Methodenartikel

Single-plate runs van Mito stress- en glycolyse-stresstests met behulp van hechtende of niet-hechtende cellen

202 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/69504

⸱

22 mei 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, Cancer Biology, Neuroscience and Pharmacology, School of Medicine, Meharry Medical College, 2Department of Biomedical Sciences, School of Graduate Studies, Meharry Medical College, 3Host-Tumor Interactions Research Program, Vanderbilt-Ingram Comprehensive Cancer Center, Vanderbilt University School of Medicine, 4Vanderbilt Institute for Infection, Immunology and Inflammation, Vanderbilt University School of Medicine

In dit artikel

Samenvatting

Deze studie presenteert geoptimaliseerde protocollen voor het gelijktijdig uitvoeren van realtime metabole analyses van Mito Stress- en Glycolyse-stresstests op dezelfde plaat. De procedures zijn afgestemd op zowel adherente (BMDM's) als niet-adherente (lymfocyten) cellen, waardoor nauwkeurige, reproduceerbare en parallelle beoordeling van de mitochondriale en glycolytische functie van de betreffende cellen mogelijk is.

Samenvatting

Realtime metabole analyse levert labelvrije metingen van mitochondriale ademhaling en glycolyse, waardoor onderzoekers het cellulaire energiemetabolisme kunnen koppelen aan ziektemechanismen en therapeutische responsen in diverse vakgebieden. Bij het vergelijken van energiemetabolisme tussen verschillende muizen, andere dieren, mensen of cellen onder verschillende behandelingen, is het cruciaal om metingen binnen één enkele run uit te voeren om nauwkeurige en betrouwbare resultaten te garanderen. Bovendien moet het experimentele ontwerp rekening houden met het celtype dat wordt geanalyseerd, bijvoorbeeld of ze hechtend zijn, zoals beenmerg-afgeleide macrofagen (BMDM's), of niet-adherent, zoals lymfocyten. Daarom werd een protocol ontwikkeld dat het mogelijk maakt om gelijktijdig Mito Stress- en Glycolyse-stresstests op dezelfde plaat uit te voeren, ondanks dat de assays aparte medicijninjecties en analyseprogramma's vereisen. Afzonderlijke behandelingsprotocollen werden geoptimaliseerd voor de analyse van zowel sterk hechtende cellen (bijv. BMDM's) als niet-adherente "drijvende" cellen (bijv. T-cellen en andere lymfocyten). Hier worden gedetailleerde protocollen gepresenteerd voor het efficiënt en reproduceerbaar uitvoeren van deze assays.

Inleiding

De Seahorse XF Analyzer is een uniek instrument dat realtime meting van mitochondriale ademhaling en glycolyse in veel celtypen mogelijk maakt. Door tegelijkertijd de zuurstofverbruikssnelheid (OCR) en de extracellulaire verzuringssnelheid (ECAR) te kwantificeren, maakt deze technologie precieze dissectie van bio-energetische routes mogelijk onder fysiologische of stressomstandigheden. De veelzijdigheid heeft het onmisbaar gemaakt in diverse onderzoeksgebieden, waaronder kanker1, neurowetenschap2, immunologie3, veroudering3, 4,4,5 en geneesmiddelenontdekking6, waar metabole herprogrammering een kenmerk is van ziekteprogressie en therapeutische respons. Door functionele bio-energetica te koppelen aan cellulaire fenotypes 7,8, biedt analyse een krachtig platform om mechanismen te ontdekken, metabole kwetsbaarheden te identificeren en de effecten van genetische of farmacologische interventies te evalueren.

In veel disciplines wordt het vergelijken van de directe effecten van medicijnen, kleine moleculen, cytokines of natuurlijke verbindingen op het cellulaire metabolisme het beste uitgevoerd onder identieke experimentele omstandigheden, dezelfde plaat, incubatietijd, omgevingsparameters en tijdstip van de dag. Daarom wordt deze aanpak gehouden om cellen met verschillende behandelingen of genetische achtergronden op dezelfde plaat te plaatsen en tegelijkertijd te analyseren op meerdere metabole parameters. Deze strategie zorgt voor de meest nauwkeurige vergelijking van geneesmiddel- of genetisch gerelateerde veranderingen in het cellulaire energiemetabolisme.

Veel celtypen gedragen zich anders in cultuur. Lymfocyten blijven in suspensie en hechten zich nooit aan de plaat9, macrofagen hechten zich sterk aan, waardoor ze moeilijk te verplaatsen zijn, en kankercellen vermenigvuldigen zich snel, maar met verschillende snelheden afhankelijk van de lijn. Deze verschillen vormen uitdagingen voor realtime metabole analyse; daarom vereist elk celtype in het experiment een op maat gemaakt protocol.

Dit artikel geeft stapsgewijze protocollen voor het uitvoeren van deze assays met behulp van realtime metabole analyse, waarmee efficiëntie en reproduceerbaarheid worden gegarandeerd. Deze protocollen kunnen worden toegepast op alle versies van analyzers die op de markt beschikbaar zijn.

Protocol

Muizen werden verzorgd volgens de procedures die zijn vastgelegd in het protocol van het National Institutes of Health and Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) aan het Meharry Medical College. Deze instelling is geaccrediteerd door de Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International en voldoet aan het beleid van de Public Health Service voor de behandeling en het gebruik van proefdieren onder ziektevrije omstandigheden. De details van de reagentia en de gebruikte apparatuur staan vermeld in de Materiaaltabel.

1. Optimalisatie voor celdichtheid

OPMERKING: Elk celtype vertoont unieke metabole kenmerken en aanzienlijke variatie in grootte. Beide factoren zijn cruciaal om het juiste aantal cellen per put te laden om optimale resultaten te verkrijgen. Voordat je een eerste experimentele assay uitvoert, bereid je een testplaat voor en laat ze uitvoeren met de geselecteerde cellen van interesse, geplateerd in verschillende dichtheden.

