Method Article

Een modulaire workflow voor kwantitatieve, structurele en functionele analyse van leptospira-biofilms

DOI:

10.3791/69511

⸱

December 19th, 2025

 , 
1Institut Pasteur de Nouvelle-Calédonie, Leptospirosis Research and Expertise Unit, Institut Pasteur International Network

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol levert een modulaire BSL-2 workflow die kristal-violet biomassa-assays, time-lapse fase-contrast kinetiek, confocale 3D/matrix mapping, SEM-ultrastructuur en een in vivo hamsterinfectiemodule combineert om de functionele rol van Leptospira biofilm te cultiveren, kwantificeren, karakteriseren en onderzoeken, waardoor gestandaardiseerde evaluatie van mutanten en anti-biofilminterventies in laboratoria mogelijk is.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we een geïntegreerde reeks protocollen voor de kweek, kwantitatieve monitoring, structurele en functionele karakterisering van Leptospira spp. biofilms in de loop van de tijd. Deze workflow combineert kristalviolet microtiterassays om biofilmbiomassa op meerdere tijdstippen te meten, met een tijdsresolutie fractioneringsbenadering die gehechte (biofilm) en niet-gehechte (vloeistoffase) bacteriële populaties onderscheidt, time-lapse fasecontrastbeeldvorming voor niet-destructieve kinetische observatie, confocale laserscanningmicroscopie om volledige 3D-reconstructies te genereren met matrixprobe-uitlezingen, en membraanondersteunde scanning elektronenmicroscopie voor ultrastructurele analyse. Parallel beschrijven we een gestandaardiseerde procedure voor het oogsten van intacte biofilmaggregaten en het voorbereiden ervan op intraperitoneale injectie in het vatbare gouden Syrische hamstermodel, waardoor directe beoordeling van biofilm-geassocieerde virulentie in vivo mogelijk is, samen met gematchte planktonische controles.

Geoptimaliseerd voor de pathogene stam Leptospira interrogans Manilae L495, is elke module gemakkelijk overdraagbaar naar andere Leptospira-soorten en mutantenbibliotheken om de biofilmvormende capaciteit te vergelijken. Samen vormen deze gecoördineerde modules een robuuste basis voor het screenen van antibiofilmstrategieën, het onderzoeken van genetische determinanten en het verduidelijken van de bijdrage van biofilms aan de persistentie en pathogenese van Leptospira .

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biofilms zijn gestructureerde microbiële gemeenschappen waarin cellen zijn ingebed in een zelfafscheidende extracellulaire polymere stof (EPS) matrix die bestaat uit polysachariden, eiwitten, nucleïnezuren en lipiden1. Deze matrix zorgt voor mechanische stabiliteit, bemiddelt adhesie aan oppervlakken en verbetert de overleving van microbiële stoffen door tolerantie te bieden voor omgevingsbelastingen zoals uitdroging, oxidatieve stress en antimicrobiële middelen 2,3. In pathogene bacteriën faciliteren biofilms persistentie, immuunontwijking en chronische infecties 4,5.

In vergelijking met planktonische cellen, die vrij zwevend en metabolisch homogener zijn, vertonen biofilm-geassocieerde cellen veranderde genexpressie, groeisnelheden en metabole activiteit6. Deze verschillen zorgen voor een verhoogde tolerantie voor omgevingsuitdagingen, antibiotica en verdediging van de gastheer, terwijl gecoördineerd gedrag mogelijk is zoals quorumdetectie, nutriëntenretentie en ruimtelijke organisatie 7,8.

Biofilmvorming is uitgebreid gekarakteriseerd in modelorganismen zoals Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus en Vibrio cholerae, die samen ons begrip van de genetische, structurele en fysiologische basis van de biofilmlevensstijl hebben gevormd. Studies op Pseudomonas hebben aangetoond dat exopolysacchariden en quorumsensing samenwerken om complexe driedimensionale biofilmarchitecturen vorm te geven 9,10. Onderzoek naar Staphylococcus heeft de rol van oppervlakte-eiwitten en extracellulair DNA benadrukt bij het verbeteren van biofilmcohesie en antibioticatolerantie11,12. Onderzoeken naar Vibrio-soorten benadrukten verder de opmerkelijke diversiteit van biofilmmorfologieën en hun ecologische betekenis in aquatische omgevingen¹³. Gezamenlijk hebben deze systemen een robuust conceptueel en methodologisch kader voor biofilmonderzoek geboden, versterkt door gestandaardiseerde protocollen14 en kritische evaluaties van bestaande technieken15,16, die samen de noodzaak van geharmoniseerde benaderingen benadrukken bij het onderzoeken van biofilmvorming in minder bestudeerde bacteriën zoals Leptospira.

Leden van het spirochetengeslacht Leptospira, de oorzakers van leptospirose, werden lange tijd verondersteld voornamelijk planktonisch te zijn. Recente studies hebben experimenteel robuuste biofilmvorming aangetoond over meerdere soorten17. Hoewel sommige studies biofilmvorming suggereren inomgevings-18- en gastheer-geassocieerde19-contexten, hebben andere experimenteel aangetoond dat leptospitsen biofilm kunnen vormen in de niertubuli van Rattus norvegicus20 en het glasvocht van paarden21, evenals het detecteren van leptospiraalsoorten binnen milieubiofilms22,23. Het ontcijferen van de omstandigheden en mechanismen die Leptospira-biofilms aansturen is daarom cruciaal voor het begrijpen van omgevingsoverdracht, reservoirpersistentie en ziektepathogenese24,25.

Bestaande Leptospira-biofilm-assays zijn gefragmenteerd en variëren van kwalitatieve microscopische waarnemingen17,26 tot eindkleurige colorimetrische of kristalviolette kleuringen27,28. Hoewel deze studies waardevolle inzichten hebben opgeleverd in biofilmvorming, missen ze vaak zowel de kinetische resolutie die nodig is om de rijping en verspreiding van biofilm in real time te monitoren als de ultrastructurele context die door confocale of elektronenmicroscopie wordt geboden. Continue monitoring en 3D-structurele analyse worden als essentieel beschouwd om het dynamische karakter van biofilmvorming en verspreiding vast te leggen 14,15. Deze beperkingen belemmeren de vergelijkbaarheid tussen studies en beperken de systematische evaluatie van factoren of interventies die de vorming en verspreiding van biofilms beïnvloeden, wat de noodzaak benadrukt van een gestandaardiseerde, multi-readout workflow die zowel de structurele als functionele dynamiek van Leptospir-biofilmsop een reproduceerbare en uitgebreide manier vastlegt.

Om deze hiaten te dichten, hebben we een geïntegreerde, modulaire workflow ontwikkeld die zes complementaire uitlezingen uit dezelfde cultuurserie samenvoegt. Ten eerste kwantificeert een high-throughput CV-microtiterassay vastzittende biomassa op meerdere tijdstippen. Ten tweede een tijdsopgeloste fractionatietest in 96-put platenverdelingen totale, vloeibare fase (niet-gehecht of gedeeltelijk losgekoppeld) en gehechte (biofilm) populaties door OD₄₀₅ om hun evolutie tijdens vorming en verspreiding te volgen. De term vloeistoffase wordt hier gebruikt om zowel planktonisch-achtige als losgekoppelde cellen te omvatten, waarbij het dynamische continuüm tussen vrijlevende en oppervlakgeassocieerde fenotypes29,30 wordt erkend. Ten derde biedt time-lapse fasecontrastbeeldvorming niet-destructieve kinetiek van adhesie, aggregate motiliteit en coalescentie. Ten vierde levert confocale laserscanning microscopie (CLSM) volledige 3D-reconstructies op met levende/dode en matrixprobe-uitlezingen, waardoor diepte-afhankelijke levensvatbaarheid en matrixmapping mogelijk zijn. Ten vijfde lost membraan- of coverslip-ondersteunde scanning-elektronenmicroscopie (SEM) de extracellulaire architectuur en basaal-apikale polariteit op bij hoge resolutie. Daarnaast werd een in vivo module geïntegreerd om virulentie te evalueren met intraperitoneale injectie van biofilmaggregaten in het vatbare gouden Syrische hamstermodel, een gevoelig en goed gevestigd model voor leptospirose 31,32,33. Deze benadering koppelt biofilmfenotypes aan pathogene potentieel, wat functionele context biedt die in vitro-analyses aanvult.

In vergelijking met single-modality benaderingen biedt dit platform verschillende voordelen: (i) gesynchroniseerde kwantitatieve (CV en gefractioneerde OD) en structurele (CLSM/SEM) uitlezingen; (ii) niet-destructieve kinetische monitoring van vroege adhesie, groei, rijping en verspreiding; (iii) 3D-levensvatbaarheid en matrixkarakterisering met behulp van gerichte probes; (iv) ultrastructurele visualisatie van de extracellulaire matrixarchitectuur; en (v) directe functionele beoordeling van biofilm-geassocieerde versus planktonische virulentie in een vatbaar hamstermodel, elk haalbaar met standaard BSL-2 infrastructuur. Door gebruik te maken van multi-well formaten en verwijderbare glas- of polycarbonaatsubstraten, ondersteunt de workflow replicatiescreens van omgevingsvariabelen, antimicrobiële verbindingen of mutante bibliotheken, terwijl steriliteit, doorvoer en kruisvalidatie tussen modules behouden blijven.

