Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Neonatale muiseierstokkweek en kwantificatie van hele mountfollikels: een efficiënte in vitro benadering voor het bestuderen van primordiale follikelregulatie

691 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/69498

⸱

19 december 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Obstetrics, Gynecology, and Women's Health, University of Missouri School of Medicine, 2Division of Biological Sciences, University of Missouri

In dit artikel

Samenvatting

Deze studie presenteert protocollen voor het kweken van postnatale muiseierstokken op membraaninserts en voor de kwantificatie van de hele mount follikel in een hele eierstok. De resultaten toonden aan dat technische behandeling tijdens eierstokkweek een significante invloed heeft op het aantal primordiale follikels, wat het belang benadrukt van consistentie om niet-biologische variatie te minimaliseren.

Samenvatting

Bij vrouwelijke zoogdieren vormen primordiale follikels zich tijdens de ontwikkeling van de foetale eierstok en dienen zij als enige bron voor het in stand houden van de volwassen eierstokfunctie. Mechanismen die ten grondslag liggen aan hoe primordiale follikels zich samenstellen, dormantie behouden, activeren voor follikelontwikkeling en celdood ondergaan, zijn belangrijk voor het begrijpen van de fysiologie en pathologische aandoeningen van de eierstokken. Deze studie presenteert een protocol voor het kweken van postnatale muiseierstokken op membraaninserts, een methode die het mogelijk maakt om intacte eierstokken tot 10 dagen te kweken en farmaceutisch te behandelen, afhankelijk van de ontwikkelingsfase van de eierstok. Veranderingen in de kweekomstandigheden kunnen worden bereikt door inserts met gekweekte eierstokken tussen putten op een plaat te plaatsen, waardoor fysieke interferentie met de weefsels tijdens de kweek wordt vermeden. P5-eierstokken werden geïsoleerd en gekweekt op een 12 mm insert in een 24-well plaat als voorbeeld. Elke eierstok werd gescheiden binnen een druppel DMEM/F12-medium, aangevuld met 10% FBS, 3 mg/mL BSA, 10 mIU/mL FSH en antibioticum-antimycoticum, en voorzichtig gestabiliseerd op het membraaninzet. Het medium werd elke twee dagen veranderd en de cultuur werd in totaal vijf dagen in stand gehouden. Na de kweek werden de eierstokken 2 uur gefixeerd in 4% paraformaldehyde en verwerkt voor whole-mount antistofkleuring van de oocytenmarker DDX4. Follikels werden in fasen geplaatst en gekwantificeerd op basis van de grootte van de eicellen en de nucleaire morfologie van somatische follikelcellen. De resultaten toonden aan dat het aantal primordiale follikels in elke eierstok significant werd beïnvloed door de juiste plaatsing van weefsels op het membraaninsert. Daarnaast kunnen verschillen in het aantal eierstokken op elke insert niet-biologische variaties introduceren en moeten worden vermeden.

Inleiding

Oogenese is een sterk gereguleerd en complex proces dat resulteert in de productie van volwassen oocyten. Bij zoogdieren begint de oogenese in foetale eierstokken, waar primordiale kiemcellen (PGC's) differentiëren tot primaire eicellen. Elke primaire oocyt wordt omsloten door een laag plaveiselachtige pregranulosa-cellen, die een oerfollikel vormen. De meeste van deze primordiale follikels worden na vorming inactief en dienen als de eierstokreserve 1,2,3. In de volwassen eierstok is periodieke activatie van primordiale follikels voor folliculaire ontwikkeling, bekend als folliculogenese, essentieel voor het in stand houden van de productie van volwassen eicellen en ovariumsteroïden hormonen 4,5. Bij afwezigheid van activatiesignalen kunnen menselijke primordiale follikels tot wel 50 jaar stil blijven. De verlengde dormantie kan bijdragen aan een verminderde oocytkwaliteit, evenals een verhoogde snelheid van primordiale follikelverlies in verouderende eierstokken6. De mechanismen die ten grondslag liggen aan hoe een specifieke groep follikels wordt geactiveerd terwijl andere stil blijven en periodiek celdood ondergaan, blijven open vragen.

