze toedieningstechnieken en de veelzijdigheid van bioluminescente in vivo beeldvorming aan om een transplantatiemodel te beschrijven dat de impact van vroege levensinfectie op de progressie van kinderkankercellen bestudeert. Deze aanpak maakt het mogelijk om luciferase-gelabelde B-ALL- of NB-cellen intraveneus toe te dienen aan 1–2 dagen oude jongen, gevolgd door immuunmodulatie via intraperitoneale (i.p.) toediening van muiscytomegalovirus (mCMV) op postnatale dag 7 (P7). De progressie van kanker werd vervolgens 10 dagen na infectie geëvalueerd (P17).

Hoewel de toegang tot de temporale vena beperkt is tot een beperkt postnataal venster (P0–P3), verbetert deze methodologie de reproduceerbaarheid en experimentele controle, en biedt het een veelzijdig platform om de invloed van immuunmechanismen in het vroege leven op immunosurveillance bij kanker, infectie–kankerinteracties en reacties op immunotherapie te onderzoeken. Daarnaast ondersteunt deze aanpak de efficiënte homing van getransplanteerde cellen, waardoor het reproduceerbaar zijn van ziektemodellen voor mechanistische onderzoeken.

Protocol

Alle procedures (Figuur 1) werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de Canadian Council on Animal Care en goedgekeurd door het University of British Columbia Animal Care Committee (protocol A23-0169).