Laboratoria die zich richten op ecologie, persistentie, gastheer-pathogeen interacties of antibiofilmontdekking kunnen individuele modules of de volledige pijplijn adopteren. De benodigde middelen zijn beperkt tot een platenlezer, een omgekeerde microscoop met milieucontrole voor time-lapse, toegang tot een confocale microscoop en SEM-faciliteit, en standaard dierfaciliteiten voor het hamstermodel, waardoor brede adoptie en reproduceerbare vergelijkingen tussen studies mogelijk zijn.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ethische verklaring:
Dit onderzoek werd goedgekeurd door het Animal Care and Use Committee van het Institut Pasteur van Nieuw-Caledonië en uitgevoerd volgens de richtlijnen van het Animal Care and Use Committee van het Institut Pasteur in Parijs, en de Europese Aanbeveling 2007/526/EG. Registratienummer Animal Research Experiment Registration: IPNC-2018-ARE-001

OPMERKING: Alle procedures waarbij levende Leptospira-kweeken worden uitgevoerd, moeten worden uitgevoerd in een laboratorium van biosafety level 2 (BSL-2), in overeenstemming met de institutionele bioveiligheidsrichtlijnen. Alle kweekmanipulaties moeten onder een biologische veiligheidskast worden uitgevoerd om de veiligheid van de gebruiker te waarborgen en milieuverontreiniging te voorkomen.

De Leptospira interrogans serovar Manilae-stam L495 die in deze studie werd gebruikt, werd oorspronkelijk verkregen uit de collectie van het Institut Pasteur (Parijs, Frankrijk) en wordt bewaard bij het Institut Pasteur van Nieuw-Caledonië. Om virulentie te behouden, wordt de stam periodiek opnieuw geïsoleerd van geïnfecteerde hamsters. Voor alle in vitro-experimenten werden de kweeken niet langer dan zes subculturen onderhouden na herstel van de dierlijke gastheer.

Alle dierprocedures moeten worden uitgevoerd in overeenstemming met de institutionele richtlijnen en goedgekeurd door de relevante Animal Care and Use Committees. Experimenten moeten voldoen aan Europese regelgeving over dierenwelzijn (EU-richtlijn 2010/63) en aan de aanbevelingen van de Public Health Service, zodat het gebruik van dieren zowel gerechtvaardigd als ethisch gereguleerd is.

1. Bereiding van het bacteriële inoculum

  1. Kweek Leptospira-spp. -cellen bij 30 °C in EMJH-media34 onder aerobe omstandigheden en zonder schudden in platbodem, schroefdopglazen buizen totdat de kweek de mid-logitmafase bereikt. Onder deze omstandigheden bereikt L. interrogans serovar Manilae stam L495, een laag-doorgang stam die regelmatig in vivo wordt onderhouden via hamsters, doorgaans binnen 3-5 dagen de juiste celdichtheid. Zorg ervoor dat culturen een O.D. van 0,2-0,4 bereiken bij 405 nm (2 tot 5 x 108 cellen/mL) voordat ze verdund worden in verse EMJH-media en verifieer motiliteit en het ontbreken van klontvorming met donkerveldmicroscopie bij 20x vergroting.
    OPMERKING: EMJH heeft intrinsieke absorptie. Zet de spectrofotometer in met steriele EMJH en trek deze waarde af van alle metingen. Het inoculum kan worden gestandaardiseerd door ofwel de optische dichtheid te meten of door directe celtelling met behulp van een Petroff-Hausser-kamer. Een verdunning van 1:100 van een geverifieerde mid-log cultuur levert doorgaans OD405 = 0,02 op (≈ 1 x 106 cellen/mL). Meng zachtjes door inversie; Niet vortexen.
  2. Onderzoek een 10 μL aliquot onder donkerveldmicroscopie met 20x vergroting. Zorg ervoor dat ≥ 90% van de cellen sterk beweeglijk is en dat er geen zichtbare klonten aanwezig zijn. Verdun de geverifieerde mid-log cultuur 1: 100 in verse EMJH om OD405 = 0,02 (≈ 1 x 106 cellen/mL) te verkrijgen. Meng zachtjes door inversie; Niet vortexen.
    OPMERKING: Eén werkend inoculum ondersteunt alle downstream assays die in dit protocol zijn beschreven (Figuur 1). Bereid 36 mL voor om een 24-put plaat (1 mL/put) te zaaien of 20 mL om een 96-well plaat (200 μL/put) te zaaien. Pas de volumes aan zodat ze overeenkomen met het aantal benodigde platen.

figure-protocol-1
Figuur 1. Wereldwijde workflow voor Leptospira-biofilmanalyse . Exponentieel groeiende Leptospira-culturen worden eerst beoordeeld op groei en gestandaardiseerd op optische dichtheid. De culturen worden vervolgens verdeeld in glazen of membraanhoudende platen, microscopie-microschalen of 96-wellplaten. De workflow omvat zeven modules: (1) inoculumvoorbereiding; (2) kristalvioletkleuring voor biomassakwantificatie; (3) ultrastructurele beeldvorming door SEM; (4) dynamische biofilmmonitoring met time-lapse fasecontrastmicroscopie; (5) 3D-visualisatie door CLSM met levende/dode kleuring; (6) tijdsopgeloste kwantificering van gehechte en niet-gehechte fracties tijdens biofilmvorming via optische dichtheid; en (7) onderzoek naar de functionele rol van de biofilm tijdens infectie bij Syrische hamsters. Deze geïntegreerde benadering maakt multimodale analyse van biofilmontwikkeling, structuur en pathogeniciteit mogelijk. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

2. Kristalviolet - Kwantificering van biofilms op coverslips of membranen

  1. Binnen een BSL2 bioveiligheidskap gebruik je steriele tangen om één 12 mm steriele glazen deklaag of een 0,1 μm steriel hydrofiel polycarbonaatmembraan plat op de bodem van elke put te leggen in een steriele 24-put plaat met deksel. Week het membraan/glazen deklaag 2 uur vooraf bij 30 °C met 1 mL steriele EMJH.
    OPMERKING: Hoewel niet essentieel, verbetert het vooraf weken van het substraat in EMJH het natmaken en verbetert het de bacteriële adhesie licht.
  2. Verwijder de weekoplossing en voeg 1,5 mL van de verdunde bacteriële suspensie (OD405 = 0,02 ≈ 1 x 106 cellen /mL) toe aan elke put. Zorg ervoor dat de coverslip of het membraan stevig onderaan blijft zitten.
  3. Incubeer de plaat bij 30 °C onder statische omstandigheden in een vochtige atmosfeer, waarbij je een met water gevulde bak in de broedmachine plaatst om verdamping van het kweekmedium te voorkomen. Voor langzaam groeiende stammen wordt een incubatie van 3 weken aanbevolen om de vorming van een volwassen, hechtende biofilm mogelijk te maken.
  4. Verwijder op het gewenste tijdstip zorgvuldig zoveel mogelijk kweekmedium uit elke put zonder de biofilm te verstoren. Spoel elke put voorzichtig af met 1 ml steriele fosfaatgebuffte zoutoplossing (PBS) om resterende niet-hechtende cellen te verwijderen, waarbij de deklaag plat tegen de bodem van de put blijft om te voorkomen dat fragiele biofilmcellen loskomen. Onder deze omstandigheden vindt biofilmgroei voornamelijk plaats aan het bovenoppervlak van de coverslip, met minimale groei aan de onderzijde, dus spoelen zonder lifting is voldoende om aan het oppervlak gehechte cellen te verrijken voor downstream analyses.
    OPMERKING: Biofilms zijn in dit stadium extreem kwetsbaar en kunnen gemakkelijk per ongeluk worden aspireerd. Pipetten moet langzaam en precies langs de wand van de put worden uitgevoerd om te voorkomen dat de biofilm wordt verstoord.
  5. Fixeer biofilmmonsters door 1 mL 4% paraformaldehyde (PFA) toe te voegen in PBS bij 37 °C gedurende 30 minuten. Verwijder het fixatiemiddel en spoel zorgvuldig twee keer af met 1 ml PBS.
    OPMERKING: Voor fixatie werd een formaldehydeoplossing van 4% vers bereid (16% methanolvrije voorraad verdund 1:4 in PBS) en na gebruik weggegooid, omdat polymerisatie tot paraformaldehyde de crosslinking-activiteit vermindert.
  6. Voeg 1 mL 0,1% (w/v) Crystal Violet (CV) oplossing toe aan elke put en incubeer 15 minuten bij kamertemperatuur, zodat het membraan of de coverslip volledig wordt afgedekt.
  7. Gooi de verf weg en spoel twee keer af met 1 mL PBS.
    OPMERKING: Kristalviolet en paraformaldehyde (PFA) zijn giftig en kunnen de huid en ogen irriteren. Draag altijd handschoenen en ga voorzichtig met beide chemicaliën om, bij voorkeur in een dampkap. Verwijder afval in aangewezen containers voor gevaarlijke kleurstoffen of chemisch afval volgens de institutionele veiligheidsrichtlijnen.
  8. Kantel de plaat en laat de restvloeistof aflopen. Laat de putten aan de lucht drogen op kamertemperatuur totdat het substraat volledig droog lijkt (≥ 4 uur, bij voorkeur 's nachts).
    OPMERKING: In dit stadium kunnen stippevormige of netvormige structuren zichtbaar zijn op het dekkings- of membraanoppervlak (Figuur 2A).
  9. Voeg 500 μL elusjonsbuffer (50% ethanol, 50% glaciale azijnzuur (vol/vol)) toe aan elke put. Bred de plaat 15 minuten uit. Pipetteer op en neer om het kristalviolet dat aan de biofilm is gebonden volledig op te lossen.
  10. Plaats 200 μL van elk monster in een optisch heldere 96-wells microplaat en meet de absorptie bij 570 nm. Trek een substraat-only blank af, bereid door een niet-geïnëntificeerde coverslip of membraan te verwerken via fixatie, CV-kleuring, washes en eluation om intrinsieke binding/achtergrond te verwijderen. Noteer het gemiddelde ± standaarddeviatie voor ten minste drie technische replica's. Verdun monsters met eluatiebuffer als de absorptie het lineaire bereik van de spectrofotometer overschrijdt.

