Methodenartikel

Superresolutiebeeldvorming van hele cellen via DNA-PAINT op een draaiende schijf confocaal met optische fotonhertoewijzing

1.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/69531

⸱

6 januari 2026

 ,  ,  , 
1London Centre for Nanotechnology, University College London, 2Department of Chemistry, University College London

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft de procedure voor het uitvoeren van diepe, whole-cell single-molecule localization microscopy (SMLM) met behulp van een draaiende schijf confocale microscoop met optische fotonherplaatsing, waardoor DNA-PAINT-beeldvorming mogelijk is zonder de noodzaak van aangepaste optica of complexe verlichting.

Samenvatting

Single-molecule localisatiemicroscopie (SMLM) maakt nanoschaalbeeldvorming van cellulaire structuren mogelijk, maar is doorgaans beperkt tot beeldvorming nabij de coverslip vanwege de beperkingen van totale interne reflectiefluorescentie (TIRF) en sterk hellende en optische sheet (HILO) verlichting. Hier wordt een protocol gepresenteerd dat gebruikmaakt van een draaiende schijf confocale microscoop uitgerust met optische fotonhertoewijzing (SDC-OPR) om SMLM uit te voeren in hele cellen. Deze methode maakt hoogprecisie-beeldvorming van één molecuul mogelijk over het volledige celvolume met behulp van DNA-puntenaccumulatie voor beeldvorming in nanoschaaltopografie (DNA-PAINT), zonder dat er aangepaste optiek of complexe verlichtingsschema's nodig zijn. Het protocol biedt een stapsgewijze gids voor het configureren van een commercieel verkrijgbare draaiende schijfmicroscoop (bijv. CSU-W1 SoRA) voor SMLM-beeldvorming, inclusief verwervingsparameters geoptimaliseerd voor diepe beeldvorming. Monstervoorbereidingsstappen zijn uiteengezet voor het labelen van intracellulaire doelen met DNA-geconjugeerde probes om DNA-PAINT-beeldvorming uit te voeren, inclusief strategieën voor meerkleurige beeldvorming van meerdere doelen. Beeldacquisitie wordt gevolgd door localisatie en reconstructie van één molecuul met behulp van standaard softwarepakketten. Belangrijke overwegingen voor het minimaliseren van achtergrond, het optimaliseren van laterale resolutie en het waarborgen van beeldkwaliteit over de volledige celdiepte worden ook besproken. Dit toegankelijke protocol stelt onderzoekers in staat om diepe, whole-cell SMLM uit te voeren met standaard confocale apparatuur, waardoor het scala aan biologische vragen die met enkelmolecuulbeeldvorming behandelbaar zijn, buiten de nabij-membraangebieden wordt uitgebreid.

Inleiding

Single-molecule localization microscopy (SMLM)1 is een familie van superresolutietechnieken die nanoschaalresolutie bereiken door de emissie van individuele fluoroforen temporeel te scheiden en deze met hoge precisie te lokaliseren. Succesvolle SMLM vereist een hoge signaal-ruisverhouding (SNR) om enkelmolecuulgebeurtenissen te detecteren, wat traditioneel beperkt is tot optische opstellingen die intense, lokale excitatie bieden. De meest voorkomende configuraties zijn totale interne reflectiefluorescentie (TIRF)2 microscopie en sterk hellend gelamineerd optisch plaatje (HILO) verlichting3. TIRF vermindert achtergrondfluorescentie door een evanescent veld te creëren dat fluoroforen selectief binnen enkele nanometers van de coverslip exciteert, waardoor onscherpe verlichting wordt onderdrukt. Deze beperking maakt TIRF echter ongeschikt voor het in beeld brengen van diepere biologische structuren, zoals organellen die zich uitstrekken in het extracellulaire domein. HILO-microscopie biedt grotere penetratiedieptes, waardoor beeldvorming enkele honderden nanometers boven het glassubstraat mogelijk is. Dit gaat ten koste van een verminderd gezichtsveld (FOV)4 en ongelijkmatige belichting met steeds hogere vlakken, waardoor de toepasbaarheid voor grotere cellulaire structuren beperkt wordt. Meer recentelijk hebben light-sheet microscopie (LSM) technieken zoals lattice light-sheet 5,6,7 en single objecte single plane illumination microscopy (soSPIM)8 SMLM uitgebreid naar volumetrische en weefselschaalbeeldvorming. Door de excitatiestraal te vormen tot dunne, gestructureerde lichtplaten, bereikt LSM optische doorsnede met verminderde achtergrond- en fototoxiciteit. SoSPIM legt brandvlakken vast die orthogonaal zijn op de detectieas in één enkele opname, waardoor snelle volumetrische beeldvorming met een bijna-isotrope resolutie mogelijk is. De soSPIM-toepassing heeft 3D SMLM aangetoond in hele cellen en kleine organellen (>20 μm diepte) met een isotrope resolutie tot 40 nm, en met minimale onscherpe achtergrond9. Ondanks hun sterke punten vereisen deze methoden doorgaans transparante monsters, gespecialiseerde optiek en complexe uitlijning, en blijven ze gevoelig voor optische aberraties en verstrooiing in dikkere exemplaren.

Confocale microscopie biedt een alternatief door onscherp licht te verwerpen via een gaatje voor de detector, gecombineerd met straalscannende spiegels10. Deze optische doorsnede-mogelijkheid maakt diepe volumetrische beeldvorming met een hoge SNR mogelijk. In het bijzonder combineert spinning disk confocal (SDC) microscopie de snelheid en breedvelddetectie van conventionele beeldvorming met de sectiecapaciteit van puntscanningssystemen. Dit wordt bereikt in conventionele SDC door de toevoeging van een roterende schijf met parallelle gaatjes, vaak gecombineerd met een uitgelijnde microlensarray. De microlenzen verzamelen een aanzienlijk deel van de uitgezonden fluorescentie en focussen deze via de gaatjes, wat het achtergrondsignaal vermindert. Deze configuratie biedt snelle optische doorsnijding zonder de noodzaak van gespecialiseerde optiek of extra monstermontage, waardoor het een robuuste keuze is die gemakkelijk geïmplementeerd en geoptimaliseerd kan worden voor diepe volumetrische SMLM-beeldopname11.

In deze studie wordt de CSU-W1 draaiende schijf confocale scanner-eenheid gebruikt die is uitgerust met optische fotonhertoewijzing (SDC-OPR). In tegenstelling tot standaard SDC introduceert SDC-OPR een tweede microlensarray die de uitgezonden fotonen projecteert op een complementair gaatjespatroon12, om verstrooiing te beperken en fotonen terug te winnen die anders zouden worden weggegooid. Deze fotonhertoewijzing verscherpt effectief de point spread function (PSF), waardoor de laterale resolutie verder wordt verbeterd dan die van conventionele SDC, terwijl het onscherp licht13 nog steeds wordt afgestoten. Specifiek leidt de SDC-OPR microlensarray fotonen buiten de as om naar hun dichtstbijzijnde oorsprongspunten, waardoor de gedetecteerde fluorescentiehelderheid effectief toeneemt ten opzichte van standaard SDC. Bovendien kunnen de resolutievoordelen van SDC-OPR worden versterkt via beelddeconvolutie. Iteratieve deconvolutie-algoritmen verfijnen de PSF computationeel, verminderen achtergrond en verbeteren de signaal-achtergrondverhouding zonder dat de optische configuratie hoeft te worden gewijzigd. Deze gecombineerde aanpak biedt een aanzienlijk voordeel qua lokalisatieprecisie ten opzichte van standaard SDC voor localisatie-experimenten met één molecuul14.

Hier wordt een robuust en reproduceerbaar protocol voor single-molecule localisatiemicroscopie gepresenteerd met behulp van een draaiende schijf confocale microscoop uitgerust met optische fotonhertoewijzing (SDC-OPR). Deze benadering combineert de nanoschaalprecisie van DNA-PAINT met de snelheid, FOV en diepte-penetratie van draaiende schijfbeeldvorming. DNA-PAINT, een aanpassing van puntaccumulatie voor imaging nanoscale topografie (PAINT)15, is afhankelijk van de tijdelijke hybridisatie van fluorescerend gelabelde "imager"-strengen met complementaire "docking"-strengen die aan moleculaire doelen zijn verankerd. Deze omkeerbare bindingsgebeurtenissen genereren stochastische fluorescentiesignalen die nauwkeurig gelokaliseerd kunnen worden, waardoor een reconstructie van de cellulaire ultrastructuur met hoge resolutie mogelijk is. DNA-PAINT maakt het gebruik van zeer fotostabiele fluoroforen mogelijk, biedt afstembare bindingskinetiek voor nauwkeurige controle van beeldvormingscondities, en vermindert fotobleaching door de continue aanvulling van fluorescerende beeldstofstrengen16.

Om reproduceerbaarheid en specificiteit te waarborgen, maakt de aanpak gebruik van aangepaste DNA-antilichaamconjugaten die dockingstrengen koppelen aan secundaire antilichamen. Gedetailleerde monstervoorbereidingsstappen, inclusief antilichaam-DNA-conjugatie, worden gepresenteerd om robuuste experimentele uitkomsten te ondersteunen. Het protocol wordt gevalideerd op goed gekarakteriseerde cellulaire structuren zoals nucleaire poriecomplexen (NPC's)17 en microtubuli in vaste monsters, wat een referentiepunt biedt bij het schatten van de reconstructienauwkeurigheid. Variaties in resolutie, gekwantificeerd via lokalisatieprecisie als proxy, worden verder beoordeeld als functie van FOV en beelddiepte.

Daarnaast wordt de efficiëntie van deze workflow voor multiplexing beeldvorming aangetoond met behulp van Exchange-PAINT18, een strategie die sequentiële visualisatie van meerdere doelen met dezelfde kleurstof en één laserbron op basis van DNA-PAINT mogelijk maakt. De Exchange-PAINT workflow wordt toegepast op multicolor superresolutiebeeldvorming van mitochondriën, microtubuli en NPC's binnen hetzelfde monster.

Samen biedt dit protocol uitgebreide richtlijnen en belangrijke aanpasbaarheidsnotities over antilichaam-DNA-conjugatie, monstervoorbereiding, beeldvormingscondities en data-analyse, waardoor onderzoekers reproduceerbare DNA-PAINT-beeldvorming op SDC-OPR kunnen uitvoeren. Door beeldvorming met hoge resolutie uit te breiden voorbij de diepte- en FOV-beperkingen van TIRF-gebaseerde benaderingen, verbreedt deze methode de toepasbaarheid van SMLM op een breed scala aan biologische contexten.

