Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Primaire isolatie, kweek en fenotypische verificatie van gewrichtschondrocyten van de rattenknie

861 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/69509

⸱

7 november 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Orthopedics, Longfu Hospital, 2Department of TCM Rheumatology, China-Japan Friendship Hospital, 3Beijing Key Lab for Immune-Mediated Inflammatory Diseases, China-Japan Friendship Hospital

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft de isolatie en kweek van primaire gewrichtschondrocyten van de knie van de rat met behulp van sequentiële enzymatische spijsvertering. De methode levert chondrocyten op met gevalideerde fenotypische kenmerken, waardoor onderzoekers een betrouwbare aanpak krijgen voor toepassingen in kraakbeenonderzoek.

Samenvatting

Kraakbeenschade als gevolg van trauma, veroudering of ontstekingsaandoeningen blijft een belangrijke klinische uitdaging vanwege het inherent beperkte regeneratieve vermogen van het weefsel. Chondrocyten, de enige cellulaire component van kraakbeen, zijn verantwoordelijk voor het behoud van de extracellulaire matrixstructuur en -functie, waardoor ze essentieel zijn voor het begrijpen van kraakbeenfysiologie, pathologie en regeneratie. De huidige studie presenteert een uitgebreid en gestandaardiseerd protocol voor de isolatie, kweek en fenotypische verificatie van primaire gewrichtschondrocyten van ratten vanuit het kniegewricht. De procedure maakt gebruik van jonge, zogende ratten om maximale cellevensvatbaarheid te garanderen en maakt gebruik van sequentiële enzymatische digestie met trypsine en collagenase type II voor efficiënte celextractie. Het fenotype van chondrocyten wordt geverifieerd door middel van type II collageenimmunofluorescentie, flowcytometrische analyse en interleukine (IL)-1β-stimulatietesten om de cellulaire identiteit en ontstekingsrespons te bevestigen. Deze geoptimaliseerde en reproduceerbare workflow maakt het mogelijk om chondrocytenculturen met een hoge zuiverheid te genereren die geschikt zijn voor het screenen van geneesmiddelen, mechanistisch onderzoek en weefselmanipulatietoepassingen, waardoor het onderzoek naar kraakbeenbiologie wordt bevorderd.

Inleiding

Kraakbeen is een gespecialiseerd type bindweefsel dat meerdere cruciale functies vervult, waaronder het bieden van ondersteuning, demping en schokabsorptie1. Het speelt een cruciale rol bij het handhaven van de structurele stabiliteit en het waarborgen van de mobiliteit binnen het skelet 2,3. Mechanisch letsel, degeneratieve veranderingen, ontstekingen of metabole afwijkingen kunnen schade aan kraakbeen veroorzaken 4,5,6. Vanwege het inherente gebrek aan bloedvaten en zenuwen, gecombineerd met de beperkte proliferatieve capaciteit van chondrocyten, brengt het herstel van kraakbeen aanzienlijke uitdagingen met zich mee. Ziekten zoals artrose (veroorzaakt door degeneratieve veranderingen en mechanisch letsel) en reumatoïde artritis (veroorzaakt door auto-immuunontstekingsreacties) kunnen onomkeerbare kraakbeenschade veroorzaken, waardoor de kwaliteit van leven van patiënten sterk afneemt 7,8,9. Als het exclusieve celtype in kraakbeenweefsel zijn chondrocyten verantwoordelijk voor sleutelfuncties zoals de secretie en het onderhoud van de extracellulaire matrix, ondersteuning van de ontwikkeling van het skelet, deelname aan gewrichtsdemping en -herstel, en centrale regulatie van kraakbeengroei en metabolisme 10,11,12.