3. Biofilmvisualisatie met behulp van Scanning Electron Microscopy (SEM)

  1. Binnen een BSL2 bioveiligheidskap gebruik je steriele tangen om één 12 mm steriele glazen deklaag of een 0,1 μm steriel hydrofiel polycarbonaatmembraan plat op de bodem van elke put te leggen in een steriele 24-put plaat met deksel. Week het membraan/glazen deklaag 2 uur vooraf bij 30 °C met 1 mL steriele EMJH.
  2. Verwijder de weekoplossing en voeg 1,5 mL van de verdunde bacteriële suspensie (OD405 = 0,02 ≈ 1 x 106 cellen /mL) toe aan elke put. Zorg ervoor dat de coverslip of het membraan stevig onderaan blijft zitten.
  3. Incubeer de plaat bij 30 °C onder statische omstandigheden in een vochtigheidsincubator om verdamping van het kweekmedium te voorkomen. Voor langzaam groeiende stammen wordt een incubatie van 3 weken aanbevolen om de vorming van een volwassen, hechtende biofilm mogelijk te maken
  4. Verwijder op het gewenste tijdstip zorgvuldig zoveel mogelijk kweekmedium uit elke put zonder de biofilm te verstoren.
  5. Spoel vervolgens elke put voorzichtig af met 1 ml steriele PBS om resterende niet-hechtende cellen te verwijderen, waarbij de deklaag plat tegen de bodem van de put blijft om te voorkomen dat fragiele biofilmcellen loskomen. Onder deze omstandigheden vindt biofilmgroei voornamelijk plaats aan het bovenoppervlak van de coverslip, met minimale groei aan de onderzijde, dus spoelen zonder lifting is voldoende om aan het oppervlak gehechte cellen te verrijken voor downstream analyses.
    OPMERKING: Biofilms zijn in dit stadium extreem kwetsbaar en kunnen gemakkelijk per ongeluk worden aspireerd. Pipetten moet langzaam en precies langs de wand van de put worden uitgevoerd om te voorkomen dat de biofilm wordt verstoord.
  6. Voeg een oplossing van 4% paraformaldehyde (PFA) en 1% glutaraldehyde toe in een natriumcacodylaatbuffer (0,2 M, pH 7,4) direct in de put om de biofilm te fixeren.
  7. Incubeer 30 minuten bij 37 °C, verwijder dan het fixatiemiddel en spoel het deklaag of membraan twee keer af met PBS. Deze aanpak behoudt de aan het oppervlak vastgehechte biofilm terwijl loslating wordt geminimaliseerd, aangezien de meeste biofilmgroei onder onze omstandigheden plaatsvindt aan het bovenoppervlak van de dekking.
    OPMERKING: Voor fixatie werd een oplossing van 4% formaldehyde en 1% glutaraldehyde vers bereid (16% methanolvrije voorraad verdund 1:4 in natriumcacodylaatbuffer) en na gebruik weggegooid, omdat polymerisatie tot paraformaldehyde de crosslinkingactiviteit vermindert.
  8. Dompel het substraat onder in 1% osmiumtetroxide (OsO₄) verdund in PBS gedurende 1 uur om het SEM-contrast te verbeteren. Spoel twee keer met PBS.
  9. Dehydrateer de monsters door ze achtereenvolgens onder te dompelen in gegradueerde ethanolseries met toenemende concentratie: 25%, 50%, 70%, 90% en 100% (v/v), elk gedurende 10 minuten.
  10. Voeg 500 μL hexamethyldisilazaan toe en incubeer 5 minuten, vervang dan door verse HMDS en incubeer nog eens 5 minuten. Verwijder overtollige HMDS en laat het monster volledig aan de lucht drogen onder de afzuigkap.
    OPMERKING: Glutaraldehyde, PFA, natriumcacodylaat, osmiumtetroxide en hexamethyldisilazaan zijn giftig en moeten onder een chemische dampkap met passende persoonlijke beschermingsmiddelen worden behandeld.
  11. Bevestig de gedroogde monsters op SEM-stompjes met dubbelzijdig geleidend koolstofband. Sputter-coat de monsters met een dunne laag (~10 nm) goud of platina, zodat voldoende elektronencontrast wordt geboden voor SEM-beeldvorming. Dit maakt een hoge resolutie visualisatie van biofilmarchitectuur mogelijk, inclusief cel-celcontacten, extracellulaire matrixmorfologie, dichtheid en heterogeniteit, zonder de noodzaak van extra kleurstoffen of kleuringen.
  12. Laad de stubs in de SEM met de juiste monsterhouder. Ontruim de kamer 's nachts, waar mogelijk, om de beeldkwaliteit te verbeteren, en neem vervolgens secundaire elektronbeelden op 5 - 15 kV en geschikte vergrotingen om de ultrastructuur van de biofilm te onthullen (Figuur 2).

4. Time-lapse fasecontrastbeeldvorming van groeiende biofilm

  1. Pipet 500 μL van het werkinoculum (OD405 = 0,02 ≈ 1 x 106 cellen/mL; zie Sectie 1) in een steriele Hi-Q4 schotel met glazen bodem van 35 mm, uitgerust met een vlak-parallel deksel om meniscusvervorming te elimineren. Vermijd het toevoegen van bellen en sluit het gerecht meteen.
    OPMERKING: De Hi-Q4 schotel met glazen bodem van 35 mm bevat 4 verschillende kweekgebieden die gebruikt kunnen worden om gelijktijdig 4 verschillende omstandigheden te fotograferen. Wijs één compartiment toe aan het steriele EMJH-medium als negatieve controle en de drie andere aan technische replicaties of verschillende stammen/mutanten.
  2. Plaats de schotel op het omgevingsniveau van een omgekeerde microscoop met fasecontrastoptiek, een gemotoriseerde focusaandrijving (Biostation IMQ) en een bevochtigde behuizing ingesteld op 30 °C en 95% relatieve luchtvochtigheid. Deze omstandigheden helpen de verdamping tijdens langdurige beeldvorming (tot 8 dagen) te minimaliseren.
  3. Start de BioStation IMQ-applicatie en open in de hoofdinterface het venster Nieuwe Time-lapse Setting om toegang te krijgen tot het configuratiepaneel. Controleer voordat je het experiment start de omgevingsparameters op het Statusdisplay, waarbij je ervoor zorgt dat zowel de Kamer- als de Watertemperatuurindicatoren Stabiel tonen om framedrift tijdens de acquisitie te voorkomen.
  4. Selecteer op het scherm Nieuwe Time-lapse Instellingen het tabblad Live en configureer de beeldparameters in het Observatieconditiepaneel door Fasecontrast (Ph) als filter te kiezen en de Vergroting op 20 X in te stellen.
  5. Stel in de handmatige modus de lichtintensiteit en belichtingstijd aan om het contrast te optimaliseren zonder verzadiging te vermijden. Controleer dit met de Saturation Check-knop . Definieer vier acquisitiepunten die overeenkomen met de centra van de vier compartimenten.
  6. Positioneer het podium sequentieel boven elk compartiment met behulp van de Jog Dial of door direct te klikken binnen het Live Observation Image Display.
  7. Verfijn de focus met de Focusknoppen en registreer elke positie door op de knop Time-lapse Experiment Point Registration te klikken. De geregistreerde punten verschijnen als genummerde blauwe frames in het Observatiepuntverificatiedisplay en worden bevestigd in het Puntentabblad.
  8. Programmeer het acquisitieschema door het tabblad Tijd te openen en op Nieuw te klikken om toegang te krijgen tot het Timelapse-dialoogvenster , waar de Acquisitiecyclus is ingesteld op 30 minuten en de Totale Tijd op 7 dagen.
  9. Na het klikken op Toepassen berekent de software automatisch het aantal acquisitierondes. Activeer Autofocus door met de rechtermuisknop op de titelbalk te klikken, Voorkeuren te selecteren en AF-modus in te schakelen om te zorgen dat je bij elke stagepositie opnieuw scherpstelt. Controleer de consistentie van belichtingsinstellingen, versterking en lichtintensiteit over alle punten en sla vervolgens de volledige configuratie op met de opslaan-knop .
  10. Begin de acquisitie door op Start Time-lapse te klikken. De software schakelt automatisch over naar de Time-lapse Images, waardoor de voortgang van de verwerving en de stabiliteit van de kamer gedurende het 7-daagse experiment continu kan worden gevolgd. Alle afbeeldingen worden automatisch opgeslagen in TIFF-formaat binnen de experimentmap die door de software is aangemaakt.
  11. Verwerk en kwantificeer de beeldreeks door de beeldstapels te importeren in FIJI (Figuur 3A, B, C).
  12. Open de afbeeldingsstapels die bij elke positie horen via File > Import > Image Sequence, zodat frames chronologisch worden geladen.
  13. Converteer de uitgelijnde stacks naar 8-bit grijswaarden met Image > Type > 8-bit om de pixelintensiteit te standaardiseren.
  14. Pas drempelvorming toe met Image > Adjust > Threshold om bacteriële biofilmgebieden te isoleren. Pas consistente drempelinstellingen toe over alle frames door Toepassen te selecteren en sla het resultaat vervolgens op als een binair masker met Process > Binary > Make Binary.
  15. Voer kwantificatie uit met Analyze > Analyze Particles, waarbij parameters zoals Oppervlakte, Percentage Oppervlakte en Gemiddelde Intensiteit worden geregistreerd.
  16. Exporteer de resultaten van elk frame automatisch naar een spreadsheet via het Resultatenvenster (Bestand > Opgeslagen als > .csv) voor kinetische analyse. Druk alle metingen uit als het aandeel van het veldoppervlak dat door biofilm wordt bedekt (oppervlaktebedekking).

