Methodenartikel

Reproduceerbare opstelling voor in vivo tweefotonbeeldvorming van de contractiliteit van cervicale lymfatische vaten en lymfestroom bij muizen

DOI:

10.3791/69482

⸱

10 april 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, Saratov State University, 2Institute of Physics, Department of Optics and Biophotonics, Saratov State University, 3Department of Computer Science and Information Technology, Saratov State University, 4, Res Inst Intelligent Complex Syst, Fudan University, 5Potsdam Institute for Climate Impact Research

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het manuscript demonstreert een innovatieve methode voor in vivo studie van de contractiliteit van cervicale lymfevaten en lymfestroom bij muizen, voor het testen van verschillende fysiologische functies van cervicale lymfevaten (cLV's) en de therapeutische strategieën voor het moduleren van de lymfatische regulatiemechanismen van hersendrainage en -clearance.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De contractiliteit van cLV's is de drijvende kracht achter de lymfestroom en een belangrijk mechanisme achter de reiniging van hersentoxines. Hier presenteren we een innovatieve methode voor in vivo tweefotonbeeldvorming van de contractiliteit van cLV's en de langetermijnobservatie van het verwijderen van rode bloedcellen met lymfestroom in cLV's bij muizen. De onderdelen van de opstelling omvatten een mini-verwarmingskussen dat is aangepast aan de nek van de muis, waarmee het venster voor beeldvorming tot 5 uur kan worden verlengd, terwijl de cLV-contractiliteit en de lymfestroom behouden blijven; vochtigheidscontrole; een beschermende behuizing; en een positioneringssysteem dat het mogelijk maakt een stabiele optische visualisatie van cLV's te behouden. De methode zorgt voor reproduceerbaarheid en compatibiliteit met andere typen twee-foton microscopen en een breed scala aan objectieven, waarbij beelden van hoge kwaliteit met een diepte tot 500 μm behouden blijven. Het protocol omvat gedetailleerde fasen van chirurgische voorbereiding van cLV's om de fysiologische omgeving te behouden, wat zorgt voor normale cLV-contractiliteit.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De contractiliteit van de cervicale lymfevaten (cLV's) speelt een sleutelrol bij hersenafvoer en de lymfatische verwijdering van hun weefsels van metabolieten en toxines 1,2,3. De vermindering van deze hoofdfunctie van cLV's leidt tot onderdrukking van hersentoxine-reiniging, die gepaard gaat met veel hersenziekten, waaronder de ziekte van Alzheimer, traumatisch hersenletsel en hersenkanker 4,5,6,7,8,9. Daarom is het bestuderen van de cLV-contractiliteit een belangrijke benadering bij de ontwikkeling van nieuwe therapeutische strategieën voor het moduleren van de lymfatische regulatiemechanismen van hersenafvoer en -clearance 10,11,12.

Deze studie presenteert een innovatieve methode voor realtime tweefotonenbeeldvorming van de cLV-contractiliteit en lymfestroom bij muizen van verschillende leeftijden. De belangrijke onderdelen van de opstelling omvatten een microverwarmingskussen, dat, wanneer bevestigd aan de nek van het dier, een verlengde beeldvormingstijd tot 5 uur mogelijk maakt, terwijl de contractiele activiteit van de collectorlymfevaten en de stabiliteit van de lymfestroom behouden blijven.

Het moet worden opgemerkt dat, in tegenstelling tot het bloedcirculatiesysteem, dat gevuld is met bloed dat met een bepaalde snelheid beweegt (van 10 mm/s in arteriolen tot 13 cm/s in de sagittale sinus bij mensen) door verschillende soorten bloedvaten, de vulling van lymfevaten met lymfe afhankelijk is van de toenemende drukgradiënt tussen lege lymfevaten en het volume interstitiële vloeistof dat tijdens metabolismewordt gevormd. 14,15,16,17,18,19. Tegelijkertijd is de lymfestroom in de lymfevaten intermitterend, variërend van 0 tot 1 mm/s 20,21,22. Recente MRI-studies bij mensen hebben aangetoond dat de lymfestroom in de meningeale lymfevaten (MLV's) 1-3 mm23 bedraagt. Het moet echter worden opgemerkt dat zelfs bij één persoon de lymfestroom bij MLV's varieert op verschillende momenten van de dag en kan dalen tot 0. Daardoor is de lymfestroom in de lymfevaten inconsistent omdat deze afhangt van het tempo van de metabole processen, die op zijn beurt weer afhankelijk zijn van temperatuur24. Inderdaad, de snelheid van een biochemische reactie wordt diepgaand en direct beïnvloed door temperatuur, wat dus ook een significant effect kan hebben op spontane samentrekkingen van lymfevaten en zo de lymfedrainage en het transportkan veranderen 24,25,26.

Daarom is het handhaven van de lichaamstemperatuur een belangrijke voorwaarde om het fysiologische milieu van lymfevaten te behouden ter ondersteuning van normale contractiliteit en lymfestroom. Het gebruik van commercieel verkrijgbare verwarmingsplaten garandeert echter niet het handhaven van de benodigde temperatuur in de diepe en optisch toegankelijke delen van de nek waar cLV's zich bevinden. Dit is vooral belangrijk voor tweefotonenbeeldvorming van de cLV-contractiliteit en lymfestroom, omdat dit wordt uitgevoerd in koude experimentele ruimtes met een omgevingstemperatuur van 19 °C, wat vereist is voor deze optische techniek27.