1. Generatie van luciferase-getagde leukemische cellen

1. Isolatie van leukemische cellen uit leukemische Eμ-Ret-muizen
   1. Verdoof muizen in een 1 L inductiekamer met 5% isofluraan en 1 L·^min-1 zuurstof totdat een diep chirurgisch vlak is bereikt (verlies van de rechtstaande reflex en langzame, regelmatige ademhaling).
   2. Zodra diepe anesthesie is bevestigd, stopt u met isoflurane en dient u kooldioxide (CO₂) toe met een hoge debiet (3–4 keer de standaard geleidelijke verplaatsingssnelheid; bijvoorbeeld 6-8 L·min voor een 10 L kamer) zonder het dier tussen kamers te verplaatsen. Houd de CO₂-blootstelling minstens 5 minuten na het stoppen van de ademhaling om de dood te waarborgen.
   3. Ventileer en verzamel de afvalgassen voordat je de kamer opent.
   4. Bevestig overlijden door afwezigheid van hartslag en ademhaling, en voer vervolgens cervicale dislocatie uit als secundaire fysieke methode volgens de institutionele procedure.
   5. Breng het karkas over naar een bioveiligheidskast, bevestig de dood opnieuw, registreer geslacht en lichaamsgewicht, en spuit de buitenkant met 70% ethanol.
   6. Maak een incisie in de buik in het midden, reflecteer de huid en buikwand, en snijd de milt uit in 5 mL steriel PBS.
   7. Snijd tibia's en femora van beide benen, verwijder overtollig weefsel en verwijder de milt onder steriele omstandigheden. Breng de milt onmiddellijk over in een 5 mL steriele, ijskoude fosfaatgepufferde zoutoplossing (PBS) om de levensvatbaarheid van de cel te behouden.
   8. Verwerk de milt.
      1. Homogeniseer miltweefsel in 1 mL van 1× rode bloedcellen (RBC) lysebuffer (gebruik 2 mL voor milt > 200 mg). Broed 2–3 minuten uit bij kamertemperatuur.
      2. Demp de lyse door 10 mL PBS + 2 % foetaal rundserum (FBS) (FACS-buffer) toe te voegen, filter via een 40 μm zeef en centrifugeer op 350 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
      3. Sussie de miltpellet opnieuw in een 5 mL FACS-buffer.
   9. Beenmerg verwerken.
      1. Exciseer beide epifysen en spoel elk bot met 1 mL FACS-buffer met een 1 mL spuit met een 29-gauge naald in een 15 mL buis.
      2. Centrifugeer de celsuspensie, verwijder het supernatant en sus cellen opnieuw in 1 mL van 1× RBC-lysebuffer, incubeer 2 minuten bij RT, quench lysis door 10 mL FACS-buffer toe te voegen, filter door een 40 μm zeef en centrifugeer op 350 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
      3. Gooi het supernatant weg en suspendeer de BM-pellet opnieuw in een 1 mL FACS-buffer door op en neer te pipetteren.
      4. Vortex voorzichtig en filter indien nodig door een 40 μm zef.
      5. Sussief 0,5 × 10^6 leukemische cellen in 200 μL celkweekmedia (bijv. Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)) aangevuld met 20% FBS en interleukine-7 (IL-7; 250 pg·^mL-1).
         Pauzepunt: Houd celsuspensies tot 2 uur op ijs voordat je ze kleurt.
2. Lentivirale transductie van leukemische cellen:
   1. Zaad muisbeenmerg-afgeleide stromale cellen bij 1 × 10^5 cellen per put in een 24-wellplaat 24 uur voor transductie om hechting mogelijk te maken en 70–80% confluentie te bereiken.
   2. Plaatleukemische cellen (0,5 × 10^6 cellen in een eindvolume van 200 μL) in een niet-weefselkweek behandelde 24-well plaat.
   3. Voeg een zelf-inactiverende (SIN) lentivirale vector toe die codeert voor een double-fusion reporter bestaande uit click beetle red (CBR) luciferase en een versterkt groen fluorescerende eiwit (eGFP), aangedreven door een constitutieve ubiquitinepromotor, met de multipliciteit van infectie (MOI): 10–20, virale titer: ≥ 1 × 10^8 TU·^mL-1 (transducerende eenheden per milliliter) in het uiteindelijke transductievolume van 200 μL samen met polybreen (8 μg·^mL-1; Sigma, H9268-5G).
      VOORZICHTIG: Polybrene is cytotoxisch bij hoge concentraties. Niet meer dan 8 μg·^mL-1. Behandel lentivirus onder Biosafety Level 2 (BSL-2) containment.
   4. Sluit de plaat af met parafilm en centrifugeer op 1.200 × g gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur (RT).
   5. Na spinocculatie worden getransduceerde leukemische cellen overgebracht naar stromale monolaag en 24 uur gekweekt bij 37 °C, 5% CO₂ in DMEM + 20% FBS + IL-7 (250 pg·^mL-1) ter ondersteuning van celoverleving en expressie door de reporter.
      OPMERKING: Antibiotica kunnen na 24 uur worden toegevoegd indien nodig, maar moeten worden vermeden tijdens virale transductie.
   6. Na 24 uur verzamel je niet-hechtende leukemische cellen en spoel je twee keer met steriele fosfaatgeboterde zoutoplossing (PBS), 350 × g gedurende 20 minuten bij 4 °C, om restanten van het virus en polybrene te verwijderen.
   7. Sussen cellen opnieuw in steriele PBS bij 1 × 10^7 cellen·^mL-1 voor transplantatie.
      Pauzepunt: Na het wassen kunnen cellen tot 48 uur voor transplantatie tot 48 uur voor transplantatie behouden blijven.
3. Transplantatie in volwassen NSG (NOD.Cg-Prkdc^scid Il2rg^tm1Wjl/SzJ) muizen
   1. Gebruik NSG-muizen van 4–6 weken oud als ontvanger.
   2. Warm de muis 5 minuten met een verwarmingsmat of warmtelamp om de staartaders te verwijden.
   3. Beperk de muis met een acrylfilter.
   4. Injecteer 1 × 10^6 cellen in 100 μL steriele PBS via de laterale staartader met een 29-gauge insulinespuit. Er is geen anesthesie nodig (tenzij verplicht volgens institutionele richtlijnen).
   5. Oefen zachte druk uit op de injectieplaats om bloedingen te voorkomen.
      VOORZICHTIG: Vermijd extravasatie. Succesvolle intraveneuze injectie resulteert in geen zichtbare zwelling.
   6. Houd twee keer per week muizen in de gaten op de ontwikkeling van de ziekte.
4. Sortering van GFP⁺ leukemische cellen
   1. Bij het begin van de ziekte wordt ontlasting of milt geoogst van leukemische NSG-muizen.
   2. Bereid een single-cell suspensie voor zoals hierboven beschreven.
   3. Kleurcellen met levensvatbaarheidskleurstof (7-AAD).
   4. Gebruik Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS) voor het sorteren van GFP+ leukemische cellen.
   5. Voor sorteren gebruik je een high-speed cell sorteerder en volg je de gatingstrategie van Forward scatter (FSC) versus side scatter (SSC) → sluit afval uit, FSC-A versus FSC-H → selecteer singlets, Viability-kleurstof negatief → selecteer levende cellen, GFP+-poort → isoleer reporter-positieve leukemische cellen.
   6. Verzamel gesorteerde cellen in buisjes met DMEM + 20% FBS. Streef na sortering zuiverheid: ≥ 95% GFP+ cellen.
      Pauzepunt: Gesorteerde cellen mogen tot 2 uur voor cryopreservatie op ijs worden gehouden.
5. Cryopreservatie van gesorteerde cellen
   1. Suspensieer gesorteerde cellen bij 5 × 10^6 cellen/mL in een vriesmedium met 90 % FBS en 10 % dimethylsulfoxide (DMSO).
   2. Aliquot 1 mL per cryoviaal en plaats de flesjes in een isopropanol-gebaseerde vriescontainer en bewaar bij −80 °C 's nachts (12–18 uur).
   3. Breng de flesjes over naar vloeibare stikstof (LN₂) voor langdurige opslag.
      VOORZICHTIG: DMSO is giftig en wordt gemakkelijk via de huid opgenomen. Handel met handschoenen en werk snel.
      Pauzepunt: Cellen kunnen langdurig worden opgeslagen in vloeibare stikstof totdat ze worden gebruikt in neonatale transplantatie-experimenten.