  1. Voor hechtende cellen (bijv. kankercellen) test je de zaaddichtheden variërend van 20.000–100.000 cellen per put. Voor sterk metabole en/of grote cellen (bijv. menselijke kankercellen of fibroblasten) begint dichtheidsoptimalisatie bij 10.000 cellen of minder per put.
  2. Voor niet-hechtende cellen (bijv. lymfocyten) optimaliseer je de zaaidichtheid binnen het bereik van 100.000–500.000 cellen per put. Voor alle celtypen streef je naar een uniforme enkelcel-monolaag om optimale resultaten te bereiken (zie Figuur 1 voor bijvoorbeeld plaatindeling van monsters).
  3. Doe de Mito Stress-assay (zoals hieronder). Gegevens van deze voorlopige assay kunnen worden gebruikt om de optimale celdichtheid voor het hoofdexperiment te bepalen. Selecteer de dichtheid die het grootste verschil tussen de assayomstandigheden laat zien.
    OPMERKING: Dit protocol is niet van toepassing op de analyse van 3D-monsters (bijv. celsferoïden, organoïden). Het kan echter worden aangepast om rekening te houden met de dikte van het monster en het ongelijkmatige oppervlak.

2. Voorbereiding op de assay

  1. Op de dag vóór het uitvoeren van de assay, til je voorzichtig de sensorcartridge uit de utility plate en voeg 200 μL RNAase/DNAse-vrij water toe aan elke put van de utility plate, en laat de sensorcartridge in de utility plate zakken totdat de sensoren volledig onder water staan.
    OPMERKING: Het waterniveau moet hoog genoeg zijn om ervoor te zorgen dat sensoren 's nachts volledig onder water blijven, omdat de fluoroforen van de sensorcartridge niet werken als ze niet goed gehydrateerd zijn. Als je een XF Hydrobooster gebruikt om de cartridge te hydrateren, kan de cartridge direct in een kaliberoplossing worden gedaan en kan de waterhydratatiestap worden weggelaten.
  2. Plaats de gehydrateerde sensorcartridge/utility plate 's nachts in een 37 °C CO2-loze broedmachine. Om verdamping van de plaat te voorkomen, plaats je ook een container met dubbel gedestilleerd water in de broedmachine.
  3. Op de dag van de test verwijder je de sensorcartridge/utility plate uit de CO2-loze incubator en haal je voorzichtig de sensorcartridge uit de utility plate, waarbij je de cartridge met de sensorzijde naar boven op de bank plaatst.
  4. Verwijder het water van de nutsplaat en schud losse druppels droog, en voeg 200 μL XF Calibrant Solution toe aan elke put.
  5. Plaats de sensorcartridge voorzichtig terug in de utility plate zodat de sensoren volledig onder water zijn in kaliberoplossing, en plaats hem terug in de 37 °CCO2-loze incubator.

3. Voorbereiding van assaymedia

  1. Voorbereiding op media-aandacht van Mito:
    1. In een 50 mL buis voeg je het volgende toe aan 45 mL XF RPMI-medium: 500 μL 100x natriumpyruvaat (eindconcentratie: 1 mM), 500 μL 100x L-glutamine (eindconcentratie: 2 mM), en 550 μL 45% glucoseoplossing (eindconcentratie: 25 mM)
  2. Stel de pH aan op 7,4. Vul bij met XF RPMI medium tot een eindvolume van 50 mL. Bewaar het voorbereide medium in een waterbad of droogbad van 37 °C voordat je het gebruikt.
  3. Glycolyse-assay media-voorbereiding:
    1. Voeg in een 50 mL buis 250 μL 100x L-glutamine toe aan 45 mL XF RPMI-medium.
  4. Stel de pH in naar 7,4 en vul dan bij met XF RPMI medium tot een eindvolume van 50 mL. Houd het voorbereide medium in een water van 37 °C of droog voor gebruik.
    OPMERKING: De pH van zowel Mito Stress als Glycolysis assaymedia moet worden aangepast naar 7,4 na toevoeging van supplementen die de pH veranderen, omdat zelfs kleine afwijkingen de testresultaten aanzienlijk kunnen beïnvloeden.

4. Cellen wassen en media veranderen voorafgaand aan analyse

OPMERKING: De wasfase van XFe96/XF Pro Cell Culture Microplates varieert afhankelijk van het gebruik van hechtende of niet-hechtende celtypen. Raadpleeg stap 9, Adherent (kankercellen, primaire BMDM-cellen) en niet-adherente cellen (T-cellen en andere lymfocyten), om de beste wasmethode voor het gebruikte celtype te bepalen.

  1. Verwijder 160–180 μL groeimedium uit elke put met een multi-pipettor, waarbij je rij voor kolom werkt om te voorkomen dat cellen uitdrogen. Vermijd het aanraken van de bodem van de putten.
  2. Met een pipetman met één tip verwijder je de resterende 20–30 μL uit de putten, waarbij je de cellaag onderin de put niet raakt.
  3. Voeg 180 μL glycolyse- of Mito-stress-assaymedia toe (zie stap 3) aan elke put, volgens de indeling in Figuur 1. Om de cellaag niet te verstoren, doseer je het medium voorzichtig langs de zijwand van elke put totdat alle putten gevuld zijn. Beide assays zitten op hetzelfde plaatje.
    OPMERKING: De putten die geen cellen en controleputten bevatten, moeten ook gevuld zijn met assaymedia.
  4. Plaats de microplaat in een 37 °C CO2-loze couvemachine voor 40–45 minuten voordat je met de test begint, en begin met de voorbereiding van de medicijnen.

5. Bereiding van medicijnen en het laden van de patroon

VOORZICHTIG: Sommige medicijnen (FCCP, Antimycine A/ Rotenon, Oligomycine) zijn gevaarlijk en moeten met zorg worden behandeld. Passende maatregelen zijn nodig om personeel te beschermen; deze omvatten het gebruik van handschoenen en andere persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM) en het weggooien van materialen in een door de instelling goedgekeurde chemische afvalbak of -container.