In dit opzicht is in de overgrote meerderheid van de in vivo studies de contractiliteit van lymfatische verzamelvaten met commerciële verwarmingsplaten beperkt tot 3-5 minuten (het maximale effect wordt meestal binnen enkele seconden waargenomen: 3,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37),38, waarna de lymfevulling en contractiliteit afnemen. Deze aanpak beperkt de observatietijd van de fysiologie van lymfevaten aanzienlijk en maakt het onmogelijk om langetermijneffecten op hun contractiliteit en lymfestroom te beoordelen, wat ons motiveerde om een mini-verwarmingskussen te ontwikkelen dat is aangepast aan de nek van de muis, met als doel het tijdsvenster voor beeldvorming tot 5 uur te verlengen, waarbij de cLV-contractiliteit en stabiele lymfestroom behouden blijven.

Een ander onderdeel van de opstelling is de beschermende behuizing met vochtigheidsregeling en positioneringssysteem, waarmee een stabiele visualisatie van cLV's zonder wateronderdompeling mogelijk is, en met behoud van beelden met hoge resolutie wanneer langafstands-luchtonderdompelingslenzen gecorrigeerd worden voor 0,17 mm afdekglas (bijv. CFI Plan Apochromat Lambda D 10x (MRD70170) en CFI Plan Apochromat Lambda D 20x (MRD70270)) worden gebruikt.

De voorgestelde methode zorgt voor reproduceerbaarheid en compatibiliteit met andere typen twee-fotonmicroscopen en diverse objectiefbereiken die compatibel zijn met de behuizing, rekening houdend met omgevingsfactoren, waaronder temperatuur-/vochtcontrole en de werkafstand tot de lens, terwijl hoogwaardige beelden behouden blijven met een diepte tot 500 μm en een tijdsvenster (tot 5 uur), wat een langetermijnanalyse van de contractiliteit van cLV's en lymfestroom met hoge kwaliteit bij muizen mogelijk maakt.

Het is belangrijk om rekening te houden met de anatomische locatie van cLV's nabij de bifurcatie van de halsslagader, waar baroreceptoren zich bevinden. De mechanische impact op baroreceptoren leidt tot destabilisatie van de bloeddruk en hartslag. Dit kan aanzienlijke veranderingen in de hydrostatische druk veroorzaken en als gevolg verstoring van de lymfestroom39. Daarom bevat de voorgestelde methode een gedetailleerde beschrijving van het chirurgische protocol voor de voorzichtige isolatie van cLV's in het diepe halsgebied om mechanische impact op de bifurcatie van de nabijgelegen halsslagader en veranderingen in de bloeddruk te vermijden, wat kan leiden tot een verminderde lymfestroom in de hersenen en daardoor een verminderde lymfestroom in cLV's en hun contractiliteit.

De resultaten tonen de leeftijdsgebonden afname van de cLV-contractiliteit en de gevoeligheid ervan voor therapeutische fotostimulerende effecten bij muizen. Bovendien tonen we voor het eerst bij langdurige observatie (meer dan 5 uur) duidelijk aan dat cLV's fungeren als tunnels voor het verwijderen van rode bloedcellen uit de rechter laterale ventrikel, een belangrijke lymfatische route voor hersentoxinereiniging 1,2,3. Al met al is de methode voor in vivo tweefotonbeeldvorming van de cLV-contractiliteit en lymfestroom bedoeld voor preklinische studies van diverse fysiologische functies van cLV's, waaronder regulatie van hersenafvoer en -zuivering, verwijdering van metabolieten en toxines uit de hersenen, evenals voor het testen van nieuwe therapeutische technologieën voor modulatie van de cLV-fysiologie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle procedures zijn uitgevoerd in overeenstemming met de Richtlijn voor de Verzorging en het Gebruik van Proefdieren, Richtlijn 2010/63/EU inzake de bescherming van dieren die voor wetenschappelijke doeleinden worden gebruikt, en de richtlijnen van het Ministerie van Wetenschap en Hoger Onderwijs van de Russische Federatie (nr. 742 van 13-11-1984), die zijn goedgekeurd door de Bio-ethische Commissie van de Staatsuniversiteit van Saratov (Protocol nr. 7, 22.09.2022).

OPMERKING: Raadpleeg de Materiaaltabel voor details over alle materialen die in dit protocol worden gebruikt.