Chondrocyten zijn opgesloten in lacunes in de avasculaire matrix, wat resulteert in een ernstig beperkte capaciteit voor hun eigen proliferatie en weefselherstel13,14. De functionele status van chondrocyten bepaalt rechtstreeks de gezondheid van kraakbeenweefsel15. Chondrocytendisfunctie, veroorzaakt door veroudering, ontsteking, trauma of genetische factoren, resulteert in verminderde matrixsynthese en verhoogde afbraak16,17. Dit pathologische proces veroorzaakt kraakbeendegeneratie (zoals bij artrose), wat leidt tot aantasting van de essentiële ondersteunings-, dempings- en smeerfuncties. Het beperkte regeneratieve vermogen van kraakbeen is de belangrijkste reden voor de grote uitdaging bij het herstel ervan en vormt een belangrijk onderzoeksgebied in de moderne orthopedie en regeneratieve geneeskunde. Het huidige onderzoek naar kraakbeen is een belangrijk aandachtspunt geworden in het veld, met op geneesmiddelen gebaseerde interventies, weefselmanipulatie en gentherapie die allemaal de isolatie van chondrocyten vereisen voor in vitro studies 18,19,20,21,22,23,24,25. Daarom vormt het isoleren en identificeren van chondrocyten een cruciale stap in veel experimentele benaderingen. Hoewel onsterfelijke chondrocytachtige cellijnen zoals SW1353 in sommige onderzoeken als handige surrogaten worden gebruikt, missen ze de expressie van kritische fenotypische markers, met name type II collageen, dat essentieel is voor de authentieke functie van chondrocyten en matrixvorming26. Daarom blijven primaire chondrocyten de gouden standaard voor onderzoek dat fysiologische relevantie vereist. Vergeleken met eerder gepubliceerde protocollen die meerdere enzymcombinaties of uitgebreide mechanische manipulatie vereisen, vermindert de vereenvoudigde enzymatische verteringsbenadering de complexiteit en verwerkingstijd in vergelijking met methoden die meerdere enzymcombinaties of uitgebreide mechanische manipulatie vereisen. Bovendien zorgt de integratie van uitgebreide validatiestappen voor een consistente identificatie van functionele chondrocyten en verbetert het de reproduceerbaarheid in experimenten en laboratoria.

Chondrocyten worden gekenmerkt door hun afscheiding van type II collageen, terwijl ze onder stimulatie door ontstekingsfactoren op grote schaal matrixmetalloproteïnasen (MMP's) synthetiseren en afgeven27. Daarom werden de cellen, na isolatie van chondrocyten, geïdentificeerd via type II collageenimmunofluorescentie en werd de zuiverheid van chondrocyten beoordeeld met behulp van flowcytometrie. En gestimuleerd met interleukine (IL)-1β om hun karakteristieke synthese en secretie van matrixmetalloproteïnasen te bevestigen. Deze studie beschrijft het proces van extractie en karakterisering van chondrocyten bij neonatale muizen en legt een basis voor latere chondrocyt-gerelateerde experimenten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Het gebruik van proefdieren in deze studie werd goedgekeurd door de ethische commissie voor experimentele dierenverzorging en -welzijn van het China-Japan Friendship Hospital (nr. zryhyy21-21-05-16). De gebruikte reagentia en de gebruikte apparatuur staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Proefdieren en voorbereidend werk

OPMERKING: Kraakbeen uit de gewrichten van ratten, konijnen en mensen na een totale knieartroplastiek kan worden gebruikt voor de isolatie van chondrocyten. Vanwege hun hogere levensvatbaarheid werden in dit onderzoek echter zogende ratten gebruikt voor de extractie van chondrocyten.

  1. Vervoer zogende ratten van de productiefaciliteit voor proefdieren naar het laboratorium met behulp van gespecialiseerde transfercontainers.
  2. Euthanaseer zogende ratten door CO2 -verstikking (volgens institutioneel goedgekeurde protocollen) en spoel hun lichaamsoppervlak af met een steriele oplossing.
  3. Dompel de geëuthanaseerde zogende ratten gedurende 10 minuten onder in 75% ethanol om de oppervlakteverontreinigingen te desinfecteren.
  4. Breng de gedesinfecteerde zogende ratten over naar een bioveiligheidskast en plaats ze in steriele petrischaaltjes.
    OPMERKING: Grondige oppervlaktereiniging en onderdompeling in ethanol van zogende ratten zijn cruciale stappen om bacteriële of schimmelbesmetting te voorkomen, wat een negatieve invloed kan hebben op latere experimenten.

2. Isolatie van gewrichtskraakbeenweefsel

OPMERKING: Het neonatale kraakbeen verschijnt als een doorschijnende, blauwachtig witte laag die de benige epifyse bedekt. Tijdens deze stap moeten strikte aseptische technieken worden gevolgd om besmetting te voorkomen die latere experimenten in gevaar kan brengen.

  1. Isoleer het kniegewricht van de zogende rat met behulp van een scalpel en een oogheelkundige schaar en verwijder vervolgens het bovenliggende huidweefsel.
  2. Breng het ontlede kniegewricht over naar een nieuw steriel petrischaaltje en vervang het scalpel en de oogheelkundige schaar.
  3. Oogst gewrichtskraakbeen van het kniegewricht met behulp van een scalpel en knip vervolgens het omliggende bindweefsel grondig weg met een oogheelkundige schaar.