Het proces van oogenese is sterk geconserveerd bij zoogdieren, waardoor muizen een ideaal model zijn voor het bestuderen van zoogdier-oogenese7. Bij muizen is de oerfollikelvorming voltooid op postnatale dag 4 (P4). Een klein deel van de primordiale follikels ondergaat direct na hun vorming folliculaire ontwikkeling. Tijdens de ontwikkeling van de follikel neemt de oocyt toe in omvang door verbeterde organogenese en mRNA- en eiwitsynthese4. Plaveiselgranulosacellen gaan over in kuboïdale granulosacellen en worden proliferatief8. Deze zich ontwikkelende follikels groeien rond dag 21 tot het ovulatiestadium, wanneer vrouwelijke muizen in de puberteit komen. Deze fase van follikelontwikkeling in postnatale eierstokken wordt gewoonlijk aangeduid als 'eerste-golf folliculogenese'. Aangezien de eerste-golf folliculogenese nauw overeenkomt met het proces van follikelontwikkeling, bieden postnatale muis-eierstokken een ideaal model voor het bestuderen van primordiale follikelregulatie en ovariumfolliculogenese9.

De classificatie van ovariumfollikels is voornamelijk gebaseerd op de nucleaire morfologie van follikelsomatische cellen en de grootte van de eicel. Bij muiseierstokken wordt de slapende primordiale follikel geïdentificeerd door een enkele laag plaveiselachtige pregranulosa-cellen die een primaire oocyt omsluiten, met een diameter van ongeveer 20 μm. Ontwikkelende follikels kunnen worden ingedeeld in primaire, secundaire, tertiaire en antrale follikels. De primaire follikel bevat een oocyt die doorgaans meer dan 25 μm in diameter is en omgeven is door een enkele laag kuboïdale granulosacellen (Aanvullende figuur 1). De secundaire follikel bevat twee lagen granulosacellen, terwijl de tertiaire follikel uit drie of meer lagen granulosacellen bestaat. De antrale follikel is groter dan de tertiaire follikel, bevat meerdere lagen granulosa-cellen en heeft een met vloeistof gevulde holte die bekend staat als de antrum. Naarmate de follikels zich ontwikkelen, neemt de oocyt toe in grootte en bereikt ongeveer 80 μm tegen de ovulatie. Daarnaast worden de zich ontwikkelende follikels omringd door verschillende lagen dunne thecacellen, die zich buiten de granulosacellen 10,11,12 bevinden.

De relatief kleine omvang van postnatale muiseierstokken maakt de hele eierstokkweek een praktische onderzoeksaanpak. Deze methode maakt het effectief mogelijk om de ontwikkeling van eierstokken en follikels binnen een intacte eierstok te bestuderen, omdat het de fysieke en fysiologische micro-omgevingen behoudt en interferentie door omliggendeweefsels minimaliseert. Deze aanpak maakt experimenten mogelijk die moeilijk in vivo modellen uit te voeren zijn. Voorbeelden zijn live beeldvorming van de ontwikkeling van de eierstokken, tijdgestuurde multi-geneesmiddelbehandelingen en de analyse van de secretorische activiteit van de eierstokken via eiwitprofilering van het kweekmedium13,14. Bovendien kan deze benadering worden toegepast om het effect van secretoire factoren te onderzoeken zonder directe cel-cel interactie via co-cultivatie-experimenten. In deze experimenten kunnen verschillende soorten weefsels op aparte membraaninserts binnen een gedeeld mediumworden geplaatst. Daarnaast kan het gebruik van voorwaardelijke gen-knockout muiseierstokken in vitro helpen om belangrijke mechanismen te verduidelijken die betrokken zijn bij primordiale follikelactivatie en -groei.

In dit artikel introduceren we methoden voor het kweken van postnatale muiseierstokken met behulp van membraaninserts en voor kwantificatie van de hele mount follikel in een gehele eierstok (Figuur 1). De hier beschreven technieken zijn onder andere 1) dissectie van neonatale muiseierstokken, 2) kweek van neonatale muiseierstokken, 3) mediaverandering tijdens kweek, 4) weefselfixatie en whole-mount antilichaamkleuring, en 5) weefselbeeldvorming en follikelkwantificatie. Daarnaast gebruikte deze studie doxorubicine om experimenteel primordiale follikelverlies te induceren, waarmee een model werd geboden om de mechanismen achter de uitputting van de eierstokreserves te onderzoeken. De resultaten toonden aan dat het aantal eierstokken per inzetstuk en hun positie binnen de inzetstuk tijdens de kweek invloed hadden op het aantal primordiale follikels. Dit benadrukt het belang van het behouden van een consistente kweekopzet om niet-biologische variaties in de experimentele uitkomsten te voorkomen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