1. Technisch apparaat voor het repareren van de muis

  1. Gebruik een stalen optische rail (SOR, lengte 270 mm, breedte 43 mm; Figuur 1A) als basis van de installatie.
  2. Installeer twee paalhouders (3PH-25) bovenop de SOR op een afstand van 175 mm van elkaar (Figuur 1B). Plaats de bevestigingspalen (3MP, diameter 12 mm) in de 3PH-25 en bevestig ze dan stevig met de M6-schroef (Figuur 1C).
  3. Bevestig de paalkraag (3PC) aan beide bevestigingspalen (3MP; Figuur 1D). Een post-collar is noodzakelijk voor de latere fixatie van de katheter met een constante aanvoer van zoutoplossing tijdens optische monitoring van het cervicale lymfevat.
    OPMERKING: Dit is noodzakelijk om het onderzoeksgebied periodiek te spoelen en zo bloed te verwijderen na chirurgische ingrepen, wat de optische monitoring kan bemoeilijken.
  4. Bevestig de haakse vaste postklem (3RPC-12) aan een van de 3MP bevestigingspalen en bevestig deze stevig met de M6-schroef (Figuur 1H).
    1. Plaats de bevestigingspost (diameter 12 mm) in het zijgat van de 3RPC-12 (Figuur 2B).
      OPMERKING: De montagepen is noodzakelijk voor het latere vastzetten van de beschermkap van een niet-wateronderdompelingslens met twee fotonen.
    2. Bevestig de houder die op een 3D-printer is geprint aan de zijbevestigingspost en bevestig deze stevig met twee paar M3-schroeven (Figuur 2C).
    3. Met UV-uithardbare lijm bevestig je een afdekglas met een diameter van 12 mm aan de onderkant van de beschermende behuizing die op een 3D-printer is geprint (Figuur 2D, F). Daarna gebruik je het M4-schroefmoerpaar om de beschermkap aan de houder te bevestigen (Figuur 2).
  5. Installeer de precisie-pantograaftafel voor verticale beweging 02TV004 (Figuur 1E) op de SOR-basis met twee tafelclips (3TC5) en sets schroeven, moeren en ringen M6 (Figuur 1F).
  6. Plaats een 3D-geprinte behuizing (155 mm lang, 110 mm breed) op het tafelblad, dat wordt gebruikt als reservoir voor de ophoping van zoutoplossing (Figuur 1G).

2. Verwarmingselement

  1. Assemblage van randapparatuur.
    1. Bedek het aansluitpunt van de draden met verwarmingselement 1 met een dunne laag siliconen (Figuur 3). Bevestig temperatuursensor 1 aan de mat en sluit deze af met siliconen (Figuur 3B).
    2. Soldeer de draden van het verwarmingselement en temperatuursensoren aan een meerdraadige kabel, vul het aansluitpunt met siliconen en sluit af met krimpfolie (Figuur 3).
    3. Plaats het verwarmingselement 2 en de temperatuursensor 2 in de foamroller (Figuur 4).
  2. Assemblage van de besturingseenheid
    OPMERKING: Link naar downloadbestanden voor het afdrukken van de behuizing van de controle https://disk.yandex.ru/d/06BURfMlQpl0Jg.
    1. Print de behuizing van de besturingsunit op een 3D-printer (Figuur 5B).
    2. Bevestig de connectoren voor het aansluiten van de stroomkabel en de aan/uit-knop aan de wanden van de behuizing, zoals te zien is in Figuur 5C,D).
  3. Installeer een 24 V DC-voeding, een DC-step-down omzetter en 2 MOSFET-modules in de behuizing (Figuur 5A, G, H, I).
  4. Om het circuit samen te stellen, volgt u deze stappen (Figuur 6).
    1. Sluit de step-down converter aan op de bron en stel de spanning in op 9 V (Figuur 6).
    2. Verbind de VIN-pin van de Arduino UNO respectievelijk met de OUT+-connector van de converter en GND met de OUT-connector (Figuur 6).
    3. Verbind de V+-pin van de voeding met de VIN+-pinnen van de MOSFET-modules, en de V-pin met de VIN-pinnen, respectievelijk (Figuur 6).
    4. Verbind de V-pin+ op verwarmingselement 1 op VOUT+ op module MOSFET 1 en V- op VOUT, respectievelijk (Figuur 6).
    5. Herhaal de stappen voor verwarmingselement 2 en MOSFET 2 (Figuur 6).
    6. Verbind de GND-pin van de MOSFET 1 en 2 modules met de GND van de Arduino UNO, en de PWM MOSFET 1 met de D11-connector van de Arduino UNO en de PWM MOSFET 2 met de D10-connector respectievelijk (Figuur 6).
    7. Verbind de VIN-pin van temperatuursensor 1 met de GND-connector van de Arduino UNO, VIN+ van de 5 V-connector van de Arduino UNO en SIG van D3 (Figuur 6).
    8. Verbind het SIG-contact van de temperatuursensor 2 met A1 op de Arduino UNO, sluit de GND-sensor aan op de GND van de Arduino UNO, en sluit ook de 100 kΩ pull-up weerstand aan (Figuur 6).
  5. Repareer de Arduino UNO en het toetsenbordscherm in de dekselbehuizing (Figuur 7I).