2. Generatie van luciferase-gelabelde NB-cellen

OPMERKING: TH-MYCN transgene muizen ontwikkelen spontane NB-tumoren en werden onderhouden onder goedgekeurde institutionele dierenzorgprotocollen. De lentivirale vector die wordt gebruikt is dezelfde als beschreven in Sectie 1.2.

1. Tumoroogst en weefseldissociatie
   1. Euthanaser tumordragende TH-MYCN muizen volgens goedgekeurde richtlijnen voor dierenverzorging.
   2. Oogst subcutane of abdominale NB-tumoren onder steriele omstandigheden.
   3. Weeg tumorweefsel en snijd het in fragmenten van ~1–2 mm met een steriele schaar.
   4. Transplanteer weefsel naar ongeveer 5 mL verteringsbuffer per 0,5 g tumorweefsel in een 15 mL kegelvormige buis, bestaande uit DMEM, Deoxyribonuclease I (DNase I; 50–100 U·^mL-1) en collagenase-gebaseerde enzymmix (10 μg·^mL-1 eindconcentratie).
   5. Broeuw 30 minuten bij 37 °C in een schuddende broedmachine bij 150 toeren per minuut.
      VOORZICHTIG: Enzymatische verteringsreagentia kunnen huid- en oogirritatie veroorzaken. Draag handschoenen en oogbescherming.
   6. Na de spijsvertering pipette je voorzichtig op en neer om het weefsel verder te dissocieren. Filter de suspensie door een 70 μm celfilter in een verse buis.
   7. Centrifugeer op 300 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (20–22 °C).
   8. Gooi supernatant weg en suspendeer pellet opnieuw in DMEM, aangevuld met 10% FBS.
   9. Voer RBC-lysis uit met behulp van de RBS-lysisbuffer zoals eerder beschreven in Sectie 1.1.
   10. Centrifugeer op 300 × g gedurende 5 minuten en hersuspendeer pellet in 10 mL hoogglucose DMEM, aangevuld met 10% FBS en 50 μM 2-mercaptoethanol.
       VOORZICHTIG: 2-mercaptoethanol is giftig en vluchtig. Voer het hanteren uit in een chemische afzuigkap.
       Pauzepunt: Cellen mogen tot 1 uur op ijs worden gehouden voordat ze worden getransduceerd.
2. Lentivirale transductie
   1. Pellet 2 × 10^6 NB-cellen bij 300 × g gedurende 5 minuten en verwijder supernatant volledig.
   2. Resuspendeer de celpellet direct in een 14 μL geconcentreerde lentivirale vector (dezelfde vector beschreven in sectie 1.2; virale titer ≥ 1 × 10^8 TU·mL-1, ongeveer MOI: 10–20).
   3. Incubeer het cel-virusmengsel gedurende 5 minuten bij 37 °C in een bevochtigde broedmachine (% CO₂).
   4. Voeg 200 μL high-glucose DMEM + 10% FBS toe en ga 2 uur door met incuberen bij 37 °C, 5% CO₂.
      VOORZICHTIG: Lentivirale vectoren moeten onder BSL 2-omstandigheden worden behandeld.
   5. Spoel getransduceerde cellen vier keer met DMEM met een hoog glucosegehalte om het resterende virus te verwijderen.
   6. Tel levensvatbare cellen met trypan blue exclusion.
      BELANGRIJK: Houd de matrixvoorbereiding altijd op ijs om voortijdige gelatie te voorkomen.
3. Subcutane implantatie in NSG-muizen
   1. Suspensieer cellen op 5 × 10^6 cellen per 100 μL in een koude basale membraanmatrix (groeifactor-gereduceerde extracellulaire matrix).
   2. Verdoof 6–8 weken oude NSG-muizen (zie Sectie 1.1) met ingeademde isoflurane (2–3% zuurstof).
   3. Load cell–matrix mengsel in een voorgekoelde 1 mL spuit voorzien van een 27-gauge naald.
   4. Injecteer 5 × 10^6 cellen in 100 μL totaalvolume subcutaan in het flankgebied.
   5. Monitor muizen tot volledig herstel van de narcose.
      OPMERKING: Injecteer direct na het mengen met de matrix om te voorkomen dat de spuit in de spuit stolt.
   6. Laat tumoren groeien tot ~1 cm in diameter.
4. Celsortering
   1. Oogst tumoren en genereer enkelcellige suspenties zoals beschreven in secties 2.1–2.2.
   2. Verrijk luciferase-gelabelde cellen met FACS op basis van GFP-expressie, volgens de gatingstrategie beschreven in Sectie 1.4.
   3. Voer twee opeenvolgende sorteringsrondes uit om ≥ 95% GFP-positieve zuiverheid te bereiken.
5. Cryopreservatie
   1. Cryopreserve-gesorteerde cellen zoals beschreven in sectie 1.5.
      Pauzepunt: Cellen kunnen op lange termijn worden opgeslagen in vloeibare stikstof voor toekomstige transplantatie-experimenten.

