Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Multimodale benadering om botregeneratie en steigerprestaties te beoordelen

332 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/69483

⸱

13 februari 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Biomedical Sciences, Federal University of Rio de Janeiro, 2Department of Condensed Matter, Applied Physics and Nanoscience, Brazilian Center for Research in Physics, 3Alberto Luiz Coimbra Institute for Graduate Studies and Research in Engineering (COPPE), Federal University of Rio de Janeiro, 4Brazilian Synchrotron Light Laboratory (LNLS), Brazilian Center for Research in Energy and Materials (CNPEM)

In dit artikel

Samenvatting

We stellen een protocol voor voor het beoordelen van botregeneratie op verschillende hiërarchische niveaus. Deze multimodale aanpak maakt structurele analyse mogelijk over verschillende lengteschalen, waardoor uitdagingen bij de monstervoorbereiding effectief worden aangepakt. Het biedt ook een betrouwbare workflow voor het evalueren van de effectiviteit van biomaterialen bij het bevorderen van botregeneratie.

Samenvatting

Het klinische succes van een implantaat hangt grotendeels af van het vermogen om botherstel te bevorderen en osteointegratie te bevorderen. Hoewel er aanzienlijke vooruitgang is geboekt in het ontwerpen van nieuwe steigers, is een grondige evaluatie van het succes van implantaten op verschillende botlengteschalen niet voldoende onderzocht. Bot is een hiërarchisch georganiseerd weefsel, met een ingewikkelde structuur die varieert van de organisatie van collageenfibrillen en hun mineralisatie op nanometer- en micrometerschaal tot de macroscopische ordening van compacte en cancelloze botten. Deze hiërarchische organisatie is cruciaal voor het waarborgen van botfunctie en mechanische prestaties. In deze context is een uitgebreide beoordeling van de effecten van biomaterialen op botherstel op meerdere lengteschalen essentieel om de effectiviteit en veiligheid van geïmplanteerde materialen te evalueren. Het voorbereiden van monsters voor geïntegreerde multimodale analyses vormt echter een technische uitdaging. In dit werk presenteren we een protocol dat is ontworpen om botregeneratie op verschillende hiërarchische niveaus te evalueren en de interface tussen nieuw gevormd bot en het geïmplanteerde steiger te analyseren. Deze aanpak biedt een robuuste methode om de effectiviteit van steigers bij het induceren van botherstel te beoordelen. De combinatie van geselecteerde 3D- en 2D-beeldvormingstechnieken is cruciaal voor een juiste evaluatie van het complexe gemineraliseerde weefsel dat zich vormt tijdens het botgenezingsproces

Inleiding

Bot is een complex, hiërarchisch georganiseerd weefsel 1,2. Het begrijpen van de structurele organisatie is essentieel om fundamentele vragen te beantwoorden over hoe cellen bijdragen aan de weefselarchitectuur en hoe structurele veranderingen de mechanische functie beïnvloeden3. In deze context blijft botremodellering na een blessure een centraal onderzoeksonderwerp. Fractuurgenezing is een complex meerfasig proces, beginnend met een initiële ontstekingsreactie, gevolgd door angiogenese en de differentiatie van voorlopercellen tot chondrozyten en osteoblasten 4,5. Er is veel discussie over de rol van biomaterialen bij het stimuleren van osteointegratie, met name over biocompatibiliteit en hun vermogen om vezelige encapsulatie6 te voorkomen.

Een veelgebruikte methode om biomateriaal-gestimuleerde osteointegratie te beoordelen is optische microscopie, die zowel kwantitatieve als kwalitatieve histologische analyses mogelijk maakt. Deze aanpak is bewezen een betrouwbare en effectieve manier te zijn om het succes van botimplantatente evalueren 7,8. Desalniettemin kunnen verschillende kwesties met betrekking tot bothiërarchische organisatie niet worden onderzocht met één enkele beeldvormingsmethode3, met name de histologische methode, die ten minste gedeeltelijk wordt beperkt door de vergrotingsbeperking van de methode.

Vooruitgang in driedimensionale beeldvorming is essentieel gebleken voor het begrijpen van de structuur van bothiërarchie. Technieken zoals microcomputertomografie (microCT; ofwel synchrotronstraling of conventionele laboratoriumgebaseerde röntgenbronnen)9,10,11, dual-beam scanning electron microscopie (FIB-SEM) geassocieerd met slice-and-view tomografie 12,13,14 en transmissie-elektronentomografie 15,16 boden nieuwe inzichten in botarchitectuur op meerdere schalen.

Gebaseerd op verschillende 3D-beeldvormingsbenaderingen is een model van bothiërarchische organisatie voorgesteld, dat aanvankelijk negen verschillende niveaus van botstructurele organisatie1 identificeerde. Dit schema is recentelijk herzien en uitgebreid om ongeveer 12 hiërarchische niveaus te omvatten, en dient als een waardevolle referentie voor het onderzoeken van de relatie tussen structuur en functie in botweefsel 2,17. Belangrijk is dat dit voorgestelde hiërarchische model een basis biedt voor het evalueren van het succes van botherstel na een blessure. Het evalueren of het geregenereerde botweefsel de oorspronkelijke hiërarchische structuur reproduceert, is een belangrijke standaard bij het beoordelen van de kwaliteit van botgenezing, vooral wanneer biomaterialen worden gebruikt binnen de beschadigde plek.