3. Gids voor temperatuurregelingssoftware

  1. Download de Arduino-schets (.ino-bestand) en open deze in de Arduino-ontwikkelomgeving (IDE-versie: 2.3.5-nightly-20241212).
  2. Selecteer de juiste COM-poort en download de firmware. De interface bevat twee knoppen. Om tussen hen te bewegen, gebruik je de linker- en rechterknop (Figuur 7B,D). De selectie-indicator bevindt zich links van de kolom (Figuur 7F).
  3. Het temperatuurselectieveld bevindt zich in de linkerkolom van het scherm (Figuur 7H). Gebruik de Omhoog- en Omlaagknoppen om het aan te passen (Figuur 7C).
  4. Het START/uitschakelveld bevindt zich in de rechterkolom van het scherm (Figuur 7G). Om deze kolom te selecteren, drukt u op de rechterknop op het toetsenbord en vervolgens op Select (Figuur 7A). Wanneer het proces draait, knippert de activiteitsindicator en verandert het label op de START-knop naar UIT.

4. Het vastzetten van het dier in het technische apparaat

OPMERKING: De experimenten werden uitgevoerd op mannelijke BALB/c-muizen (25-28 g, 2, 18 en 24 maanden oud); In elke groep waren er 7 dieren.

  1. Bereid een mengsel van ketamine en xylazine (respectievelijk 100 mg/kg; 10-156 mg/kg) en injecteer dit via intraperitoneale injectie op basis van het gewicht van de muis.
  2. Breng oogzalf aan op de oogleden om te voorkomen dat de oogbollen tijdens de operatie uitdrogen. Herhaal deze procedure indien nodig.
  3. Wanneer de reflexen van het terugtrekken van de achterpoten en het intrekken van de staart stoppen, plaats je de muis op het verwarmingselement op de rug om toegang te krijgen tot het buikgedeelte van het lichaam.
  4. Steek de besturingsunit in een stopcontact (ingangsspanning 175-240 V AC, frequentiebereik 50-60 Hz, AC 1,8A/230 V AC). Stel de bedrijfstemperatuur van het apparaat in op 37-38 °C.
  5. Met medisch tape bevestig je het dier zo dat het lichaam parallel is aan het tafeloppervlak en plaats je het hoofd onder een hoek ten opzichte van de sagittale as van het lichaam, zodat de rechter- of linkerkant van de nek op de rol ligt (Figuur 8A).
    OPMERKING: Deze fixatie van de muiskop is noodzakelijk zodat de rechter- of linkerkant van de nek (afhankelijk van de experimentele omstandigheden) tot ongeveer 5 mm naar de microscooplens wordt opgetild. Daardoor zal het gebied van dcLN en cLV bijna op hetzelfde niveau zijn als de luchtpijp.
  6. Wikkel de ligatuur om de bovenste snijtanden en bevestig deze aan de achterkant van het apparaat om de lichaamstemperatuur van het dier te behouden met medisch tape.
  7. Met een scheermachine scheer je het gebied van de haarlijn in de nek. Verwijder het resterende haar na het scheren en bedek het dier om het steriele veld te beschermen. Voor chirurgische ingrepen en daaroptische controle wordt 0,5 - 1 mL lidocaïne/bupivacaïne (respectievelijk 1 mg/mL en 0,25 mg/mL) subcutaan in de incisieplaats geïnjecteerd.
    1. Voor de eerste desinfectie ontvet en desinfecteer je gedeeltelijk de huid met een alcoholstaafje, en breng voor antiseptische behandeling vervolgens een oplossing van 0,5% chloorhexidine of jodium 2% aan op de huid. Herhaal alle sterilisatiestappen nog twee keer.
  8. Met een rechte dissectieschaar voert u een dermatotomie uit van de nekhuid met een longitudinale incisie van de onderkaak tot het sleutelbeengebied van ongeveer 2 cm lang (Figuur 8B).
  9. Fasciotomie met microchirurgische gebogen schaar, waarbij met gebogen pincet worden de speekselklieren en oppervlakkige spieren van de nek uit elkaar worden geduwd, waardoor de sternocleidomastoïde spier blootligt. Vermijd beschadiging van zichtbare bloedvaten om bloedingen te voorkomen. Bevochtig het operatiegebied voortdurend met zoutoplossing om overmatige weefselschade te voorkomen.
  10. Met behulp van een microchirurgische schaar wordt een myotomie uitgevoerd van de sternocleidomastoïde spier om toegang te krijgen tot het gebied tussen de luchtpijp en de halsslagader van het dier.
  11. Door de spieren en fascia te blijven spreiden en myo- en fasciotomie uit te voeren, lokaliseer je de diepe cervicale lymfeklier en afferente en efferente lymfevaten op een diepte van 5-7 mm (Figuur 8C).