3. Bereid de celsuspensie voor voor temporale vene-injectie

1. Ontdooide luciferase-gelabelde leukemische cellen of NB-cellen snel in een waterbad van 37 °C totdat er een klein ijskristal overblijft.
2. Desinfecteer onmiddellijk de buitenkant van het flesje met 70% ethanol en doe vervolgens de inhoud over in 9 mL voorverwarmde DMEM + 10% FBS-medium in een 15 mL conische buis.
3. Centrifugeer op 300 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C, aspireer supernatant en suspendeer de pellet opnieuw in steriele, ijskoude PBS.
4. Bepaal de levensvatbaarheid met behulp van trypan blue exclusion en een hemocytometer (of geautomatiseerde celteller). Gebruik alleen suspenties met ≥ 80% levensvatbaarheid.
5. Laat de celsuspensie door een 40 μm celzeef lopen om klonten te verwijderen.
   VOORZICHTIG: Celklonten verhogen mislukte injecties en weefselbeschadiging.
6. Pas de concentratie aan om 20 μL per neonaat te bereiden met 1 × 10^4 leukemische cellen (voor leukemische transplantatie), of 5 × 10^4 NB-cellen (voor NB-transplantatie).
7. Houd de celsuspensie op ijs en meng voorzichtig direct voordat je de spuit laadt om de homogeniteit te behouden.
   Pauzepunt: Houd cellen tot 2 uur op ijs voor injectie als de levensvatbaarheid ≥ 80% blijft.

4. Temporale aderinjectie (P1–P2 pups)

OPMERKING: Neonatale temporale vene-injectie kan worden uitgevoerd zonder narcose. Korte hypothermische immobilisatie wordt echter vaak gebruikt om beweging te verminderen en de nauwkeurigheid van de injectie te verbeteren. Het gebruik van hypothermische immobilisatie is niet toegestaan door sommige institutionele dierenzorgcommissies - onderzoekers moeten overleg hebben met hun relevante institutionele commissie voordat deze procedure wordt uitgevoerd. Als deze door uw instelling wordt goedgekeurd, zijn de volgende stappen effectief voor onderkoeling van immobilisatie.