OPMERKING: De optimale FCCP/oligomycineconcentratie is afhankelijk van celtype en vóór de test empirisch getitreerd bij werk met bijzonder gevoelige cellen. De uiteindelijke concentraties kunnen variëren voor geneesmiddelen afhankelijk van het celtype. Bereid medicijnen en testmedia vers voor op de dag van gebruik. Niet bevriezen of hergebruiken. De voorbereiding van het assaymedicijn kan binnen deze periode van 45 minuten worden afgerond voor optimale resultaten.

  1. Gebruik het voorverwarmde Mito Stress and Glycolysis Assay-medium uit stap 3, om de verbindingen volgens Tabel 1 en/of Tabel 2 te verdunnen tot de concentraties die geschikt zijn voor elk celtype. Bereid elke verbinding voor in een aparte 15 mL buis (als je alle zes verbindingen gebruikt, zijn zes buizen nodig).
  2. Verwijder de sensorcartridge/utilityplaat van de 37 °C CO2-loze broedmachine en verwijder het deksel, waarbij je voorzichtig de XF-laadgeleider die bij de kit wordt geleverd, en de XF-laadgeleider die overeenkomt met de injectorpoort (Geleider A voor poort A) stevig boven de bovenkant van de sensorcartridge plaatst (zie Figuur 2).
  3. Met een multikanaals pipettor en reagensreservoir voor elk geneesmiddel, voeg je langzaam het benodigde volume toe aan de overeenkomstige poort (zie Tabel 1 en Tabel 2 voor volume). Houd de pipettor strikt rechtop bij het laden van de medicijnen (zie Figuur 2).
  4. Vervang of hergebruik na grondig spoelen en drogen van de laadgids voor elke poort (poort A, B, C en D) en gooi pipettips na elke lading weg.
    OPMERKING: Pipettentips moeten stevig in de geleidepoort passen, maar niet te strak, omdat de pipettoppen vast kunnen komen te zitten in de geleiding! Het wordt aanbevolen om de pipetpunten/pipettor die op de geleiders worden gebruikt te testen voordat je de verbindingen laadt, om te voorkomen dat monsters verkeerd geladen worden.
  5. Nadat alle verbindingen in hun respectievelijke poorten zijn geladen, verwijder je de geleider, controleer je visueel of alle poorten gevuld zijn en sluit je de cartridge vast met het deksel. Geneesmiddelen moeten overeenkomen met de assay in elk deel van dezelfde plaat (Figuur 1).
    OPMERKING: De uiteindelijke aanbevolen concentraties voor Mito Stress zijn 1 μM oligomycine, 1 μM FCCP en 0,5 μM rotenon/antimycine; voor glycolyse, 10 mM glucose, 1 μM oligomycine en 50 mM 2-DG.

6. Het opzetten van de Seahorse XFe96-analyzer

  1. Zet de analyzer aan en open de WAVE-software (zie Figuur 3).
  2. Selecteer XF Mito Stress Test.
    OPMERKING: Zolang het juiste assaymedium en de juiste verbindingen worden gebruikt, kan de analyzer tegelijkertijd zowel mitochondriale als glycolysetests uitvoeren op dezelfde plaat met behulp van de XF Mito Stress Test.
  3. Selecteer het aantal 'Groepen' op basis van de plaatopstelling en label elke groep. Ga door naar het volgende tabblad om putten toe te wijzen voor de plaatkaart (zie Figuur 3). Beide assays worden op dezelfde plaat uitgevoerd.
  4. Merk de putten voor elke groep aan op basis van hoe de plaat geladen is.
  5. Pas het programma aan volgens het celtype en het experimentele doel. Als de opstelling bijvoorbeeld een vooraf geactiveerde groep bevat vóór de analyse of als er tijdens de run een activator wordt toegevoegd, verleng dan de incubatietijd in elke cyclus om activatie mogelijk te maken.
  6. Selecteer het volgende tabblad, 'Voer Assay uit', en vul de informatie in waar nodig om het gegevensbestand op te slaan.
  7. Laad de voorgehydrateerde cartridge met medicijnen (vanaf stap 5) in de machine wanneer dit wordt aangegeven voor initialisatie. De initialisatiestap geeft aan of de sensoren goed gehydrateerd en functioneel zijn.
  8. Start de assay en laad en los de platen zoals aangegeven door de instructies tijdens het programma.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat alle deksels verwijderd zijn wanneer je de cartridge of microplaat in de analyzer laadt! Hoewel sommige analyzermodellen een veiligheidsfunctie hebben die deksels kan detecteren, hebben eerdere modellen dat niet. Dit kan de machine beschadigen als het deksel intact blijft tijdens een plaatgebruik.

7. Normalisatiemethoden: (SRB) en nucleaire telling (DAPI-kleuring en beeldvorming)

VOORZICHTIG: Sommige reagentia in de SRB-testkit zijn corrosief en branden als ze in contact komen met de huid. DAPI kan een allergische huidreactie veroorzaken. Het gebruik van handschoenen en andere PBM wordt aanbevolen, evenals het verwijderen van materialen in een door de instelling goedgekeurde chemische afvalbak of container.

OPMERKING: Kies de normalisatiemethode op basis van de kenmerken en voorbehandelingen van de geanalyseerde cellen. Beide methoden zijn geschikt bij het vergelijken van cellen met verschillende proliferatiesnelheden, aangezien beide methoden rekening houden met dergelijke variaties. Als medicijnbehandelingen echter senescentie induceren, proliferatie stoppen en celgrootte vergroten, is DAPI-kleuring de voorkeursnormalisatiemethode. DAPI is mogelijk niet geschikt voor celtypen waarbij nucleaire kleuring moeilijk te visualiseren is (bijv. adipocyten, erytrocyten) of cellen multinucleair kunnen zijn (bijv. parenchymale hepatocyten, myocyten).