Hoewel het gebruik van meerdere beeldvormingstechnieken om botorganisatie te onderzoeken is besproken 6,7,18,19,20, is er weinig onderzocht over een workflow die verschillende beeldvormingsmodaliteiten integreert om de organisatie van botmineraalen op meerdere ruimtelijke schalen te beoordelen. Zoals vermeld is bot een complex samengesteld weefsel, bestaande uit een organische fase (cellen, collageen en macromoleculen) en een gemineraliseerde matrix. Vanuit het perspectief van monstervoorbereiding brengt deze complexiteit technische uitdagingen met zich mee met betrekking tot de permeatie van oplosmiddelen door het monster, het doorsnijden van een hard monster en de integratie van verschillende beeldvormingsstrategieën op hetzelfde monster.

De belangrijkste innovatie in dit werk is het opzetten van een reproduceerbare, correlatieve en multiscale beeldvormingsworkflow met behulp van driedimensionale beeldvorming en complementaire technieken. Zoals geïllustreerd in Figuur 1A, is de workflow zo ontworpen dat hetzelfde monster sequentieel kan worden onderzocht met verschillende beeldvormingsmodaliteiten. Omdat sommige van deze technieken destructief zijn of sectie vereisen, volgt de workflow een volgorde die begint met niet-destructieve methoden en doorgaat naar benaderingen die snijden of materiaalverwijdering omvatten.

Deze workflow voor de voorbereiding en analyse van monsters is breed toepasbaar op harde of gemineraliseerde monsters, waaronder corticaal en trabeculair bot, pre-implantatie steigers en de evaluatie van de bot/biomaterialen-interface na implantatie. Door beeldvormingsmodaliteiten te combineren die verschillende gezichtsvelden en resolutiebereiken beslaan (Figuur 1B), maakt de workflow de analyse van monsters mogelijk van centimeterschaal tot micrometer- en nanometerschaal. Hoewel de sequentie geoptimaliseerd is om correlatieve analyse van één enkel monster te ondersteunen, kan elke techniek ook onafhankelijk worden toegepast volgens het experimentele doel. Deze aanpak maakt een gedetailleerde beoordeling van de osteo-integratie van biomaterialen mogelijk en de evaluatie van de geregenereerde botgroei in het genezingsgebied.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

De resultaten die in dit protocol worden gepresenteerd, zijn verkregen uit een experimentele procedure die in een eerdere studie21 is uitgevoerd. Alle procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de ethische richtlijnen van het Ethisch Comité voor het Gebruik en de Verzorging van Proefdieren aan de Fluminense Federale Universiteit, Brazilië (CEUA/UFF: 779). Kort gezegd werden 20 mannelijke Wistar-ratten van tussen de 300 en 400 g willekeurig toegewezen aan twee groepen: Sham- en cHA-microsfeerimplantatie. Alle dieren ondergingen een operatie waarbij een defect van 2 mm in de tibia-diafyse werd gecreëerd. De Sham-groep diende als stolselcontrole om botregeneratie te evalueren bij een niet-kritisch defect, terwijl de experimentele groep CHA37-microsferen in de defectplaats kreeg geïmplanteerd. Na 7 en 21 dagen werden de dieren geëuthanaseerd met een overdosis algehele narcose, en werden tibia-botblokken van elke groep en tijdstip (7 en 21 dagen) verzameld. De botkwaliteit en de omvang van nieuw gevormd bot werden beoordeeld met optische microscopie en microCT.

1. Monsterfixatie en resin-inbedding

  1. Onmiddellijk na euthanasie verwijder je het tibia met het geïmplanteerde biomateriaal en breng het over in een buisje met Karnovsky-fixatieve oplossing (2,5% glutaraldehyde, 4% formaldehyde in 0,1 M cacodylaatbuffer). Bewaar het monster minstens één dag op -4 °C.
    OPMERKING: Bereid het fixatiemiddel voor en behandel het onder een dampkap om blootstelling aan vluchtige stoffen te voorkomen. Alle chemische omgang moet worden uitgevoerd met geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM), en aanvullende technische veiligheidsmaatregelen moeten worden genomen wanneer dat nodig is.
  2. Breng het monster over van het fixatief naar een buisje met een cacodylaatbuffer van 0,1 M. Houd het monster zacht gedraaid en vervang de buffer twee keer om de 10 minuten. In deze fase snoei je de randen van het monster af met een kleine zaag om de harsinfiltratie te vergemakkelijken. Houd het bij het snijden van het monster nat in de 0,1 M cacodylaatbuffer om te voorkomen dat het uitdroogt.
    OPMERKING: Houd het sample altijd in een buffervolume dat minstens twee keer zo groot is als het samplevolume. Dit moet worden gevolgd voor alle oplossingen en hars die in dit protocol worden gebruikt. Bij het hanteren van de hierboven genoemde chemische componenten, werk dan in een dampkap en gebruik geschikte PBM. Verzamel de fixatieve oplossing en cacodylaat bufferafval in duidelijk gelabelde, chemisch compatibele containers met goed passende doppen. Volg de institutionele Standard Operating Procedures (SOP's) voor de veilige opslag en verwijdering van gevaarlijk chemisch afval.
  3. Begin het uitdrogingsproces met toenemende concentraties aceton (10%, 30%, 50%, 70%, 90% en 100%). Houd het monster 30 minuten onder rotatie bij elke concentratie. Herhaal de stap van 100% watervrij aceton drie keer.
    OPMERKING: Werk bij het hanteren van aceton in een dampkap en draag geschikte PBM. Na gebruik verzamel je eventueel residueel oplosmiddel in duidelijk gelabelde, chemisch compatibele afvalcontainers met correct passende doppen. Volg de institutionele SOP's voor de veilige opslag en verwijdering van gevaarlijk chemisch afval.
  4. Infiltreer met spur resin door het monster door een reeks gegradueerde aceton-harsverhoudingen te verplaatsen: 2:1, 1:1, 1:2, en uiteindelijk pure resin. Elke stap moet 12 uur duren en onder rotatie bij kamertemperatuur worden uitgevoerd. Na de gegradueerde aceton-naar-hars infiltratie vervang je de pure hars twee keer. Tot slot wordt het monster overgebracht in een mal met pure hars en het monster gepolymeriseerd bij 70 °C gedurende 24 uur.
    OPMERKING: De hars is volgens het datablad voorbereid om een gemiddelde hardheid te bereiken. Bij het hanteren van sporenhars werk je in een dampkap en draag je geschikte PBM. Verzamel na gebruik eventuele restanten in duidelijk gelabelde, chemisch compatibele afvalcontainers met correct geplaatste doppen. Volg de institutionele SOP's voor de veilige opslag en verwijdering van gevaarlijk chemisch afval.