5. De muis onder een microscoop vastzetten

  1. Plaats het apparaat met het vaste dier op de beweegbare tafel van de microscoop en verbind ze stevig met de M6-schroef. Dit is noodzakelijk om een permanente installatiepositie op de beweegbare tafel te garanderen.
  2. Steek de besturingsunit in een stopcontact (ingangsspanning 175-240 V AC, frequentiebereik 50-60 Hz, AC 1,8A/230 V AC). Stel de bedrijfstemperatuur van het apparaat in op 36-37 °C.
  3. Bevestig de katheter gevuld met zoutoplossing aan de bevestigingspost met medisch tape.
  4. Plaats een roller van 1 cm diameter onder het verwarmingselement aan de zijkant van het hoofd van het dier om een kantelhoek van 45° ten opzichte van de verplaatsbare microscooptafel te garanderen. Dit is noodzakelijk om het cervicale lymfevat horizontaal te plaatsen en de daaropvolgende druk op de luchtpijp te verminderen.
  5. Plaats de vaste katheter in het open nekgebied na de operatie, zodat deze zich aan de zijkant van de sleutelbeenderen van het dier bevindt.
    1. Zet de toevoer van zoutoplossing aan, wacht tot het open halsgebied volledig gevuld is met zoutoplossing.
    2. Laat de beschermende behuizing zakken over het met zoutoplossing gevulde nekgebied zodat het gebied van het lymfevat in het midden ligt en de luchtpijp van het dier niet wordt samengedrukt (Figuur 9A).
    3. Om de beschermbehuizing te installeren, wordt aanbevolen een verrekijker te gebruiken die is aangesloten op een twee-fotonmicroscoop. Plaats de beschermende behuizing op de luchtpijp zodat deze er niet op drukt. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen onder de bescherming ontstaan terwijl deze wordt neergelaten. Zorg ervoor dat de beschermplaat zich op de bovenste spieren van de nek bevindt en niet op cLV's drukt, zodat de verwarmde zoutoplossing in het vat kan stromen en mechanische vervorming van cLV's wordt voorkomen.
  6. Laat de niet-water-onderdompelingslens met twee fotonen in de beschermende behuizing zakken tot een diepte die overeenkomt met de werkafstand van deze lens en voer vervolgens een visualisatie van het cervicale lymfevat uit (Figuur 9B).
    OPMERKING: Bij het uitvoeren van de eerste scan is het noodzakelijk om ervoor te zorgen dat het lymfevat over de gehele lengte een volledige structuur heeft en beweeglijk is wanneer de muis ademt. Dit betekent dat het niet vervormd of bekneld is door een beschermende behuizing.

6. Twee-foton in vivo monitoring van de cLV-contractiliteit

OPMERKING: De 2-fotonbeelden zijn verkregen met een multifotonmicroscoop (gepulseerde laser, excitatiegolflengte 970 nm). De afbeelding werd verkregen met een resolutie van 20x (f/0,75). Elke afbeelding bestond uit 1 gezichtsveld zoom x 3,0 (212,13 × 212,13 μm), bestaande uit 512 x 512 stippen. De beelden van cLV's werden verkregen door een video te maken met 30 frames per seconde, die 1 minuut duurde. De 2-fotonbeelden werden verkregen in één kanaal met een excitatie van fluorescerende LYVE-1 in cLV's met een golflengte van 488 nm en emissie bij een golflengte van 525 nm.

  1. cLV-diameteranalyse en geautomatiseerde contractiliteitsbeoordeling
    1. Meet de diameter van cLV's in het interessegebied (ROI) met 30 minuten films bij 30 frames per seconde en 3x vergroting. Met behulp van een aangepaste Python-code meet je het tijdprofiel van de cLV-diameter voor dezelfde segmenten die worden gebruikt voor de lymfestroomberekening.
    2. Selecteer handmatig twee punten die overeenkomen met de tegenovergestelde wanden van de сLV's. Bepaal hun positie in volgende frames met behulp van het Lucas-Kanade optische stroomalgoritme (calcOpticalFlowPyrLK-functie in OpenCV), dat subpixelnauwkeurigheid voor de metingen biedt. Bereken de diameter als de afstand tussen de gevolgde punten, omgerekend van pixels naar micrometer. Gebruik een mediaanfilter voor schuifvenster om bewegingsartefacten te elimineren. Er zouden minstens 20 diametermetingen in één ROI moeten zijn.
    3. Om de interne frequentie van pulsaties te bepalen, gebruik je de gladde tijdreeks van diameter. Detecteer automatisch de maxima en minima van het signaal met behulp van de find_peaks-functie uit de SciPy-bibliotheek, die lokale extremen van het tijdsignaal identificeert op basis van amplitudedrempels en de minimale afstand tussen pieken.
    4. Sluit de cLV-contracties met een amplitude van minder dan 3% van de gemiddelde diameter en een interval van minder dan 2 s, uit de analyse. Bereken de gemiddelde frequentie over intervallen van 30 minuten als de frequentie van samentrekkingen per minuut.

7. Twee-fotonanalyse van lymfestroom in cLV's

OPMERKING: De lymfestroomanalyse werd beoordeeld door de beweging van rode bloedcellen in cLV's gedurende 5 uur na het inbrengen van autoloog bloed in de rechter laterale ventrikel via de chronische katheter.

  1. Verdoof de muis met 1% isoflurane (zie protocol gepubliceerd in40). Implanteer de katheter in de rechter laterale ventrikel volgens het protocol beschreven in40.
  2. Bereid de muis voor op twee-foton in vivo beeldvorming van cLV's volgens stappen 7.1, 7.3-7.5.
  3. Verzamel bloed uit de staartader door naaldprik, in een hoeveelheid van 10 μL in een steriele microcentrifugebuis, voorgespoeld met heparine, om stolling tijdens bloedmonsters en injectie te voorkomen.
  4. Injecteer bloed in de rechter laterale ventrikel (AP = −0,5 mm; ML= −1,06 mm; DV = 2,5 mm) met een micro-injectiepomp met een snelheid van 0,1 μL/min.
  5. Voer een tweefotonanalyse uit van de beweging van rode bloedcellen in cLV's. Bereken de lymfestroomsnelheid met behulp van protocollen gepubliceerd in41,22.