3. Vertering van kraakbeenweefsel

OPMERKING: Gebruik trypsine om bindweefsel rond het kraakbeen te verteren, gevolgd door 0,2% collagenase II voor de vertering van de kraakbeenmatrix.

  1. Voeg het geoogste kraakbeen toe aan 3 volumedelen 0,25% trypsine en incubeer in een thermostatische schudder van 37 °C met schudden gedurende 30 min.
  2. Beëindig de spijsvertering door PBS toe te voegen dat 10% foetaal runderserum (FBS) bevat. Verwijder aanhangende weefsels van het kraakbeen met behulp van een oogheelkundige schaar. Centrifugeren (4 °C, 500 × g, 5 min) en gooi het bovenstaande weg.
  3. Resuspendeer het kraakbeenweefsel in PBS, centrifugeer (4 °C, 500 × g, 5 min) en gooi het supernatant weg. Herhaal deze wasstap 3 keer.
  4. Voeg 0,2% collagenase II toe aan het bewerkte kraakbeenweefsel en verteer in een thermostatische schudder van 37 °C met schudden gedurende 4 uur.

4. Chondrocyten isolatie en cultuur

OPMERKING: Alle procedures moeten onder steriele omstandigheden worden uitgevoerd in een bioveiligheidskast. Steriele handschoenen moeten worden gedragen tijdens mechanische dissociatie van kraakbeenweefsel met behulp van een spuitzuiger op de celzeef om experimentele besmetting te voorkomen. Onder standaard kweekomstandigheden hebben primaire chondrocyten doorgaans ongeveer 2-3 dagen nodig om 80%-90% samenvloeiing te bereiken voor de eerste passage.

  1. Plaats een celzeef van 200 μm op een steriel kweekschaaltje en filtreer de verteerde kraakbeensuspensie door het gaas.
  2. Maal de resterende kraakbeenfragmenten op de zeef met behulp van een steriele spuitzuiger en spoel de zeef vervolgens af met volledig DMEM-medium.
  3. Verzamel alle filtraten, centrifugeer (4 °C, 500 × g, 5 min) en gooi het bovenstaande weg.
  4. Resuspendeer de pellet in PBS, centrifugeer (4 °C, 500 × g, 5 min) en gooi het bovenstaande weg.
  5. Resuspendeer de cellen in volledig DMEM-medium en breng ze over naar een T25-kweekkolf.
  6. Incubeer de kolf in een bevochtigde broedmachine (37 °C, 5 % CO2).
  7. Passagecellen bij deze samenvloeiing met behulp van trypsine-EDTA en subcultuur in een verhouding van 1:2.

5. Type II collageenimmunofluorescentiekleuring voor identificatie van chondrocyten

OPMERKING: De aangehechte chondrocyten worden gekenmerkt door een spoelvormige en veelhoekige morfologie. Alle biomarkeranalyses die in deze studie worden gepresenteerd, zijn uitgevoerd met behulp van cellen in passage 2. Chondrocyten bij passage 3 beginnen een meer uitgesproken dedifferentiatie te vertonen, gekenmerkt door een verschuiving naar een spoelvormige, fibroblastachtige morfologie en een vertraging van de proliferatiesnelheid. Deze fenotypische verandering wordt duidelijker na passage 4. Tegen passage 6 neemt de overgrote meerderheid van de cellen een langwerpige, fibroblastachtige vorm aan. De antilichaamverdunningen werden bepaald op basis van de aanbeveling van de fabrikant en gevalideerd door onze voorlopige experimenten om een optimale specificiteit en signaalintensiteit te garanderen.