2. Voorbeeldvisualisatie met behulp van microcomputer-röntgentomografie (microCT)

OPMERKING: microCT wordt gebruikt om de positie van het implantaat en botregeneratie te beoordelen. Het helpt ook bij het identificeren van potentiële regio's van belang voor verdere analyse. Deze stap moet worden uitgevoerd met het monster dat in hars is ingebed.

  1. Gebruik een monsterhouder die door de fabrikant wordt verstrekt als basis, zodat het monster veilig is geplaatst om beweging tijdens de scan te voorkomen. Gebruik materialen met lage dichtheid als ondersteuning, zoals polystyreen, gaas of microcentrifugebuizen.
  2. Visualiseer met de volgende optimale scanparameters: buisspanning/stroom = 60 kV/133 mA; hoekstap = 0,33°; gemiddelde frames = 5; voxelgrootte = 5 μm; rotatiemodus = 180°. Voor monsters met metalen implantaten gebruik je een 360° rotatie en een aluminium filter van 0,5 mm.
    OPMERKING: Tijdens botregeneratie ligt de dikte van trabekelachtig geweven bot doorgaans binnen de resolutielimieten van conventionele microCT-beeldvorming. Om conventionele morfometrische parameters van trabeculair bot, zoals trabeculaire dikte, scheiding en aantal, nauwkeurig te kwantificeren, wordt aanbevolen de kleinste voxelgrootte te gebruiken (5 μm zoals gespecificeerd). Als de Region of Interest (ROI) het Field of View (FOV) overschrijdt bij deze nominale resolutie, gebruik dan eerst de multiscan-functie om de ROI te tilenen. Overweeg om de voxelgrootte alleen als laatste redmiddel te vergroten als de ROI niet via multiscan kan worden vastgelegd.
  3. Na het scannen bestaat de ruwe verwervingsgegevens uit een reeks genummerde afbeeldingsbestanden. Voer reconstructie uit met de software van de fabrikant, met de nadruk op het minimaliseren van artefacten in het gebied van interesse van het monster.
    OPMERKING: Het is gebruikelijk om beeldartefacten tegen te komen langs de randen van de beelden, vooral in gebieden die niet geanalyseerd zullen worden. Het uiteindelijke volume kan worden bijgesneden met behulp van de software van de fabrikant om deze gebieden te elimineren.
  4. Analyseer het gereconstrueerde volume met verschillende 3D-visualisatiesoftware, zoals Avizo, VGStudio Max, CTVox en Dragonfly22. Pas digitale beeldfilters toe om artefacten te verwijderen. Gebruik in dit geval de Non-local Means Denoising-methode voor dit doel19.
    OPMERKING: Niet-lokale filters denoiserende filters moeten zo laag mogelijk worden gehouden, om de belangrijke details van de interface niet te belemmeren.