Protocol

De reagentia en de gebruikte apparatuur worden vermeld in de Materiaaltabel.

1. Voorbereiding van buffers

  1. Cytoskeletbuffer (CB) voorbereiding:
    1. Bereid 10 mM MES (pH 6,1) voor met 150 mM NaCl, 5 mM EGTA, 5 mM D-glucose en 5 mM MgCl2 in 1x gefilterde fosfaatbufferoplossing (PBS).
    2. Bewaar op 4 °C en filter voor gebruik.
  2. 40x protocatechuïnezuur (PCA) voorraadbereiding:
    1. Los 154 mg PCA op in 10 mL gedistilleerd, gefilterd water.
    2. Stel de pH in naar 9,0 met NaOH.
    3. Aliquot en bewaren bij -20°C maximaal 6 maanden.
      OPMERKING: Als een aliquot bruin lijkt, gooi deze dan weg, want dit duidt op oxidatie.
  3. 100x protocatechuaat-3,4-dioxygenase (PCD) voorraadpreparaat:
    1. Maak een glyceroloplossing van 50% met 50 mM KCl, 1 mM EDTA en 100 mM Tris buffer.
    2. Los 2,2 mg PCD op in 3,4 mL glyceroloplossing.
    3. Aliquot en bewaar bij -20 °C maximaal 6 maanden.
  4. 100x Trolox kolf voorbereiding:
    1. Los 50 mg Trolox (6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromaan-2-carboxylzuur) op in 215 μL methanol totdat de oplossing groen wordt binnen een chemische dampkap met de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM).
    2. Voeg 1,6 ml gedestilleerd, gefilterd water toe. Laat de oplossing wit worden en begin te stollen.
    3. Voeg 175 μL van 1M NaOH 1M toe. Laat de oplossing weer vloeibaar worden.
    4. In volumes van 10 μL blijf je 1 M NaOH toevoegen totdat de oplossing volledig is geklard (ongeveer 40 μL).
    5. Aliquot en bewaar bij -20 °C maximaal 6 maanden. De uiteindelijke oplossing lijkt geelachtig.
      OPMERKING: De uiteindelijke 100x-oplossing heeft een pH van 11, maar verdunning naar 1x resulteert in een pH van 7-8.
  5. Buffer C+
    1. Maak 1 mM EDTA, 500 mM NaCl en 0,02% Tween-20-oplossing in 1x PBS.
    2. Stel de pH aan naar 7,4 met HCl en/of NaOH indien nodig.
    3. Optioneel Trolox-supplement: Voeg de benodigde volumes van PCA (40x), PCD (100x) en Trolox (100x) toe om 1x verdunning te bereiken, laat de oplossing 1 uur in evenwicht zijn bij kamertemperatuur (23 °C) voordat je het gebruikt.
      OPMERKING: Bereid wekelijks verse voor. Als je Trolox gebruikt, gebruik het dan binnen 4 uur na het mengen.
  6. Immunokleuringsbuffers (paraformaldehyde PFA, glycine en triton):
    1. Voor 4% PFA-bereiding uit een 10 mL 16% PFA-ampul:
      1. Binnen een chemische dampkap klik je voorzichtig de ampul open.
      2. Dekanteer 10 mL 16% PFA in een 50 mL conische centrifugaalbuis.
      3. Voer een 1:4 verdunning uit in 1x PBS om 4% PFA te krijgen, waarbij je zorgvuldig ~30 mL 1x gefilterde PBS toevoegt aan de gedecanteerde 16% PFA, zodat het uiteindelijke volume ~40 mL is.
      4. Aliquot in 1 mL microcentrifugebuizen en opslaan bij -20 °C totdat het nodig is.
    2. Voor 60 mM glycine in PBS-bereiding:
      1. Weeg 225 mg glycine in een 50 mL conische centrifugale buis.
      2. Voeg 50 ml 1x gefilterde PBS toe.
      3. Vortex tot volledig gemengd en filter.
      4. Bewaar op 4 °C tot het nodig is.
    3. Voor 0,1% Triton X-100 voorbereiding:
      1. Bereid eerst een werkvoorraad van 10% Triton X-100 voor door 1 mL 100% Triton X-100 te verdunnen in 9 mL 1x gefilterde PBS (eindvolume = 10 mL), pipetteer en meng langzaam om overbubbels te voorkomen. Bewaar op 4 °C tot het nodig is.
      2. Voeg van de 10% werkende voorraad 0,1 mL 10% Triton X-100 toe aan 9,9 mL 1x gefilterde PBS voor de 0,1% eindvoorraad, en meng opnieuw langzaam. Bewaar op 4 °C tot het nodig is.

2. Antilichaam-DNA conjugatie

  1. Concentreer het antilichaam met een 100 kDa ultrafiltratie-centrifugaalfiltereenheid:
    1. Was een 100 kDa ultrafiltratie-centrifugaalfilterunit met 100 μL 1x gefilterde PBS gedurende 30 minuten bij 14.000 x g, 4 °C.
    2. Voeg 100 μL antilichaam toe met 200 μL 1x gefilterde PBS aan de eerder gewassen 100 kDa ultrafiltratie-centrifugaalfilterunit, draai 30 minuten bij 14.000 x g, 4°C. Zorg ervoor dat de antistofconcentratie hoger is dan 1,5 mg/mL na concentratie met het ultrafiltratie-centrifugaalfilter. Met deze methode concentreert het ultrafiltratie-centrifugaalfilter het antilichaam meestal ~3x.
    3. Draai de 100 kDa ultrafiltratie-centrifugaalfilterunit om in een schone buis, draai 6 minuten op 1000 x g, 4 °C. Dit is het geconcentreerde antilichaam in PBS.
    4. Meet het volume van het geconcentreerde antilichaam (1 of 2 μL) om de nieuwe concentratie te berekenen en voer UV-Vis absorptiespectra uit met een microvolume UV-Vis spectrofotometer. Stel de achtergrond in op 1x PBS en sla de spectra op.
  2. Verminder de gethioleerde DNA-dockingstreng:
    1. Los 7,7 mg voorgewogen DTT op in 100 μL gefilterd water en doe het over in een verse buis.
    2. Voeg 100 μL 3 mM EDTA in 1x PBS toe aan de originele buis DTT, vortex, en transfer naar dezelfde buis als stap 2.2.1, wat resulteert in 200 μL 250 mM DTT in 1,5 mM EDTA in 1x PBS.
    3. Los het gethioleerde DNA-dockingstreng op in 1x gefilterd PBS voor een uiteindelijke concentratie van 1 mM. Neem een UV-Vis-spectra van de DNA-dockingstrengoplossing op (verdund tot 10 μM in 1x PBS) en sla deze op met de microvolume UV-Vis spectrofotometer.
    4. Meng 13 μL gethiolakt DNA (1 mM) met 30 μL DTT (250 mM), schud 2 uur bij kamertemperatuur (23 °C).
      OPMERKING: Bewaar eventuele resterende niet-gebruikte DNA-dockingstrengen in 13 μL aliquots bij -20 °C voor toekomstige reacties.
  3. Antilichaamconjugatie naar crosslinker:
    1. Los maleimide-PEG2-succinimidylester-kruisverbinder op in DMSO tot 10 mg/mL (23,5 mM). Bewaar 10 μL aliquots bij -20 °C totdat het nodig is.
    2. Meng geconcentreerd antilichaam uit stap 2.1 met 20x molair overschot van de crosslinker. Broed 90 minuten uit, schud, op 4 °C.
  4. Zuiver antilichaam-crosslinkerfiltering met een 7,0 KDa spin-desaltingkolom die grootte-uitsluitingshars bevat (7 kDa molecuulmassa afkap):
    1. Verwijder de onderste sluiting van de 7,0 kDa spin desalting kolom en maak de dop los. Plaats het in een eiwit-laagbindende microcentrifugebuis. Centrifugeer 1 minuut op 1500 x g, 4 °C.
      OPMERKING: Markeer de helling van de hars na de eerste draai. Voor alle volgende toepassingen van de kolom plaats je de schuine lijn direct naar buiten op de centrifuge. Breng monsters en washes aan in het midden en vermijd contact met het resinbed.
    2. Voeg 300 μL 1x gefilterd PBS toe aan het 7,0 kDa spin-desaltingskolomfilter, maak de dop los, centrifugeer 1 minuut bij 1500 x g, 4 °C. Herhaal nog twee keer.
      OPMERKING: Laat de 7,0 KDa spin-ontzoutingskolom met 300 μL 1x PBS zitten totdat de antilichaam-crosslinkerreactie klaar is; Laat de kolom niet uitdrogen.
    3. Verwijder de laatste 300 μL PBS-wash door opnieuw 1 minuut te centrifugeren op 1500 x g, 4 °C.
    4. Breng de antilichaam-crosslinkeroplossing aan op het midden van het harsbed, dropwise. Plaats de 7,0 kDa spin-ontzoutingskolom in een schone microcentrifugebuis, centrifugeer 2 minuten op 1500 x g, 4 °C. Het antilichaam-crosslinkerproduct bevindt zich nu in de microcentrifugebuis; Houd het op 4 °C of blijf op ijs.
  5. Zuiver het DNA-DTT-mengsel met ontzoutende spinkolommen met Sephadex G-25 (grootte-uitsluitingshars voor DNA-zuivering):
    1. Vortex de ontsaltende spinkolommen (DNA-zuivering) zodat de hars gelijkmatig verdeeld is. Verwijder de onderste sluiting en maak de dop los, en plaats hem in een schone microcentrifugebuis.
    2. Centrifuge-ontzoutingsspinkolommen (DNA-zuivering) op 735 x g gedurende 1 minuut om opslagbuffer te verwijderen.
    3. Plaats ontzoutende spinkolommen (DNA-zuivering) in een verse microcentrifugebuis en voeg langzaam het DNA/DTT-mengsel toe aan het midden van de hars. Centrifugeer op 735 x g gedurende 2 minuten. Het gezuiverde, gereduceerde DNA zal nu in de microcentrifugebuis zitten.
  6. Combineer DNA en antilichaam-crosslinkerproducten:
    1. Voeg het gereduceerde DNA toe aan het antilichaam-crosslinkerproduct bij een 10x molair overschot aan DNA:antilichaam. Meng het gezuiverde DNA direct na de zuivering met het antilichaam-crosslinkerproduct. Dit voorkomt dat DNA opnieuw bindt.
    2. Broed 's nachts uit, trillend, op 4 °C.
      OPMERKING: Meng het DNA en het antilichaam in de late namiddag en zuiver ze direct de volgende ochtend. Langdurige incubatie van DNA en antistoffen kan leiden tot hoge DNA:antistofverhoudingen.
  7. Verwijder overtollig DNA de volgende ochtend met een 100 kDa ultrafiltratie-centrifugaalfilter:
    1. Was de 100 kDa ultrafiltratie centrifugale filterunit met 300 μL 1x gefilterde PBS gedurende 30 minuten op 14.000 x g, 4 °C.
    2. Voeg het DNA-antistofmengsel toe met 300 μL 1x gefilterde PBS aan de 100 kDa ultrafiltratie centrifugale filterunit en draai 30 minuten op 14.000 x g, 4 °C.
    3. Draai de ultrafiltratie-centrifugale filterunit om in een schone buis, draai 6 minuten op 1000 x g, 4 °C. Dit is het geconcentreerde product in PBS.
    4. Verdun het product tot 100 μL in 1x gefilterde PBS.
    5. Neem een UV-Vis-spectra van het product op (1 of 2 μL) met de microvolume UV-Vis spectrofotometer, met een achtergrond van 1x PBS, en sla de spectra op.
    6. Meet de uiteindelijke concentratie en DNA:antistofverhouding uit de spectra. Observeer een verschuiving in de absorptiepiek van het antilichaam van 280 nm naar 260 nm, door de extra absorptie van het DNA. Gebruik stap 2.8 om de concentratie en DNA:antistofverhouding te bepalen.
    7. Bewaar het product onder de oorspronkelijke opslagomstandigheden van het gebruikte antilichaam. Als het vriest, vermijd dan vries-dooicycli.
  8. Bereken de DNA:antistofverhouding uit de UV-Vis-spectra:
    1. Uit de spectra van puur DNA (10 μM in 1x PBS) wordt de absorptiewaarden gemeten bij 260 nm (Vergelijking 1) en 280 nm (Vergelijking 2). Divisie deze door de DNA-concentratie (10 μM) om de molaire absorptiecoëfficiënten van DNA te vinden (Vergelijking 3 en Vergelijking 4).
    2. Herhaal voor het antilichaam om en Vergelijking 6te vindenVergelijking 5, en denk eraan te delen door de concentratie van het antilichaam dat voor de spectra wordt gebruikt.
    3. Uit de productspectra hangt de absorptie bij 260 nm en 280 nm af van zowel de absorptie van het DNA als het antilichaam:
      Vergelijking 7
      Vergelijking 8
      Waarbij cDNA en cAb respectievelijk de concentraties van DNA en antilichaam zijn binnen het eindproduct. Los deze vergelijkingen gelijktijdig op om de molaire concentratie van zowel DNA als antilichaam binnen het product te vinden. Bereken de verhouding DNA:antistof met behulp van deze concentraties.
      OPMERKING: De concentratie van het antilichaam voor de eerste spectra kan worden berekend door het volume antilichaam dat na de filtratie overblijft te meten met ultrafiltratie-centrifugaalfilterunit 100 kDa filtratie en dit te vergelijken met het oorspronkelijke volume (met bekende concentratie) van het gebruikte antilichaam.