CD-1 mannelijke en vrouwelijke muizen werden samen gehuisvest in een verhouding van 1:1 als broedparen. De geboortedatum van nieuwe jongen werd aangeduid als postnatale dag 0. Alle dierproeven zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care & Use Committee (IACUC) van de University of Missouri (protocolnummer: 36647).

1. Reagentia en cultuurmedia

  1. Alle reagentia die in deze studie zijn gebruikt, staan vermeld in de Materiaaltabel. Bereid alle materialen en media voor vóór de eierstokkweek.
  2. Kweekmedia: Maak ~5 mL DMEM/F-12 media, aangevuld met 3 mg/mL boviene serumalbumine (BSA), 10% fotaal runderenserum (FBS) en 10 mIU/mL folliculair-stimulerend hormoon (FSH).
    OPMERKING: De media moeten vers worden voorbereid door de BSA (30 mg/mL), FBS en FSH (10 IU/mL) toe te voegen aan DMEM/F-12 media. Breng het medium in een petrischaal ongeveer 30 minuten in balans in een 5% CO2-incubator bij 37 °C. Bewaar de bouillon bij -20 °C en ontdooi ze direct voor gebruik. Aliquot voorraad in de juiste volumes om herhaaldelijk bevriezen en ontdooien van de voorraden te voorkomen.

2. Eierstokkweek

  1. Euthanaser P5-vrouwelijke muizen door onthoofding. Verwijder de eierstokken en het aanhechtende bursaweefsel met chirurgische schaar en pincet. Plaats de eierstokken in een 60 mm petrischaaltje met voorgekoelde Dulbecco's fosfaatgebakken zoutoplossing (DPBS) met antibioticum-antimycoticum (Figuur 2A,B).
  2. Met een paar insulinespuiten (1 ml) ontleed en verwijder je het bursaweefsel uit de eierstok onder een stereoscoop (Figuur 2C,D). Breng de eierstokken over met een 1 ml pipet naar een 30 mm petrischaal met 3 ml kweekmedium en plaats de schaal in eenCO2-incubator.
    OPMERKING: Vermijd het prikken of knijpen in de eierstokken. Maak schone en gelijkmatige incisies door de eierstokbursa met de insulinespuiten om de eierstok los te maken. Vul de pipettip vooraf met ongeveer 50 μL media, plaats de pipettip naast de eierstok en aspireer deze in de tip voor overdracht.
  3. Onder de laminaire stromingskap bereid je de plaat voor door 400 μL medium en een insert in elke put te plaatsen (Figuur 2E,E'). Het medium bevindt zich buiten de inzet, en het membraan van het inzetstuk wordt ondoorzichtig zodra het door het medium is doorweekt.
  4. Voor de kweek met 24 uur Dox-behandeling bereid je media met Dox bij een concentratie van 0,1 mg/mL vers door Dox-voorraad (10 mg/mL) te verdunnen met het medium.
    OPMERKING: Media die Dox bevatten, moeten op de juiste manier worden afgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de institutionele commissies voor bioveiligheid en milieu, gezondheid en veiligheid.
  5. Onder een stereoscoop wordt tot drie eierstokken naar een insert gebracht met een pipet van 1 mL (Figuur 2F,G). Minimaliseer de hoeveelheid media die in de insert wordt overgebracht en verwijder direct overtollige media na de overdracht. Zodra de eierstokken voorzichtig in de insert zijn geplaatst, gebruik je een 200 μL pipet om ongeveer 200 μL media van de put naar de insert over te brengen, zorg dat het membraan volledig door het medium wordt bedekt. Breng het medium terug naar de put en centreer de eierstokken op het membraan. Vul de pipettip met kweekmedia om te voorkomen dat de eierstok in de punt wordt gezogen bij het centreren. Zorg ervoor dat er voldoende ruimte tussen de eierstokken wordt gelaten en dat ze gestabiliseerd zijn op het membraaninzetstuk (Figuur 2H), in plaats van in het medium te blijven hangen (Figuur 2I). Let erop dat je de eierstokken en het membraan niet prikt.
  6. In een 5-daagse cultuur wissel je elke twee dagen het medium door 200 μL medium (de helft van de totale hoeveelheid) uit de put te verwijderen en 200 μL verse cultuurmedia terug te voegen aan de put (Figuur 2J).
  7. Voor de kweek met 24 uur medicamenteuze behandeling wordt de insert met eierstokken na de eerste 24 uur overgebracht naar een nieuwe put met 400 μL verse kweekmedia, met de volgende stappen:
    1. Verwijder het inzetstuk met de eierstokken uit de put met een tang.
    2. Spoel de onderkant van het inzetstuk kort af door het in een schaal van 60 mm te dompelen met vers kweekmedium.
    3. Tik voorzichtig op de onderkant van de inzetplaat op een lege 60 mm schaal om overtollig materiaal van de inzetplaat te verwijderen. Plaats de insert in de put met verse cultuurmedia.
      OPMERKING: Verwijder overtollig materiaal uit de inzetstuk om ervoor te zorgen dat de eierstokken direct na het wisselen van het medium of het overbrengen van het inzetstuk op het membraan gestabiliseerd zijn.