3. Monstervoorbereiding voor optische microscopie

  1. Selecteer de richting van het doorsnijden van het monster volgens het experimentele doel. Het scheenbeen kan transversaal of longitudinaal langs de lengteas van het bot worden doorgesneden. Gebruik transversale doorsneden om seriële doorsneden te maken die het volledige defectvolume bestrijken. Longitudinale doorsnede is geschikt om botregeneratie langs de langasrichting te evalueren. Deze benadering levert echter slechts één deel van het defect.
    1. Gebruik een diamantzaagschijf met lage snelheid om het monster in 1 mm sneden te snijden, volgens de experimentele strategie.
      OPMERKING: Het wordt aanbevolen een diamantschijf te gebruiken met een dikte van 0,006 tot 0,012 inch. Dunnere bladen maken zeer nauwkeurige sneden mogelijk, met minimaal materiaalverlies door de bladdikte.
    2. Vul het vloeistofreservoir totdat het vloeistofniveau de onderkant van het blad bedekt.
      OPMERKING: Gedestilleerd water is geschikt voor botmonsters. Als echter overmatige verwarming wordt verwacht, bijvoorbeeld bij monsters met metalen implantaten, gebruik dan de olie die door de fabrikant wordt geleverd om het reservoir te vullen.
    3. Bevestig het monster aan de monsterhouder en bevestig het aan de instrumentarm. Zorg ervoor dat het monster stabiel en horizontaal ligt ten opzichte van het oppervlak van de schijf. Gebruik de positioneringsknoppen om het snijgebied van het monster aan te passen op de schijf.
    4. Begin met het snijden van het monster met hogere snelheidsinstellingen (210 - 250 RPM) en oefen lage druk uit totdat er een inkeping in het monster ontstaat. Verlaag vervolgens de snelheid (naar 93 - 124 RPM) om het doorsnijden soepel te voltooien en overmatige trillingen te voorkomen.
    5. Stop de zaag direct nadat de zaag is voltooid. Stel het systeem correct af om ervoor te zorgen dat het snijden stopt zodra het monster van het oorspronkelijke blok is losgemaakt.
  2. Onderzoek het monster met een stereomicroscoop. Begin met een lage vergroting (bijvoorbeeld 5x-10x) om het hele monster te inspecteren, en verhoog vervolgens de vergroting (bijv. 20x-40x) om het interessegebied te selecteren volgens de wetenschappelijke vraag. Het exacte vergrotingsbereik kan variëren afhankelijk van het gebruikte instrument. In dit onderzoek werden gebieden met een hogere dichtheid van interfaces tussen nieuw gevormd bot en het biomateriaal geselecteerd voor verdere analyse.
  3. Voorbeeldmontage voor dunner maken
    1. Bevestig het monster op een steun om een correcte behandeling tijdens het polijsten te vergemakkelijken. Als het monster uitsluitend bedoeld is voor optische microscopie-analyse, bevestig het dan direct aan een plastic deklaag met secondelijm aan de eerder gepolijste zijde.
      OPMERKING: Plastic glijbanen worden aanbevolen vanwege hun verbeterde hechting. Glazen glijbanen kunnen ook worden gebruikt (na uitgebreid wassen met neutrale zeep). Glasglaasjes verhogen echter het risico op monsterloslating tijdens het polijsten.
    2. Voor monsters die verder geanalyseerd zullen worden met een correlatieve benadering, wordt op een tweedelige aluminium buisassemblage gemonteerd. In dit protocol werd een zelfgemaakte aluminium buisconstructie ontwikkeld, bestaande uit een binnenste solide cilinder met een diameter van 2,5 cm en een buitenste holle cilinder die mechanische ondersteuning biedt tijdens het polijsten. Het monster wordt bevestigd aan de binnenste vaste cilinder.
    3. Plaats de binnenste aluminium cilinder op een hete plaat en verwarm deze tot een temperatuur die geschikt is om de was te smelten (meestal rond de 60-70 °C, afhankelijk van het type was dat wordt gebruikt).
      OPMERKING: Bijenwas is ook geschikt. Werk bij het hanteren van montagewas in een afzuigkap en draag geschikte PBM. Na gebruik verzamel je de restanten in duidelijk gelabelde, chemisch compatibele afvalcontainers met correct geplaatste doppen. Volg de institutionele SOP's voor de veilige opslag en verwijdering van gevaarlijk chemisch afval.
    4. Breng een kleine hoeveelheid was aan op het oppervlak van de cilinder en laat deze volledig smelten.
    5. Na het gesmolten plaats je het monster met het interessante oppervlak op het met was bedekte oppervlak en pers je het voorzichtig om volledig contact te garanderen.
      OPMERKING: Het betreffende oppervlak moet naar het cilinderoppervlak wijzen zodat dunner wordt gemaakt aan de tegenovergestelde kant. Vermijd het gebruik van overmatige was, omdat dit kan leiden tot ongelijkmatige montage en de polijstkwaliteit kan beïnvloeden.
