Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

CRISPR/Cas9-gemedieerde generatie en karakterisering van een Ent2*/CyO Drosophila melanogasterstam

62 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/69546

⸱

7 augustus 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1College of Traditional Chinese Medicine, The Affiliated Hospital to Changchun University of Chinese Medicine, 2Innovative Team for Medicinal Plant Resources and Breeding, Institute of Special Agricultural Products, Chinese Academy of Agricultural Sciences

In dit artikel

Samenvatting

Evenwichtige nucleosidetransporter 2 (ENT2) is een geconserveerd transmembraaneiwit dat betrokken is bij nucleosidetransport en cellulaire stofwisseling. In deze studie werd een CRISPR/Cas9-gebaseerde genoombewerkingsworkflow opgezet om een op Ent2 gerichte allel in Drosophila melanogaster te genereren. Een stabiele Ent2*/CyO heterozygote lijn werd geconstrueerd en onderhouden met behulp van een balancer-chromosoomstrategie. Dit werk beschrijft het ontwerp, de generatie en moleculaire validatie van de mutantlijn, evenals de fenotypische karakterisering onder verschillende temperatuurcondities. De gevestigde workflow en mutantenstam bieden een praktisch kader voor het bestuderen van genen met homozygote dodelijke fenotypen en voor het onderzoeken van temperatuurgeassocieerde fenotypische variatie bij Drosophila.

Samenvatting

In deze studie werd een op CRISPR/Cas9 gebaseerde genoombewerkingsmethode gebruikt om mutaties te introduceren in het evenwichtige nucleoside transporter 2 (Ent2)-gen in Drosophila melanogaster. Gids-RNA's die zich richten op het coderende gebied van Ent2 werden ontworpen en samen met Cas9 mRNA in w1118-embryo's geïnjecteerd. Mutante allelen werden geïdentificeerd door Sanger-sequencing en gehandhaafd als een stabiele Ent2*/CyO heterozygote lijn met behulp van een balancerchromosoom. Vervolgens evalueerden we het lichaamsgewicht, het klimvermogen, de overlevingskans en de activiteiten van superoxide-dismutase (SOD) en katalase (CAT) bij fruitvliegen bij respectievelijk 22 °C en 25 °C. De resultaten geven aan dat bij zowel 22 °C als 25 °C de lichaamslengte en het gewicht van Ent2*/CyO-fruitvliegen significant werden verminderd ten opzichte van de w1118, en hun ontwikkeling vertraagd was. Bij 22 °C was de totale levensduur van Ent2*/CyO-vliegen iets langer dan die van de w1118, terwijl bij 25 °C geen significant verschil werd waargenomen. Wat betreft het voortbewegingsvermogen was de klimprestaties van heterozygote vliegen aanzienlijk lager dan die van de W1118 bij beide temperaturen, waarbij mannetjes ernstiger werden getroffen. Daarnaast waren de antioxidante enzymactiviteit van CAT en SOD bij Ent2*/CyO fruitvliegjes significant verminderd, wat wijst op een duidelijke vermindering van de antioxidantcapaciteit. Deze resultaten beschrijven het fenotypische profiel van een door CRISPR gegenereerde Ent2-mutantlijn en tonen de haalbaarheid aan van het combineren van genoombewerking met balancerchromosoomstrategieën in Drosophila. Deze studie biedt een methodologisch kader en een genetische bron voor toekomstige onderzoeken naar genen die geassocieerd zijn met metabolisme en omgevingsreacties.

Inleiding

Drosophila melanogaster blijft een van de meest gebruikte modelorganismen voor genetica en ontwikkelingsbiologie1. Het wordt gekenmerkt door een korte levenscyclus, snelle voortplanting, gevestigde genetische manipulatietools en een volledig geannoteerd genoom 2,3. Deze soort wordt uitgebreid toegepast in studies naar genfunctie, metabole regulatie en milieuaanpassing 4,5. Nucleosiden en hun afgeleiden zoals ATP zijn centraal voor de opwekking van cellulaire energie, nucleïnezuursynthese en signaaltransductie in Drosophila, wat de geconserveerde metabole regulatie over metazoënweerspiegelt 6. Purinerge signaalroutes in Drosophila, die afhankelijk zijn van extracellulaire adenosin- en nucleosidetransportmechanismen, benadrukken de functionele rol van nucleosidebeweging over membranen bij het coördineren van energie- en signaaltransductieresponsen7. Onder deze processen wordt het transport van nucleosiden over het cytoplasmatisch membraan voornamelijk gemedieerd door de evenwichtige nucleosidetransporter (ENT) familie, waarbij DmENT2 functionele transportactiviteit vertoont in Drosophila8.