3. Celcultuur

  1. HeLa Kyoto mEGFP-Nup107-cellen.
    1. Maak een voorraad celkweekmedium, Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), aangevuld met 10% foetaal rundvleesserum (FBS) en 1% penicilline/streptomycine (P/S), en bewaar dit bij 4 °C. Verwarm het medium 30 minuten voor gebruik in een 37 °C waterbad. Afhankelijk van de werkomstandigheden wordt aanbevolen om de benodigde hoeveelheid te aliquoteren en te filteren om besmetting te voorkomen.
    2. Zaadcellen bij 2 x 105 cellen/mL in 7 mL voorverwarmde aangevuld DMEM-media in T25-kolven. Plaats de celflessen in een geschikte broedmachine bij 37 °C en 5%CO2-omgeving .
    3. Zorg voor een doorgang elke 48-72 uur om overbevolking te voorkomen.
      1. Neem de T25-fles met de confluente cultuur en aspiraat medium uit de kolf.
      2. Pipett 1 mL trypsine EDTA (TE), waarbij volledige dekking wordt gegarandeerd door de kolf voorzichtig te kantelen. Incubeer 7 minuten bij 37 °C om celloskoppeling van de kolf mogelijk te maken.
      3. Voeg 2 ml aangevuld DMEM-medium toe en tritureer.
      4. Breng de celsuspensie over in een 15 mL conische centrifugaalbuis met een extra 7 mL aangevuld DMEM-medium.
      5. Centrifugeer op 400 x g gedurende 5 minuten. Controleer zorgvuldig op de vorming van pellets aan de onderkant van de buis zonder deze te verstoren.
      6. Aspireer het medium en suspendeer de celpellet opnieuw in aangevuld DMEM-media.
      7. Zaad 2 x 105 cellen /mL in een nieuwe T25-kolf met 7 mL voorverwarmd medium. Incubeer bij 37 °C en 5%CO2.
        OPMERKING: Als men onzeker bent over de celdichtheid, kan men een hemocytometer gebruiken om het aantal cellen te bepalen. Het wordt aanbevolen om te beginnen met een 1 mL pellet-ophanging voordat je telt.
  2. U2OS CRISPR mEGFP-Nup96-cellen
    1. Bereid een 10% FBS en 1% P/S aanvullend op McCoy's 5A media, volgens stap 3.1.1.
    2. Zaadcellen met 2 x 105 cellen/mL in 7 mL aangevuld McCoy's 5A-medium in T25-kolven. Incubeer bij 37 °C en 5%CO2.
    3. Passage elke 48 uur om de kweekgroei onder de 80% confluentie te houden:
      1. Aspireer het medium uit de fles en was de hechtende kweek voorzichtig met 2 ml gefilterde, vooropgewarmde (37 °C) 1x PBS.
      2. Aspireer PBS en voeg 2 mL Accutase toe, kantel de kolf langzaam om volledige dekking te garanderen, en incubeer dan 7 minuten bij 37 °C.
      3. Voeg 2 ml aangevuld McCoy's 5A medium toe en tritureer.
      4. Voeg 7 ml medium toe aan de celsuspensie en breng dit over in een 15 mL of 50 mL conische centrifugaalbuis voor centrifugatie. Centrifugeer op 400 x g gedurende 5 minuten en controleer op de vorming van de pellets onderin de buis.
      5. Sussen de celpellet opnieuw in de aangevuld 5A-media van McCoy.
      6. Zaad op 2 x 105 cellen /mL in een nieuwe T25-kolf met 7 mL voorverwarmd medium. Incubeer bij 37 °C en 5%CO2.
        OPMERKING: Verwarm alle aan cellen toegevoegde oplossingen tot 37 °C in een water- of kralenbad. Voor Accutase kun je slechts 2 mL aliquots verwarmen voor maximaal 5 minuten om degradatie te voorkomen.