3. Fixatie en volledige mount-immunokleuring

  1. Om de gekweekte eierstokken te fixeren, verwijder je de inzetplaat met een tang en plaats je deze in een 60 mm petrischaaltje met 5 ml DPBS. Breng ongeveer 100 μL DPBS over naast de eierstokken en sussen ze opnieuw met een pipet van 1 mL.
  2. Met een pipet van 1 mL breng je de eierstokken van de insert over in een 1,5 mL Eppendorf-buis. Verwijder DPBS uit de buis en voeg 500 μL 4% paraformaldehyde toe. Zet de eierstokken vast op 4°C gedurende 2 uur.
    OPMERKING: Het uiteinde van de pipettip moet mogelijk breder worden geknipt om beschadiging van het weefsel te voorkomen als de eierstokken te groot zijn om erdoorheen te kunnen.
  3. Was de vaste eierstokken minstens drie keer in 1 ml PBST2 (PBS, 0,1% Tween [v/v], 0,5% Triton [v/v])), elk 1 uur op een roterende shaker. Het wordt aanbevolen om de weefsels een nacht (12-16 uur) in PBST2 te laten staan op 4 °C om de penetratie van antistoffen te verbeteren.
    OPMERKING: Dit kan een stoppunt zijn; de weefsels kunnen tot drie dagen voor de primaire antistofincubatie in PBST2 worden opgeslagen.
  4. Incubeer de eierstokken met anti-dead-box helicase 4 (DDX4) in 100 μL antilichaamverdunningsbuffer (1% BSA [w/v], 10% Donkey serum [v/v], 0,1 M glycine, 0,1% Tween en 0,5% Triton in PBS) bij een verdunning van 1/400 (2,3 μg/mL) bij 4 °C gedurende 12-16 uur.
  5. Verwijder de volgende dag het primaire antilichaam en voeg 1 ml PBST2 toe aan de buis. Was de zakdoekjes minstens drie keer, elk 1 uur op een roterende shaker.
    OPMERKING: Dit kan een stoppunt zijn; de weefsels kunnen tot drie dagen na de primaire antistofincubatie in PBST2 blijven.
  6. Verdun het secundaire antilichaam anti-konijn AF488 bij 1/500 verdunning (1,5 μg/mL) in PBST2. Incubeer het weefsel met minstens 100 μL van het verdunde secundaire antilichaam bij 4 °C gedurende 12-16 uur.
  7. De volgende dag was je de weefsels uitgebreid in PBST2 minstens drie keer, elk 1 uur op een roterende shaker. Het wordt aanbevolen om de zakdoekjes tot 8 uur te wassen om de achtergrond te verminderen. Zorg ervoor dat je de buizen met folie bedekt om ze te beschermen tegen licht bij deze stap naar voren.
  8. Verwijder PBST2 en voeg 100 μL DAPI toe bij een verdunning van 1/1000 (1 μg/mL) in PBS aan de buis. Incubeer de weefsels in DAPI gedurende 30 minuten op kamertemperatuur.
  9. Was de eierstokken in PBST2 één keer gedurende 30 minuten en monteer ze op een microscopisch preparaat met een beeldvormingsafstandhouder. Breng de eierstokken over naar het midden van de spacer met een pipet van 1 mL en verwijder overtollig PBST2. Voeg ongeveer 5 μL van het antifade montagemedium toe en plaats een microscoopschuif bovenop de afstandhouder. Sluit de randen van de afstandhouder af met doorzichtige nagellak voor langdurige opslag.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat nagellak volledig droog is en dat er geen montagemedium aan de buitenkant van de deklaag zit voordat je de dia's fotografeert. Deze reagentia kunnen de objectieven van de microscoop beschadigen. Vermijd daarnaast het gebruik van overtollig montagemateriaal, omdat de eierstokken tijdens de beeldvorming stil moeten blijven.
  10. Beeld de eierstokken af met een confocale microscoop met 10x vergroting en een Z-stapgrootte van 10 μm. Pas de instellingen aan en gebruik de Z-compensatie (excitatieversterking) om de hele eierstok te beelden. Dit kan worden gedaan met de volgende stappen:
    1. Pas het excitatievermogen en de detectorversterking aan door de signaalverzadiging te monitoren met behulp van het histogram, omdat dit kan variëren tussen weefsels. Begin met een lage laserkracht en verhoog geleidelijk wanneer nodig.
    2. Voor het beelden van diepere gebieden, schakel Z-compensatie in voor de versterkingsdetector, omdat de signaalintensiteit met de diepte kan afnemen. Gebruik een framegemiddelde van minstens 10 en schakel bidirectionele X-scanning in bij een snelheid van 600 Hz.
      OPMERKING: Met deze instellingen mag de beeldvorming niet meer dan 10 minuten per eierstok (~200 μm) overschrijden. Volledige immunofluorescerende kleuring van eierstokken met anti-DDX4 is doorgaans robuust en fotobleekt zelden.