5. Biofilmvisualisatie met behulp van Confocal Scanning Laser microscopie (CLSM)

  1. Inoculeer 1,5 mL van het werkinoculum (OD405 = 0,02 ≈ 1 x 106 cellen /mL; zie Sectie 1) in een steriele schaal met glazen bodem van 35 mm. Incubeer statisch in een bevochtigde doos met een waterreservoir in een broedmachine bij 30 °C totdat het gewenste ontwikkelingsstadium is bereikt (tot 21 dagen).
  2. Op het gekozen tijdstip aspireer je het medium voorzichtig langzaam langs de schaalwand zonder de biofilm te verstoren. Spoel één keer met 2 ml steriele PBS om planktonische cellen te verwijderen en wees uiterst voorzichtig om de biofilm niet los te maken of te verstoren.
  3. Bereid kleuringsoplossingen voor die geïncubeerd moeten worden met ongefixeerde (levende) biofilms (uitvoer vóór fixatie).
    1. Voor levend/dood kleuring voeg je 3 μL SYTO9 groene fluorescerende nucleïnezuurkleuring (1,67 mM) en 3 μL propidiumjodide (18,3 mM) toe aan 10 mL PBS om een kleuringsoplossing te creëren. Voeg 200 μL van de kleuroplossing direct toe aan de biofilmvormende bacteriën, incubeer dan 30 minuten op kamertemperatuur in het donker, en spoel één keer af in PBS.
    2. Levend celtracer kan ook worden gebruikt om de cellen te kleuren vóór fixatie. Incubeer levende cellen met een 10 μM CFDA/SE tracer gedurende 30 minuten. Alternatief kan het labelen van membranen met FM4-64 bij een concentratie van 5 μg/mL ook worden gebruikt. Spoel één keer af in PBS.
  4. Fixeer de biofilm door 2 mL van een 4% paraformaldehydeoplossing toe te voegen in PBS en incubeer 30 minuten bij 37 °C. Verwijder het fixatiemiddel en spoel twee keer af met PBS.
  5. Voeg een druppel antifade montagemedium toe om de biofilm te bedekken en belletjes te voorkomen.
  6. Verkrijg Z-stacks op een omgekeerde confocale microscoop uitgerust met een afstembare witlichtlaser (WLL) en een HC PL APO CS2 63×/1.4 NA olie-immersieobjectief. Voor CFDA/SE stel je de excitatie in op 488 nm en verzamel je emissie tussen 500-550 nm, met een gaatje van 1 Airy-eenheid (AU). Voor FM4-64 stel je de excitatie in op 561 nm en detecteer je emissie tussen 630-700 nm, ook met een 1 AU gaatje.
  7. Verkrijg Z-stacks met intervallen van 0,5-1,0 μm over de gehele biofilmdikte. Pas laservermogen en detectorversterking aan om het dynamisch bereik te maximaliseren zonder verzadiging (<1% verzadigde pixels) te vermijden.
  8. Gebruik lijngemiddelden (2-4×) om de signaal-ruisverhouding te verbeteren en alle beeldparameters (laservermogen, detectorbandbreedte, gaatjesgrootte, scansnelheid) constant te houden over de monsters.
  9. Sla beeldstacks op als 12-bits bestanden en exporteer ze in .lif-formaat voor kwantitatieve analyse in FIJI (ImageJ).
    OPMERKING: Zorg ervoor dat de microscoopinstellingen (bijv. laservermogen, detectorversterking, gaatjesgrootte) vóór beeldvorming zijn gestandaardiseerd met controlemonsters die met dezelfde kleurstoffen zijn gekleurd. Deze kalibratiestap is essentieel om variabiliteit tussen acquisities te minimaliseren en betrouwbare vergelijkingen tussen experimenten mogelijk te maken.
  10. Verwerk en kwantificeer confocale beeldstacks met behulp van FIJI uitgerust met de COMSTAT-plugin (of equivalente 3D-analysesoftware). Meet biovolume, gemiddelde en maximale dikte, oppervlaktebedekking en leven/dode verhoudingen (of andere vooraf gedefinieerde meetinstrumenten). Exportrepresentatieve orthogonale beelden en maximum-intensiteitsprojecties voor illustratieve doeleinden (Figuur 3D, E).

6. Tijdsopgeloste kwantificering van gehechte en niet-gehechte fracties tijdens biofilmvorming in 96-put microtiterassays

  1. Inoculeer 200 μL van het werkinoculum (OD405 = 0,02 ≈ 1 x 106 cellen/mL; zie Sectie 1) in de putten van een plaat met 96 putten. Incubeer statisch bij 30 °C tot het gewenste tijdstip (dag 3, 5, 7, 10, 12, 14, 17 of 21).
    OPMERKING: Randeffecten en verdamping komen vaak voor bij het gebruik van 96-well platen, vooral als de broedmachine geen vochtigheidsregeling heeft. Om deze effecten te minimaliseren, voeg 200 μL steriel gedestilleerd water toe aan alle perifere putten. Daarnaast werden platen geplaatst in een bevochtigde doos met een waterreservoir, dat vervolgens in de incubator wordt geplaatst om verdamping verder te verminderen en een constante vochtigheid in putten te behouden.
  2. Bereid op elk tijdstip drie voorbeeldtypen voor:
    1. Totale suspensie - Homogeniseer de volledige inhoud van één put met de biofilm door voorzichtig meerdere keren op en neer te pipetteren, zodat bubbelvorming wordt voorkomen. Deze fractie vertegenwoordigt de totale bacteriële populatie, inclusief zowel niet-gehechte leptospires als die binnen de semi-adherente biofilm. Deze homogenisatiestap helpt om celaggregaten te verspreiden die de daaropvolgende absorptiemetingen kunnen verstoren.
    2. Vloeibare fase - Verwijder uit een tweede put zorgvuldig 180 μL van het supernatant zonder de biofilmlaag te verstoren. Overbrengen naar een lege put en 20 μL vers EMJH-medium toevoegen. Pipetteer voorzichtig meerdere keren op en neer om celaggregaten te verspreiden. Deze fractie vertegenwoordigt de niet-gehechte cellen die aanwezig zijn in de vloeibare fase, die zowel vrij zwevende leptospitsen als losgekoppelde biofilmaggregaten kan omvatten.
    3. Biofilm - In dezelfde put als voor stap 2.2 wordt de resterende biofilm opnieuw opgehangen door 180 μL vers EMJH-medium toe te voegen en voorzichtig meerdere keren op en neer te pipetten. Deze fractie komt overeen met leptospitsen binnen de biofilm.
  3. Meet de absorptie van elke suspensatie bij 405 nm met een spectrofotometer, nadat je hebt gecontroleerd dat elke put grondig is gehomogeniseerd, en plot de waarden om een representatieve grafiek te genereren (Figuur 4A).

7. Onderzoek naar de functionele rol van biofilm tijdens gastheerinfectie

  1. Inoculeer 200 μL van het werkinoculum (OD405 = 0,02 ≈ 1 x 106 cellen/mL; zie Sectie 1) in de putten van een plaat met 96 putten. Incubeer statisch bij 30 °C totdat de gewenste ontwikkelingsfase is bereikt (tot 21 dagen).
  2. Om de inoculumconcentratie te bepalen, wijd specifieke "biofilmcontrole"-putten aan die alleen voor groeimonitoring worden gebruikt en niet voor dierinjectie. Zodra de biofilm macroscopisch zichtbaar is, verwijder voorzichtig 180 μL supernatant uit één controleput zonder de biofilm te verstoren. Vervang door 180 μL vers EMJH-medium, suspendeer de biofilmaggregaten voorzichtig zonder bellen te genereren, en meet de OD405 om de bacteriële concentratie te schatten.
    OPMERKING: In principe kan het wassen van de putten vóór kwantificering helpen om niet-hechtende cellen te verwijderen. Omdat Leptospira-biofilms echter zwakke adhesie vertonen in 96-wellplaten, zou washing leiden tot ongecontroleerd verlies van biofilmmateriaal. Om deze reden werd de opsussiestap uitgevoerd zonder voorafgaande wasbeurt om reproduceerbaarheid tussen putten en consistente bacteriële concentraties te waarborgen.
    Biofilmcontroleputten bevatten doorgaans ~2 x 10 leptospitten van8 stuks, die werden gekozen als standaardinoculum voor hamsterinfectie-experimenten. Deze concentratie bepaalt ook het doelaantal planktonische leptospitsen dat als controles wordt gebruikt. Wanneer opgenomen, worden planktonische controles voorbereid door Leptospira vers te subcultiveren in EMJH-medium onder schudomstandigheden bij 30 °C gedurende maximaal 5 dagen, wat overeenkomt met de midden- tot laat-exponentiële groeifase die een vergelijkbare celdichtheid oplevert.
  3. Voor dierinenting gebruik je aparte biofilmputten (niet de controlebronnen). Verwijder voorzichtig 180 μL supernatant uit de putten om de meeste vloeistoffase leptospitsen te elimineren.
  4. Verzamel de resterende 20 μL biofilmaggregaten met een pipettip van 200 μL om verstoring van de structuur te voorkomen.
    OPMERKING: De biofilm is fragiel. Zorg ervoor dat aggregaten zichtbaar zijn voor en na het verzamelen. Bereid extra putten voor voor het geval herhaling nodig is.
  5. Breng de aggregaten over in een voorgevulde spuit met 300 μL vers EMJH-medium. Laat de aggregaten door de zwaartekracht neerzetten.
  6. Bevestig een naald van 21 G en voer voorzichtig overtollige EMJH uit tot een eindvolume van 200 μL is bereikt. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen achterblijven en dat biofilmaggregaten zichtbaar blijven.
    OPMERKING: Wachten tot aggregaten zich settelen, minimaliseert het verlies tijdens volume-aanpassing. Controleer vóór gebruik in vivo of aggregaten intact blijven na passage door een 21 G naald (Figuur 4C, D).
  7. Voer intraperitoneale injectie uit van 2 x 10⁸ leptospitsen in 200 μL EMJH-medium.
    OPMERKING: Gebruik 7-8 weken oude gouden Syrische hamsters (beide geslachten), onderhouden onder standaard huisvestingsomstandigheden. Voor negatieve controles injecteer je slechts 200 μL EMJH-medium (één dier per replica).
  8. Houd dieren twee keer per dag in de gaten tot 21 dagen op klinische tekenen van leptospirose (verwarde vacht, prostratie en verminderde reactie op stimulatie). Euthanaceer onmiddellijk via kooldioxide-inhalatie als lijden wordt waargenomen en noteer het moment van euthanasie als het tijdstip van overlijden.
  9. Op dag 21 euthanasen alle overlevende dieren.
    OPMERKING: Voer drie onafhankelijke biologische replicaties uit met culturen die op verschillende data zijn gemaakt. Elke replicatie bevat twee dieren per conditie en één negatief controledier.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wanneer het inoculum correct is bereid, gaan culturen binnen 3-5 dagen in de halverwege logitaritmafase en vertonen OD405-waarden van ~ 0,2-0,4 met heldere, sterk beweeglijke velden onder donkerveldmicroscopie (≥ 90% van de cellen beweeglijk) en geen zichtbare klonten. Suboptimale preparaten presenteren zich als trage bacteriën en heterogene motiliteit over het hele veld; Dergelijke culturen leveren vaak zwakke biofilms op en moeten worden weggegooid. In de praktijk minimaliseert het direct voor het zaaien naast elkaar bevestigen van motiliteit en OD mislukte runs. Het opzetten van deze kwaliteitscontrolepoorten in de inoculumfase is de beste voorspeller van succes in downstream toepassingen. Hoewel de methodologie geoptimaliseerd was voor L. interrogans serovar Manilae L495, werden dezelfde procedures ook toegepast op de stam Leptospira biflexa Patoc om de toepasbaarheid van verschillende soorten aan te tonen. L. biflexa vormt over het algemeen minder samenhangende en dunnere biofilms dan L. interrogans, maar de karakteristieke ontwikkelingssequentie en structurele kenmerken blijven detecteerbaar met passende parameteraanpassingen. Het opnemen van beide soorten benadrukt dus de aanpassingskracht van de workflow aan zowel pathogene als saprofytische Leptospira .