4. Immunokleuring van Nup96, mitochondriën en microtubuli

  1. Voorbereiding van U2OS mEGFP-Nup96-cellen
    1. Volg de stappen in stap 3.2, aspireer het medium uit de T25-kolf en was de vastzittende cellen voorzichtig met 2 mL 1x gefilterde PBS.
    2. Aspiratief PBS en voeg 2 ml Accutase toe, kantel de fles langzaam op en neer, en incubeer 7 minuten bij 37 °C om celloslating te bevorderen.
    3. Voeg 2 ml aangevuld McCoy's 5A medium toe en tritureer.
    4. Topcel-suspension met 7 mL aangevuld McCoy's 5A-medium en het overbrengen naar een 15 mL of 50 mL conische centrifugaalbuis voordat het wordt gecentrifugeerd op 400 x g gedurende 5 minuten. Controleer opnieuw op de vorming van pellets aan de onderkant van de buis.
    5. Sussen de celpellet opnieuw in de aangevuld 5A-media van McCoy.
    6. Zaadcellen op 1 x 105 cellen /mL in 8-well microslides en incuberen 's nachts in de celincubator (37 °C, 5% CO2).
      OPMERKING: Zaad de cellen 24 uur voor fixatie en immunokleuring, om hechting te waarborgen.
  2. Immunokleuring van U2OS mEGFP-Nup96-cellen voor Nup96-beeldvorming
    1. Na nachtelijke incubatie vervang de McCoy's 5A-media in de 8-well microslides door 1x gefilterde PBS. Snel achter elkaar aspireer je het PBS en voeg je de voorverwarmde (37 °C) 4% PFA-fixatieoplossing toe in een chemische dampkap.
    2. Laat cellen 30 minuten fixeren bij kamertemperatuur (23 °C), bij voorkeur binnen de chemische afzuigkap, voordat de PFA wordt gewassen en afval wordt weggegooid. Alle stappen kunnen nu op kamertemperatuur worden uitgevoerd, tenzij anders vermeld.
    3. Verwijder de 4% PFA-fixatieoplossing en was de glaasje 3x 3 minuten met 1x PBS.
      VOORZICHTIG: Gebruik PFA in een chemische dampkap terwijl je de juiste PBM draagt.
    4. Na fixatie permeabiliseer je het celmembraan door 0,1% Triton X-100 toe te voegen aan 1x PBS-oplossing. Laat het 5 minuten intrekken, was dan 3 x 3 minuten met 60 mM glycine in 1x PBS om de autofluorescentie van resterende PFA te dempen.
      OPMERKING: Tritonpermeabilisatieoplossing is extreem tijdgevoelig en kan de celstructuur veranderen als het te lang blijft zitten.
    5. Voeg 5% BSA toe in 1x PBS gedurende 1 uur in het donker, om cellen te blokkeren voordat je immunokleuring begint.
    6. Bereid 20 nM van de DNA-geconjugeerde anti-GFP nano voor in blokkerende oplossing (5% BSA in 1x PBS) om onspecifieke binding blokkering te voorkomen. Incubeer de glaasglaasje met het nanono-mengsel 1 uur op kamertemperatuur (23 °C), en was daarna de ongebonden DNA-strengen 3 x 3 minuten met 1x gefilterd PBS.
      OPMERKING: Pauzepunt: Na fixatie, blokkering en toevoeging van antilichamen kunnen monsters een nacht op 4 °C worden bewaard. Dit pauzepunt wordt voornamelijk opgenomen vanwege de tijd die nodig is voor de monstervoorbereiding, en niet vanwege de strikte noodzaak van het protocol. De beeldvorming kan direct na deze stappen worden uitgevoerd indien gewenst.
  3. Immunokleuring van U2OS mEGFP-Nup96-cellen voor mitochondriën en microtubuli-beeldvorming
    1. Na de incubatie gedurende de nacht vervang je gelijktijdig het DMEM-medium in de 8-put microslides met 200 μL 0,3% glutaraldehyde en 0,25% Triton X-100 in cytoskeletbuffer (CB) en laat je het 2 minuten prefixeren.
    2. Vervang de prefixatieoplossing door cytoskeletbuffer (CB) aangevuld met 2% glutaraldehyde. Laat het 10 minuten staan om de cellen te herstellen, was de diparaat dan 3 x 3 minuten met 60 mM glycine in PBS, zoals in stap 4.2.4.
      VOORZICHTIG: Gebruik glutaraldehyde in een chemische dampkap terwijl je de juiste PBM draagt.
    3. Voeg geschoren zalmspermad-DNA toe in 3% BSA in 1x PBS gedurende 1 uur in het donker, om cellen te blokkeren vóór immunokleuring.
    4. Voeg 5 μg/mL DNA-geconjugeerde antitubuline toe (geconjugeerd zoals hierboven beschreven), voor microtubuli-beeldvorming, en/of 1:200 TOM20-antilichaam voor mitochondriën beeldvorming, in 2% BSA gedurende 2 uur bij kamertemperatuur (23 °C). Was 3 x 3 minuten met 1x PBS.
    5. Voeg 25 nM DNA-geconjugeerde sdAb anti-Konijn IgG toe en incubeer 1 uur bij kamertemperatuur (23 °C). Was 3 x 3 minuten met 1x PBS.
      OPMERKING: Pauzepunt: Na fixatie, blokkering en toevoeging van antilichamen kunnen monsters een nacht op 4 °C worden bewaard. Dit pauzepunt wordt voornamelijk opgenomen vanwege de tijd die nodig is voor de monstervoorbereiding, en niet vanwege de strikte noodzaak van het protocol. De beeldvorming kan direct na deze stappen worden uitgevoerd indien gewenst.
  4. Bereiding van HeLa Kyoto mEGFP-Nup107-cellen
    1. Aspireer het medium uit de T25-kolf van HeLa Kyoto mEGFP-Nup107-cellen en was de kolf voorzichtig met 2 mL 1x gefilterde PBS.
    2. Aspireer PBS en voeg 2 ml trypsine EDTA (TE) toe en kantel de kolf langzaam op en neer, incubeer bij 37 °C gedurende 7 minuten.
    3. Voeg 2 ml aangevuld DMEM-medium toe en tritureer.
    4. Voeg celoplossing toe aan een 15 mL conische centrifugaalbuis met een extra 7 mL aangevuld DMEM-medium en centrifugeer op 400 x g gedurende 5 minuten. Controleer op pelletvorming aan de onderkant van de buis.
    5. Suspendeer de celpellet opnieuw in aangevuld DMEM-medium.
    6. Zaadcellen op 1 x 105 cellen /mL in 8-well microslides.
      OPMERKING: Zaadcellen 24 uur voor beeldvorming.
  5. Immunokleuring van HeLa Kyoto mEGFP-Nup107 voor microtubuli
    1. Na de incubatie gedurende de nacht vervang je gelijktijdig het DMEM-medium in de 8-put microslides met 200 μL 0,3% glutaraldehyde en 0,25% Triton X-100 in cytoskeletbuffer (CB) en laat je het 2 minuten prefixeren.
    2. Vervang de prefixatieoplossing door 2% glutaraldehyde in CB en laat het 10 minuten voor celfixatie. Was 3 x 3 minuten met 60 mM glycine in 1x PBS.
      VOORZICHTIG: Gebruik glutaraldehyde in een chemische dampkap terwijl je de juiste PBM draagt.
    3. Voeg 5% BSA toe in 1x PBS gedurende 1 uur in het donker, om cellen te blokkeren voordat je immunokleuring begint.
    4. Voeg 5 μg/mL DNA-geconjugeerde antitubuline toe (geconjugeerd zoals hierboven beschreven), voor microtubuli-beeldvorming in 5% BSA in 1x PBS gedurende 2 uur bij kamertemperatuur (23 °C). Was 3 x 3 minuten met 1x PBS.
      OPMERKING: Pauzepunt: Na fixatie, blokkering en toevoeging van antilichamen kunnen monsters een nacht op 4 °C worden bewaard. Dit pauzepunt wordt voornamelijk opgenomen vanwege de tijd die nodig is voor de monstervoorbereiding, en niet vanwege de strikte noodzaak van het protocol. De beeldvorming kan direct na deze stappen worden uitgevoerd indien gewenst.
    5. OPMERKING: Bij het werken met alternatieve antilichamen of cellijnen pas je de verdunningsfactoren aan voor het DNA-gekoppelde antilichaam of nano volgens de aanbevelingen van de fabrikant.
  6. Beeldvormingsvoorbereiding
    OPMERKING: Deze stap is gebruikelijk voor alle immunokleuringsprotocollen.
    1. Voeg 90 nm gouden nanodeeltjes die 1:2 verdund zijn in gedeïoniseerd water direct toe aan elke put, waarbij je het volledige putvolume gebruikt. Incubeer 5 minuten om toekomstige driftcorrectie tijdens de beeldvorming mogelijk te maken. Was de putten 3 keer met 1x PBS.
    2. Voor Nup96-beeldvorming voeg je de gewenste beeldstofstreng toe op 1 nM in C+ buffer, aangevuld met 1x Trolox, 1x PCA en 1x PCD.
    3. Voor Exchange-PAINT van mitochondriën en/of microtubuli voeg je de eerste gewenste beeldvormerstreng toe op 1 nM in alleen de C+-buffer. Na de eerste ronde wordt het monster grondig maar zorgvuldig gewassen om alle resterende beeldvormers te verwijderen zonder het monster te verplaatsen. Meestal is het voldoende met 5 wasbeurten en een wachttijd van 30 seconden ertussen. Voeg vervolgens de tweede beeldstofstreng toe op 1 nM in C+ buffer alleen voor de tweede ronde beeldvorming.

5. Beeldvormingsopstelling en parameters: Single-molecule localisatiemicroscopie

OPMERKING: Beelden die in dit protocol worden getoond, zijn verkregen in de LMCB superresolutie microscopiefaciliteit aan University College London, VK, met behulp van een commercieel verkrijgbare draaiende schijf confocale microscoop, uitgerust met een sCMOS-camera, en bediend via NIS-Elements-software.