1. Maak een klein bakje klaar met een steriel servet en koel het vooraf door het op ijs te leggen.
2. Plaats pups (postnatale dag 1–2; P1–P2) op het servet in de container voor hypothermische immobilisatie gedurende 2–3 minuten totdat de spontane beweging aanzienlijk afneemt.
   BELANGRIJK: Laat pups niet direct met ijs in contact komen (gebruik altijd de container en servetbarrière).
3. Laad 60 μL van de celsuspensie in een glazen spuit van 100 μL en bevestig een naald van 30 gauge. Voer de suspensie terug in de buis om het dode volume van de spuit en naald te vullen. Zodra het dode volume is geprimeerd, aspireer je 20 μL celsuspensie voor injectie, zodat er geen luchtbellen aanwezig zijn. Gebruik BALB/c- en TH-MYCN-muizen als ontvangers van respectievelijk leukemische en NB-cellen.
4. Bereid een getranslumineerd podium voor door een koude lichtbron onder een plexiglazen platform te plaatsen.
5. Draag een vergrootglas (of gebruik een stereomicroscoop) om de injectieplaats te visualiseren.
6. Plaats een steriel servet met een centraal gat op het podium en plaats de pup zo dat de temporale ader zichtbaar is.
7. Plaats een klein stukje modelleerklei (speeldeeg) naast het hoofd van de pup om de naald tijdens de injectie te stabiliseren.
8. Steek de naald omhoog in de zichtbare temporale ader en injecteer langzaam de celsuspensie, waarbij je de vaatvulling observeert om een succesvolle intraveneuze levering te bevestigen.
9. Na de injectie oefen je zachte druk uit op de injectieplaats met een steriel wattenstaafje. Plaats de pup op een verwarmd hersteloppervlak (ongeveer 37 °C, bijvoorbeeld een verwarmingskussen op laag met een handdoekenbarrière) totdat normale beweging en roze kleur terugkeren.
10. Houd de jongen 5–10 minuten na het herstel in de gaten en breng hem dan terug naar de moeder.
    VOORZICHTIG: Voorkom oververhitting tijdens het herstel. Gebruik een barrièrelaag en monitor continu.
11. Spoel de spuit direct af met PBS, daarna met een spuitreinigingsoplossing, en maak af met 70% ethanol.

5. Virusvoorbereiding en infectie

1. Voer alle procedures uit waarbij muiscytomegalovirus (mCMV) onder BSL-2 containment wordt uitgevoerd in overeenstemming met institutionele goedkeuringen voor bioveiligheid en dierzorg.
2. Behandel virusvoorraden in een gecertificeerde Klasse II biologische veiligheidskast en voer dierinfecties uit in aangewezen BSL-2 proceduregebieden.
3. Voer de voorbereiding en behandeling van het virus uit in een gecertificeerde Klasse II biologische veiligheidskast, en voer de dierinfecties uit in aangewezen BSL-2 proceduregebieden.
4. Draag geschikt PBM, waaronder een laboratoriumjas of wegwerpjas, handschoenen en oogbescherming. Behandel alle virusbevattende materialen (spuiten, beddengoed, kooien en oppervlakken) als mogelijk besmettelijk.
5. Minimaliseer het gebruik van scherpe middelen en gooi naalden onmiddellijk weg in goedgekeurde biohazard-containers voor scherpe middelen. Decontaminateer werkoppervlakken en apparatuur na gebruik. Voer al het vaste en vloeibare afval als biologisch gevaarlijk afval af volgens institutionele procedures.
6. Muizen infecteren bij P7 (5–6 dagen na leukemische celtransplantatie).
7. Ontdooi een virus aliquot op ijs, meng voorzichtig door inversie en laat het ijs liggen tijdens de voorbereiding. Vermijd herhaalde vries-dooicycli (gebruik eenmalige aliquots).
8. Bereid mCMV voor bij 2 × 10^5 plaque-vormende eenheden (PFU)/mL in PBS en injecteer de pups intraperitoneaal (i.p.) met 1 × 10^4 PFU in 50 μL PBS met een 30-gauge naald. Injecteer in het rechterbenedenkwadrant van de buik onder een ondiepe hoek om buikorganen te vermijden.
   VOORZICHTIG: mCMV is besmettelijk (BSL-2). Gebruik passende containment en decontaminatie.
9. Noteer dieridentificatie, leeftijd, experimentele groep, virusdosis, volume en injectiedetails.