  1. Zaad chondrocyten in een plaat met 24 putjes en kweek gedurende 24 uur om celhechting mogelijk te maken.
  2. Gooi het kweekmedium weg en was de cellen 3 keer met PBS (voeg PBS toe aan elk putje, incubeer gedurende 5 minuten en aspireer dan).
  3. Fixeer de cellen met 4% paraformaldehyde gedurende 10 minuten en was vervolgens 3 keer met PBS.
  4. Permeabiliseer de cellen met 0,3% Triton X-100 (bereid in PBS) gedurende 10 minuten.
  5. Was de cellen 3 keer met PBS en blokkeer vervolgens met diervrije blokkeeroplossing (150 μL/putje, verdund 5× in PBS) bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
  6. Verwijder de blokkeeroplossing en incubeer een nacht bij 4 °C met primair antilichaam (anti-Col II, verdunning 1:200).
  7. Haal het primaire antilichaam op en was de cellen 3 keer met PBS.
  8. Voeg Alexa Fluor 488-geconjugeerd anti-konijn IgG secundair antilichaam toe (verdunning 1:50) en incubeer gedurende 1,5 uur in het donker bij 37 °C.
  9. Verwijder het secundaire antilichaam en was de cellen 3 keer met PBS.
  10. Monteren met DAPI-bevattende antifade medium en 10 minuten in het donker drogen.
  11. Bekijk en leg beelden vast met behulp van een omgekeerde fluorescentiemicroscoop.

6. Flowcytometrische analyse van de zuiverheid van chondrocyten

OPMERKING: Chondrocyten worden gekenmerkt door hun vermogen om collageen van type II te synthetiseren en af te scheiden, dat dient als een definitieve marker voor identificatie. De chondrosarcoomcellijn SW1353 vertoont weliswaar enkele chondrocytische kenmerken, maar mist type II collageensecretiecapaciteit en dient dus als de negatieve controle in dit experiment.

  1. Verteer zowel chondrocyten als SW1353-cellen met behulp van EDTA-vrije trypsine.
  2. Neutraliseer de spijsvertering met volledig DMEM-medium en resusinfecteer cellen in PBS.
  3. Incubeer de cellen gedurende 15 minuten met fixatie-/permeabilisatieoplossing en voeg vervolgens 1 ml wasbuffer toe.
  4. Centrifugeer (500 × g, 5 min), gooi het supernatant weg en incubeer met 100 μL anti-type II collageenantilichaam (1:100 verdunning) gedurende 15 minuten beschermd tegen licht, gevolgd door het toevoegen van 1 ml wasbuffer.
  5. Centrifugeer (500 × g, 5 min), gooi het supernatant weg en incubeer met Alexa Fluor 488-geconjugeerd anti-konijn IgG secundair antilichaam gedurende 30 minuten beschermd tegen licht, en voeg vervolgens 1 ml wasbuffer toe.
  6. Centrifugeer (500 × g, 5 min), gooi het supernatant weg, suspendeer elk monster opnieuw in een wasbuffer van 200 μl en analyseer met behulp van flowcytometrie.

7. IL-1β stimulatie van chondrocyten

OPMERKING: De productie van matrixmetalloproteïnasen (MMP's) als reactie op IL-1β-stimulatie is een kenmerkend kenmerk van chondrocyten. Daarom maakt deze studie gebruik van IL-1β-stimulatie om deze fenotypische eigenschap in geïsoleerde chondrocyten te valideren.

  1. Ontsmet chondrocyten uit kweekkolven en suspendeer in volledig DMEM-medium.
  2. Tel de cellen en pas de concentratie aan op 5 × 105 cellen/ml met behulp van volledige DMEM.
  3. Zaad cellen in een plaat met 6 putjes (24 putjes in totaal), met 12 putjes aangeduid als de blanco controlegroep en 12 putjes als de IL-1β-stimulatiegroep.
  4. Incubeer de plaat gedurende 12 uur in een celkweekincubator.
  5. Voeg 10 ng/ml IL-1β toe aan de stimulatiegroep na volledige celadhesie.
  6. Verzamel celkweeksupernatanten na 24 uur voor analyse van de Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA).
  7. Was de cellen twee keer met PBS.
  8. Lyse 6 controleputten en 6 IL-1β-gestimuleerde putten met RIPA-buffer voor daaropvolgende Western blot-analyse.
  9. Extraheer RNA uit 6 controleputjes en 6 IL-1β-gestimuleerde putjes met behulp van TRIzol voor qPCR-analyse.

8. Kwantitatieve Real-Time PCR (qRT-PCR) analyse

OPMERKING: Alle RNA-gerelateerde experimenten werden uitgevoerd met behulp van met DEPC behandelde verbruiksartikelen. In het kort werden de buisjes en tips gedurende 12 uur geweekt in 0,1% DEPC, geautoclaveerd (121 °C, 20 min) om zowel RNases als resterende DEPC te inactiveren, en voor gebruik in de oven gedroogd.