Na 21 dagen statische incubatie bij 30 °C in een bevochtigde kamer (of de juiste duur voor de gebruikte Leptospira-soort ), worden biofilms zichtbaar voor het blote oog op zowel glazen dekfolies als hydrofiele polycarbonaatmembranen. Succesvolle groei levert na 2-3 weken karakteristieke CV-patronen op, zoals stipachtige, vertakkende of netvormige voetafdrukken die aan het oppervlak vastzitten (Figuur 2A).

In een typische run bereikt wildtype L. interrogans Manilae L495 tegen week 3 ~ 50% oppervlaktedekking, terwijl de laag-biofilm mutanten een plateau van bijna ~ 20% en high-biofilm fenotypes ~ 70-80% naderen, wat een praktisch dynamisch bereik voor screening creëert. De mate van biofilmvorming kan ook variëren afhankelijk van de Leptospira-soort en stam; zo ontwikkelt L. biflexa Patoc-stam zichtbare biofilms sneller, waarbij eerdere studies structuren al vanaf 120 uur na de inoculatie als volwassen biofilms35 beschouwden.

Kristalvioletkleuring biedt een betrouwbare en reproduceerbare methode om biofilmbiomassa te kwantificeren. In goed ontwikkelde biofilms resulteert kleuring in diepe paarse kleuring die gelokaliseerd is op het bedekkings- of membraangebied, wat wijst op hoge niveaus van gehechte biomassa (Figuur 2A). Visuele aanwijzingen tijdens de kleurings- en oplosbaarheidsstappen zijn ook nuttige indicatoren van het succes van het protocol. Zo kan een ongelijke CV-verdeling of bleke verkleuring het gevolg zijn van onderzaaiing, verdamping of agressief wassen dat vroege biofilms losmaakt.

Absorptiemetingen bij 570 nm weerspiegelen de hoeveelheid vastgehouden kleuring, en daarmee de relatieve biofilmdichtheid (Figuur 2B). In representatieve experimenten tonen L. interrogans-culturen die onder optimale omstandigheden zijn gekweekt, consistente en reproduceerbare OD₅₇₀-metingen over replicaten, wat een stabiele biofilmvorming weerspiegelt. Daarentegen worden vaak grote variaties tussen replicaten waargenomen wanneer monsters overmatig pipetteren tijdens mediumwisselingen, wat wijst op slechte adhesie of gedeeltelijke biofilmloslating. Dergelijke variabiliteit moet worden beschouwd als een teken van technische problemen, en de getroffen monsters moeten worden uitgesloten of het protocol zorgvuldig worden beoordeeld. Opmerkelijk is dat L. biflexa Patoc onder vergelijkbare omstandigheden uitgebreidere biofilms vormt op zowel glazen coverslips als polycarbonaatmembranen, wat tot uiting komt in hogere CV-absorptiewaarden, wat aantoont dat het protocol aanpasbaar en effectief is bij Leptospira-soorten .

Succesvolle SEM-voorbereiding kan extracellulaire matrixafzettingen al vanaf dag 3 onthullen, gevolgd door een opvallend gepolariseerde architectuur in volwassen biofilms: een ruwe, gekanaliseerde basale zijde (vaak met > kanalen van 5 μm) die een poreuze binnenstructuur verankert, en een gladder apikal vlak waar spirocheten verstrengeld liggen in een dichte matrix (Figuur 2C, D, E, F). Velden met hoge vergroting vangen vaak vertakkende extracellulaire filamenten en af en toe paddenstoelachtige uitsteeksels op; kenmerken die overeenkomen met de coalescentiedynamiek die wordt gezien door time-lapse (Aanvullende video 1). In suboptimale preparaten kunnen ingestorte matrices, lading en onduidelijke celcontouren worden waargenomen, meestal wat leidt tot onvoldoende postfixatie, onvoldoende geleidende coating of slechte droging. Wanneer basaal-apikale polariteit en doordringende kanalen zichtbaar zijn, komen SEM-uitlezingen nauw overeen met confocale schattingen van dikte en porositeit, wat de succesvolle uitvoering van zowel voorbereiding als beeldvorming bevestigt.

In effectieve time-lapse-series verschijnen geïsoleerde puncta binnen 24-72 uur en smelten geleidelijk samen tot grotere aggregaten die over het oppervlak vegen voordat ruimtebeperkingen hun beweging vertragen (Figuur 3A, B, C). Kwantitatieve segmentatie zorgt voor een monotone toename van het totale bedekte gebied, terwijl de aggregate tellingen stijgen, pieken en vervolgens dalen doordat botsingen en fusies domineren tussen ~12 en 216 uur. Deze kinetiek (oppervlakte omhoog, aantal aggregaten omlaag) duidt op actieve accretie in plaats van eenvoudige sedimentatie. Mislukte of borderline runs missen vroege puncta, laten vlakke area-over-time curves zien, of hebben focus drift die in verband staat met onstabiele temperatuur/vochtigheid. Het behouden van een gestabiliseerde omgeving van 30 °C met 95% luchtvochtigheid en het gebruik van autofocus op elk tijdstip herstelt doorgaans duidelijke trajecten die geschikt zijn voor het vergelijken van mutanten of behandelingen.

Representatieve Z-stacks uit volwassen biofilms vertonen schuimachtige, meerlaagse architectuur die doorgaans meer dan 50 μm dik is, waarbij de meeste cellen levend kleuren (SYTO 9-positief) en af en toe centrale holtes die wijzen op collectieve herschikkingen tijdens groei (Figuur 3D). Matrixprobes kunnen worden gebruikt om matrixsamenstelling te onderzoeken: WGA benadrukt polysaccharide epitopen, BOBO-3 labelt overvloedig extracellulair DNA, en eiwitselectieve kleuringen leveren weinig extern celgeassocieerd signaal (Figuur 3E). Suboptimale resultaten zijn dunne of discontinue stapels die worden gedomineerd door propidiumjodide, sterke fotobleaching of inconsistente versterkingsinstellingen, die elk de kwantitatieve vergelijkbaarheid ondermijnen. Het samen interpreteren van dikte-, biovolume- en live/dead-verhoudingen (terwijl laservermogen, detectorversterking en gaatje constant blijven over omstandigheden) bevestigt de rijpingsstatus en ondersteunt directe vergelijkingen met SEM-ultrastructuur en CV-biomassa.

Het proces van biofilmvorming van Leptospira volgt doorgaans verschillende fasen, hoewel exacte tijdstippen en waarden kunnen variëren afhankelijk van de soort of stam. Met L . interrogans-stam Manilae L495 als referentie omvat de verwachte progressie over 21 dagen een beginfase (dagen 0-3) waarin bacteriën grotendeels planktonisch blijven met minimale biofilm (Figuur 4A). Hierop volgt een exponentiële groeifase (dag 3-7) waarin zowel planktonische als biofilm-geassocieerde bacteriën toenemen, tot ongeveer 9 x 10⁸ cellen/mL, gepaard met de vorming en uitbreiding van biofilmaggregaten. Tussen dag 7 en 12 nemen planktonische bacteriën aanzienlijk af, terwijl biofilm-geassocieerde cellen pieken en ongeveer 80% van de populatie vertegenwoordigen. Ten slotte neemt tijdens de rijpingsfase (dag 12-21) het aantal biofilmbacteriën af zonder toename van planktonische cellen, maar de grootte en complexiteit van de biofilm blijven toenemen. Het observeren van deze reeks veranderingen geeft aan dat het protocol effectief de dynamische ontwikkeling en rijping van Leptospira-biofilms vastlegt.