4. Follikelkwantificatie

  1. Om follikels in elke eierstok te kwantificeren, open je de afbeeldingen met de ImageJ-software. Zorg er bij het openen voor dat de kleurmodus als ingekleurd is geselecteerd en dat gesplitste kanalen is aangevinkt in het vakje onder 'splitsen in aparte vensters'. Selecteer de afbeelding van interesse en gebruik vervolgens het beeld/transformatie-/rotatiegereedschap om de eierstok symmetrisch in de afbeelding te plaatsen.
    OPMERKING: De met confocale beelden kunnen in 3D worden bekeken en geanalyseerd met Imaris-software (Figuur 3A,B) of ImageJ-software16.
  2. Gebruik het analyse-/gereedschap/raster-gereedschap om de eierstok op te delen in rasters (Figuur 3C,C').
  3. Gebruik de plugins/analyze/celteller-tool om alle roosters die de eierstok bedekken te markeren (Figuur 3D, D, rasters gemarkeerd met 4). Van deze rasters markeer je elk ander raster in elke rij voor follikelkwantificatie (Figuur 3E,E', rasters gemarkeerd met 8). Roosters aan de rand van de eierstok met minder dan 10 oocyten worden niet meegenomen voor follikelkwantificatie.
    OPMERKING: Initialiseer de celteller en kies de teller die je makkelijk leesbaar vindt.
  4. Oocyten kunnen worden geïdentificeerd aan de aanwezigheid van een DDX4-positieve ringvormige structuur rondom een kern die positief is voor DAPI. Primordiale follikels hebben oocyten van ongeveer 20 μm in diameter, omgeven door plaveiselachtige somatische cellen. Zich ontwikkelende follikels hebben oocyten die groter zijn dan 25 μm in diameter en omgeven worden door een of meer lagen kuboïdale granulosacellen (Aanvullende Figuur 1).
  5. Tel de primordiale follikels in elk gemarkeerd raster (zoals te zien in Figuur 3E,E' met teller Type 8). Bekijk de follikels met optische secties/stapels in het raster en markeer ze met het cellentellertool. Zorg ervoor dat je primordiale follikels niet dubbel telt op twee opeenvolgende optische secties/stacks. Tel ontwikkelende follikels in alle rasters die zijn gemarkeerd met teller Type 4.
    OPMERKING: Gebruik de zoomoptie om de eicellen door de stapels heen te visualiseren en te tellen.
  6. Bereken het aantal primordiale follikels in de gehele eierstok (nf) door het gemiddelde aantal primordiale follikels per rooster (nfgrid) te vermenigvuldigen met het aantal roosters dat de eierstok omvat (ngrids). nf = nf rooster × ngrids.
    OPMERKING: Statistische analyses werden uitgevoerd en grafieken werden gegenereerd met Prism 10.2.0-software (GraphPad Software, versie 10, Inc., CA). Verschillen tussen groepen werden geëvalueerd met behulp van eenrichtingsvariantieanalyse (ANOVA), gevolgd door Tukey's meervoudige vergelijkingstest. Statistische significantie werd beschouwd bij p < 0,05. De gegevens worden gepresenteerd als het gemiddelde ± standaardfout (SE).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