De KNO-familie bestaat uit meerdere subtypes, waarvan ENT2 een uitgebreid bestudeerde transmembraannucleosidetransporter9 is. Het faciliteert het energieonafhankelijke transmembraantransport van verschillende purine- en pyrimidinenucleosiden10,11. Bij zoogdieren is ENT2 een alomtegenwoordige bidirectionele transporter die de cellulaire opname van purine- en pyrimidinenucleosiden en nucleobasen faciliteert. Deze transportactiviteit draagt bij aan het herstel van nucleotiden en helpt de cellulaire metabole homeostase12 te behouden. ENT2 bemiddelt ook het transport van diverse nucleoside-afgeleide geneesmiddelen, waardoor de functionele relevantie ervan verder gaat dan de beweging van endogene nucleosiden, en het bredere fysiologische en klinische belang benadrukt13. Bovendien is ENT2 in verband gebracht met neurologische aandoeningen14, tumormetabolisme15, vasculaire disfunctie16 en cellulaire energiemetabolisme bij mensen17. Studies naar de rol van Ent2 op organismeniveau in Drosophila blijven echter beperkt.

De rollen van ENT2 in groei en ontwikkeling, energiemetabolisme, locomotorische prestaties en antioxidantcapaciteit onder wisselende temperatuurcondities zijn nietvolledig onderzocht. Temperatuur beïnvloedt sterk de basale stofwisseling en levensduur bij Drosophila, waarbij hogere opvoedingstemperaturen over het algemeen de metabole activiteit verhogenen de levensduur verkorten. Deze temperatuurafhankelijke veranderingen in genexpressie kunnen fysiologische routes beïnvloeden en daarmee de fenotypische effecten van specifieke genmutaties wijzigen20.

Geclusterde Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-geassocieerd eiwit 9 (CRISPR/Cas9) is veel toegepast in Drosophila voor diverse genomische modificatieoperaties zoals site-specific knockout, deletie, vervanging en tag-introductie, waarmee de efficiëntie en betrouwbaarheid worden aangetoond 21,22,23. De laatste vooruitgang geeft aan dat CRISPR-afgeleide basiseditors ook kunnen worden gebruikt voor fijnere site-specifieke basismodificaties in Drosophila, wat een nieuw hulpmiddel biedt voor puntmutaties en precieze fenotypische controle24. Traditionele mutagenesemethoden, waaronder chemische en stralingsmutagenese evenals transposon-gemedieerde screenings, kunnen genetische mutaties genereren25. Deze benaderingen worden vaak beperkt door lage efficiëntie en hoge willekeur in de mutatiegebeurtenissen. Daarom moeten onderzoekers grote aantallen individuen screenen om specifieke allelen van belang te isoleren26. CRISPR/Cas9 maakt geprogrammeerde gids-RNA (gRNA)-gestuurde splitsing mogelijk bij gespecificeerde DNA-sequenties. De resulterende dubbelstrengbreuken worden gerepareerd door niet-homologe eindverbindingen of homologiegerichte reparatie, wat gedefinieerde, erfelijke mutaties genereert en achtergrondmutaties aanzienlijk vermindert die fenotypische analyse kunnen verstoren27,28. Mutante allelen die via CRISPR/Cas9 worden gegenereerd, kunnen in een heterozygote toestand worden gehouden door koppeling met balancerchromosomen, zoals Curly O (CyO)29. Deze strategie is aangetoond effectief het verlies van dodelijke allelen in homozygote vorm te voorkomen in de genetica van Drosophila. Als gevolg hiervan ondersteunt het langetermijn- en systematische fenotypische beoordeling, inclusief functionele studies onder wisselende temperaturen of omgevingscondities29,30. Het eenvoudige ontwerp en de hoge efficiëntie van CRISPR/Cas9 hebben de cyclus van de stamconstructie aanzienlijk verkort en de stabiliteit van de genetische achtergrond verbeterd. Dit is vooral belangrijk voor het bestuderen van langetermijnomgevingsfactoren zoals temperatuurrespons en ontwikkelingshomeostase.

Voortbouwend op deze basis werd het Ent2-gen in Drosophila melanogaster uitgeschakeld met behulp van het CRISPR/Cas9-systeem, en werd een stabiel geërfde Ent2*/CyO heterozygote mutantenstam opgebouwd. De ontwikkelingscyclus, het lichaamsgewicht, het bewegingsvermogen en de activiteiten van de antioxidantenzymen SOD en CAT werden systematisch beoordeeld. Door multidimensionale fenotypes van w1118 en mutante vliegen onder wisselende temperatuurcondities te vergelijken, beoogt deze studie een reproduceerbare strategie te presenteren voor het genereren en onderhouden van CRISPR-afgeleide mutantlijnen en biedt het een beschrijvende karakterisering van de resulterende fenotypen. Dit werk biedt een methodologisch kader en een nuttige genetische bron voor toekomstige studies die genen onderzoeken die betrokken zijn bij metabolisme en omgevingsreacties.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Ontwerp van CRISPR/Cas9-doelen voor het Ent2-gen