  1. Voeg 1 ml Trizol toe aan de celpellet en homogeniseer met een homogenisator. Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
  2. Voeg 0,2 ml chloroform toe en draai krachtig gedurende 30 s. Incubeer gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur.
  3. Centrifugeren bij 4 °C 12.000 × g gedurende 15 min. Breng de kleurloze waterige fase over naar een nieuwe microcentrifugebuis en voeg een gelijk volume isopropanol toe.
  4. Meng goed en incubeer 10 minuten bij kamertemperatuur. Centrifugeer bij 4 °C 12.000 × g gedurende 10 min. Gooi het bovenstaande weg en bewaar de RNA-pellet.
  5. Voeg 1 ml voorgekoelde 75% ethanol toe aan de RNA-pellet. Vortex grondig en centrifugeer bij 4 °C, 12.000 × g gedurende 5 min. Gooi het bovenstaande weg en bewaar de RNA-pellet.
  6. Droog de RNA-pellet aan de lucht in een bioveiligheidskast. Los het RNA op in 20 μL RNasevrij water.
  7. Meet de RNA-concentratie en -kwaliteit met behulp van een Nanodrop-spectrofotometer.
  8. Reverse transcriptie van het totale RNA in cDNA met behulp van een reverse transcriptiekit.
  9. Bereid het reactiemengsel voor met 1 μg totaal RNA, 4 μl magnesiumchlorideoplossing, 2 μl dNTP-mengsel, 0,5 μl RNaseremmer, 0,6 μl AMV reverse transcriptase, 1 μl willekeurige primers en RNasevrij water om het uiteindelijke volume aan te passen aan 20 μl.
  10. Incubeer de reactie gedurende 15 minuten bij 42 °C, gevolgd door 95 °C gedurende 5 minuten. Koel gedurende 5 minuten af tot 4 °C en verdun het cDNA vervolgens met RNasevrij water.
  11. Bereid het PCR-reactiemengsel met 2 μl cDNA, 10 μl SYBR Green Real-time PCR Master Mix, voorwaartse en achterwaartse primers (tabel 1) met een eindconcentratie van elk 0,2 μmol/l en RNasevrij water tot een eindvolume van 20 μl.
  12. Stel de PCR-omstandigheden als volgt in: pre-denaturatie bij 95 °C gedurende 1 minuut, gevolgd door 40 cycli van 95 °C gedurende 15 s, 60 °C gedurende 15 s en 72 °C gedurende 45 s. Verzamel fluorescentiegegevens tijdens de verlengingsstap van 72 °C.
  13. Noteer na de reactie de CT-waarden voor elk monster en de interne referentie. Bereken de relatieve expressieniveaus van doelgenen met behulp van de 2-ΔΔCT-methode.

9. ELISA-bepaling

OPMERKING: Bereid gebiotinyleerde antilichaamwerkoplossing en enzymgeconjugeerde werkoplossing vers voor gebruik.

  1. Haal de ELISA-kit 30 minuten van tevoren uit de koelkast en laat deze op kamertemperatuur komen.
  2. Bereid alle benodigde oplossingen voor volgens de instructies van de kit.
  3. Voeg 100 μl monsters of standaardoplossingen (met verschillende concentraties) toe aan de aangewezen putjes (nulputjes bevatten alleen standaard/monsterverdunningsbuffer). Sluit de plaat af met plakfolie en incubeer gedurende 90 minuten bij 37 °C (exclusief lege controleputjes).
  4. Gooi de vloeistof weg en was elk putje met 350 μL wasbuffer. Incubeer gedurende 30 s, gooi de vloeistof weg en dep droog op dik absorberend papier. Herhaal de was 4 keer.
  5. Voeg 100 μL gebiotinyleerde antilichaamwerkoplossing toe aan elk putje. Sluit de plaat af en incubeer gedurende 60 minuten bij 37 °C (exclusief lege controleputjes).
  6. Gooi de vloeistof weg en was elk putje 4 keer zoals beschreven in stap 4.
  7. Voeg 100 μL enzymgeconjugeerde werkoplossing toe aan elk putje. Sluit de plaat af en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 °C (exclusief lege controleputjes).
  8. Gooi de vloeistof weg en was elk putje 4 keer zoals beschreven in stap 4.
  9. Voeg 100 μL substraatoplossing toe aan elk putje. Beschermen tegen licht en 15 minuten incuberen bij 37 °C.
  10. Voeg 100 μL stopoplossing toe aan elk putje, meng grondig en meet onmiddellijk de optische dichtheid (OD) bij 450 nm.
  11. Genereer een standaardcurve met behulp van CurveExpert-software en bereken de monsterconcentraties.