In dit artikel demonstreren we de methoden van neonatale eierstokkweek, whole-mount antistofkleuring, confocale beeldvorming en follikelkwantificatie om te beoordelen of het aantal en de positie van de eierstokken in het insert tijdens de kweek invloed hebben op het experimentele resultaat, met name het follikelaantal in de eierstok. We hebben eierstokken gekweekt met de volgende opstellingen: één, twee of drie eierstokken per insert voor gestabiliseerde kweek, en drie eierstokken per insert voor drijvende kweek. De eier...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

In deze studie demonstreerden we methoden voor neonatale muiseierstokkweek en voor kwantificatie van de hele mount ovariumfollikel. De kweekbenadering kan primordiale en vroeg ontwikkelende follikels in vitro in stand houden. De whole-mount follikelkwantificatiemethode vereist minimale weefselverwerking, wat tijd bespaart en de weefselintegriteit behoudt, waardoor nauwkeurige follikelkwantificatie wordt gegarandeerd.

Het aantal primordiale follikels dat in de ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Er zijn geen belangenconflicten om te melden.

Dankbetuigingen

Het onderzoek dat in deze publicatie werd gerapporteerd, werd ondersteund door het National Institute of General Medical Sciences van de National Institutes of Health onder het Award Number R35GM158131. EADM werd ondersteund door de Lalor Foundation. De auteurs danken de University of Missouri Advanced Light Microscopy Core voor hun ondersteuning en ondersteuning bij dit werk

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
24-well cell culture platesFisher scientific 09-761-146 
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-RabbitJackson ImmunoResearch Laboratories711-546-152
Anti-Anti (100X)Gibco15240-062
Bovine Serum AlbuminSigma-AldrichA1470-25G
CD-1 IGS MouseCharles River Laboratories 022Muizen
Cell Culture InsertsMilliporePICM01250
Comfort Point Insulin Syringe With Needle 1cc 28G x 1/2Exel26027
DAPIThermo Scientific62248
DDX4 Rabbit mAbabcamab13840
DMEM/F12 (1:1) (1X)Gibco11320-033
Doxorubicine hydrochloride Sigma-AldrichPHR1789
DPBS (1X)Gibco14190-144
Fetal Bovine SerumSigma-AldrichF0926-500ML
Fiji-ImageJNIH, USA (https://imagej.net/ij/)ImageJ 1.52p
Fisherbrand Nutating Mixers - Variable SpeedFisher scientific 88-861-043Shaker
Follicle Stimulating HormoneSigma-AldrichF4021-10UG
Forma Steri-Cycle i160Thermo Scientific™i160CO2 Incubator
GlycineFisher scientific BP381-500
Imaris Oxford Instruments (https://imaris.oxinst.com/)Imaris 10.2
Leica TCS SP8Leica MicrosystemsSN 8100001409Confocal
Normal Donkey SerumJackson ImmunoResearch Laboratories017-000-121
Olympus SZ61Olympus MicroscopesSZ61Stereoscoop
Paraformaldehyde Fisher scientific 15714
SecureSeal imaging spacerGrace Bio-Labs654002
Triton X-100Sigma-AldrichX100-500ML
TWEEN 20Sigma-AldrichP1379-500ML
VECTASHIELD Antifade Mounting MediumVector LaboratoriesH-1000