6. Bioluminescentiebeeldvorming (BLI)

OPMERKING: Voer BLI uit op P7 (5–6 dagen na celinjectie en vóór infectie) en P17 (10 dagen na infectie) zoals hieronder beschreven.

1. Los D-luciferine op in PBS bij 10 μg·^μL-1. Filtersteriliseer met een 0,22 μm filter, aliquot, en bewaar bij −20 °C beschermd tegen licht.
   VOORZICHTIG: D-luciferine is lichtgevoelig. Minimaliseer de lichtblootstelling tijdens de voorbereiding en het gebruik.
2. Injecteer D-luciferine i.p. bij 50 μL per pup met een naald van 30 gauge.
3. Verdoof de jongen met isoflurane (inductie 3–4 %, onderhoud 1,5–2 %) in zuurstof (0,8–1,0 L·^min-1). Houd de lichaamstemperatuur op een verwarmde beeldvormingsfase (ongeveer 37 °C).
   VOORZICHTIG: Isoflurane is een vluchtig verdovingsmiddel. Gebruik een goedgekeurde vaporizer en een verzamelsysteem.
4. Plaats verdoofde welpen in een beeldvormingssysteem voor kleine dieren (instrumentdetails in de Materiaaltabel).
5. Haal bioluminescente en röntgenfoto's met consistente belichtingsinstellingen 10 minuten na D-luciferine-injectie (BLI-instellingen: belichtingstijd 120 s voor P7-beelden en 30 s voor P17, binning B4 voor P7 en B4 voor P17-beelden, gezichtsveld (FOV) 25, f-stop 1.2, objecthoogte 1.5 en röntgeninstellingen: resolutie hoog, vermogen hoog).
   Pauzepunt: Afbeeldingen direct na de beeldvorming opslaan; De analyse kan later worden afgerond.
6. Analyseer beelden met geschikte BLI-beeldsoftware door interessegebieden (ROI's) te definiëren die het hele lichaam van elke muis omvatten en het uitgezonden licht te kwantificeren als fotonen·s⁻¹·cm⁻²·sr⁻¹.
7. Exporteer gekwantificeerde ROI-waarden voor downstream statistische analyse.

7. Het oogsten van leukemische cellen van celgetransplanteerde muizen

1. Oogst leukemische cellen en genereer enkelcel-suspenties zoals beschreven in Sectie 1.1.

8. Kleuring en acquisitie van flowcytometrie

1. Tel cellen en centrifugesuspensies op 300 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C en suspensieer opnieuw bij 1 × 10^7 cellen·^mL-1 in FACS-buffer.
2. Breng 100 μL (1 × 10^6 cellen) over in polystyreenflowcytometriebuizen.
3. Voeg een antilichaam tegen de Fc-receptorblokkering toe (anti-CD16/32; 1 μL per buis) en incubeer 5 minuten bij kamertemperatuur.
4. Bereid antilichaam-mastermix voor in FACS-buffer en voeg aan elke buis CD19-FITC, BP1-PE, B220-APC en lineage negatieve markers toe (TER119-PerCP, CD3-PerCP, CD11b-PerCP), 1 μL van elk antilichaam per 1 x 10^6 cellen in een 100 μL FACS-buffer.
5. Incubeer 20 minuten op kamertemperatuur in het donker.
6. Was met 5 mL FACS-buffer, centrifugeer en hersuspendeer in een 200 μL FACS-buffer met 7-AAD (3 μL) en telende kralen (6 μL; 6.000 kralen).
7. Bereid enkelkleurige compensatiecontroles voor met behulp van antilichaamvangstkralen of -cellen en verkrijg controles naast experimentele monsters.
8. Neem monsters op een flowcytometer met standaard FITC/PE/APC/PerCP-detectorinstellingen en een gemiddelde debietsnelheid. Verzamel evenementen totdat er 1.000 kralen zijn verzameld.
9. Exporteer FCS-bestanden en analyseer met behulp van flowcytometrie-analysesoftware (vermeld in Table of Materials) met de vastgestelde gatingstrategie (Figuur 2D).
10. Bereken absolute celnummers per milt of beenmerg door het tellen van kralen door het aantal doelgebeurtenissen bij 1.000 pareltjes te vermenigvuldigen met een schaalfactor van 6 (6.000 toegevoegde kralen), en normaliseren tot totale orgaancellulariteit op basis van het aandeel gekleurde cellen (1 × 10^6 cellen).