    6. Haal de cilinder van de hete plaat en laat de was bij kamertemperatuur uitharden.
  4. Monitoring van de dikte van het monster tijdens het polijsten
    1. Om de dikte van het monster tijdens het polijstproces te monitoren, gebruik je reflectiemicroscopie met lage tot gemiddelde vergroting (bijvoorbeeld 10x-20x). Een diagram dat de kalibratie van de microscoop en de meting van de monsterdikte illustreert, is weergegeven in Figuur 2.
    2. Kalibreer de Z-as van de microscoop met een standaard coverslip, die doorgaans ongeveer 150 μm dik is. Markeer één kant van het dekmantel met een rode permanente stift en een aangrenzend gebied aan de overkant met een blauwe stift. Bevestig de dekmantel op een glazen glijbaan.
    3. Met de fijne scherpstelknop en de micrometerschaal richt je eerst op het onderoppervlak van de coverslip en daarna op het bovenoppervlak.
    4. Noteer de Z-verplaatsingswaarde. Deze waarde komt overeen met de dikte van de coverslip (ongeveer 150 μm) en dient als referentie.
    5. Gebruik tijdens het polijsten van het monster periodiek deze Z-as-kalibratie om de dikte van het monster te schatten zonder het uit de aluminium cilinder te verwijderen.
      OPMERKING: Deze techniek maakt snelle en niet-destructieve dikteschatting mogelijk tijdens het polijsten. Als alternatief kan het monster uit de houder worden gehaald en gemeten worden met een digitale remklauw of micrometer.
  5. Uitdunnen en polijsten
    1. Begin met het grove en middellange polijsten met schuurpapier met korrelgroottes van 1200, 2500 en 4100. Het doel van deze stap is om de dikte van het monster te verkleinen tot ongeveer 0,15 mm terwijl significante oppervlakte-onregelmatigheden worden verwijderd.
    2. Begin met schuurpapier van korrel 1200, ga dan door naar korrel 2500. Oefen lichte druk uit tijdens dit proces. Monitor periodiek de dikte van het monster met reflectiemicroscopie tijdens het polijsten.
    3. Zodra de gewenste dikte is bereikt, polijst u beide zijden van het monster met schuurpapier van korrel 4100. Polijsten kan handmatig worden uitgevoerd of met een semi-automatische polijstmachine die op lage rotatiesnelheid is ingesteld. Maak het monster grondig schoon met gedestilleerd water bij elke polijststap.
      OPMERKING: Het nat houden van de monsters en schuurpapier tijdens het polijsten helpt de hitte te verminderen en voorkomt oppervlaktevervuiling door het ruwere schuurpapier.
    4. Voor het laatste polijsten breng je een kleine hoeveelheid diamantpasta aan (bijvoorbeeld 6 μm of 3 μm) op een vilten poetsdoek dat op een polijstschijf is gemonteerd. Selecteer de diamantpasta-deeltjesgrootte op basis van de oppervlakteruwheid van het monster.
      OPMERKING: Een pasta van 6 μm is geschikt voor voorlopige fijnpolijsten, terwijl een pasta van 3 μm wordt aanbevolen voor het laatste spiegelpolijsten. Waar mogelijk levert het gebruik van beide pasta's opeenvolgend de beste resultaten op. Desalniettemin kan bevredigend polijsten worden bereikt met alleen de 6 μm pasta.
    5. Polijst voorzichtig beide zijden van het monster met minimale druk. Gebruik perslucht of katoen om het gepolijste oppervlak van het monster te drogen voordat je microscopisch onderzoek doet.
    6. Om het monster van de cilinder los te maken, verwarm je de was met een warme plaat en verwijder je eventueel achtergebleven was van het monster met anhydre aceton.
      OPMERKING: Bij het hanteren van montagewas en watervrij aceton, werk dan in een dampkap en draag de juiste PBM. Na gebruik verzamel je de restanten in duidelijk gelabelde, chemisch compatibele afvalcontainers met correct geplaatste doppen. Volg de institutionele SOP's voor de veilige opslag en verwijdering van gevaarlijk chemisch afval.
    7. Plaats het monster tussen een glazen glaasglaasje en een deklaag met dompelolie als montagemedium en evalueer de oriëntatie van de collageenvezel met behulp van gepolariseerde lichtmicroscopie. Begin met een lage vergroting (bijv. 5x-10x) om het monster te onderzoeken en verhoog naar een intermediaire vergroting (bijv. 20x-40x) om potentiële gebieden voor verder onderzoek met elektronenmicroscopie te identificeren.
      OPMERKING: Om door te gaan met de correlatieve workflow en de daaropvolgende analyse van het monster met scanning-elektronenmicroscopie, is het raadzaam het monster niet te verzegelen.