  1. Gebruik een draaiende schijf confocale systeem met multifocale excitatie en een sCMOS-camera.
  2. Start het systeem 30 minuten voor de beeldvorming: zet de microscoop, camera en lasers aan, en start dan de computer. Wacht tot de NIS-Elements-software volledig geladen is.
  3. Selecteer de juiste beeldvormingsmodus in NIS-Elements: standaard draaiende schijf confocale of SDC-OPR SoRA superresolutie, voordat je de acquisitieparameters instelt.
  4. Kies het 60× Apo NA 1.49 olie-immersieobjectief voor zowel SDC- als SDC-OPR-beeldvorming om de detectie van enkelmolecuul-gebeurtenissen te maximaliseren voor een verbeterde nabewerking.
  5. Selecteer de juiste vergroting (1×, 2,8× of 4×) op basis van het objectief, de camera-instellingen en het te bestuderen monster. Pas de binning van de camera dienovereenkomstig aan: 1× binning voor 1× vergroting, 2× binning voor 2,8× en 4× binning voor 4×. Voor deze opstelling komt dit overeen met effectieve pixelgroottes van 108 nm voor 1× (geen binning) of 4× (4× binning), en 78 nm voor 2,8× (2× binning). Binning is nodig om pixelgroottes te verkrijgen die geschikt zijn voor SMLM, ongeveer overeenkomend met de PSF-standaarddeviatie (typisch 100-150 nm)19,20.
    OPMERKING: Hogere vergrotingen (2,8× of 4×) verhogen de laservermogensdichtheid, wat de uniformiteit van de verlichting verbetert. Dit vermindert het gezichtsveld, dus moet binning proportioneel worden aangepast (bijv. binning 2× binning voor 2,8× vergroting; 4×binning voor 4× vergroting) om de pixelgrootte te behouden.
  6. Stel de belichtingstijd in voor DNA-PAINT-verwerving en synchroniseer deze met de rotatiesnelheid van de draaiende schijf (instelbaar vanaf het CSU-W1-pad). Zorg ervoor dat de rotatiesnelheid een veelvoud is van de belichtingstijd, of druk op de Sync-knop om automatisch het dichtstbijzijnde compatibele toerental te matchen. Controleer het scherm op striping-artefacten, want dit geeft niet-gesynchroniseerde instellingen aan. Voor de hier gepresenteerde experimenten werd een belichtingstijd van 300 ms gebruikt.
    OPMERKING: De rotatiesnelheid van de SDC-eenheid die draait en synchroniseert microlens-versterkte SoRa-schijven beïnvloedt het straalexcitatieprofiel, wat de gemiddelde vermogensdichtheidsverdeling over het verlichte gebied beïnvloedt. Om deze reden kunnen hogere belichtingstijden nodig zijn dan bij TIRF-opstellingen.
  7. Configureer de lasergolflengte, het vermogen en het filterwiel (NIS-Elements zal een geschikt filter voorstellen). De lasergolflengte wordt bepaald door het spectrum van de beeldstof.
    OPMERKING: In dit werk werd Cy3B gebruikt, dat optimaal wordt geëxciteerd met een 561 nm laser. Cy3B biedt de beste signaal-achtergrondverhouding voor DNA-PAINT, waardoor het de voorkeurskeuze is voor deze toepassing.
  8. Pas de laserkracht aan via de laserpad (0%-100%). Voor DNA-PAINT beeldvorming zet je de laser op maximaal vermogen (100%). Voor dit systeem komt dit overeen met 1,75 mW (≈ 65 W/cm2) gemeten na het objectief voor de 4× vergroting, 3 mW (≈ 50 W/cm2) voor 2× en 5 mW (≈ 15 W/cm2) voor 1×.
    1. Om het vermogen na het objectief op te nemen, gebruik je een gekalibreerde laservermogenmeter en plaats je de sensor zo dicht mogelijk bij de plek waar het monstervlak zou moeten zijn, op de microscooptrap. Vermijd contact met de objectieflens. Noteer het vermogen voor elke gebruikte configuratie.
  9. Breng een druppel dompelolie aan op het schone 60× Apo NA 1.49 olieobjectief.
  10. Bevestig het voorbereide monster (van stappen 4.2-4.5) op het podium met een stage-adapter. Dit is belangrijk om drift tijdens beeldverwerving te minimaliseren en om beweging tijdens bufferuitwisselingen te voorkomen, vooral bij multicolor-experimenten.
  11. Schakel over naar de brightfield-modus binnen de geselecteerde beeldvormingsmethode en focus op het glasvlak met nanodeeltjes als referentie. Activeer het Perfect Focus System (PFS). De PFS of een vergelijkbaar systeem om de focus gedurende de gehele verwervingstijd te behouden is cruciaal omdat de drift in de axiale richting niet door nabewerking kan worden gecorrigeerd.
    OPMERKING: De Nikon PFS houdt het monster scherp scherp door continu de afstand tussen een vast referentievlak en het brandpunt van het monster te monitoren en aan te passen met behulp van een offsetlens en een lijn-CCD-detector. Door onafhankelijk van beeldverwerving te werken, corrigeert het systeem in realtime (~milliseconden) voor focusdrift.
  12. Met PFS actief selecteer je het beeldvlak van interesse. Voor U2OS mEGFP-Nup96-cellen of HeLa Kyoto mEGFP-Nup107-cellen wordt het 488 GFP-signaal van GFP-gelabelde NPC's gebruikt om de vlakste cel te identificeren en het optimale brandpuntsvlak te bepalen. Gebruik tijdens deze stap een laag laservermogen (~10% van het maximale laservermogen) om fotobleaching te voorkomen.
  13. Definieer de naam en het opslaande pad van het experiment. Vink het vakje Tijd aan om het interval, de duur en het aantal lussen in te stellen. Voor continue acquisitie zet je het interval op Geen Vertraging en voer alleen het aantal lussen in, dat overeenkomt met het totale aantal frames.
    OPMERKING: Zorg dat het PFS-vakje onderaan is geselecteerd en druk dan op Run. De software geeft automatisch een geschatte duur van het experiment en slaat de gegevens op na voltooiing. Om het experiment te stoppen voordat het klaar is, druk je op Voltooien om de huidige voortgang op te slaan, of Annuleren om het experiment te beëindigen zonder op te slaan.
  14. Voor het eerste eiwit verkrijg je 17.000-20.000 frames met een integratietijd van 300 ms.
    OPMERKING: De concentratie van de beeldvormerstreng moet in deze stap worden geoptimaliseerd om te waarborgen dat signalen van één molecuul niet overlappen, terwijl er toch voldoende lokalisaties voor reconstructie worden geboden. Dit proces lijkt op een typische SMLM-acquisitie, waarbij de concentratie van de beeldvormer wordt aangepast om een voldoende aantal gebeurtenissen voor reconstructie te bereiken, terwijl overlapping wordt geminimaliseerd. De optimale concentratie hangt af van de te fotograferen structuur. Zo vereisen sterk gelabelde structuren zoals microtubuli doorgaans lagere beeldapparaatconcentraties (minder dan 1 nM).
  15. Verwijder voorzichtig de beeldvormingsbuffer voor het volgende eiwit met een pipet, waarbij je voorzichtig bent om het monster niet te verstoren. Voeg tijdens het monitoren van het monster met de microscoopcamera voorzichtig 200 μL C+ buffer toe zonder de imager om de eerste kleurstof te wassen.
  16. Herhaal deze stap totdat er geen fluorescentiesignaal meer is van de eerste DNA-imageroplossing (meestal 5 wasbeurten).
  17. Voeg een tweede imageroplossing toe en controleer of gebeurtenissen van één molecuul opnieuw worden gedetecteerd.
  18. Verkrijg 17.000-20.000 frames met 300 ms integratietijd voor het tweede eiwit.
  19. Herhaal stappen 5.14-5.18 voor elk extra eiwit dat wordt gefotografeerd.
  20. Voor 3D-beeldvorming verkrijg z-stacks met 0,5-1 μm afstand over de volledige celhoogte. Dit werd gedaan met een specifiek JOB-protocol21 , ontworpen voor de acquisitiesoftware (NIS-elementen), dat een video maakt van een vooraf bepaald aantal frames op specifieke z-posities , waarbij de PSF gedurende de gehele acquisitietijd wordt behouden.
    OPMERKING: Het softwarepakket, samen met gedetailleerde gebruikersinstructies, wordt geleverd binnen JOB-protocol21. Een volledige beschrijving van de BAAN is ook inbegrepen. De software, genaamd "MultiZ_DNAPaint.bin", kan worden gedownload via het tabblad Materialen van de publicatie. Om de JOB uit te voeren, download je dit bestand en importeer je het in de NIS-Elements JOBS Explorer, volgens de stapsgewijze instructies die zijn verstrekt.

6. Beeldverwerking en analyse

OPMERKING: Beelden werden eerst verwerkt door deconvolutie met compatibele software, gevolgd door localisatie-analyse van één molecuul met Picasso-software ontwikkeld door het Jungmann-lab16.

  1. Open de ND2-imagestacks in de NIS-Elements AR-software.
  2. Voor 2D-beelden, selecteer 2D Deconvolutie. Voor 3D-beelden herhaal je deze procedure voor elke individuele z-stack.
  3. Kies blinde deconvolutie, een effectief gaatje van 0,01, en stel het ruisniveau in op Ruis. Vervolgens voer je de laserexcitatie en emissiesnelheid in, hier respectievelijk 560 nm en 571 nm. Andere parameters worden automatisch verkregen uit de ND2-metadata om een ruwe schatting te geven van de bronbeeldpuntspreidingsfunctie (PSF).
  4. Geef het aantal iteraties op (hier, 12), selecteer Nieuw Document maken en druk op Deconverve. Sla het resulterende bestand op na verwerking.
    OPMERKING: Het algoritme verbetert iteratief de beeldkwaliteit door convolutiebewerkingen uit te voeren die de PSF verfijnen totdat convergentie of het opgegeven aantal iteraties is bereikt. Visuele inspectie van het gedeconvolveerde beeld wordt aanbevolen. Het aanpassen van het aantal iteraties is nodig afhankelijk van rekenkundige beperkingen en beeldkwaliteit.
  5. Laad de deconvoluted image stack in de Picasso Localize-module.
  6. Selecteer in de menubalk 'Parameters →analyseren' en voer de camera-specifieke parameters in volgens de specificaties van de fabrikant. Voor de sCMOS-camera die in deze studie werd gebruikt (Hamamatsu ORCA-Fusion BT): EM-versterking: 1, Baseline: 100, Gevoeligheid: 0,23 (conversiefactor, elektronen/tellingen), Kwantumefficiëntie: 0,95 (afhankelijk van de gebruikte excitatiegolflengte).
    OPMERKING: Quantum Efficiency wordt niet meer gebruikt sinds Picasso versie 0.6.0 en wordt alleen behouden voor achterwaartse compatibiliteit.
  7. Stel de lengte van de dooszijde in op 7. De boxlengte wordt bepaald met behulp van de formule [6 × σPSF + 1], waarbij σPSF de standaarddeviatie van de PSF is. Deze optimalisatie verbetert de nauwkeurigheid van de lokalisatie, waardoor de resolutie van het gereconstrueerde beeld verbetert.
  8. Selecteer de juiste pixelgrootte voor de beeldconfiguratie, volgens stap 5.5 in sectie.
  9. Kies vervolgens een geschikte Min. Net Gradient (bijv. ~1000, afhankelijk van het sample) en schakel Preview in om de gedetecteerde lokalisaties te visualiseren. Inspecteer de resultaten en pas de gradiëntdrempel aan indien nodig om achtergronddetecties te minimaliseren en nauwkeurige lokalisatie te garanderen.
  10. Selecteer in de menubalk Analyseren → Lokaliseren (Identificeren & passen) om te beginnen met spotidentificatie en het passen van alle filmframes. Na de competitie slaat dit proces automatisch een .hdf5- en .yaml-bestand op.
    OPMERKING: .hdf5-bestand slaat de lokalisatiepositie van elke Gaussian fit en meer parameters op. .yaml-bestand slaat informatie op over de video en de analyseprocedure en kan worden geïnspecteerd met een teksteditor.
  11. Laad het .hdf5-bestand in de Picasso Render-module om de gereconstrueerde lokalisatiekaart te visualiseren en driftcorrectie uit te voeren.
  12. Selecteer in Picasso Render Postprocess → Undrift by RCC. Voer een segmentatiewaarde in, beginnend bij 1000. Na voltooiing verschijnt de berekende xy-driftgrafiek. Herhaal het proces sequentieel met lagere segmentatiewaarden (bijv. 500, dan 250), waarbij geleidelijke verbeteringen in temporele drift worden waargenomen.
    OPMERKING: Driftcorrectie kan ook worden uitgevoerd met nanodeeltjes als fiduciale markers; echter, bij het afbeelden van verhoogde vlakken is het nanodeeltjessignaal mogelijk niet zichtbaar. In deze gevallen wordt alleen redundante kruiscorrelatie (RCC) driftcorrectie toegepast.
  13. Zorg ervoor dat je het drift-gecorrigeerde bestand opslaat, selecteer Bestand → Opgeslagen Lokalisaties voordat je het Picasso Render-venster sluit.
  14. Laad het drift-gecorrigeerde bestand van stap 6.13 in de Picasso Filtermodule voor extra nabewerkingstappen, door drempels op te leggen aan de kwaliteitsmetrics van enkelmolecuullokalisatie, zoals: (i) Lokalisatieprecisie (lpx, lpy); (ii) PSF-breedtes (sx, sy); (iii) Fotonentellingen; en (iv) eventuele aanvullende criteria om ruis, uitschieters of slecht opgeloste plekken te verwijderen.
    OPMERKING: lpx en lpy (lokalisatieprecisie in x en y) schatten de onzekerheid in de gelokaliseerde spotpositie langs de x- en y-assen en worden berekend op basis van de Cramér-Rao ondergrens (CRLB).
  15. Om één eigenschap te filteren, selecteer je de betreffende kolom in de kop van de tabel en kies je Plot → Histogram vanuit het menu.
    OPMERKING: Door twee kolommen te selecteren wordt een 2D-histogram uitgezet.
  16. Om te filteren op een specifiek eigenschapsbereik, klik en sleep je over het gewenste gebied binnen een 1D- of 2D-histogram. De geselecteerde regio zal groen gearceerd worden en alle lokalisatiegebeurtenissen met waarden buiten dit bereik worden onmiddellijk uit de lokalisatielijst verwijderd.
  17. Filter de gegevens op fotonen, sx, sy, lpx en lpy, waarbij alleen het centrale deel van de verdeling van elke parameter behouden blijft om de meest betrouwbare lokalisaties te behouden.
    OPMERKING: Het centrale deel van de PSF-breedteverdeling ligt doorgaans tussen 0,4 en 1,2 × pixelgrootte. Sluit secundaire verdelingen uit die vaak worden veroorzaakt door overlappende signalen of slecht opgeloste plekken.
  18. Sla de gefilterde gegevens op door Bestand → Opslaan in het menu te selecteren.
  19. Herhaal het proces van stap 6.1-6.18 voor alle video's die voor elke imageroplossing zijn gemaakt.
  20. Open het gefilterde bestand in de Picasso Render-module. De intensiteit in dit super-resolved beeld vertegenwoordigt het aantal lokalisaties. Contrast kan worden aangepast door View → Display Settings te selecteren en de waarde van Max. dichtheid te wijzigen.
  21. Om de superresolutieafbeelding van één kanaal op te slaan, selecteer je "Individuele Lokalisatieprecisie" in het gedeelte Vervaging. Een schaalbalk kan ook worden toegevoegd vanuit de Toonladderbalksectie.
  22. Om de superresolutie-image van alle kanalen op te slaan, open je alle verwerkte .hdf5-bestanden. De kleur van elk kanaal kan worden gewijzigd door in het menu te kiezen op Bestanden bekijken → weergeven.
  23. Lijn alle kanalen uit met het selecteren van nabewerking → Kanalen uitlijnen.
  24. Selecteer Bestand → Export Complete Image om een .png afbeelding op te slaan of File → Export Current View voor een specifieke zoom van de afbeelding.
    OPMERKING: Gebruik consistente bestandsnaam- en documentatiepraktijken voor reproduceerbaarheid. Picasso-software voegt automatisch een achtervoegsel toe aan elk opgeslagen bestand. Cramer Rao Lower Bound en de op dichtstbijzijnde buur-gebaseerde analyse (NeNA)22-metrieken kunnen worden geëxtraheerd door te kiezen op View → Show info vanuit het menu. De NeNA kwantificeert de ruimtelijke verdeling van gelokaliseerde fluoroforen door de Euclidische afstand tussen naburige lokalisaties te evalueren. Terwijl de CRLB een theoretische ondergrens biedt voor lokalisatieprecisie op basis van fotonstatistiek en achtergrondruis, biedt de NeNA een experimentele schatting van de lokalisatieprecisie die rechtstreeks uit de dataset zelf is afgeleid. Om deze reden wordt NeNA veel gebruikt in SMLM als complementaire maat voor de CRLB, omdat het niet alleen theoretische limieten vastlegt, maar ook praktische invloeden zoals driftcorrectie, fittingfouten en experimentele variabiliteit. De NeNA-metriek wordt geëxtraheerd uit de Picasso Render-module. De CRLB van de enkelmolecuulpassing wordt gebruikt om de locatieprecisiewaarden te bepalen die σSMLM zijn. De gerapporteerde waarde is het gemiddelde tussen σx en σy, voor alle lokalisaties, die de moduswaarde zijn van de verdeling van de lokalisatieprecisie in respectievelijk x en y.