Wanneer correct uitgevoerd, gebruikt het infectieprotocol inocula met ~2 x 10⁸ leptospitsen in 200 μL EMJH, bereid uit goed gedefinieerde planktonische (5-daags) of biofilm (21-dagen) culturen. Hoewel deze twee kweektypen verschillende fysiologische toestanden vertegenwoordigen, is dit verschil opzettelijk, aangezien het experiment wil bepalen of Leptospira-biofilms – gekenmerkt door verminderde metabole activiteit en structurele differentiatie – het vermogen behouden om infectie te initiëren. Dit contrast wordt ondersteund door transcriptomische studies die grote verschuivingen in genexpressie tussen planktonische en biofilm Leptospira35,36 aantonen. Biofilmaggregaten worden zorgvuldig geoogst om hun structuur te behouden en blijven intact na passage door een 21 G-naald, zoals bevestigd vóór injectie (Figuur 4C, D). Na intraperitoneale injectie vertonen gouden Syrische hamsters meestal klinische tekenen van leptospirose binnen 3 tot 5 dagen (bijv. lusteloosheid, ruige vacht, prostratie). Negatieve controles die alleen met EMJH-medium zijn geïnjecteerd, vertonen geen tekenen van ziekte. De progressie en ernst van klinische symptomen, evenals de tijd tot euthanasie, variëren afhankelijk van het inoculum: planktonische bacteriën veroorzaken vaak eerder en meer acute symptomen, terwijl biofilm-afgeleide aggregaten een vertraagde maar aanhoudende infectie kunnen veroorzaken (Figuur 4B). Door twee keer per dag tot 21 dagen te monitoren, kan het volledige ziekteverloop vasthouden.

figure-results-1
Figuur 2. Kristalviolette kleuring, kwantificering en ultrastructurele beeldvorming van Leptospira-biofilms. (A) Kristalviolet (CV) kleuring van biofilms die op verschillende substraten zijn gegroeid. CV-kleuring maakt visualisatie mogelijk van biofilmarchitectuur en initiële hechtingspatronen voor verschillende soorten en substraten. i. L. interrogans op een polycarbonaatfilter; ii. L. biflexa op polycarbonaatfilter; iii. L. ondervragingen op glazen dekmantel; iv. L. biflexa op glazen omslaglijst. (B) Voorbeeld van kwantitatieve biofilmvorming beoordeeld door CV-absorptie (OD570 nm) over de tijd voor L. interrogans en L. biflexa. Deze kinetische meting legt zowel vroege adhesie als biomassa-accumulatie dynamiek vast, en benadrukt verschillen in biofilmgroei tussen pathogene en saprofytische soorten. Dit cijfer is aangepast van27. (C-E) Scanning elektronenmicroscopie (SEM) van L. interrogans-biofilms: (c) 3 dagen oude biofilm die vroege microkolonievorming en initiële extracellulaire matrixafzetting toont; (d) 14 dagen oude biofilm met volwassen architectuur met uitgebreide matrix en driedimensionale organisatie; (E-F) 3 weken oude biofilm die structurele consolidatie en matrixrijping over langdurige kweek illustreert. Deze combinatie van CV-kleuring, kwantitatieve OD-metingen en SEM-beeldvorming biedt een uitgebreid overzicht van de ontwikkeling van biofilms, van vroege hechting tot volwassen ultrastructurele organisatie, waardoor directe vergelijking tussen soorten en kweekduur mogelijk is. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 3. Visualisatie van de vorming van Leptospira-biofilm . Fasecontrastbeelden die met een BioStation zijn gemaakt, tonen biofilmontwikkeling bij (A) 48 uur, (B) 96 uur en (C) 144 uur. (D) CLSM-reconstructie van een Leptospira-biofilm die het totale biovolume toont met orthogonale sneden voor 3D-visualisatie. (E) Confocale kleuring van een rijpe biofilm met DAPI (groen) en WGA (rood), waarbij bacteriële cellen en extracellulaire matrixcomponenten worden benadrukt. Deze figuur is aangepast van37. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 4. Tijdsopgeloste kwantificering van planktonische en biofilmfracties en functionele beoordeling van Leptospira-biofilms . (A) Kinetiek van biofilmvorming gemeten door absorptie bij 405 nm. Voor elk tijdstip werden metingen genomen van de totale put, de biofilmfractie en de supernatant met planktonische leptospires, waardoor onderscheid kon worden gemaakt tussen vastzittende en vrij zwemmende bacteriën. (B) Voorbeelden van overlevingscurves van hamsters die zijn geïnjecteerd met biofilmaggregaten, planktonische leptospitsen of EMJH-controle. Biofilm-geïnjecteerde dieren vertonen een verminderde virulentie, waarvan sommige 21 dagen overleven, terwijl planktonische leptospitsen snelle sterfte veroorzaken. (C-D) Voorlopige validatie van biofilmintegriteit: aggregaten zijn zichtbaar in de spuit vóór injectie (C) en blijven intact na passage door een 21 G naald (D, witte pijlen), wat bevestigt dat de biofilmstructuur tijdens het gebruik behouden blijft. Dit cijfer is aangepast van36. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol biedt een modulaire en integratieve workflow voor het bestuderen van Leptospira-biofilms, waarbij kwantitatieve biomassa (kristalviolet)9,27, dynamica (time-lapse fasecontrast), driedimensionale samenstelling (confocale laserscanningmicroscopie met gerichte probes)38, ultrastructuur (scanning-elektronenmicroscopie) en functionele beoordeling (hamsterinfectie) wordt geïntegreerd. Door dezelfde kweekreeks over modules te gebruiken, worden batcheffecten geminimaliseerd en wordt binnen het experiment kruisvalidatie mogelijk gemaakt, wat vooral belangrijk is voor langzaam groeiende, fragiele spirocheten. Elke module vult de andere aan: CV kwantificeert "hoeveel", time-lapse toont "hoe snel", CLSM onthult "wat erin zit", SEM bepaalt "hoe het gebouwd is," en in vivo testen levert "proof-of-function." De opname van L. biflexa toont aanpassingsvermogen tussen soorten aan, benadrukt snellere en dichtere biofilmvorming en benadrukt methodologische flexibiliteit35.

Het succes van elke module hangt af van de kwaliteit van het inoculum en de fysiologische toestand. Planktonische culturen in het midden-log (3-5 dagen), zeer beweeglijk en vrij van aggregaten, leveren reproduceerbare adhesie en biofilmontwikkeling. Alleen laagdoorgangsisolaten moeten worden gebruikt om robuuste biofilmvorming en reproduceerbaarheid te waarborgen.

De CV-assay verankert de workflow door zijn snelheid, schaalbaarheid en doorvoersnelheid 9,27. Het maakt snelle screening mogelijk van mutanten, media of antibiofilmverbindingen. Omdat Leptospira-biofilms echter fragiel en heterogeen zijn, zijn zachte manipulatie en replicataire validatie essentieel. CV kan compacte van poreuze architecturen niet onderscheiden of matrixcompositie detecteren – vandaar zijn rol als screening gate voor diepere structurele analyses.

Time-lapse beeldvorming overbrugt die kloof door biofilmkinetiek in realtime te onthullen. Het legt het ontstaan, de samensmelting en immobilisatie van beweeglijke aggregaten vast, waardoor tijdelijke fenomenen worden blootgelegd die eindpunt-assays missen. Omgevingsstabiliteit (temperatuur, luchtvochtigheid, autofocus) is cruciaal. Deze opnames hebben aangetoond dat zelfs wanneer CV-biomassa stabiel lijkt, de dynamiek kan divergeren – wat wijst op structurele herschikkingen of verlies van levensvatbaarheid in diepere lagen.

CLSM biedt volumetrische en chemische inzichten zonder uitdrogingsartefacten39. Levend/dode kleuring onthult cellevensvatbaarheidsgradiënten binnen de biofilm, wat overeenkomt met meldingen van beperkte zuurstofdiffusie en metabole stratificatie 6,40. Lectines en nucleïnezuurkleurstoffen brengen overvloedig extracellulair DNA en specifieke glycanmotieven bloot, waardoor kwantificering en karakterisering van matrixcomponenten41,42 mogelijk is. CLSM-gegevens tonen vaak interne leegtes, wat doet denken aan de collectieve herschikkingen die in time-lapse38 te zien zijn. Toch zijn beperkingen onder andere probe-specificiteit, fotobleaching en diffractie-beperkte axiale resolutie; Daarom moeten de microscoopinstellingen en kleurstofprestaties vooraf worden gestandaardiseerd en getest om betrouwbare, vergelijkbare resultaten over experimenten heen te garanderen.

SEM biedt aanvullende ultrastructurele resolutie43. In de vroege stadia lost het beginnende aggregaten op; Bij rijpheid (≈ 15-21 dagen) toont het een gepolariseerde architectuur: een ruwe, gekanaliseerde basale laag voor anker en uitwisseling, en een gladder apicaal matrixrijk oppervlak37. Zorgvuldige fixatie, HMDS-droging en correlatie met confocale gegevens beperken artefacten door uitdroging of instorting44.

Samen maken deze vier modules interne kruisvalidatie mogelijk: wanneer CV, CLSM en SEM convergeren, zijn conclusies robuust; Wanneer ze uit elkaar lopen, zijn de afwijkingen zelf informatief – bijvoorbeeld een toename van biomassa met verminderde levensvatbaarheid of ongewijzigde biomassa met veranderde matrixsamenstelling.

Er blijven verschillende intrinsieke beperkingen bestaan. Leptospira-biofilms zijn heterogeen en delicaat, waardoor ze gevoelig zijn voor aanraking en uitdroging. CV integreert totale biomassa maar niet levensvatbaarheid16; CLSM mag optische limietenvan 38 niet overschrijden; SEM riskeert voorbereidingsartefacten. Sterfte in diepere lagen wordt verwacht door zuurstofgradiënten6, maar deze bias is systematisch en vergelijkbaar tussen de omstandigheden. De rijping van biofilms bereikt een plateau rond 15-21 dagen, geassocieerd met transcriptiesignaturen van nutriëntbeperking36. Latere stadia blijven slecht gekarakteriseerd.