  1. Om cellen te normaliseren met behulp van de SRB-assay (Sulfohodamine B Cell Cytoxicity Assay Kit) na realtime metabole analyse, verwijder je de plaat uit de machine en voeg je 1/4 van het mediavolume (bijv. 50 μL in 200 μL kweekmedium) van de fixatieoplossing toe aan elke put.
    1. Incubeer op kamertemperatuur gedurende 1 uur of een nacht op 4 °C.
    2. Verwijder de oplossing en was de putten voorzichtig drie keer met 200 μL RNase/DNase-vrij water, waarbij je erop let dat de cellaag niet wordt verstoord. Voor kortdurende opslag (indien nodig) vervang de eindwas door PBS en bewaar bij 4 °C.
    3. Voor directe normalisatie met de SRB-assay verwijder je de wasoplossing en laat je de plaat volledig aan de lucht drogen bij kamertemperatuur.
    4. Voeg 25 μL SRB-oplossing toe aan elke put en kleur 15 minuten bij kamertemperatuur in het donker of wikkel de plaat in aluminiumfolie tijdens de incubatieperiode.
      OPMERKING: SRB-oplossing is lichtgevoelig en dit deel van het experiment moet worden uitgevoerd in een gebied met weinig licht.
    5. Verwijder de kleuroplossing en voeg 100 μL 1x wasoplossing toe om elke put 2–3 keer te wassen.
    6. Was zo snel mogelijk om bleken te voorkomen en verwijder wasmiddelen zoveel mogelijk door vacuümzuiging.
    7. Voeg 100 μL 1x oplosoplossing toe aan elke put en plaats de plaat op een shaker gedurende 10 minuten op kamertemperatuur.
    8. Meet de optische dichtheid (O.D.) bij 565 nm op een plaatlezer om de putdichtheid te bepalen op basis van kleursaturatie (zie Figuur 3 voor visuele referentie).
    9. Exporteer de overdosis waarden als een Excel-bestand. Deze spreadsheet wordt in de WAVE-software geplakt voor normalisatie (stap 8).
      OPMERKING: Als intense kleuren worden waargenomen (> O.D. 3,5) door celoverbelasting, kan een suboptimale golflengte (bijv. 490–530 nm) worden gebruikt om de metingen terug te brengen naar het lineaire bereik van het instrument. Correctie van de achtergrond door de overdosis van de controle die alleen het kweekmedium (achtergrondcontroleput bevat) af te trekken van alle monsters.
  2. Voor DAPI-kleuring, verdun de DAPI-kolfoplossing tot 300 nM in 1x PBS.
    1. Was elke put van de celplaat drie keer voorzichtig met 200 μL 1x PBS.
      OPMERKING: Als er niet-hechtende cellen zijn, centrifugeer dan de plaat op 200 x g gedurende 3 minuten zonder rem om ervoor te zorgen dat cellen na elke wasstap op de bodem van elke put worden opgehangen.
    2. Fixeer cellen in 2%–4% PFA verdund in 1x PBS gedurende 10–15 minuten bij kamertemperatuur.
    3. Was elke put van de celplaat drie keer voorzichtig met 200 μL 1x PBS.
    4. Voeg ongeveer 150 μL van deze verdunde DAPI-kleuringsoplossing toe aan elk, zodat de cellen volledig bedekt zijn met elke put.
    5. Incubeer 1–5 minuten op kamertemperatuur in een gebied met weinig licht (of bedek de plaat met aluminiumfolie).
    6. Verwijder de DAPI-kleuroplossing uit elke put.
    7. Was elke put van de celplaat drie keer voorzichtig met 200 μL 1x PBS.
    8. Verwijder alle resterende PBS.
    9. Beeld de cellen in beeld bij elke excitatie/emissie tussen 358–461 nm of onder elke DAPI-filterinstelling op een microscoop.
    10. Exporteer de emissiewaarden als een Excel-bestand. Deze spreadsheet wordt in de WAVE-software geplakt voor normalisatie (stap 8).

8. Analyse en normalisatie van de gegevens

OPMERKING: Voor de analyse van data kan "Wave" of andere software worden gebruikt. Het aangeboden protocol is toepasbaar op de Wave-software.

  1. Open de resultaten van de analyse in Wave (zie Figuur 3). Normalisatie wordt uitgevoerd met waarden die zijn verkregen uit het Excel-bestand dat door de microplaatlezer wordt gegenereerd na SRB-kleuring (stap 7).
  2. Klik op "Normaliseren".
  3. Kies in het open venster "selecteer alles" gevolgd door "plakken" om de gegevens te plakken die gekopieerd zijn uit de Excel-spreadsheet die tijdens de normalisatiestap is gegenereerd. Klik op "Solliciteren". Deze procedure normaliseerde automatisch alle experimentele gegevens.
  4. Om een rapport te genereren, klik je op "Exporteren naar" in het paneel dat rechts opent, selecteer je "XF Cell Mito Stress Test Report Generator." Sla het gegenereerde bestand op. Selecteer tijdens de analyse alleen de putten die zijn toegewezen aan de Mito Stress Test (zie Figuur 3).
  5. Om een rapport te genereren, klik je op "Exporteren naar" in het paneel dat rechts opent, selecteer je "XF Cell Glycolysis Stress Test" Report Generator." Sla het gegenereerde bestand op. Selecteer tijdens de analyse alleen de putten die zijn toegewezen aan de Glycolyse Stress Test (zie Figuur 3).

9. Adherente versus niet-adherente cellen

OPMERKING: Hechtende en niet-hechtende cellen verschillen in groeigedrag, oppervlakkige hechting en hanteringsvereisten. Hechtende cellen (bijv. kankercellen, BMDM's) hechten zich aan het kweekoppervlak, dus plateren en wassen vereisen geen speciale voorzorgsmaatregelen. Niet-hechtende cellen (bijv. T-cellen, andere lymfocyten) blijven in suspensie en vereisen verschillende centrifugatie-, resuspendeer- en plateringsmethoden. Het begrijpen van deze verschillen is cruciaal voor nauwkeurige celzaaiing, medicatiebehandeling en testconsistentie.