9. Grafieken uitzetten en statistische analyse

OPMERKING: Genereer grafieken en voer statistische analyses uit voor BLI- en flowcytometriegegevens met behulp van een statistisch softwarepakket (vermeld in de Materiaaltabel).

1. Presenteer gegevens als gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde (SEM).
   OPMERKING: Geen enkel dier werd uitgesloten van deze studie.
2. Voor BLI kun je PBS- en mCMV-groepen afzonderlijk vergelijken op P7 en P17 met behulp van ongepaarde Mann–Whitney-tests, waarbij Holm–Šídák-correctie wordt toegepast om meerdere vergelijkingen over tijdstippen te corrigeren.
3. Analyseer flowcytometrie-uitkomsten met behulp van een tweezijdige, ongepaarde Mann–Whitney-test.
4. Definieer statistische significantie als p < 0,05.

Resultaten

Temporale vene-injectie maakt een efficiënte neonatale engraftatie van leukemie- en neuroblastoomcellen mogelijk
Om de impact van vroege levensinfectie op de progressie van kinderkanker te modelleren, werden luciferase-gelabelde B-ALL-cellen afkomstig van leukemische volwassen Eμ-Ret-muizen of NB-cellen afkomstig van stervende Th-Mycn-muizen intraveneus toegediend via de temporale vene aan syngene jongen van 1–2 dagen oud. Succesvolle engraftment werd vijf dagen na de...

Discussie

Begrijpen hoe de ontwikkeling van het immuunsysteem in het vroege leven de voortgang van kanker beïnvloedt, is essentieel voor het ontwerpen van leeftijdsadequate immunomodulerende strategieën. In deze studie beschrijven we een reproduceerbaar neonataal transplantatieplatform dat precieze temporele controle van kankercel-entransplantatie en immuunmodulatie mogelijk maakt tijdens een kritisch venster van postnatale immuunonvolwassenheid. Door temporale vene-gemedieerde intraveneuze toedie...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
100µL, Microliter Syringe, Luer Tip	Hamilton	80601	-
30 G Needle	BD	305106	-
7-AAD	Biolegend	420404	-
Ami-X imaging system	Spectral Instruments Imaging	-	-
anti-mouse B220- APC	Biolegend	103212	-
anti-mouse CD19-FITC	Biolegend	152404	-
anti-mouse CD3ε- PerCP	Biolegend	100326	-
anti-mouse Ly-51-PE	Biolegend	108308	Ook genoemd BP1
anti-mouse TER119- PerCP	Biolegend	116226	-
anti-mouse/human CD11b- PerCP	Biolegend	101230	-
Aura software	Spectral Instruments Imaging	-	versie 4.0.8
BD Accuri C6	BD	-	-
BD Fortessa X-20	BD	-	-
Cleaning solution	Hamilton	18310	-
CountBright Absolute Counting Beads	Invitrogen by Thermo Fisher Scientific	2770930	6 µL bevat 6000 kralen
D-Luciferin	GoldBio	eLUCK-1G	-
DMEM	Gibco	11965092	-
DNase I	Sigma	1.13E+10	-
Falcon 40µm Cell Strainer, Blue, Sterile, Individually Packaged	FALCON	352340	-
FBS	Gibco	A5256701	-
FlowJo software	BD	-	v10.8
GeltrexTM	Thermo Fisher Scientific	A1413202	-
GraphPad Prism software	Dotmatics	-	v10.4.1
LE.5209 Cold light source	Euromex	-	-
Liberase™ TM Research Grade	Sigma	5.4E+09	-
NSG muizen	Jackson Labrotary	5557	NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ
Polybrene	Sigma	H9268-5G	-
Geverfd anti-muis CD16/32 Antilichaam	Biolegend	101301	-
RBC Lysis Buffer (10X)	Biolegend	420301	-