Resultaten

Om de superresolutie-beeldvormingsmogelijkheden van het SDC-OPR-systeem (Figuur 1A) te demonstreren, werd de in-plane resolutie beoordeeld door DNA-PAINT beeldvormingsexperimenten uit te voeren (Figuur 1B) op nucleaire poriecomplexen (NPC's), die een biologische referentiestructuur17 vormen. Figuur 1C toont een representatief DNA-PAINT SDC-OPR-beeld van nucleoporine 96 (Nup96), gelabeld met monomerisch versterkt groen fluorescerende eiwit (mEGFP's) en gelabeld met DNA-geconjugeerde anti-GFP-nanolichamen, in U2OS-cellen. De ingezoomde panelen tonen de NUP-substructuur, en Figuur 1D toont gepaarde Nup96-eiwitten (aangegeven door pijlen) die consistent zijn met de verwachte 8-voudige symmetrie van kernporiën. In Figuur 1E werd de Euclidische afstand tussen Nup96-paren gemeten door ze uit te lijnen en het dwarsdoorsnedehistogram van het opgetelde beeld (n = 16 paren) uit te zetten. De analyse toonde een piek-tot-piek scheiding van (13 ± 2) nm (Figuur 1E), in overeenstemming met resultaten van EM-modellen evenals HILO- en TIR-beeldvorming23. Elke piekpassing toonde een standaarddeviatie van 4 nm, waarmee de hoge lokalisatieprecisie (σSMLM = 3,3 nm, NeNA = 4,4 nm) werd bereikt met DNA-PAINT op SDC-OPR, werd bevestigd. Opmerkelijk is dat deze precisie werd gehandhaafd over het gehele 53 × 53 μm² gezichtsveld, wat uitzonderlijk is voor confocale systemen.

Om de mogelijkheid tot multicolor imaging aan te tonen, werden Nup96, mitochondriën en microtubuli in U2OS-cellen DNA-gelabeld voor acquisitie met Exchange-PAINT18. Deze techniek maakt gebruik van orthogonale DNA-beeldvormers die geconjugeerd zijn tot één enkele fluorofoor, waardoor alle doelen met dezelfde laserbron kunnen worden geëxciteerd (Figuur 2A). In plaats van signalen gelijktijdig te verkrijgen, scheidt het deze over sequentiële beeldvormingsrondes, waardoor eenvoudige integratie in elk commercieel SDC-OPR-systeem mogelijk is. Figuur 2B toont Nup96 in blauw met een anti-GFP nanolichaam, mitochondriën in rood met een secundair anti-TOM20 antilichaam, en microtubuli in groen met een primair anti-α-tubuline antilichaam. Opmerkelijk is dat de uitstekende localisatieprecisie voor enkelkleurige Nup96-beeldvorming in alle doelen in het multi-doelwitexperiment behouden bleef, wat resulteerde in lokalisatieprecisie van 3,9 nm voor de NPC, 4,0 nm voor α-tubuline en 3,3 nm voor mitochondriën (Figuur 2B, panelen 1, 2 en 3).

Voor beeldvorming met grote FOV werden microtubuli in HeLa-cellen gefotografeerd met verschillende vergrotingen die beschikbaar zijn op het SDC-OPR-systeem, gecombineerd met verschillende camerabinning-instellingen om pixelgroottes tussen 78 nm en 108 nm te behouden (Figuur 3). Figuur 3A toont het microtubuli-cytoskelet van 10 HeLa-cellen, met kleuren die de lokalisatieprecisie aangeven. Bij 1× vergroting is de gemiddelde lokalisatieprecisie merkbaar slechter vergeleken met hogere vergrotingen (Figuur 3B-D), met een grotere variabiliteit. Dit komt door de verminderde laservermogensdichtheid over het grotere FOV, waar het Gaussische belichtingsprofiel duidelijk wordt, wat leidt tot een verminderde precisie richting de randen van het FOV. Desalniettemin is het bereiken van een gemiddelde lokalisatieprecisie van 9,5 nm over het uitgestrekte 211 × 211 μm² FOV indrukwekkend voor confocaal-gebaseerde systemen en maakt het hoogresolutieonderzoek van biologische heterogeniteit mogelijk.

Ten slotte wordt de mogelijkheid aangetoond om hele cellen in beeld te brengen door DNA-PAINT-beelden van het microtubuli-netwerk te verkrijgen in vaste HeLa-cellen met een confocale volume van ~500 nm dikte en 1 μm z-stap met de hoogste vergroting van het systeem (4×, 53 × 53 μm² FOV). Figuur 4A toont de reconstructiebeelden van één molecuul voor elk z-vlak, samen met de bijbehorende lokalisatieprecisie en NeNA-waarden. Daarnaast wordt een 3D-kleurgerenderde visualisatie van het microtubuli-netwerk in de HeLa-cel weergegeven in Figuur 4C. Naarmate de diepte toeneemt, neemt het aantal gedetecteerde fotonen af door verstrooiing en optische aberraties, wat resulteert in een verminderde lokalisatieprecisie voor zowel de lokalisatieprecisie afgeleid van de Cramér-Rao Lower Bound (CRLB) (Figuur 4A, rechts) als die berekend met de NeNA-metriek. Toch maakt het hoge niveau van fotonenverzameling mogelijk door het SDC-OPR-systeem σSMLM ≤ 10 nm voor beelddiepte tot 9 μm met smalle verdelingen. Inderdaad, dubbelwandige filamenteuze microtubulistructuren werden duidelijk opgelost op verschillende dieptes: nabij de grens tussen dekkingglap en cel, op tussenliggende axiale posities, en aan de top van de cel, met piek-tot-piek afstand tussen 30 nm en 40 nm (Figuur 4C), consistent met gerapporteerde waardenvan 24. Deze resultaten benadrukken het vermogen van de SDC-OPR om beeldvorming met hoge resolutie te leveren over grote FOV's en over de gehele celhoogte.

Figuur 1
Figuur 1: In-vlak single-molecuul lokalisatiemicroscopie van verschillende celmonsters en multicolor superresolutie beeldvorming. (A) Schema van het Spinning Disk Confocal with Optical Photon Reassignment (SDC-OPR) systeem, met een microlensarray ontworpen om de fotonenverzameling te maximaliseren. (B) Schema van DNA-PAINT: Fluorescentief-gelabelde DNA-strengen, bekend als imagers-strengen, hybridiseren tijdelijk met complementaire DNA-sequenties (dockingstrengen) die verankerd zijn aan het antilichaam/nano dat het eiwit van interesse target. Deze kortstondige bindingsgebeurtenissen genereren fluorescentiesignalen die lijken op stochastisch knipperen. (C) Representatief DNA-PAINT-beeld op het SDC-OPR-systeem met 4× vergroting van de NPC van U2OS-cellen. De mogelijkheid voor hoge resolutie wordt gedemonstreerd in het inset, waar individuele NPC's duidelijk worden opgelost. (D) SDC-OPR-verbeterde DNA-PAINT maakt visualisatie van individuele NPC's mogelijk, waarbij witte pijlen karakteristieke Nup96-eiwitparen binnen de poriearchitectuur markeren. (E) Verdeling van afstandsmetingen tussen Nup96-dimeren (n=16 paren) binnen enkele NPC-symmetrie-eenheden. Deze figuur is aangepast van Zaza et al.14. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. 