10. Analyse van de westerse vlek

OPMERKING: Bereid voorafgaand aan het experiment elektroforesebuffer, overdrachtsbuffer, TBST, 5% magere melk voor en snijd het PVDF-membraan van tevoren op de juiste maat. Leg vervolgens de chemiluminescente signalen vast met behulp van een chemiluminescentiebeeldvormingssysteem. Stel het instrument in op de automatische of handmatige modus voor gradiëntbelichting, die doorgaans varieert van 10 s tot 5 minuten, om ervoor te zorgen dat signalen worden vastgelegd binnen het lineaire dynamische bereik en om pixelverzadiging te voorkomen. Selecteer na het vastleggen van het signaal het belichtingsbeeld waarbij de doelbanden duidelijk zijn en de achtergrond laag is voor daaropvolgende kwantitatieve analyse.

  1. Bereid de RIPA lysisbuffer voor (met 1% PMSF en 1% fosfataseremmer) en voeg de RIPA lysisbuffer toe in een verhouding van 250 μL per putje van een plaat met 6 putjes.
  2. Lyseer de cellen met behulp van een ultrasone verstoorder (3 cycli van elk 7-10 s) en broed ze 30 minuten op ijs.
  3. Centrifugeer het lysaat gedurende 10 minuten bij 4 °C, 12.000 × g en verzamel vervolgens het bovenstaande voor het kwantificeren van het eiwit.
  4. Bepaal de eiwitconcentratie met behulp van de bicinchoninezuur (BCA)-test.
  5. Pas de eiwitconcentraties aan op hetzelfde niveau met behulp van de RIPA lysisbuffer.
  6. Voeg 5× laadbuffer toe aan monsters in een verhouding van 4:1 (voorbeeld: buffer).
  7. Kook de monsters gedurende 10 minuten, centrifugeer vervolgens 12.000 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C en verzamel het bovenstaande voor elektroforese.
  8. Monteer de SDS-PAGE-gel in de elektroforesekamer en vul deze met elektroforesebuffer totdat de kam is ondergedompeld.
  9. Verwijder de kam, laad monsters in putjes en voeg de eiwitladder toe aan referentiebanen.
  10. Voer elektroforese uit totdat de broomfenolblauwe kleurstof de bodem van de gel bereikt, demonteer vervolgens het apparaat en haal de gel op.
  11. Zet de "sandwich" van de overdracht in elkaar en voer de natte overdracht uit met een constante spanning.
  12. Blokkeer het PVDF-membraan met 5% magere melk in TBST gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
  13. Incubeer met verdund primair antilichaam een nacht bij 4 °C.
  14. Herstel het primaire antilichaam en was het membraan met TBST (5 × 5 min).
  15. Incubeer met HRP-geconjugeerd secundair antilichaam gedurende 90 minuten bij kamertemperatuur.
  16. Herstel het secundaire antilichaam en was het membraan met TBST (5 × 5 min).
  17. Bereid ECL-substraatoplossing voor en bewaar deze beschermd tegen licht.
  18. Breng het ECL-substraat aan op het membraan en vang chemiluminescente signalen op met behulp van een beeldvormingssysteem met gradiëntbelichting.
  19. Analyseer bandintensiteiten met behulp van ImageJ-software en bereken relatieve eiwitexpressieniveaus voor verdere analyse.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Immunofluorescentiekleuring voor collageen type II toonde aan dat de geïsoleerde chondrocyten sterk positief waren (Figuur 1A). Flowcytometrische analyse toonde verder aan dat meer dan 98% van de cellen positief was voor type II collageen (Figuur 1B), terwijl de negatieve controle SW1353-cellen negatief waren (Figuur 1C). Na stimulatie met 10 ng/ml IL-1β gedurende 24 uur toonde Western blotting een duidelijke verhoging van de MMP3- ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het hier beschreven protocol biedt verschillende belangrijke voordelen voor de isolatie en kweek van primaire articulaire chondrocyten van ratten. Het gebruik van zogende ratten is van cruciaal belang voor het bereiken van een optimale celopbrengst en levensvatbaarheid, aangezien kraakbeen van jonge dieren meer proliferatieve chondrocyten en minder gemineraliseerde matrix bevat in vergelijking met volwassen kraakbeen. Deze leeftijdsselectie verbetert de efficiëntie van de enzymatische ve...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs melden geen belangenconflicten in dit werk.