In vivo assays bieden functionele context. Het intraperitoneal injecteren van aggregaten test of biofilm-afgeleide cellen verschillen in virulentie of persistentie van planktonische tegenhangers. Hoewel intraperitoneale inoculatie geen natuurlijke route is, biedt het een gecontroleerd vergelijkend model36. Aggregate heterogeniteit brengt enige variatie met zich mee, maar consistente behandeling en een aangepaste inoculumgrootte verminderen dit. Belangrijk is dat biofilmpersistentiekenmerken (bijv. ECM-gemedieerde stresstolerantie) niet noodzakelijkerwijs leiden tot verhoogde acute virulentie, wat de ecologische in plaats van pathogene rol van biofilmvormingbenadrukt 24.

Het modulaire ontwerp maakt schaalbaar gebruik mogelijk. Voor snelle screening volstaan CV en timelapse. Voor mechanistisch inzicht voegen CLSM en SEM compositorische en architectonische resolutie toe. Modules kunnen enzymatische of chemische verstoringen (DNase, glycosidase), alternatieve probes voor glycanen of nucleïnezuren, of microfluïdische systemen om stromingsresponsen te testen, integreren. Hetzelfde inoculum kan transcriptomische of proteomische analyses voeden, waarbij biofilmfenotype direct wordt gekoppeld aan regulatie (bijv. c-di-GMP-signalering, hongerrespons). Dit kader omvat ook mutantscreening, omgevingsverstoringstests en evaluatie van antibiofilm- of antivirulentieverbindingen.

Deze geïntegreerde workflow transformeert geïsoleerde waarnemingen in een coherent multidimensionaal begrip van Leptospira-biofilms. Door doorvoer (CV), dynamica (time-lapse), chemie en diepte (CLSM) en ultrastructuur (SEM) te combineren, vangt de benadering de mobiele, poreuze en gepolariseerde aard van Leptospira-gemeenschappen met getrouwheid. Met een uitbreiding van eerdere studies17, 35, 36, toont het aan dat gecoördineerde, modulaire experimenten fenomenen aan het licht brengen die onzichtbaar zijn voor enkelmethodestudies – zoals stijgende biomassa ondanks dalende levensvatbaarheid, of divergerende kinetiek tussen soorten. Uiteindelijk ondersteunt deze benadering vergelijkende, reproduceerbare en functioneel relevante analyses over soorten, mutanten en omstandigheden, en biedt het een basis voor mechanistische microbiologie, ecologische veerkracht en het ontwerp van anti-biofilmstrategieën.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs geven geen concurrerende financiële of niet-financiële belangen op. Alle auteurs hebben deze openbaarmaking beoordeeld en goedgekeurd.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij erkennen dankbaar de financiële steun die het AXA Research Fund biedt via een postdoctoraal fellowship (referentie: 15-AXA-PDOC-037), door het Institut Pasteur van Nieuw-Caledonië (IPNC) en de Universiteit van Nieuw-Caledonië (UNC) via een PhD-beurs, en door het Franse Nationale Onderzoeksagentschap (ANR) onder subsidienummer SPIraL-19-CE35-0006-01. De vermelding van handelsnamen of commerciële producten in deze publicatie is uitsluitend bedoeld om de materialen die in de experimentele procedures zijn gebruikt te documenteren. Dergelijke verwijzingen vormen geen goedkeuring, aanbeveling of aanwijzing van commercieel belang door het Institut Pasteur van Nieuw-Caledonië.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.1 µm sterile hydrophilic polycarbonate membraneit4ip1000M25/861N101/13
12 mm sterile glass coverslipSPL330164
16% paraformaldehyde (PFA) Thermo Scientific28908
21G needleBD Medical304432
24-well microplateNUNC143982
35 mm glass-bottom dishIbidi81218-200
35-mm glass bottom Hi-Q4 dishIbidi81156
96-well microplateNEST701001
Antifade mounting medium Biorad29410
Carbon coaterLeica MicrosystemEm ACE600
CFDA/SE tracerBiolegend423801
Conductive carbone adhesiveElectron Microscopy Science77816
Crystal violet (CV)SigmaC3886
Dark field microscopeLeica Microsystem11888846Leica DM4000 B equiped with a dark fiel condenseur (cat n° 11505142)
EthanolVWR Chemicals83813.36
FM4-64InvitrogenT3166
Glacial acetic acidSupelco1.00063
Glutaraldehyde solutionSigma-AldrichG5882
HexamethyldisilazaneAcros Organics120581000
IncubatorMemmertIN30
Inverted confocal microscopeLeica MicrosystemLeica DMI6000 TCS SP8 XConfocal microscope SP8
Inverted microscope fitted with phase-contrast opticsNikonCELL-S2BioStation IM-Q
Leptospira Medium Base EMJH Becton DickinsonBD 279410EMJH medium for Leptospira
Osmium tetroxide (OsO4) SigmaBCCG9181
Propidium iodide Biotium40017
Scanning electron microscopeJEOLJSM-IT300
Sodium cacodylate buffer Thermo Scientific Chemicals15453149
Spectrophotometer Varioskan LuxThermo ScientificVLBL00GD0
Sterile Phosphate-buffered SalineBiosolve0016232301BS
Syringe (1 mL)ChiranaCH03002L
SYTO9 green fluorescent nucleic acid stain InvitrogenS34854