Figuur 2
Figuur 2: Exchange-PAINT voor meerkleurige beeldvorming met een SDC-OPR-microscoop. (A) Schema van Exchange-PAINT van drie doelen die sequentieel worden afgebeeld. Drie eiwitdoelen werden gelabeld met ofwel DNA-gefunctionaliseerde antilichamen, Fab-fragmenten of nanobodies. De Cy3B-beeldvormers werden sequentieel gefotografeerd per strengtype met wash-stappen tussen de beeldrondes. (B) Driekleurige Exchange-PAINT-beeldvorming van U2OS-cellen met behulp van SDC-OPR-microscopie met 4× vergroting, met microtubuli (rood; gelabeld met DNA-geconjugeerde anti-α-tubuline), mitochondriën (groen; TOM20-gerichte DNA-nanobodies), en NPC (blauw; mEGFP-gemarkeerd als Nup96 met anti-GFP DNA-nanobodies). Schaalbalk: 5 μm. Het ingezoomde gebied benadrukt de verbeterde resolutie die op het SDC-OPR-systeem is verkregen, met de nadruk op (1) mitochondriën, (2) microtubuli en (3) NUP. Schaalbalken = 1 μm. Deze figuur is aangepast van Zaza et al.14. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3
Figuur 3: DNA-PAINT-beeldvorming binnen grote FOV's op een SDC-OPR-microscoop. Microtubule DNA-PAINT-beelden (anti-α-tubuline-labeling) verkregen bij meerdere vergrotingen: (A) 1× vergroting en 1 binning (FOV van 211 × 211 μm²), (B) 2,8× en 2 binning (FOV van 76 × 76 μm²), (C) 4× vergroting en 4 binning (FOV van 53 × 53 μm²). Kleur geeft de lokalisatieprecisie weer van 0-16 nm in het geval van 1x vergroting en 0-4 nm in de andere. (D) Lokalisatieprecisie gemeten op verschillende afstanden (in μm) vanaf het midden van het gezichtsveld voor 1× (rood), 2,8× (geel) en 4× (groen) vergrotingen. Deze figuur is aangepast van Zaza et al.14. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4
Figuur 4: Whole cell DNA-PAINT beeldvorming. (A) Links. Volumetrische microtubuli-beeldvorming in HeLa-cellen via DNA-PAINT verkregen met SDC-OPR bij 4× vergroting, met axiale doorsneden van z = 0 tot 9 μm (stappen van 1 μm). Elk vlak toont z-positie , lokalisatieprecisie en NeNA-metriek. Schaalbalken: 5 μm (xy). Goed. Lokalisatieprecisie versus penetratiediepte voor alle vliegtuigen. (B) 3D-weergave van het microtubuli-netwerk op dezelfde HeLa-cel als in (A). Kleur geeft de penetratiediepte van 0 tot 9 μm weer (C) Ingezoomde beelden van gemarkeerde kleine gebieden van elke penetratiediepte aangegeven in (A). Deze figuur is aangepast van Zaza et al.14. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Superresolutiefluorescentiemicroscopie heeft de diffractiebarrière doorbroken en de ruimtelijke resolutie aanzienlijk verbeterd. Toch kent de brede adoptie ervan in biologisch onderzoek voortdurende uitdagingen. Opmerkelijk is dat afwegingen tussen FOV, resolutie en penetratiediepte het moeilijk maken om alle drie de factoren tegelijk te optimaliseren. Deze uitdagingen werden aangepakt door gebruik te maken van de gecombineerde mogelijkheden van SMLM en spinning disk confocal microscopie, versterkt door optische fotonhertoewijzing (SDC-OPR). Door microlensarrays te integreren in een standaard SDC-configuratie, zoals mogelijk gemaakt door het commerciële SDC-OPR-systeem, werd de fotonenverzameling vergroot terwijl de effectieve gaatjesgrootte werd verkleind, wat leidde tot een aanzienlijke resolutieverbetering. In vergelijking met standaard SDC toonde het SDC-OPR-systeem een duidelijke verbetering in het resolutievermogen, waarbij kenmerken die met 10 nm14 gescheiden zijn in het brandvlak succesvol werden onderscheiden, terwijl standaard SDC alleen afstanden groter dan 20 nm11 kon onderscheiden. Deze verbeterde resolutiecapaciteit benadrukt het voordeel van fotonenhertoewijzing voor het bereiken van moleculaire schaalafstanden. Specifiek werd laterale lokalisatieprecisie onder 2 nm bereikt in het fokale vlak (z = 0 μm), waarbij laterale precisie onder de 10 nm bleef op dieptes tot 9 μm, gecombineerd met een zeer aanpasbaar gezichtsveld van 53 × 53 μm² of 76 × 76 μm². Zelfs met een groot FOV van 211 × 211 μm² leverde het systeem een indrukwekkende gemiddelde lokalisatieprecisie van 9,5 nm in het vlak. Deze resultaten benadrukken het vermogen van het systeem voor beeldvorming met hoge resolutie in hele cellen.

Wat betreft de koppelingsreacties voor de verschillende gebruikte antilichamen, moet het protocol zorgvuldig worden gevolgd om een optimale antistof-DNA-verhouding te waarborgen. Het overschrijden van deze verhouding kan de lokalisatieprecisie verminderen en kwantitatieve metingen nadelig beïnvloeden, zoals uitgevoerd in qPAINT25. Daarom is het cruciaal om de verhouding te verifiëren met een microvolume UV-Vis spectrofotometer, zodat een definitieve 1:1-verhouding tussen DNA en antilichaam wordt gegarandeerd.

Een cruciale stap bij het verkrijgen van hoogwaardige, superresolutiebeelden van microtubuli is de juiste fixatie. Conventionele fixatiemethoden die uitsluitend vertrouwen op hoge concentraties PFA verstoren vaak microtubuli-structuren. In plaats daarvan verbetert het gebruik van glutaraldehyde (GA) alleen of in combinatie met PFA het structurele behoudaanzienlijk 26,27.

Voor optimale beeldvorming is een objectief met hoge numerieke apertuur (NA) essentieel om de fotonenverzameling per enkelmolecuulgebeurtenis te maximaliseren. In het commerciële SDC-OPR-systeem is het laservermogen bewust lager dan in conventionele TIRF-microscopen die voor SMLM worden gebruikt om fotobleaching van monsters te minimaliseren. Hoewel DNA-PAINT problemen met fotobleaching wegneemt en theoretisch een hogere laserkracht zou kunnen gebruiken, leggen huidige commerciële systemen beperkingen op, waardoor langere belichtingstijden nodig zijn dan bij TIRF-verlichting. Bovendien worden de moleculen tijdens de blootstelling niet continu aangeslagen omdat de verlichting in SDC-OPR confocaal is. Als gevolg hiervan zijn langere belichtingstijden nodig in verhouding tot continue TIRF-verlichting; In deze studie werd een belichtingstijd van 300 ms gebruikt. Afhankelijk van de resolutie-eisen van een bepaald experiment kunnen kortere integratietijden (bijv. 150-200 ms) worden toegepast met minimaal verlies vanresolutie 28.

Het optimaliseren van de concentratie van de beeldvormerstreng is een cruciale stap om ervoor te zorgen dat signalen van één molecuul goed gescheiden blijven, terwijl er toch voldoende lokalisaties worden gegenereerd voor een nauwkeurige reconstructie. Deze aanpassing is analoog aan standaard SMLM-acquisitie, waarbij de balans tussen gebeurtenisdichtheid en signaaloverlap zorgvuldig wordt gecontroleerd. De optimale concentratie van de imager moet voor elk verschillend doel worden aangepast. Bijvoorbeeld, voor microtubuli wordt een initiële beeldvormerstrengconcentratie van minder dan 1 nM aanbevolen, met aanpassingen indien nodig.

Het behouden van stabiele focus tijdens langdurige acquisities is cruciaal, omdat axiale (z) drift niet na verwerking kan worden gecorrigeerd. Laterale (xy) drift kan worden gecompenseerd via RCC- of fiduciale markers. In deze opstelling zorgt het Perfect Focus System (PFS) van de microscoop voor scherpstelstabiliteit gedurende uren beeldvorming.

Samenvattend biedt de integratie van SMLM met SDC-OPR een krachtig platform voor beeldvorming met hoge resolutie diep in hele cellen, waarmee traditionele afwegingen tussen resolutie, diepte en FOV worden overwonnen. Om echter de capaciteiten van het systeem volledig te benutten, is nauwgezette aandacht voor experimentele omstandigheden essentieel, van antilichaamconjugatie en fixatie tot acquisitie-instellingen en dataverwerking. Elke stap, van monstervoorbereiding tot driftcorrectie, speelt een cruciale rol bij het verkrijgen van betrouwbare, precisie-data. Met zorgvuldige protocoloptimalisatie biedt deze aanpak een robuuste en veelzijdige oplossing voor kwantitatieve, nanoschaalbeeldvorming in complexe biologische monsters. Dit protocol zal naar verwachting de gemeenschap helpen bij het adopteren van single-molecule localisatiemicroscopie en het verkrijgen van super-resolved beelden van monstervlakken die moeilijk toegankelijk zijn met conventionele TIRF- of HILO-verlichting. Beide objectieven worden gefaciliteerd met commercieel verkrijgbare microscopen die doorgaans wereldwijd in microscopiefaciliteiten te vinden zijn.

Wat betreft andere en toekomstige toepassingen is de methode toepasbaar op hele celmonsters evenals op complexere weefselmonsters op grotere beeldvormingsdieptes, zoals aangetoond in eerdere studies14. In tegenstelling tot benaderingen die fysieke sectie vereisen, maakt deze techniek volumetrische beeldvorming van intact weefsel mogelijk, waardoor de native architectuur behouden blijft en artefacten die door fysieke doorsnijding worden veroorzaakt worden geminimaliseerd. Het gebruik van kleinere affiniteitsprobes, zoals nanobodies, verbetert de weefselpenetratie verder in vergelijking met full-length antistoffen, waardoor een uniformere labeling over dikke monsters mogelijk wordt. Deze benadering opent de deur naar het bestuderen van cellulaire organisatie en moleculaire verdelingen in situ met hogere nauwkeurigheid. Naast deze toepassingen leent de strategie zich ook voor high-throughput screening van nanostructuren en biomoleculaire assemblages, wat systematisch onderzoek naar structurele heterogeniteit en functie mogelijk maakt. Daarnaast hebben recente ontwikkelingen in DNA-PAINT zelfblussende beeldsondes opgeleverd, gebaseerd op kleurstof-afkoeler- of kleurstof-kleurstofinteracties 29,30,31, die achtergrondsignalen effectief verlagen, de fluorescentieintensiteit verhogen en de ruimtelijke resolutie verbeteren, waardoor snellere acquisitiesnelheden mogelijk worden. Het integreren van deze fluorogene probes in het SDC-OPR-raamwerk heeft het potentieel om zowel beeldvormingssnelheid als resolutie verder te verhogen. Door deze vooruitgang te combineren met de sterke punten van het SDC-OPR-systeem, kan het de toepasbaarheid uitbreiden op complexere biologische monsters, waardoor het platform een flexibel hulpmiddel wordt voor gedetailleerde kaartlegging van cellulaire en moleculaire structuren in een breed scala aan weefsels.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te verklaren.