  1. Zorg ervoor dat alle cellen die voor het experiment worden gebruikt, worden gekweekt in een medium en celkweekvat naar keuze vlak voordat de assay wordt uitgevoerd, en vervolgens naar de microplaat worden gebracht om de test uit te voeren.
    OPMERKING: Hoewel XF RPMI-medium wordt aanbevolen voor de celtypen die in dit protocol worden beschreven, moet voor andere celtypen de fabrikant worden overgesproken om te zorgen dat het juiste medium wordt gebruikt.
  2. Voor hechtende cellen (kankercellen, BMDM-cellen) zaait u de cellen 4–5 uur voor de assay in de XFe96/XF Pro Cell Culture Microplate met een geoptimaliseerde celdichtheid (zie stap 1) in het mediavolume 200 μL en plaats deze in een 37 °C CO2-incubator.
    OPMERKING: BMDM-cellen kunnen tot 24 uur voor de test worden geplateerd, omdat ze niet vermenigvuldigen en dezelfde celdichtheid behouden. Voor snelgroeiende hechtende cellen, zoals kankercellijnen, wordt geadviseerd om op de dag van de test te platen als geen verdere behandeling nodig is en ze te analyseren zodra cellen zijn gehecht om verdere celgroei te voorkomen. Als dit ontwerp niet mogelijk is, is normalisatie naar eiwithoeveelheid/-well of kern-/putnummer een noodzakelijke stap.
  3. Zorg ervoor dat de hoekputten voor elke vier hoeken van de microplaat vrij zijn van cellen maar gevuld zijn met media, aangezien dit wordt gemeten als de blanke controleputten.
  4. Na 3–5 uur incubatie observeer je de microplaat om zeker te zijn dat cellen op een gelijkmatig niveau aan de bodem van elke put aan de plaat zijn bevestigd.
  5. Als cellen nog niet gehecht zijn, kan de plaat in de 37 °C CO2-incubator worden geplaatst voor extra tijd totdat de cellen volledig zijn bevestigd.
  6. Vervolgens bereid je de microplaat voor met hechtende cellen voor het wassen zoals vermeld in stap 4 om de test te starten.
  7. Voor niet-hechtende cellen (T-cellen en andere lymfocyten) wordt de microplaat bedekt met Poly-D-Lysine voordat cellen aan de plaat worden toegevoegd.
    OPMERKING: Hoewel Poly-D-Lysinecoating wordt aanbevolen in dit protocol, kan afhankelijk van het celtype een andere plaatcoating (bijv. collageen, fibronectine, gelatine) geschikter zijn. Als je een alternatieve coating gebruikt, volg dan de instructies van de fabrikant.
  8. Om de microplaat te coaten, bereid je 2,5 mL van een 20 μg/mL Poly-D-Lysine-oplossing (50x verdunning van 1 mg/1 mL wateroplossing) in 0,1 M natriumbicarbonaat, pH 8,0 (bicarbonaat levert de optimale pH voor adhesie-adsorptie). Deze stap kan worden uitgevoerd vóór de assay of op de dag zelf.
  9. Breng 25 μL van de oplossing toe op elke put van de plaat en incubeer op de bank of op een plaatwip bij kamertemperatuur gedurende 20–30 minuten.
  10. Aspireer of pipetteer de resterende oplossing en was elke put twee keer met 200 μL RNAase/DNAse-vrij water.
  11. Wacht tot de putten droog zijn (1–2 uur) voordat je de cellen aan de microplaat plant.
  12. Bereid vervolgens de microplaat voor met niet-hechtende cellen voor de wasfase door de plaat 3 minuten te centrifugeren op 200 x g zonder pauze, zodat de cellen aan de bodem van elke put worden opgehangen.
  13. Ga door met stap 4 en ga verder met de rest van de assay zoals vermeld in stappen 5–7.

Resultaten

Dit gecombineerde protocol is ontwikkeld om beide assays op dezelfde plaat uit te voeren. Zo werd deze methode gebruikt om mGluR1−TCR crosstalk-signalering op de metabole bekwaamheid van CD8+ T-cellen tijdens activatie10 te verduidelijken. Dit was bedoeld om de impact van mGluR1-remming op de overgang naar glycolyse en de veranderingen in mitochondriale ademhaling te evalueren, processen die essentieel zijn voor de optimale werking van T-cellen, terwijl het aantal T-cellen dat in elk experiment wordt gebruikt wordt geminimaliseerd. Dezelfde enkelplaattechniek werd ook effectief toegepast op andere celtypen, zoals adherente beenmerg-afgeleide macrofagen (BMDM's; Figuur 4 en Figuur 5), en aan niet-hechtende cellen, zoals menselijke perifere bloed mononucleaire cellen (PMBC's; Figuur 3). Er werd aangetoond dat de mGluR1-signaalblokkade op geactiveerde CD8+ T-cellen de mitochondriale en niet-mitochondriale energieproductie beïnvloedt. Daarentegen vertoonden naïeve cellen geen significante veranderingen in hun metabole energieprofiel (Figuur 6A,B). De Mito Stresstest van geactiveerde CD8+ T-cellen toonde een hoge basale en maximale ademhaling evenals een hoge ademhalingscapaciteit (Figuur 6C). T-cellen die werden behandeld met CPCCOEt, een niet-competitieve antagonist die downstream signaaloverdracht blokkeert bij glutamaatbinding aan mGluR1, hadden een verlaagde zuurstofverbruik (OCR) zoals de naïeve cellen en resulteerden in een verminderde ATP-productie (Figuur 6C). De glycolysetest toonde ook aan dat alleen onbehandelde geactiveerde CD8+ T-cellen ATP produceerden via glycolyse, en de CPCCOE-behandeling vertoonde metabole activiteit vergelijkbaar met de naïeve aandoening (Figuur 6D). Deze resultaten bevestigen dat mGluR1-signalering essentieel is voor een goede CD8⁺ T-celfunctie bij activatie.