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. The biofilm matrix. Nat Rev Microbiol. 8 (9), 623-633 (2010).">Flemming, H. C., Wingender, J. The biofilm matrix. Nat Rev Microbiol. 8 (9), 623-633 (2010).
  2. Microbial biofilm: A review on formation, infection, antibiotic resistance, control measures, and innovative treatment. Microorganisms. 11 (6), (2023).">Sharma, S., et al. Microbial biofilm: A review on formation, infection, antibiotic resistance, control measures, and innovative treatment. Microorganisms. 11 (6), (2023).
  3. Biofilms: An emergent form of bacterial life. Nat Rev Microbiol. 14 (9), 563-575 (2016).">Flemming, H. C., et al. Biofilms: An emergent form of bacterial life. Nat Rev Microbiol. 14 (9), 563-575 (2016).
  4. Impact of biofilms on chronic infections and medical challenges. Cureus. 15 (11), e48204(2023).">Mendhe, S., Badge, A., Ugemuge, S., Chandi, D. Impact of biofilms on chronic infections and medical challenges. Cureus. 15 (11), e48204(2023).
  5. Bacterial biofilms: From the natural environment to infectious diseases. Nat Rev Microbiol. 2 (2), 95-108 (2004).">Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. Bacterial biofilms: From the natural environment to infectious diseases. Nat Rev Microbiol. 2 (2), 95-108 (2004).
  6. Physiological heterogeneity in biofilms. Nat Rev Microbiol. 6 (3), 199-210 (2008).">Stewart, P. S., Franklin, M. J. Physiological heterogeneity in biofilms. Nat Rev Microbiol. 6 (3), 199-210 (2008).
  7. The sociobiology of biofilms. FEMS Microbiol Rev. 33 (1), 206-224 (2009).">Nadell, C. D., Xavier, J. B., Foster, K. R. The sociobiology of biofilms. FEMS Microbiol Rev. 33 (1), 206-224 (2009).
  8. Biofilms: Microbial life on surfaces. Emerg Infect Dis. 8 (9), 881-890 (2002).">Donlan, R. M. Biofilms: Microbial life on surfaces. Emerg Infect Dis. 8 (9), 881-890 (2002).
  9. Microtiter dish biofilm formation assay. J Vis Exp. (47), e2437(2011).">O'Toole, G. A. Microtiter dish biofilm formation assay. J Vis Exp. (47), e2437(2011).
  10. Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT. Microbiology (Reading). 146 (Pt 10), 2395-2407 (2000).">Heydorn, A., et al. Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT. Microbiology (Reading). 146 (Pt 10), 2395-2407 (2000).
  11. Global gene expression in Staphylococcus aureus biofilms. J Bacteriol. 186 (14), 4665-4684 (2004).">Beenken, K. E., et al. Global gene expression in Staphylococcus aureus biofilms. J Bacteriol. 186 (14), 4665-4684 (2004).
  12. Quantitative and qualitative assessment methods for biofilm growth: A mini-review. Res Rev J Eng Technol. 6 (4), (2017).">Wilson, C., et al. Quantitative and qualitative assessment methods for biofilm growth: A mini-review. Res Rev J Eng Technol. 6 (4), (2017).
  13. Vibrio biofilms: So much the same yet so different. Trends Microbiol. 17 (3), 109-118 (2009).">Yildiz, F. H., Visick, K. L. Vibrio biofilms: So much the same yet so different. Trends Microbiol. 17 (3), 109-118 (2009).
  14. Growing and analyzing static biofilms. Curr Protoc Microbiol. Chapter 1 (Unit 1B.1), (2005).">Merritt, J. H., Kadouri, D. E., O'Toole, G. A. Growing and analyzing static biofilms. Curr Protoc Microbiol. Chapter 1 (Unit 1B.1), (2005).
  15. Critical review on biofilm methods. Crit Rev Microbiol. 43 (3), 313-351 (2017).">Azeredo, J., et al. Critical review on biofilm methods. Crit Rev Microbiol. 43 (3), 313-351 (2017).
  16. Comparison of multiple methods for quantification of microbial biofilms grown in microtiter plates. J Microbiol Methods. 72 (2), 157-165 (2008).">Peeters, E., Nelis, H. J., Coenye, T. Comparison of multiple methods for quantification of microbial biofilms grown in microtiter plates. J Microbiol Methods. 72 (2), 157-165 (2008).
  17. Biofilm formation by saprophytic and pathogenic Leptospires. Microbiology. 154 (Pt 5), 1309-1317 (2008).">Ristow, P., et al. Biofilm formation by saprophytic and pathogenic Leptospires. Microbiology. 154 (Pt 5), 1309-1317 (2008).
  18. Presence of Leptospira spp. in a mosaic of wetlands used for livestock raising under differing hydroclimatic conditions. Appl Environ Microbiol. 89 (6), e0197122(2023).">Chiani, Y. T., et al. Presence of Leptospira spp. in a mosaic of wetlands used for livestock raising under differing hydroclimatic conditions. Appl Environ Microbiol. 89 (6), e0197122(2023).
  19. Characterizing interactions of Leptospira interrogans with proximal renal tubule epithelial cells. BMC Microbiol. 18 (1), 64(2018).">Yamaguchi, T., et al. Characterizing interactions of Leptospira interrogans with proximal renal tubule epithelial cells. BMC Microbiol. 18 (1), 64(2018).
  20. Leptospira interrogans biofilm formation in Rattus norvegicus (Norway rats) natural reservoirs. PLoS Negl Trop Dis. 15 (9), e0009736(2021).">Santos, A. A. N., et al. Leptospira interrogans biofilm formation in Rattus norvegicus (Norway rats) natural reservoirs. PLoS Negl Trop Dis. 15 (9), e0009736(2021).
  21. In vivo biofilm formation of pathogenic Leptospira spp. in the vitreous humor of horses with recurrent uveitis. Microorganisms. 9 (9), (2021).">Ackermann, K., et al. In vivo biofilm formation of pathogenic Leptospira spp. in the vitreous humor of horses with recurrent uveitis. Microorganisms. 9 (9), (2021).
  22. Environmental biofilms from an urban community in Salvador, Brazil, shelter previously uncharacterized saprophytic Leptospira. Microb Ecol. 86 (4), 2488-2501 (2023).">Dos Santos Ribeiro, P., et al. Environmental biofilms from an urban community in Salvador, Brazil, shelter previously uncharacterized saprophytic Leptospira. Microb Ecol. 86 (4), 2488-2501 (2023).
  23. Molecular detection of pathogenic leptospiral protein encoding gene (lipL32) in environmental aquatic biofilms. Lett Appl Microbiol. 62 (4), 311-315 (2016).">Vinod Kumar, K., Lall, C., Raj, R. V., Vedhagiri, K., Vijayachari, P. Molecular detection of pathogenic leptospiral protein encoding gene (lipL32) in environmental aquatic biofilms. Lett Appl Microbiol. 62 (4), 311-315 (2016).
  24. Leptospirosis: Toward a better understanding of the environmental lifestyle of Leptospira. Front Water. 5, 1195094(2023).">Davignon, G., et al. Leptospirosis: Toward a better understanding of the environmental lifestyle of Leptospira. Front Water. 5, 1195094(2023).
  25. Leptospira biofilms: Implications for survival, transmission, and disease management. Appl Environ Microbiol. 91 (2), e0191424(2025).">Dias, C. S., Pinna, M. H. Leptospira biofilms: Implications for survival, transmission, and disease management. Appl Environ Microbiol. 91 (2), e0191424(2025).
  26. Biofilm production of Leptospira spp. strains. Acta Sci Vet. 46 (1), 5(2018).">Gomes, D. O., et al. Biofilm production of Leptospira spp. strains. Acta Sci Vet. 46 (1), 5(2018).
  27. Biofilm formation and quantification using the 96-microtiter plate. Methods Mol Biol. 2134, 207-214 (2020).">Thibeaux, R., Kainiu, M., Goarant, C. Biofilm formation and quantification using the 96-microtiter plate. Methods Mol Biol. 2134, 207-214 (2020).
  28. Co-existence and survival of pathogenic Leptospires by formation of biofilm with Azospirillum. FEMS Microbiol Ecol. 91 (6), fiv051(2015).">Vinod Kumar, K., Lall, C., Vimal Raj, R., Vedhagiri, K., Vijayachari, P. Co-existence and survival of pathogenic Leptospires by formation of biofilm with Azospirillum. FEMS Microbiol Ecol. 91 (6), fiv051(2015).
  29. Dispersed cells represent a distinct stage in the transition from bacterial biofilm to planktonic lifestyles. Nat Commun. 5, 4462(2014).">Chua, S. L., et al. Dispersed cells represent a distinct stage in the transition from bacterial biofilm to planktonic lifestyles. Nat Commun. 5, 4462(2014).
  30. Biofilm-detached cells, a transition from a sessile to a planktonic phenotype: A comparative study of adhesion and physiological characteristics in Pseudomonas aeruginosa. FEMS Microbiol Lett. 290 (2), 135-142 (2009).">Rollet, C., Gal, L., Guzzo, J. Biofilm-detached cells, a transition from a sessile to a planktonic phenotype: A comparative study of adhesion and physiological characteristics in Pseudomonas aeruginosa. FEMS Microbiol Lett. 290 (2), 135-142 (2009).
  31. Hamster model of leptospirosis. Curr Protoc Microbiol. Chapter 12 (Unit 12E.12), (2006).">Haake, D. A. Hamster model of leptospirosis. Curr Protoc Microbiol. Chapter 12 (Unit 12E.12), (2006).
  32. Use of golden Syrian hamster as an animal model to study leptospirosis-associated immune responses. Methods Mol Biol. 2134, 243-255 (2020).">Cagliero, J., Huet, K., Matsui, M. Use of golden Syrian hamster as an animal model to study leptospirosis-associated immune responses. Methods Mol Biol. 2134, 243-255 (2020).
  33. Animal models of leptospirosis: Of mice and hamsters. Front Immunol. 8, 58(2017).">Gomes-Solecki, M., Santecchia, I., Werts, C. Animal models of leptospirosis: Of mice and hamsters. Front Immunol. 8, 58(2017).
  34. Improvement of the enrichment used in the EMJH medium (Ellinghausen-McCullough-Johnson-Harris) for the cultivation of Leptospira spp. Rev Argent Microbiol. 54, 95-99 (2022).">Guedes, I. B., et al. Improvement of the enrichment used in the EMJH medium (Ellinghausen-McCullough-Johnson-Harris) for the cultivation of Leptospira spp. Rev Argent Microbiol. 54, 95-99 (2022).
  35. Transcriptome sequencing reveals wide expression reprogramming of basal and unknown genes in Leptospira biflexa biofilms. mSphere. 1 (2), e00042-e00116 (2016).">Iraola, G., et al. Transcriptome sequencing reveals wide expression reprogramming of basal and unknown genes in Leptospira biflexa biofilms. mSphere. 1 (2), e00042-e00116 (2016).
  36. Leptospira interrogans biofilm transcriptome highlights adaption to starvation and general stress while maintaining virulence. NPJ Biofilms Microbiomes. 10 (1), 95(2024).">Davignon, G., et al. Leptospira interrogans biofilm transcriptome highlights adaption to starvation and general stress while maintaining virulence. NPJ Biofilms Microbiomes. 10 (1), 95(2024).
  37. The zoonotic pathogen Leptospira interrogans mitigates environmental stress through cyclic-di-GMP-controlled biofilm production. NPJ Biofilms Microbiomes. 6 (1), 24(2020).">Thibeaux, R., et al. The zoonotic pathogen Leptospira interrogans mitigates environmental stress through cyclic-di-GMP-controlled biofilm production. NPJ Biofilms Microbiomes. 6 (1), 24(2020).
  38. Confocal laser scanning microscopy for analysis of microbial biofilms. Methods Enzymol. 310, 131-144 (1999).">Lawrence, J. R., Neu, T. R. Confocal laser scanning microscopy for analysis of microbial biofilms. Methods Enzymol. 310, 131-144 (1999).
  39. Contribution of confocal laser scanning microscopy in deciphering biofilm tridimensional structure and reactivity. Methods Mol Biol. 1147, 255-266 (2014).">Bridier, A., Briandet, R. Contribution of confocal laser scanning microscopy in deciphering biofilm tridimensional structure and reactivity. Methods Mol Biol. 1147, 255-266 (2014).
  40. Stratified growth in Pseudomonas aeruginosa biofilms. Appl Environ Microbiol. 70 (10), 6188-6196 (2004).">Werner, E., et al. Stratified growth in Pseudomonas aeruginosa biofilms. Appl Environ Microbiol. 70 (10), 6188-6196 (2004).
  41. Advanced techniques for in situ analysis of the biofilm matrix (structure, composition, dynamics) by means of laser scanning microscopy. Methods Mol Biol. 1147, 43-64 (2014).">Neu, T. R., Lawrence, J. R. Advanced techniques for in situ analysis of the biofilm matrix (structure, composition, dynamics) by means of laser scanning microscopy. Methods Mol Biol. 1147, 43-64 (2014).
  42. Innovative techniques, sensors, and approaches for imaging biofilms at different scales. Trends Microbiol. 23 (4), 233-242 (2015).">Neu, T. R., Lawrence, J. R. Innovative techniques, sensors, and approaches for imaging biofilms at different scales. Trends Microbiol. 23 (4), 233-242 (2015).
  43. Microscopy methods for biofilm imaging: Focus on SEM and VP-SEM pros and cons. Biology (Basel). 10 (1), (2021).">Relucenti, M., et al. Microscopy methods for biofilm imaging: Focus on SEM and VP-SEM pros and cons. Biology (Basel). 10 (1), (2021).
  44. Drying cells for SEM, AFM and TEM by hexamethyldisilazane: A study on hepatic endothelial cells. J Microsc. 186 (Pt 1), 84-87 (1997).">Braet, F., De Zanger, R., Wisse, E. Drying cells for SEM, AFM and TEM by hexamethyldisilazane: A study on hepatic endothelial cells. J Microsc. 186 (Pt 1), 84-87 (1997).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Leptospira BiofilmsBiofilm QuantificationCrystal Violet AssayConfocal MicroscopyScanning Electron MicroscopyBiofilm StructureBiofilm VirulenceTime Lapse ImagingBiofilm FractionationExtracellular Matrix

Related Articles