8. Fotobiomodulatie van de cLV-contractiliteit

  1. Voor de PBM van cLV's gebruik je de eerder gepubliceerde technologie en protocollen in40.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het gebruik van beschermende behuizing biedt de belangrijkste voordelen voor langdurige monitoring van cervicale lymfatische vaten in vivo, zoals isolatie van het operatiegebied van de externe omgeving, waardoor de onderdompeling van het lymfevat en omliggende weefsels in zoutoplossing met een constante toevoer van zoutoplossing via een katheter aan het lichaam kan worden gehandhaafd. Daarnaast zorgt de beschermbedekking door de bevestiging aan het microscoopglaasje en nauwe mec...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De studie van de fysiologie van lymfevaten vereist het gebruik van niet-invasieve methoden, terwijl speciale omgevingsomstandigheden behouden blijven die normale contractiliteit en stabiele lymfestroom mogelijk maken. De overgrote meerderheid van de methoden om de functies van lymfevaten te bestuderen is gebaseerd op optische monitoring van hun contractiliteit en beoordeling van de snelheid van de lymfestroom 3,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit onderzoek werd ondersteund door een subsidie van de Russische Wetenschappelijke Stichting (nr. 23-75-30001).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
3D printerBambu Lab, ChinaP1S
5pin connectorConnfly electronic (Zhenqin), ChinaDS1110-01
A set of heat shrinkable tubesJupiter, ChinaJP7230-01
Arduino IDEArduino LLC2.3.5-nightly-20241212
BALB/c mice"Andreevka" Branch FSBIS SCBT FMBA, Russia3-15-16Male, 6-month-old
Chlorhixedin BIOPHARMACEUTICAL PLANT, RussiaN/A
Dumont forceps Stoelting, USA52100-07 
Evans Blue dye Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USAN/A
Fine ForcepsStoelting, USA52102-02P
HamiltonHamilton Bonaduz AG, Switzerland29 G needle
Heating elementChinaLFH-9415sg
Insulin needleINSUPEN, Italy31G, 0.25mm*6mm
Ketamine MOSCOW ENDOCRINE PLANT, FSUE, RussiaGeneral anesthesia 
Keypad Shielddiymore, China1602 LCD Keypad Shield
Lidocaine ORGANICA, RussiaN/A Analgesic drug
Lockable switch buttonChinaN/A
Metal-film resistorsTZT, ChinaN/A
Micro Dissecting Vannas Spring ScissorsStoelting, USA52130-00P
MOSFET ModuleChinaMOSFET Module D4184
Mounting postStanda, Lithuania3MP, diameter 12 mm
Mounting wireAB retail, RussiaHB-1
Non-sharp tweezerStoelting, USA52108-83P 
Plastic for 3D printerBambu Lab, ChinaA00-D0-1.75-1000-SPL.
Post collar Standa, Lithuania3PC
Post holderStanda, Lithuania3PH-25
Power connectorRUICHI, ChinaAC-015
Power supplySANPU, ChinaPS200-H1V24
Precision pantograph table for vertical movement"Laser components", Russia02TV004 
Right-angle fixed post clamp Standa, Lithuania3RPC-12
Screw M3Standa, LithuaniaN/A
Screw M4Standa, LithuaniaN/A
Screw M6Standa, LithuaniaN/A
Shaving machine Braun, figure-materials-1Series 3310s
Sodium chlorideKraspharma, RussiaN/A
Solder Production of metal powders, Russiatin-lead solder 61
Soldering fluxSolins, RussiaLTI-120 22 ml with brush
Soldering stationAOYUE, ChinaN/A
Soldering station AOYUE, ChinaN/A
Steel optical rails (SOR)Standa, LithuaniaN/A
Step-down voltage converterRUICHI, ChinaEM-825
Straight dissecting scissors Stoelting, USA52132-10P 
Temperature sensorLiludin, ChinaDS1820
TetracyclineJSC Tatkhimfarmpreparaty, RussiaEye ointment 
The ControllerArduino, ChinaUNO R3
TweezerStoelting, USA52100-03 
Two-photon  microscopNikon, JapanA1R MP
WirePartner-Electro, RussiaP020G-0305-C050
Xylazine "Alfasan International B.V.", NetherlandsMuscle relaxant
CatheterScientific Commodities Inc., USAPE-10, 0,28 mm ID × 0,61 mm OD