4. Monstervoorbereiding voor scanning-elektronenmicroscopie

  1. Haal het monster voorzichtig van de glazen glaas. Schuif de deksel voorzichtig van de glazen slede met een pipetpunt. Gebruik filterpapier om de overtollige dompelolie te verwijderen. Was het monster met neutrale zeep. Doe de wasbeurt in een klein bakje om per ongeluk monsterverlies te voorkomen.
    OPMERKING: Als er nog restolie op het monster aanwezig is, maak dan het oppervlak voorzichtig schoon met een wattenstaafje dat licht is bevochtigd met 70% ethanol.
  2. Laat het monster aan de lucht drogen op filterpapier. Perslucht of katoen kan ook worden gebruikt om het monster te drogen. Als het volledig droog is, bevestig je het monster op een stompje met carbontape. Sputter-coat het monster met een laag goud van 10 nm om opladen tijdens beeldvorming te voorkomen.
  3. Gebruik de dubbele bundel FIB-SEM-microscoop om het monster op verschillende manieren te onderzoeken.
    1. In de SEM (scanning elektronenmicroscopie) modus, met behulp van secundaire elektronen of terugverstrooide elektronen, evalueren we de monstermorfologie, het biomateriaal en de nieuw gevormde botinterface in gebieden die eerder door optische microscopie zijn geselecteerd.
    2. In de focus ion-straal scanning elektronenmicroscopie (FIB-SEM) modus voer je slice-and-view tomografie uit.
  4. In SEM-modus met de secundaire elektronendetector selecteert u gebieden die eerder zijn geanalyseerd met gepolariseerde lichtmicroscopie en SEM om verder te gaan met slice-and-view tomografie-acquisitie.
  5. Pas de parameters voor greppelvolume, pixelgrootte en snitdikte aan op basis van de relevante kenmerken. In onze opstelling werd slice-and-view-tomografie uitgevoerd met een greppelvolume van 15 μm x 10 μm x 10 μm, een pixelgrootte van 20 nm en een slicedikte van 60 nm. Het wordt aanbevolen om waar mogelijk een isometrische voxelmaat te gebruiken voor een verbeterde beeldkwaliteit over alle drie de dimensies (XYZ).
    OPMERKING: Deze parameters kunnen variëren afhankelijk van het specifieke FIB-SEM-systeem. Raadpleeg de apparatuuroperator om de optimale omstandigheden te bepalen op basis van uw analytische behoeften en de capaciteiten van het systeem.