Dankbetuigingen

Dit onderzoek werd gefinancierd door de Human Frontier Science Program Organization (HFSP) via een interdisciplinaire postdoctorale beurs bij CZ (LT0025/2023-C) en de Engineering and Physical Sciences Research Council ter ondersteuning van M.T. (EP/R513143/1 en EP/W524335/1) en O.P.L.D (EP/R513143/1 en EP/T517793/1). S.S erkent ook The Royal Society via een Dorothy Hodgkin fellowship (DHF\R1 191019\ en DHF\R\251006). Dit werk is ook ondersteund door The Chan Zuckerberg Initiative (2023-321188) en BBSCR (BB/Y513064/1) subsidies aan S.S.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
(±)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acidMerck 238813-5GTrolox
3,4-Dihydroxybenzoic acid Merck 37580-25G-FPCA
60× Apo NA 1.49 objectieflensNikon
7.0 KDA spin desalting kolom met size-exclusion hars Fisher Scientific Ltd89882Zeba Spin Desalting Columns voor stap 2.4
Accutase - Enzym voor celdetachmentPromo CellC-41310
Alpaca sdAb (1H1) anti-GFP gekoppeld met aangepast DNA (sdAB-5’-TCCTCCTCCTCCT-3’)Massive PhotonicsCustom productAnti-GFP nanobody voor Drosophila
Alpaca sdAb (1H1) anti-GFP gekoppeld met DNAMassive PhotonicsMASSIVE-TAG-Q-FAST anti-GFP - F3Anti-GFP nanobody voor NUP
Anti-alpha tubulin (YL1/2)Thermo Fisher ScientificMA1-80017
Anti-rabbit IgGMassive PhotonicsMassive-sdAB-FAST 2-Plex, Secondary sdAB F2
Anti-TCRζ (6B10.2)BioLegend644102
Bovine serum albumineMerck A4503-10GBSA
Conische centrifugeerbuis 15 mLFisher Scientific Ltd17705004
Conische centrifugeerbuis 50 mLVWR International734-0448
CSU-W1 SoRaNikonSDC-OPR microscoop
Desalting spin kolommen met Sephadex G-25 (size-exclusion hars voor DNA-zuivering) Fisher Scientific Ltd11743309Merk: Cytiva. G-25 kolommen voor stap 2.5
D-glucoseMerck G8270-1KG
DMEM mediaThermo Fisher Scientific11965092
DMSO, AnhydrousThermo Fisher ScientificD12345
DTT (Dithiothreitol)Thermo Fisher Scientific15976082
EDTAThermo Fisher Scientific15575020
EGTAMarck324626
Fetal bovine serumThermo Fisher ScientificA5256701
GlutaraldehydeServa2311402
GlycerolMerck G5516-500ML 
GlycineMP Biomedicals219482580
Maleimide-PEG2-succinimidyl Merck 746223-50MG
McCoy's 5A mediaFisher Scientific Ltd16600082
MES (2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid)MerckM3671-50G
MethanolFisher Scientific Ltd32213-25L
MgCl2Fisher Scientific Ltd10418464
Microcentrifugebuisjes 0.5 mLFisher Scientific Ltd11508232
Microcentrifugebuisjes 1.5 mLEppendorf10509691 
Microvolume UV-Vis SpectrofotometerThermo Fisher ScientificND-ONE-WNanodrop
NaCl2Sigma-AldrichS6546-1L 
Nanoparticles 90 nm -GoudCytodiagnosticsG-90-100
Orca Fusion-BT cmos cameraHamamatsu
Penicilline-StreptomycineThermo Fisher Scientific15070063P/S
Phosphate-buffered saline (1x oplossing)Fisher Scientific Ltd11530546PBS
Pierce 16% formaldehyde (w/v), methanol vrijFisher Scientific Ltd11586711PFA
Kaliumchloride Merck  P9541-500G
Protocatechuat 3,4-Dioxygenase  Merck P8279-25UN PCD
NatriumhydroxideFisher Scientific Ltd12963614
TOM20 antilichaamAbcamAb186735
Tris bufferVWR InternationalA4577.1000
Triton X-100  VWR International1086031000
Tween-20Merck P9416-50ML
Ultrafiltratie centrifugeer filter unit, 100 kDa MWCOMerck UFC510024Fabrikant: Amicon Ultra
μ-Slide 8 Well Hoog GlasbodemIbidiIB-80807
μ-Slide VI 0.5 GlasbodemIbidiIB-80607

Referenties

  1. Lelek, M., et al. Single-molecule localization microscopy. Nat Rev Methods Primers. 1 (1), 39(2021).
  2. Axelrod, D. Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence. J Cell Biol. 89 (1), 141-145 (1981).
  3. Tokunaga, M., Imamoto, N., Sakata-Sogawa, K. Highly inclined thin illumination enables clear single-molecule imaging in cells. Nat Methods. 5 (2), 159-161 (2008).
  4. Vignolini, T., Capitanio, M., Caldini, C., Gardini, L., Pavone, F. S., et al. Highly inclined light sheet allows volumetric super-resolution imaging of efflux pumps distribution in bacterial biofilms. Sci Rep. 14 (1), 12902(2024).
  5. Kim, J., et al. Oblique-plane single-molecule localization microscopy for tissues and small intact animals. Nat Methods. 16 (9), 853-857 (2019).
  6. Ghosh, A., et al. Decoding the molecular interplay of CD20 and therapeutic antibodies with fast volumetric nanoscopy. Science. 387 (6730), eadq4510(2025).
  7. Wäldchen, F., et al. Whole-Cell imaging of plasma membrane receptors by 3D lattice light-sheet d STORM. Nat Commun. 11 (1), 887(2020).
  8. Zagato, E., et al. Microfabricated devices for single objective single plane illumination microscopy (SoSPIM). Opt express. 25 (3), 1732-1745 (2017).
  9. Galland, R., et al. 3D high-and super-resolution imaging using single-objective SPIM. Nat Methods. 12 (7), 641-644 (2015).
  10. Pawley, J. Handbook of biological confocal microscopy. 236, Springer Science & Business Media. (2006).
  11. Schueder, F., et al. Multiplexed 3D super-resolution imaging of whole cells using spinning disk confocal microscopy and DNA-PAINT. Nat Commun. 8 (1), 2090(2017).
  12. Azuma, T., Kei, T. Super-resolution spinning-disk confocal microscopy using optical photon reassignment. Opt Express. 23 (11), 15003-15011 (2015).
  13. York, A. G., et al. Instant super-resolution imaging in live cells and embryos via analog image processing. Nat Methods. 10 (11), 1122-1126 (2013).
  14. Zaza, C., et al. Super-resolution imaging in whole cells and tissues via DNA-PAINT on a spinning disk confocal with optical photon reassignment. Nat Commun. 16 (1), 4991(2025).
  15. Jungmann, R., et al. Single-molecule kinetics and super-resolution microscopy by fluorescence imaging of transient binding on DNA origami. Nano Lett. 10 (11), 4756-4761 (2010).
  16. Schnitzbauer, J., Strauss, M. T., Schlichthaerle, T., Schueder, F., Jungmann, R. Super-resolution microscopy with DNA-PAINT. Nat Protoc. 12 (6), 1198-1228 (2017).
  17. Thevathasan, J. V., et al. Nuclear pores as versatile reference standards for quantitative super-resolution microscopy. Nat Methods. 16 (10), 1045-1053 (2019).
  18. Jungmann, R., et al. Multiplexed 3D cellular super-resolution imaging with DNA-PAINT and Exchange-PAINT. Nat Methods. 11 (3), 313-318 (2014).
  19. Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes. Biophys J. 82 (5), 2775-2783 (2002).
  20. Ober, R. J., Ram, S., Ward, E. S. Localization accuracy in single-molecule microscopy. Biophys J. 86 (2), 1185-1200 (2004).
  21. Tetley, R., Vaughan, A., Zaza, C. NIS-Elements JOB for DNA-Paint Acquisition at Serial Z-Planes. , (2025).
  22. Endesfelder, U., Malkusch, S., Fricke, F., Heilemann, M. A simple method to estimate the average localization precision of a single-molecule localization microscopy experiment. Histochem Cell Biol. 141, 629-638 (2014).
  23. Schlichthaerle, T., et al. Direct visualization of single nuclear pore complex proteins using genetically-encoded probes for DNA-PAINT. Angew Chem. 131 (37), 13138-13142 (2019).
  24. Stehr, F., Stein, J., Schueder, F., Schwille, P., Jungmann, R. Flat-top TIRF illumination boosts DNA-PAINT imaging and quantification. Nat Commun. 10 (1), 1268(2019).
  25. Jungmann, R., et al. Quantitative super-resolution imaging with qPAINT. Nat Methods. 13 (5), 439-442 (2016).
  26. Whelan, D. R., Bell, T. D. M. Image artifacts in single molecule localization microscopy: why optimization of sample preparation protocols matters. Sci Rep. 5 (1), 7924(2015).
  27. Xie, Z., et al. Quantitative characterization of microtubule ultrastructure based on single-molecule localization microscopy. Cytoskeleton. , (2025).
  28. Steen, P. R., et al. The DNA-PAINT palette: A comprehensive performance analysis of fluorescent dyes. Nat Methods. 21 (9), 1755-1762 (2024).
  29. Kessler, L. F., et al. Self-quenched fluorophore-DNA labels for super-resolution fluorescence microscopy. J Phys Chem B. 128 (28), 6751-6759 (2024).
  30. Kessler, L. F., et al. Self-quenched fluorophore dimers for DNA-PAINT and STED Microscopy. Angew Chem Int Ed. 62 (39), e202307538(2023).
  31. Chung, K. K. H., et al. Fluorogenic DNA-PAINT for faster, low-background super-resolution imaging. Nat Methods. 19 (5), 554-559 (2022).

Herprints en machtigingen

Tags

DNA PAINT beeldvorminglokalisatie van enkelvoudige moleculenbeeldvorming van hele cellenmulticolor beeldvormingintracellulaire labellingdiepe celbeeldvormingbeeldreconstructie
Superresolutiebeeldvorming van hele cellen via DNA-PAINT op een draaiende schijf confocaal met optische fotonhertoewijzing
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.