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Li, D. Y., et al. Photostimulation of brain lymphatics in male newborn and adult rodents for therapy of intraventricular hemorrhage. Nat Commun. 14 (1), 6104(2023).
  2. Kunert, C., Baish, J. W., Liao, S., Timothy, P. P., Lance, L. M. Mechanobiological oscillators control lymph flow. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 112 (35), 10938-10943 (2015).
  3. Du, T., et al. Restoration of cervical lymphatic vessel function in aging rescues cerebrospinal fluid drainage. Nat Aging. 4 (10), 1418-1431 (2024).
  4. Mesquita, D., et al. Functional aspects of meningeal lymphatics in ageing and Alzheimer's disease. Nature. 560 (7717), 185-191 (2018).
  5. Bolte, A. C., et al. Meningeal lymphatic dysfunction exacerbates traumatic brain injury pathogenesis. Nat Commun. 11, 4524(2020).
  6. Hu, X., et al. Meningeal lymphatic vessels regulate brain tumor drainage and immunity. Cell Res. 30, 229-243 (2020).
  7. Song, E., et al. VEGF-C-driven lymphatic drainage enables immunosurveillance of brain tumours. Nature. 577 (7792), 689-694 (2020).
  8. Chen, J., et al. Meningeal lymphatics clear erythrocytes that arise from subarachnoid hemorrhage. Nat. Commun. 11, 3159(2020).
  9. Liu, X., et al. Subdural haematomas drain into the extracranial lymphatic system through the meningeal lymphatic vessels. Acta Neuropathol Commun. 8, 16(2020).
  10. Li, D. Y., et al. Photostimulation of brain lymphatics in male newborn and adult rodents for therapy of intraventricular hemorrhage. Nat Commun. 14, 6104(2023).
  11. Liu, S., et al. Neuro-lymphaphotonics opens new horizons of the future technologies for the therapy of brain diseases. Theranostics. 16 (2), 776-793 (2025).
  12. Lin, H., et al. Transcranial photobiomodulation for brain diseases: review of animal and human studies including mechanisms and emerging trends. Neurophotonics. 11 (1), 010601(2024).
  13. Bollmann, S., et al. Imaging of the pial arterial vasculature of the human brain in vivo using high-resolution 7T time-of-flight angiography. Elife. 11, e71186(2022).
  14. Jordan, J. E., Pelc, N. J., Enzmann, D. R. Velocity and flow quantitation in the superior sagittal sinus with ungated and cine (gated) phase-contrast MR Imaging. J Magn Reson Imaging. 4 (1), 25-28 (1994).
  15. Negrini, D., Fabbro, M. D. Subatmospheric pressure in the rabbit pleural lymphatic network. J Physiol. 520 (Pt 3), 761-769 (1999).
  16. Negrini, D., Moriondo, A., Mukenge, S. Transmural pressure during cardiogenic oscillations in rodent diaphragmatic lymphatic vessels. Lymphat Res Biol. 2 (2), 69-81 (2004).
  17. Moriondo, A., Mukenge, S., Negrini, D. Transmural pressure in rat initial subpleural lymphatics during spontaneous or mechanical ventilation. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 289 (1), H263-H269 (2005).
  18. Grimaldi, A., et al. Functional arrangement of rat diaphragmatic initial lymphatic network. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 291 (2), H876-H885 (2006).
  19. Gashev, A. A., Zawieja, D. C. Hydrodynamic regulation of lymphatic transport and the impact of aging. Pathophysiology. 17 (4), 277-287 (2010).
  20. Park, J. K., et al. Association of lymphatic flow velocity with surgical outcomes in patients undergoing lymphovenous anastomosis for breast cancer-related lymphedema. Breast Cancer. 29 (5), 835-843 (2022).
  21. Fischer, M., et al. Flow velocity of single lymphatic capillaries in human skin. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 270 (1), H358-H363 (1996).
  22. Dixon, J. B., et al. Lymph flow, shear stress, and lymphocyte velocity in rat mesenteric prenodal lymphatics. Microcirculation. 13 (7), 597-610 (2006).
  23. Kim, J. H., Yoo, R. E., Choi, S. H., Park, S. H. Non-invasive flow mapping of parasagittal meningeal lymphatics using 2D interslice flow saturation MRI. Fluids Barriers CNS. 20 (1), 37(2023).
  24. Solari, E., Marcozzi, C., Negrini, D., Moriondo, A. Temperature-dependent modulation of regional lymphatic contraction frequency and flow. American Journal of Physiology-Heart and Circ Physiol. 313 (5), H879-H889 (2017).
  25. Solari, E., Marcozzi, C., Negrini, D., Moriondo, A. Lymphatic Vessels and Their Surroundings: How Local Physical Factors Affect Lymph Flow. Biology (Basel). 9 (12), 463(2020).
  26. Angeli, V., Lim, H. Y. Biomechanical control of lymphatic vessel physiology and functions. Cell Mol Immunol. 20, 1051-1062 (2023).
  27. Chong, C., et al. In vivo visualization and quantification of collecting lymphatic vessel contractility using near-infrared imaging. Sci Rep. 6, 22930(2016).
  28. Weiler, M., Kassis, T., Dixon, J. B. Sensitivity analysis of near-infrared functional lymphatic imaging. J Biomed Opt. 17 (6), 066019(2012).
  29. Semiachkina-Glushkovskaia, A., et al. NO-ergic mechanisms of age differences in photostimulation of lymphatic drainage, filtration and clearance. Biomed Opt Exp. , In press (2025).