Dankbetuigingen

Deze studie werd ondersteund door de National High-Level Hospital Clinical Research Funding en het Elite Medical Professionals Initiative van het China-Japan Friendship Hospital (NO. ZRJY2025-QM05).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
4% ParaformaldehydeSolarbioP1110
5× Loading BufferSolarbioP1040
Alexa Fluor 488-geconjugeerd anti-konijn IgGZhongshan Jingqiao BiotechnologyZF-0511
Diervrij blokkeringsoplossingCell Signaling Technology15019
Anti-collageen II-antilichaamAbcamab34712
Bicinchoninic Zuur (BCA) Eiwit Assay KitSolarbioPC0020
Collageenase IIYeasen Biotechnology40508ES60
DAPI-bevattende fluorescerende montagemediumZhongshan Jingqiao BiotechnologyZLI-9556
Dulbecco's Gemodificeerd Eagle MediumSolarbio11995
Foetaal bovien serum (FBS)SolarbioS9010
Horseradish Peroxidase (HRP)-geconjugeerd Geit Anti-Konijn IgGZhongshan Jingqiao BiotechnologyZB-2301
IL-1βpeprotech400-01B
MMP13 Konijn mAbABclonalA11148
MMP3 Konijn mAbABclonalA11418
Vetvrij droge melkSolarbioD3840
Fosfaat Buffered Saline (PBS)SolarbioP1020
PVDF MembraanThermo Fisher Scientific88518
Rat MMP-13 ELISA KitNouvsNBP3-06931
Rat MMP-3 ELISA KitNouvsNBP3-06894
Omgekeerde Transcriptie KitPromegaA3500
RIPA Lysis BufferSolarbioR0010
RNase-vrij WaterSolarbioR1600
SDS-PAGE GelEpizymePG112
SYBR Green Real-time PCR Master MixToyoboQPK-201
Triton X-100SolarbioT8200
TRIzolSolarbio15596026
TrypsineSolarbioT1320
Ultragevoelige ECL Chemiluminescence Substraat KitNCM BiotechP10300
β-Actine Konijn mAbABclonalAC026