figure-results-1
Figuur 1: Deze figuur illustreert het overzicht van de plaatopstelling van de microplaat, inclusief de Mito Stress en Glycolysis Assay in dezelfde plaat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Het laden van de medicijnpatroon. (A) Een gedetailleerde kaart van de sensoren en poorten aan de achterkant en voorkant van de patroon, met aantekeningen welk medicijn in welke poort geladen moet worden. (B) De aanbevolen oriëntatie van de geleiders bovenop de cartridge voor het laden van de bijbehorende poorten en de aanbevolen positie voor het gebruik van de multikanaals pipettor boven de geleiders. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Het gebruik van het WAVE-programma om de assay uit te voeren en te analyseren. (A) De doorloop van het opzetten van het programma omvat het selecteren van het assaytype, het toewijzen van groepen, het maken van de plaatkaart en het programmeren van de geneesmiddelpoorten. (B) De volgorde van de geneesmiddelen die in de overeenkomstige poorten geladen moeten worden, hangt af van of het monster Mito-stress of glycolyse is. (C) Een close-up van de SRB-kleuring tijdens de laatste stap van normalisatie. (D) Na normalisatie kunnen de plaatgegevens afzonderlijk worden geëxporteerd als zowel Glycolyse- als Mito-stresstest voor dezelfde plaat. (E) De gegevens voor Mito-spanning kunnen worden geselecteerd door de huidige selectie alleen voor Mito-spanningsmonsters te bewerken. (F) De gegevens voor glycolyse kunnen worden geselecteerd door de huidige selectie alleen voor glycolysemonsters te bewerken. De voorbeeldgegevens die in deze figuur worden gebruikt, zijn afkomstig uit een analyse van mononucleaire cellen in het perifere bloed. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Gelijktijdige uitvoering van Mito-stress op dezelfde plaat. Macrofagen afkomstig van beenmerg, afkomstig van 2 maanden oude WT- en Tusc2 KO-muizen, werden aan beide soorten analyses onderworpen. Cellen werden ofwel onbehandeld (sham) gelaten of gestimuleerd met LPS (100 ng/mL) gedurende 5 uur vóór het plateren (30.000 cellen/put). Mito Stress- en glycolysestresstests werden parallel uitgevoerd om nauwkeurige vergelijking mogelijk te maken, zoals weergegeven in Figuur 1. (A) Mito-stressprofielen voor verschillende celtypes (WT en KO) en condities (naïef en geactiveerd), gegenereerd met Wave-software. Normalisatie werd uitgevoerd via SRB-kleuring zoals beschreven in stap 7. (B) Vergelijkende staafdiagrammen van de parameters die in elke test worden geanalyseerd. ∗ p ≤ 0,05, ∗∗p ≤ 0,005, Student T-test. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5: Gelijktijdige uitvoering van glycolysestresstests uitgevoerd op dezelfde plaat. Macrofagen afkomstig van beenmerg, afkomstig van 2 maanden oude WT- en Tusc2 KO-muizen, werden aan beide soorten analyses onderworpen. Cellen werden ofwel onbehandeld (sham) gelaten of gestimuleerd met LPS (100 ng/mL) gedurende 5 uur vóór het plateren (30.000 cellen/put). Mito Stress- en glycolysestresstests werden parallel uitgevoerd om nauwkeurige vergelijking mogelijk te maken, zoals weergegeven in Figuur 1. (A) Glycolysestressprofielen voor verschillende celtypen (WT en KO) en condities (naïef en geactiveerd), gegenereerd met Wave-software. Normalisatie werd uitgevoerd via SRB-kleuring zoals beschreven in stap 7. (B) Vergelijkende staafdiagrammen van de parameters die in elke test worden geanalyseerd. ∗ p ≤ 0,05, ∗∗p ≤ 0,005, Student T-test. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-6
Figuur 6: Mito Stress- en Glycolyse-stresstests op één plaat met behulp van CD8⁺ T-cellen gezuiverd uit muissplenocyten. (A) Representatieve profielen van de mitochondriale stresstest die medicijnafhankelijke veranderingen in zuurstofconsumptiesnelheid (OCR) van CD8+ T-cellen vergelijken, uitgevoerd met naïeve, geactiveerde en geactiveerde + mGluR1-inhibitor T-celgroepen. (B) Representatieve profielen van de Glycolysetest die medicijnafhankelijke veranderingen in de extracellulaire verzuringssnelheid (ECAR) van CD8+ T-cellen vergelijken op naïeve, geactiveerde en geactiveerde + mGluR1-remmergroepen. (C) Staafdiagrammen die kwantitatieve veranderingen tonen in verschillende parameters van mitochondriale ademhaling van CD8+ T-cellen in naïeve, geactiveerde en geactiveerde + mGluR1-remmergroepen. Balken vertegenwoordigen het gemiddelde ± SEM (n = 4). (D) Staafdiagrammen die kwantitatieve veranderingen tonen in verschillende glycolyseparameters in naïeve, geactiveerde en geactiveerde + mGluR1-remmer CD8+ T-cellen. Balken vertegenwoordigen het gemiddelde ± SEM (n = 4). ∗p ≤ 0.05, ∗∗p ≤ 0.005, Student T-Test. Deze figuur is aangepast van Aquino et al.10. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Laatste put (μM)Volume van de standaardoplossing (μL)Mediavolume (uL)10x poort (μM)Volume toegevoegd aan poort (μL)
Port A oligomycine0.51502850520
1.545025501520
2.563018902520
Port B FCCP0.12537.52962.51.2522
0.257529252.522
0.51502850522
130027001022
260024002022
Port C Rotenon/Antimycine0.53002700524

Tabel 1: Samengestelde voorbereiding voor het laden van XFe96-sensorcartridges voor Mito-spanning.