5. Uitlijning, filterverwerking en segmentatie van FIB-SEM slice-and-view tomografie

  1. Slice-and-view-tomografie genereert een reeks beelden die achtereenvolgens worden genummerd. Om verder te gaan met uitlijning, converteer je de serie naar een MRC-bestand, algemeen bekend als een stack.
  2. Voer MRC-bestandsgeneratie en image stack-uitlijning uit met behulp van IMOD-software.
    OPMERKING: Andere software, zoals Avizo en FIJI/ImageJ, biedt ook stack-alignment-plugins aan. Voor gedetailleerde richtlijnen raadpleeg elke softwarespecifieke documentatie. Daarnaast het werk van Peddie et al.23. Biedt een overzicht van de methoden die tijdens het uitlijnen van de stapels zijn toegepast.
  3. Om het MRC-bestand te genereren, open je de terminal of de opdrachtprompt, navigeer je naar de map met de afbeeldingssequentie en voer je het volgende commando uit: tif2mrc imagerootfile*.tif stackname.mrc
    1. Voor afbeeldingen die niet in TIFF-formaat zijn, gebruik in plaats daarvan raw2mrc. Voeg -g toe (bijv. tif2mrc -g) om 24-bit RGB-afbeeldingen om te zetten naar 8-bit grijstinten. Dit zal de rekentijd aanzienlijk verkorten.
  4. Start Etomo vanaf de terminal en selecteer de optie Align Serial Sections. Volg de volgorde om de stack uit te lijnen: (1) Laad de niet-uitgelijnde stack in één frame. (2) Algin-tabblad met Initial Auto Alignment. (3) Maak een stapeltab aan met 'Maak uitgelijnde stapel' en open vervolgens de uitgelijnde stapel.
    OPMERKING: Dit proces kan enkele minuten duren, afhankelijk van de stackgrootte en de prestaties van het systeem.
  5. Als het klaar is, bekijk dan het resultaat. Het uitgelijnde stackbestand wordt stackname_ali.mrc genoemd.
    OPMERKING: Deze procedure gebruikt de standaardinstellingen van het systeem voor stack-uitlijning. Parameters met betrekking tot de initiële uitlijning en uiteindelijke stapelgeneratie kunnen echter worden aangepast volgens de voorkeuren van de gebruiker. Voor gedetailleerde richtlijnen, raadpleeg de IDMOD-documentatie: https://bio3d.colorado.edu/imod/doc/serialalign.html.https://bio3d.colorado.edu/imod/doc/serialalign.html.
  6. Voer extra beeldfiltering uit met de Avizo-software. Open de uitgelijnde stack en pas sequentieel de volgende filters toe: Fast Fourier transform (FFT) filter, beschikbaar in de Sandbox Filter-plugin (selecteer de optie verticale streeporiëntatie, tolerantiewaarde: 2), Shading correctiewizard (pas maskerselectie aan om het hele schaduwgebied van de afbeelding te dekken, gebruik normalisatiefactor 100), Histogramequalisatie (standaardconfiguratie), en Non-local means (waarden aanpassen naar 5; 0,1; 10; 3).
    OPMERKING: Equivalente filters zijn beschikbaar in andere beeldanalysesoftware. In FIJI/ImageJ raden we de volgende volgorde aan: FFT-filter, Achtergrond Subtracteren, Lokaal Contrast versterken (CLAHE) en Non-Local Means-filter.
  7. Ga verder met beeldsegmentatie en 3D-rendering met de software. Er zijn verschillende segmentatiestrategieën beschikbaar, waaronder handmatige segmentatie en drempelgebaseerde segmentatie. Extra tools, zoals het Watershed-algoritme, kunnen helpen het proces te automatiseren en de tijd die nodig is voor segmentatie te verkorten.

6. Monstervoorbereiding voor transmissie-elektronenmicroscopie

  1. Bereid lamellen voor met behulp van gefocuste ionenbundel scanning elektronenmicroscopie (FIB-SEM) om de bot/biomateriaalinterface te beoordelen.
    OPMERKING: Als het geïmplanteerde biomateriaal niet keramisch of metaalachtig is, zoals in deze studie, kunnen ultradunne snitten geschikt voor transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) worden gemaakt met een ultramicrotoom. Het is echter belangrijk op te merken dat het snijden van gemineraliseerde materialen de levensduur van het diamantmes aanzienlijk kan verkorten.
  2. Kleur de ultradunne secties na de kleur gedurende 20 minuten in een waterige oplossing van 5% uranylacetaat.
    OPMERKING: Bij het hanteren van uranylacetaat, werk in een dampkap en draag de juiste PBM. Na gebruik verzamel je eventueel residueel oplosmiddel in duidelijk gelabelde, chemisch compatibele afvalcontainers met correct passende doppen. Volg de institutionele SOP's voor de veilige opslag en verwijdering van gevaarlijk chemisch afval.
  3. Analyseer de secties met behulp van TEM. Voor een uitgebreide analyse combineer beeldvorming met geselecteerde elektronendiffractie (SAED), energiedispersieve röntgenspectroscopie (EDS) en elektrontomografie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De initiële analyse van hars-ingebedde monsters wordt uitgevoerd met behulp van microcomputertomografie (microCT). Deze niet-destructieve techniek faciliteert 3D-visualisatie van het gehele defectgebied, waardoor zowel kwantitatieve als kwalitatieve analyses van het monster mogelijk zijn. Contrast in microCT-beeldvorming is vooral te danken aan de dichtheidsverschillen van de materialen in het monster. Figuur 1 illustreert de microCT-analyse van een niet-kri...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Verschillende beeldvormingstechnieken zijn gebruikt om de botarchitectuur te onderzoeken en de effectiviteit van biomaterialen bij het induceren van osteointegratiete beoordelen 7,21,22,23,24. In dit protocol hebben we een workflow opgezet die röntgenmicrotomografie, optische microscopie en elektronenmicroscopie omvat om het g...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs geven aan dat zij geen bekende concurrerende financiële belangen of persoonlijke relaties hebben die het werk in dit artikel zouden kunnen beïnvloeden.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door subsidies aan de auteurs van de volgende Braziliaanse instanties: Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq/Brazilië) en Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ). Wij danken LABNANO/CBPF en CENABIO/UFRJ voor de elektronenmicroscopiefaciliteiten. Taalverfijning en grammaticaherziening werden uitgevoerd met ChatGPT (OpenAI, GPT-5.1, 2025). Alle bewerkingen zijn beoordeeld en geverifieerd door de auteurs.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Acetone Merck67-64-1
Aluminium cylinderhome-maden/a
Avizo version 2022.1ThermoFishern/asoftware voor beeldfilteren, segmentatie en 3D-visualisatie
Cacodylic Acid, Sodium Salt, trihydrateTed Pella18851poeder voor Cacodylate Buffer. Bereid een stockoplossing van 0,2 M
Diamond Polishing Compound 3 µm sizeTed Pella895-8
Diamond Polishing Compound 6 µm sizeTed Pella895-9
Diamond Wheel x.006South Bay TechnologyDWH 3063
Diamond Wheel x.012South Bay TechnologyDWH 4122
Felt polishing clothTed Pella816-20
Flat Embedding CapsulesEMS70021
Glass cover slipKnitteln/a
Glass slideKnitteln/a
Glutaraldehyde, 25% EM gradeTed Pella18426/18427
Gold sputter K550XEMITECHn/a
ImageJNational Institutes of Health (NIH)software voor beeldafstemming, filteren, segmentatie en 3D-visualisatie
IMOD version 5.1University of Coloradosoftware voor beeldafstemming, segmentatie en 3D-visualisatie
Lapping e Polishing MachineSouth Bay Technologymodel 910
Low-Speed Diamond Wheel Saw South Bay Technologymodel 650
Low Viscosity Embedding KitEMS14300kit voor SPURR-hars. Bereid volgens de specificaties in de datasheet 
Micro-CT Skyscan 1273 Brukern/a
Microscope Jeol 2100F 200kV Jeoln/a
Microscope Olympus BX51Olympusn/a
Microscope Tescan Lyra3Tescann/a
Microscope Zeiss AxioplanZeissn/auitgerust met een lambda-plaat van de eerste orde
Paraformaldehyde, EM GradeSigmaP6148poeder voor formaldehydeoplossing. Bereid een stockoplossing van 16%
Plastic slideExakt41500
QuickStick 135 Mounting WaxSouth Bay Technologyn/a
Sandpapers  grit sizes 1200n/an/a
Sandpapers  grit sizes 2500n/an/a
Sandpapers  grit sizes 4100n/an/a
Super GlueLoctiten/a
Water Soluble Coolant South Bay Technologyn/a
Whatmann grade 1 filter papersigmaWHA1001150