Referenties

  1. Min, Q., et al. Strong and elastic chitosan/silk fibroin hydrogels incorporated with growth-factor-loaded microspheres for cartilage tissue engineering. Biomimetics (Basel). 7 (2), 41(2022).
  2. Kloppenburg, M., Namane, M., Cicuttini, F. Osteoarthritis. Lancet. 405 (10472), 71-85 (2025).
  3. Barisón, M. J., et al. Functionalized hydrogels for cartilage repair: The value of secretome-instructive signaling. Int J Mol Sci. 23 (11), 6010(2022).
  4. Han, Y., et al. High-precision, gelatin-based, hybrid, bilayer scaffolds using melt electro-writing to repair cartilage injury. Bioact Mater. 6 (7), 2173-2186 (2021).
  5. Molnar, V., et al. Cytokines and chemokines involved in osteoarthritis pathogenesis. Int J Mol Sci. 22 (17), 9208(2021).
  6. Zhang, H., et al. Mechanical overloading promotes chondrocyte senescence and osteoarthritis development through downregulating FBXW7. Ann Rheum Dis. 81 (5), 676-686 (2022).
  7. Ouyang, Z., et al. Cartilage-related collagens in osteoarthritis and rheumatoid arthritis: From pathogenesis to therapeutics. Int J Mol Sci. 24 (12), 9841(2023).
  8. Mueller, A. L., et al. Recent advances in understanding the pathogenesis of rheumatoid arthritis: new treatment strategies. Cells. 10 (11), 3017(2021).
  9. Cao, F., et al. Trends and cross-country inequalities in the global burden of osteoarthritis, 1990-2019: A population-based study. Ageing Res Rev. 99, 102382(2024).
  10. Wu, X., Fan, X., Crawford, R., Xiao, Y., Prasadam, I. The metabolic landscape in osteoarthritis. Aging Dis. 13 (4), 1166-1182 (2022).
  11. Deng, H., et al. Altered expression of the Hedgehog pathway proteins BMP2, BMP4, SHH, and IHH involved in knee cartilage damage of patients with osteoarthritis and Kashin-Beck disease. Cartilage. 13 (1), 19476035221087706(2022).
  12. Hui, L., et al. Effects of androgen receptor overexpression on chondrogenic ability of rabbit articular chondrocytes. Tissue Eng Regen Med. 18 (4), 641-650 (2021).
  13. Drevet, S., Favier, B., Lardy, B., Gavazzi, G., Brun, E. New imaging tools for mouse models of osteoarthritis. Geroscience. 44 (2), 639-650 (2022).
  14. Wu, S., Guo, W., Li, R., Zhang, X., Qu, W. Progress of platelet derivatives for cartilage tissue engineering. Front Bioeng Biotechnol. 10, 907356(2022).
  15. Zhang, Y., et al. DL-3-N-butylphthalide promotes cartilage extracellular matrix synthesis and inhibits osteoarthritis development by regulating FoxO3a. Oxid Med Cell Longev. 2022, 9468040(2022).
  16. Krych, A. J., Saris, D. B. F., Stuart, M. J., Hacken, B. Cartilage injury in the knee: assessment and treatment options. J Am Acad Orthop Surg. 28 (22), 914-922 (2020).
  17. Muthu, S., et al. Failure of cartilage regeneration: emerging hypotheses and related therapeutic strategies. Nat Rev Rheumatol. 19 (7), 403-416 (2023).
  18. Morici, L., Allémann, E., Rodríguez-Nogales, C., Jordan, O. Cartilage-targeted drug nanocarriers for osteoarthritis therapy. Int J Pharm. 666, 124843(2024).
  19. Urlić, I., Ivković, A. Cell sources for cartilage repair-biological and clinical perspective. Cells. 10 (9), 2496(2021).
  20. Chen, G. Y., et al. Integrating network pharmacology and experimental validation to explore the key mechanism of Gubitong recipein the treatment of osteoarthritis. Comput Math Methods Med. 2022, 7858925(2022).
  21. Bai, L., et al. Engineering bone/cartilage organoids: Strategy, progress, and application. Bone Res. 12 (1), 66(2024).
  22. Dönges, L., et al. Engineered human osteoarthritic cartilage organoids. Biomaterials. 308, 122549(2024).
  23. Chen, G. Y., et al. Total flavonoids of Rhizoma Drynariae treat osteoarthritis by inhibiting arachidonic acid metabolites through AMPK/NFκB pathway. J Inflamm Res. 16, 4123-4140 (2023).
  24. Barisón, M. J., et al. Functionalized hydrogels for cartilage repair: the value of secretome-instructive signaling. Int J Mol Sci. 23 (11), 6010(2022).
  25. Yu, L., et al. Hyaline cartilage differentiation of fibroblasts in regeneration and regenerative medicine. Development. 149 (2), dev200249(2022).
  26. Gebauer, M., et al. Comparison of the chondrosarcoma cell line SW1353 with primary human adult articular chondrocytes with regard to their gene expression profile and reactivity to IL-1β. Osteoarthritis Cartilage. 13 (8), 697-708 (2005).
  27. Yan, W., et al. Chondrocyte-targeted delivery system of Sortase A-engineered extracellular vesicles silencing MMP13 for osteoarthritis therapy. Adv Healthc Mater. 13 (16), e2303510(2024).
  28. Goldring, M. B. Chondrogenesis, chondrocyte differentiation, and articular cartilage metabolism in health and osteoarthritis. Ther Adv Musculoskelet Dis. 4 (4), 269-285 (2012).
  29. Chen, G. Y., et al. Network pharmacology analysis and experimental validation to investigate the mechanism of total flavonoids of Rhizoma Drynariae in treating rheumatoid arthritis. Drug Des Devel Ther. 16, 1743-1766 (2022).
  30. Chen, G. Y., et al. Total flavonoids of Rhizoma Drynariae treat osteoarthritis by inhibiting arachidonic acid metabolites through AMPK/NFκB pathway. J Inflamm Res. 16, 4123-4140 (2023).
  31. Dou, Y., Fang, Y., Zhao, C., Fu, W., Jiang, D. Editorial: Bioengineering and translational research for bone and joint diseases. Front Bioeng Biotechnol. 10, 969416(2022).
  32. Ye, K., et al. Bioengineering of articular cartilage: Past, present and future. Regen Med. 8 (3), 333-349 (2013).
  33. Chen, P., et al. Desktop-stereolithography 3D printing of a radially oriented extracellular matrix/mesenchymal stem cell exosome bioink for osteochondral defect regeneration. Theranostics. 9 (9), 2439-2459 (2019).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Isolatie van chondrocytenkweek van chondrocytenkniekraakbeen van rattenenzymatische digestiecollagenase type IIflowcytometrietype II collageenimmunofluorescentie assay
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.