Laatste BronVolume van de standaardoplossing (μL)Mediavolume (μL)10x PortVolume toegevoegd aan poort (μL)
Port A Glucose250 mM100240020
Port B oligomycine0,5 μM15028505 uM22
1,5 μM450255015 uM22
2,5 μM630189025 uM22
Port C 2-DG50 mM30000500mM24

Tabel 2: Compoundvoorbereiding voor het laden van XFe96-sensorcartridges voor glycolyse.

Discussie

Het hier gepresenteerde protocol maakt nauwkeurige en betrouwbare vergelijkingen mogelijk van twee belangrijke energieproducerende routes: oxidatieve fosforylering (mitochondriale ATP-productie) en anaerobe glycolyse (ATP-productie buiten mitochondriën, zonder zuurstof), en twee verschillende stresstests binnen één enkele run. Daarnaast houdt het experimentele ontwerp rekening met het type cellen dat wordt geanalyseerd, waardoor een breder begrip van celmetabolisme-analyse mogelijk wordt, terwijl de hoeveelheid monsters en reagentia wordt geminimaliseerd.

De verschillen tussen de Mito Stress- en Glycolysis Stress-tests die worden uitgevoerd op realtime protocollen voor metabole analyse-instrumenten ontworpen en verkocht door Agilent, Inc. zijn aanzienlijk. Deze twee assays vereisen verschillende assaymedia, specifieke geneesmiddelen en verschillende instrumentenprogramma's. De Mito Stress Test gebruikt assaymedia met glucose, L-glutamine en pyruvaat, terwijl de Glycolyse Stress Test glucosevrije media gebruikt die alleen worden aangevuld met L-glutamine. De tests worden onderzocht met verschillende verbindingen: Oligomycine → FCCP → Antimycine A + Rotenon voor de Mito Stress Test, en Oligomycine → Glucose → 2-DG voor de Glycolyse Stress Test. Daarom worden deze tests normaal gesproken op verschillende tijdstipten op aparte platen uitgevoerd, omdat de realtime metabole analyzer slechts één plaat tegelijk kan verwerken.

Om deze beperkingen aan te pakken, werd een gecombineerd protocol ontwikkeld dat het mogelijk maakt beide assays op dezelfde plaat uit te voeren met behulp van de Mito Stress Test-opstelling in een eerder artikel10. Er worden aanbevelingen gegeven voor het analyseren van verschillende celtypen, waaronder immuuncellen, kankercellen, hechtende cellen en suspensiecellen. Deze richtlijnen kunnen afzonderlijk of in combinatie worden toegepast, met flexibiliteit afhankelijk van de doelstellingen en beschikbare middelen van de onderzoeker.

Normalisatie van de cellen via SRB Assay of DAPI biedt ook meer flexibiliteit, in het geval van het gebruik van meerdere celtypen met verschillende groeisnelheden/grootte 9,11. Bovendien vereist deze techniek slechts één plaat voor twee assays, waardoor deze gecombineerd kan worden met verschillende monstertypen om metabole processen te meten.

Factoren die het succes van de methode beïnvloeden: (1) optimaal celaantal per put; (2) efficiënte celhechting; en (3) zorgvuldig laden van de patroon, aangezien twee verschillende sets medicijnen in aparte delen van de patroon geladen moeten worden.

Wetenschappelijke en experimentele voordelen van de methode zijn directe vergelijking binnen dezelfde biologische context. Het gebruik van dezelfde cellen onder identieke kweekomstandigheden elimineert variabiliteit tussen platen of runs en maakt een nauwkeurigere vergelijking van mitochondriale en glycolytische functies in hetzelfde monster mogelijk. Het bevat ook een geïntegreerd beeld van de cellulaire stofwisseling. Het parallel meten van zowel oxidatieve fosforylering (OXPHOS) als glycolyse geeft een volledig momentopname van het totale energiemetabolisme van een cel en haar flexibiliteit bij het schakelen tussen routes. Deze parallelle assay vermindert ook de biologische variabiliteit. Verschillen in celplatingdichtheid, doorgangsaantal of omgevingsomstandigheden worden geminimaliseerd omdat beide assays op dezelfde celpopulatie worden uitgevoerd, wat leidt tot verbeterde reproduceerbaarheid. Het gelijktijdig uitvoeren van beide tests vermindert de run-to-run variabiliteit veroorzaakt door kalibratie van de sensorcartridge, temperatuurveranderingen of reagentiabereiding.

De technische voordelen van deze techniek zijn onder meer verhoogde efficiëntie door het combineren van assays, wat tijd, reagentia en plaatverbruiksmaterialen bespaart, waardoor het belangrijk is voor grootschalige of hoge-doorvoerstudies. Dit maakt lagere sample-eisen mogelijk. Er is slechts één plaat cel nodig, wat voordelig is bij het werken met beperkte of zeldzame primaire cellen (bijv. lymfocyten, hersencellen). Betere normalisatie tussen assays treedt op omdat beide tests dezelfde plaat gebruiken, normalisatie (bijvoorbeeld naar eiwitgehalte of celnummer), en het is consistenter en betrouwbaarder. Met deze consistentie wordt de datacorrelatie versterkt. Directe koppeling van mitochondriale en glycolytische parameters uit hetzelfde monster vergemakkelijkt metabole profilering en statistische analyses.

De enige bekende beperking van deze techniek is dat het combineren van twee protocollen op één plaat het aantal beschikbare putreplicaties vermindert. Het wordt aanbevolen het aantal condities per plaat te beperken om te zorgen voor minimaal 8 putreplicaties per conditie.