  30. Davis, M. J., et al. Modulation of lymphatic muscle contractility by the neuropeptide substance P. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 295 (2), H587-H597 (2008).
  31. Bell, R. D., et al. iNOS dependent and independent phases of lymph node expansion in mice with TNF-induced inflammatory-erosive arthritis. Arthritis Res Ther. 21 (1), 240(2019).
  32. Bachmann, S., Detmar, M., Proulx, S. Visualization and Measurement of Lymphatic Function In Vivo. Methods Mol Biol. 1846, 197-211 (2018).
  33. Nelson, T. S., et al. Minimally invasive method for determining the effective lymphatic pumping pressure in rats using near-infrared imaging. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 306 (5), R281-R290 (2014).
  34. Proulx, S. T., et al. Use of a PEG-conjugated bright near-infrared dye for functional imaging of rerouting of tumor lymphatic drainage after sentinel lymph node metastasis. Biomaterials. 34 (21), 5128-5137 (2013).
  35. Kwon, S., Sevick-Muraca, E. M. Noninvasive quantitative imaging of lymph function in mice. Lymphat Res Biol. 5 (4), 219-231 (2007).
  36. Zhou, Q., Wood, R., Schwarz, E. M., Wang, Y. J., Xing, L. Near-infrared lymphatic imaging demonstrates the dynamics of lymph flow and lymphangiogenesis during the acute versus chronic phases of arthritis in mice. Arthritis Rheum. 62 (7), 1881-1889 (2010).
  37. Schmid-Schonbein, G., Zweifach, B. Fluid pump mechanisms in initial lymphatics. News Physiol Sci. 9, 67-71 (1994).
  38. Schmid-Schonbein, G. W. Mechanisms causing initial lymphatics to expand and compress to promote lymph flow. Arch Histol Cytol. 53 (Suppl), 107-114 (1990).
  39. Hughes, G. W., Moore, J. P., Lord, R. N. Barosensory vessel mechanics and the vascular sympathetic baroreflex: Impact on blood pressure homeostasis. Exp Physiol. 108 (10), 1245-1249 (2023).
  40. Blokina, I., et al. Photobiomodulation under Electroencephalographic Controls of Sleep for Stimulation of Lymphatic Removal of Toxins from Mouse Brain. J Vis Exp. (208), e67035(2024).
  41. Dixon, J. B., Zawieja, D. C., Gashev, A. A., Cote, G. L. Measuring microlymphatic flow using fast video microscopy. J Biomed Opt. 10, 064016(2005).
  42. Terskov, A., et al. Age as a limiting factor for effectiveness of photostimulation of brain drainage and cognitive functions. Front Optoelectron. 31 (3), 6(2025).
  43. Blivet, G., Relano-Gines, A., Wachtel, M., Touchon, J. A randomized, double-blind, and sham-controlled trial of an innovative brain-gut photobiomodulation therapy: safety and patient compliance. J Alzheimers Dis. 90 (2), 811-822 (2022).
  44. Herkes, G., et al. A novel transcranial photobiomodulation device to address motor signs of Parkinson's disease: a parallel randomised feasibility study. EClinicalMedicine. 66 (1), 102338(2023).
  45. Bullock-Saxton, J., Lehn, A., Laakso, E. L. Exploring the effect of combined transcranial and intra-oral photobiomodulation therapy over a four-week period on physical and cognitive outcome measures for people with Parkinson's disease: a randomized double-blind placebo-controlled pilot study. J Alzheimers Dis. 83 (4), 1499-1512 (2021).
  46. Lee, T. L., Chan, A. S. Photobiomodulation may enhance cognitive efficiency in older adults: a functional near-infrared spectroscopy study. Front Aging Neurosci. 20 (6), 1-10 (2023).
  47. Cardoso, F. S., et al. Effects of chronic photobiomodulation with transcranial near-infrared laser on brain metabolomics of young and aged rats. Mol Neurobiol. 58 (5), 2256-2268 (2021).
  48. Hosseini, L., et al. Effect of transcranial near-infrared photobiomodulation on cognitive outcomes in D-galactose/AlCl3-induced brain aging in BALB/c mice. Lasers Med Sci. 37 (3), 1787-1798 (2022).
  49. Lutfy, R. H., Essawy, A. E., Mohammed, H. S., Shakweer, M. M., Salam, S. A. Transcranial irradiation mitigates paradoxical sleep deprivation effect in an age-dependent manner: role of BDNF and GLP-1. Neurochem Res. 49 (4), 919-934 (2024).
  50. Bohlen, H. G., Gasheva, O. Y., Zawieja, D. C. Nitric oxide formation by lymphatic bulb and valves is a major regulatory component of lymphatic pumping. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 301 (5), H1897-H1906 (2011).
  51. Scallan, J. P., Zawieja, S. D., Castorena-Gonzalez, J. A., Davis, M. D. Lymphatic pumping: mechanics, mechanisms and malfunction. J Physiol. 594 (20), 5749-5768 (2016).
  52. Aspelund, A., et al. A dural lymphatic vascular system that drains brain interstitial fluid and macromolecules. J Exp Med. 212 (7), 991-999 (2015).
  53. Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. 523 (7560), 337-341 (2015).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

In vivo beeldvorminglymfatische contractiliteitmuismodelleringklaring van hersentoxineschirurgische voorbereidingoptische visualisatiereproduceerbaarheid van beeldvorming

Gerelateerde artikelen