Referenties

  1. Pepling, M. E. From primordial germ cell to primordial follicle: Mammalian female germ cell development. Genesis. 44 (12), 622-632 (2006).
  2. Ikami, K., Nuzhat, N., Lei, L. Organelle transport during mouse oocyte differentiation in germline cysts. Curr Opin Cell Biol. 44, 14-19 (2017).
  3. Pepling, M. E. Follicular assembly: Mechanisms of action. Reproduction. 143 (2), 139-149 (2012).
  4. Lintern-Moore, S., Moore, G. P. The initiation of follicle and oocyte growth in the mouse ovary. Biol Reprod. 20 (4), 773-778 (1979).
  5. Picton, H. M. Activation of follicle development: The primordial follicle. Theriogenology. 55 (6), 1193-1210 (2001).
  6. Smitz, J. E., Cortvrindt, R. G. The earliest stages of folliculogenesis in vitro. Reproduction. 123 (2), 185-202 (2002).
  7. Jagarlamudi, K., Rajkovic, A. Oogenesis: Transcriptional regulators and mouse models. Mol Cell Endocrinol. 356 (1-2), 31-39 (2012).
  8. Binelli, M., Murphy, B. D. Coordinated regulation of follicle development by germ and somatic cells. Reprod Fertil Dev. 22 (1), 1-12 (2010).
  9. Xu, M., Kreeger, P. K., Shea, L. D., Woodruff, T. K. Tissue-engineered follicles produce live, fertile offspring. Tissue Eng. 12 (10), 2739-2746 (2006).
  10. Bristol-Gould, S. K., et al. Postnatal regulation of germ cells by activin: The establishment of the initial follicle pool. Dev Biol. 298 (1), 132-148 (2006).
  11. Pedersen, T., Peters, H. Proposal for a classification of oocytes and follicles in the mouse ovary. J Reprod Fertil. 17 (3), 555-557 (1968).
  12. Eppig, J. J., O'Brien, M. J. Development in vitro of mouse oocytes from primordial follicles. Biol Reprod. 54 (1), 197-207 (1996).
  13. Levy, E. W., Leite, I., Joyce, B. W., Shvartsman, S. Y., Posfai, E. A tug-of-war between germ cell motility and intercellular bridges controls germline cyst formation in mice. Curr Biol. 34 (24), 5728-5738 (2024).
  14. Nagamatsu, G., Shimamoto, S., Hamazaki, N., Nishimura, Y., Hayashi, K. Mechanical stress accompanied with nuclear rotation is involved in the dormant state of mouse oocytes. Sci Adv. 5 (6), eaav9960(2019).
  15. Stefansdottir, A., Fowler, P. A., Powles-Glover, N., Anderson, R. A., Spears, N. Use of ovary culture techniques in reproductive toxicology. Reprod Toxicol. 49, 117-135 (2014).
  16. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  17. Bristol-Gould, S. K., et al. Fate of the initial follicle pool: Empirical and mathematical evidence supporting its sufficiency for adult fertility. Dev Biol. 298 (1), 149-154 (2006).
  18. Kawamura, K., et al. Hippo signaling disruption and Akt stimulation of ovarian follicles for infertility treatment. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (43), 17474-17479 (2013).
  19. Myers, M., Britt, K. L., Wreford, N. G., Ebling, F. J., Kerr, J. B. Methods for quantifying follicular numbers within the mouse ovary. Reproduction. 127 (5), 569-580 (2004).
  20. Sonigo, C., et al. High-throughput ovarian follicle counting by an innovative deep learning approach. Sci Rep. 8 (1), 13499(2018).
  21. Sarma, U. C., Winship, A. L., Hutt, K. J. Comparison of methods for quantifying primordial follicles in the mouse ovary. J Ovarian Res. 13 (1), 121(2020).
  22. Murphy, K., Carvajal, L., Medico, L., Pepling, M. Expression of Stat3 in germ cells of developing and adult mouse ovaries and testes. Gene Expr Patterns. 5 (4), 475-482 (2005).
  23. Luan, Y., Yu, S. Y., Abazarikia, A., Dong, R., Kim, S. Y. TAp63 determines the fate of oocytes against DNA damage. Sci Adv. 8 (51), eade1846(2022).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Neonatale eierstokkultuurwhole-mount kwantificeringfolliculusstadiëringoocytenmarker DDX4membraaninsertkweekovariële fysiologiefolliculusactivatie
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.