Dankbetuigingen

Dit onderzoek werd gefinancierd door het National Institute on Minority Health and Health Disparities (NIMHD), subsidienummer 5U54MD007586-37, pilotproject aan A. Ivanova; NHGRI Diversity Center for Genome Research subsidie UG3HG013248, onderzoeksproject 2, PI-Ivanova, en ook enige ondersteuning werd geleverd door Genprex Inc.  Bovendien werd dit onderzoek uitgevoerd bij de Core Facilities van het Meharry Medical College, die steun ontvangen van NIH-subsidies MD007586, CA163069 en S10RR025497.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
15 mL Centrifuge Tubes, Bagged With Screw Cap, Sterile, 500 Tubes/UnitGenesee Scientific21-408B
Biologix Pipet Tips-200 μl Extended (Pack, Sterile)Biologix USASKU 21-0200
BioTek Synergy H1BIOSPX
BZ-X700 fluorescence microscopeKeyence
Corning Costar Sterile Disposable Reagent ReservoirsFisher4873
D-(+)-Glucose Solution 45% in H20SigmaG9769
DAPI, hydrochloride Thermofisher ScientificD1306
Eppendorf Centrifuge 5810 REppendorf
GenClone Fetal Bovine Serum Heat InactivatedGenesee Scientific25-514H
L-Glutamine 200 mM (100x)Gibco25030-081
Olympus Plastics 22-284, Olympus 1.7ml Microtubes, Clear, Sterile Polypropylene, Boilproof, Ster, 50/Bag, 250 Tubes/UnitGenesee Scientific22-284
Olympus Plastics 28-108, 50ml Conical Centrifuge Tubes, Polypropylene Bulk, Sterile, 20 Bags of 25 Tubes, 500/UnitGenesee Scientific28-108
Paraformaldehyde 16% solution EM gradeElectron Microscopy Science15710
Poly-D-Lysine hydrobromide lyophilizedSigmaP6407
Precision 180 Water BathPrecision Scientific51221060
Precision Scientific GCA Model 26 IncubatorThelco51221091
QBI 120-095-671 Penicillin/Streptomycin Mixture, 100x Pen/Strep Mixture, 10 x 10 mL/UnitGenesee Scientific25-827
QBI PBS, 1x, without Ca, Mg, Phenol Red, 0.1um Sterile FilteredGenesee Scientific25-507B
RPMI 1640, with L-GlutamineGenesee Scientific25-506
Seahorse XF RPMI medium, pH 7.4, 500 mLAgilent103576-100
Seahorse XFe96 AnalyzerAgilent
Seahorse XFe96/XF Pro FluxPakAgilent103792-100includes 18 XFe96/XF Pro sensor cartridges,18 XFe96/XF Pro Cell Culture Microplates, 1 bottle of Seahorse XF Calibrant Solution 500mL and 3 pairs of XF Loading Guides
Sodium BicarbonateSigmaS6014
Sodium Pyruvate (100mM) 100XGibco11360-070
SRB assay (Sulfurhodamine B Assay Kit)Abcamab235935
VWR Signature Ergonomic High Performance Multichannel PipettorAvantor89079-956
XF Cell Mito Stress Test KitAgilent103015-100
XF Glycolytic Rate Assay KitAgilent103344-100

Referenties

  1. Caines, J. K., Barnes, D. A., Berry, M. D. The use of Seahorse XF assays to interrogate real-time energy metabolism in cancer cell lines. Methods Mol Biol. 2508, 225-234 (2022).
  2. Marinangeli, C., Kluza, J., Marchetti, P., Buee, L., Vingtdeux, V. Study of ampk-regulated metabolic fluxes in neurons using the Seahorse XF Analyzer. Methods Mol Biol. 1732, 289-305 (2018).
  3. Tan, W. J. T., Santos-Sacchi, J., Tonello, J., Shanker, A., Ivanova, A. V. Pharmacological modulation of energy and metabolic pathways protects hearing in the fus1/tusc2 knockout model of mitochondrial dysfunction and oxidative stress. Antioxidants (Basel). 12 (6), 1225(2023).
  4. Sure, V. N., et al. A novel high-throughput assay for respiration in isolated brain microvessels reveals impaired mitochondrial function in the aged mice. Geroscience. 40, 365-375 (2018).
  5. Hammoud, S., et al. Tubular CPT1a deletion minimally affects aging and chronic kidney injury. JCI Insight. 9 (6), e171961(2024).
  6. Wei, C., Heitmeier, M., Hruz, P. W., Shanmugam, M. Evaluating the efficacy of glut inhibitors using a Seahorse extracellular flux analyzer. Methods Mol Biol. 1713, 69-75 (2018).
  7. Zhu, Y., et al. The role of PKM2-mediated metabolic reprogramming in the osteogenic differentiation of BMSCs under diabetic periodontitis conditions. Stem Cell Res Ther. 16 (1), 186(2025).
  8. Liu, J., Zhang, X., Fan, X. Liensinine reshapes the immune microenvironment and enhances immunotherapy by reprogramming metabolism through the AMPK-HIF-1α axis in hepatocellular carcinoma. J Exp Clin Cancer Res. 44 (1), 208(2025).
  9. Van Der Windt, G. J. W., Chang, C. H., Pearce, E. L. Measuring bioenergetics in T cells using a Seahorse extracellular flux analyzer. Curr Protoc Immunol. 113 (3), 3.16B.1-3.16B.14 (2016).
  10. Teresa P de Aquino, M., et al. Glutamate receptor–TCR signaling potentiates full CD8+ T cell activation and effector function in tumor immunity. iScience. 28 (10), 112772(2025).
  11. Hammoud, S., Kern, J., Mukherjee, S. Assays to enhance metabolic phenotyping in the kidney. Am J Physiol Renal Physiol. 328 (4), 563-577 (2025).

Herprints en machtigingen

Tags

Mito Stress TestGlycolyse Stress TestReal time Metabole AnalyseCellulair EnergiemetabolismeBeenmergmacrofagenLymfocytenmetabolismeMitochondri le RespiratieGlycolysemeting

Dit artikel is gepubliceerd

Video binnenkort beschikbaar

Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.