Referenties

  1. Reznikov, N., Shahar, R., Weiner, S. Bone hierarchical structure in three dimensions. Acta Biomater. 10 (9), 3815-3826 (2014).
  2. Buss, D. J., Kröger, R., McKee, M. D., Reznikov, N. Hierarchical organization of bone in three dimensions: A twist of twists. J Str Biol: X. 6, (2022).
  3. Grandfield, K., Gustafsson, S., Palmquist, A. Where bone meets implant: The characterization of nano-osseointegration. Nanoscale. 5 (10), 4302-4308 (2013).
  4. Loi, F., Córdova, L. A., Pajarinen, J., Lin, T., Yao, Z., Goodman, S. B. Inflammation, fracture and bone repair. Bone. 86, 119-130 (2016).
  5. Einhorn, T. A., Gerstenfeld, L. C. Fracture healing: mechanisms and interventions. Nature Rev Rheumatol. 11 (1), 45-54 (2015).
  6. Shah, F. A., Thomsen, P., Palmquist, A. Osseointegration and current interpretations of the bone-implant interface. Acta Biomater. 84, 1-15 (2019).
  7. Palmquist, A. A multiscale analytical approach to evaluate osseointegration. J Mater Sci Mater Med. 29 (5), 60(2018).
  8. Sim, J. H., Yeo, I. S. Light Microscopy Analysis of Bone Response to Implant Surfaces. Microsc Today. 24 (4), 28-33 (2016).
  9. Reznikov, N., et al. Inter-trabecular angle: A parameter of trabecular bone architecture in the human proximal femur that reveals underlying topological motifs. Acta Biomater. 44, 65-72 (2016).
  10. Müller, R. Hierarchical microimaging of bone structure and function. Nat Rev Rheumatol. 5 (7), 373-381 (2009).
  11. Martinez-Zelaya, V. R., Archilha, N. L., Calasans-Maia, M., Farina, M., Rossi, A. M. Trabecular architecture during the healing process of a tibial diaphysis defect. Acta Biomater. 120, 181-193 (2021).
  12. Buss, D. J., Reznikov, N., McKee, M. D. Crossfibrillar mineral tessellation in normal and Hyp mouse bone as revealed by 3D FIB-SEM microscopy. J Str Biol. 212 (2), 107603(2020).
  13. Binkley, D. M., Deering, J., Yuan, H., Gourrier, A., Grandfield, K. Ellipsoidal mesoscale mineralization pattern in human cortical bone revealed in 3D by plasma focused ion beam serial sectioning. J Str Biol. 212 (2), 107615(2020).
  14. Reznikov, N., Almany-Magal, R., Shahar, R., Weiner, S. Three-dimensional imaging of collagen fibril organization in rat circumferential lamellar bone using a dual beam electron microscope reveals ordered and disordered sub-lamellar structures. Bone. 52 (2), 676-683 (2013).
  15. Reznikov, N., Bilton, M., Lari, L., Stevens, M. M., Kröger, R. Fractal-like hierarchical organization of bone begins at the nanoscale. Science. 360 (6388), 2189(2018).
  16. Grandfield, K., Vuong, V., Schwarcz, H. P. Ultrastructure of Bone: Hierarchical Features from Nanometer to Micrometer Scale Revealed in Focused Ion Beam Sections in the TEM. Calcified Tissue Int. 103 (6), 606-616 (2018).
  17. Micheletti, C., et al. mineral organization at the mesoscale: A review of mineral ellipsoids in bone and at bone interfaces. Acta Biomater. 142, 1-13 (2022).
  18. Micheletti, C., Shah, F. A. Bone hierarchical organization through the lens of materials science: Present opportunities and future challenges. Bone Rep. 22, (2024).
  19. Shah, F. A., Ruscsák, K., Palmquist, A. 50 years of scanning electron microscopy of bone-a comprehensive overview of the important discoveries made and insights gained into bone material properties in health, disease, and taphonomy. Bone Res. 7 (1), (2019).
  20. Georgiadis, M., Müller, R., Schneider, P. Techniques to assess bone ultrastructure organization: Orientation and arrangement of mineralized collagen fibrils. J Royal Soc Interface. 13 (119), (2016).
  21. Martinez-Zelaya, V. R., Archilha, N. L., Calasans-Maia, M., Farina, M., Rossi, A. M. Trabecular architecture during the healing process of a tibial diaphysis defect. Acta Biomater. 120, 181-193 (2021).
  22. Keklikoglou, K., et al. Micro-computed tomography for natural history specimens: a handbook of best practice protocols. Eur J Taxonomy. (522), (2019).
  23. Peddie, C. J., et al. Volume electron microscopy. Nat Rev Meth Primers. 2 (1), 51(2022).
  24. Costa De-Moraes, S. L., et al. Histomorphometric and microtomographic evaluation of hydroxyapatite coated implants and L-PRF in over drilled bone sites in sheep. Sci Rep. 15 (1), 14761(2025).
  25. Liu, Y., Xie, D., Zhou, R., Zhang, Y. 3D X-ray micro-computed tomography imaging for the microarchitecture evaluation of porous metallic implants and scaffolds. Micron. 142, (2021).
  26. Wee, H., Khajuria, D. K., Kamal, F., Lewis, G. S., Elbarbary, R. A. Assessment of Bone Fracture Healing Using Micro-Computed Tomography. J Vis Exp. (190), e64262(2022).
  27. Ramezanzadehkoldeh, M., Skallerud, B. H. MicroCT-based finite element models as a tool for virtual testing of cortical bone. Med Eng Physics. 46, 12-20 (2017).
  28. Shefelbine, S. J., et al. Prediction of fracture callus mechanical properties using micro-CT images and voxel-based finite element analysis. Bone. 36 (3), 480-488 (2005).
  29. O'Neill, K. R., et al. Micro-computed tomography assessment of the progression of fracture healing in mice. Bone. 50 (6), 1357-1367 (2012).
  30. Morgan, E. F., et al. Micro-computed tomography assessment of fracture healing: Relationships among callus structure, composition, and mechanical. Bone. 44 (2), 335-344 (2009).
  31. Reznikov, N., et al. Inter-trabecular angle: A parameter of trabecular bone architecture in the human proximal femur that reveals underlying topological motifs. Acta Biomater. 44, 65-72 (2016).
  32. Zaborowska, M., Shah, F. A., Trobos, M., Palmquist, A. Retrieval, sample processing, and analyses of bone-anchored implants. Bone Repair Biomater Regenerat Clin Appl Second Edition. , 447-466 (2018).
  33. Thorfve, A., Palmquist, A., Grandfield, K. Three-dimensional analytical techniques for evaluation of osseointegrated titanium implants. Mater Sci Technol. 31 (2), 174-179 (2015).
  34. Mastrogiacomo, M., Campi, G., Cancedda, R., Cedola, A. Synchrotron radiation techniques boost the research in bone tissue engineering. Acta Biomater. 89, 33-46 (2019).
  35. Raguin, E., Rechav, K., Shahar, R., Weiner, S. Focused ion beam-SEM 3D analysis of mineralized osteonal bone: lamellae and cement sheath structures. Acta Biomater. 121, 497-513 (2021).
  36. McMahon, G., Malis, T. Ultramicrotomy of nanocrystalline materials. Microscopy Res Tech. 31 (4), 267-274 (1995).
  37. Bassim, N. D., et al. Minimizing damage during FIB sample preparation of soft materials. J Microsc. 245 (3), 288-301 (2012).
  38. Witzke, K., et al. Comparative Sample Preparation Using Focused Ion Beam and Ultramicrotomy of Human Dental Enamel and Dentine for Multimicroscopic Imaging at Micro- and Nanoscale. Materials. 15 (9), 3084(2022).
  39. Carter, J. L. W., Karakulak Uz, T., Ibrahim, B., Pigott, J. S., Gordon, J. V. A comparison of energy dispersive spectroscopy in transmission scanning electron microscopy with scanning transmission electron microscopy. Ultramicroscopy. 270, 114106(2025).
  40. Grandfield, K., McNally, E. A., Palmquist, A., Botton, G. A., Thomsen, P., Engqvist, H. Visualizing biointerfaces in three dimensions: electron tomography of the bone-hydroxyapatite interface. J Royal Soc Interface. 7 (51), 1497-1501 (2010).
  41. Grandfield, K., Palmquist, A., Engqvist, H. Three-dimensional structure of laser-modified Ti6Al4V and bone interface revealed with STEM tomography. Ultramicroscopy. 127, 48-52 (2013).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Multimodale beeldvormingbotherstelbiomateriaalevaluatiebot biomateriaalinterfacegepolariseerde lichtmicroscopiescanning elektronenmicroscopietransmissie elektronenmicroscopieenergiedispersieve r ntgenspectroscopie
Multimodale benadering om botregeneratie en steigerprestaties te beoordelen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.