  1. Selecteer kandidaat-CRISPR-locaties in exons 2 en 5 van Ent2 (FlyBase ID: FBgn0263916) met behulp van CHOPCHOP (v3)31 en de CCTop (v1.0)32.
  2. Het referentiegenoom werd gedefinieerd als Drosophila melanogaster Release 6 (dm6) (RefSeq assembly accession: GCF_000001215.4). Vervolgens werden kandidaat-gRNA-locaties geïdentificeerd. Ten slotte werden de geïdentificeerde locaties gefilterd om de optimale gRNA's te verkrijgen.
  3. Filter doelen op MIT Specificity Score ≥ 80 (CHOPCHOP), CFD-score ≤ 0,1 (CCTop), GC-inhoud 40%–60% en minimale PAM-afstand.
  4. Rangschik doelen met een gewogen score (efficiëntie 50%, specificiteit 30%, GC-optimalisatie 20%) en kies twee gRNA's.
  5. Voeg één "G" toe aan het 5′-uiteinde van elk gRNA om aan de T7-promotorvereiste te voldoen. Gebruik de volgende gRNA-specifieke vooraanstaande oligonucleotiden om het volledige sgRNA-transcriptiesjabloon te genereren met PCR:
    Ent2-sg1-F: TAATACGACTCACTCACT
    AGGTGACGTTAAATCCATCGTTTTAGAGCTAGATAGAAATAGĄG
    Ent2-sg2-F: TAATACGACTCAC
    TATATTGCCGTTGGAATCATGGGGGTTTTAGAGCTAGAAATAAATAGC
  6. De resterende sgRNA-scaffoldsequentie wordt geleverd door de universele omgekeerde oligonucleotide tijdens PCR.

2. Voorbereiding van sgRNA-transcriptiesjablonen

  1. Voorbereiding van sgRNA-transcriptietemplates
    1. Stel een 60 μL PCR-reactiemengsel samen met de double-oligonucleotide annealing–PCR methode33 volgens de instructies van de fabrikant. Combineer het gRNA-specifieke forward oligonucleotide (Ent2-sg1-F of Ent2-sg2-F) met een universele reverse oligonucleotide die codeert voor de sgRNA-scaffold om het volledige dsDNA-sjabloon voor in vitro transcriptie te verkrijgen.
    2. Programmeer de thermocycler: 95 °C 3 min; 35 cycli van 95 °C 30 s, 55 °C 30 s, 72 °C 20 s; daarna 72 °C 10 min; Houd op 12 °C.
  2. Zuiver het transcriptiesjabloon
    1. Voeg 100 μL ammoniumacetaat toe (zie Materiaaltabel) aan het 60 μL PCR-product; meng. Voeg 400 μL watervrij ethanol toe; Omkeren om te mengen en 20 minuten incuberen bij -20 °C.
    2. Centrifugeren op 4 °C, 20.000 x g gedurende 15 minuten; Gooi supernatant weg.
    3. Laat de pellet 10 minuten aan de lucht drogen met de buis open. Sussief de pellet opnieuw in 10 μL nucleasevrije ddH₂O.
  3. In vitro transcriptie van gRNA
    1. Stel een 10 μL T7 in vitro transcriptiereactie op volgens de instructies van de kit (zie Materiaaltabel).
    2. Incubeer bij 37 °C gedurende 35 minuten. Voeg 0,5 μL DNase I toe (geleverd in de transcriptiekit) en incubeer bij 37 °C gedurende 15 minuten.
  4. Zuiver gRNA
    1. Verdun het transcriptiemengsel tot 60 μL met nucleasevrije ddH₂O. Voeg 60 μL waterverzadigd fenol/chloroform toe (zie Materiaaltabel ); Draai kort en centrifugeer bij 4 °C, 16.000 x g gedurende 5 minuten.
    2. Breng 45 μL van de waterige fase over naar een nieuwe 1,5 mL RNase-vrije buis. Voeg 5 μL natriumacetaat toe; Mix.
    3. Voeg 125 μL voorgekoelde watervrije ethanol toe; Meng en bebroei bij -20 °C gedurende 20–30 minuten. Centrifugeren op 4 °C, 20.000 x g gedurende 15 minuten; Gooi supernatant weg.
    4. Was de pellet met 200 μL 70% ethanol (RNase-vrij); centrifugeren op 4 °C, 20.000 x g gedurende 5 minuten; Verwijder supernatant.
    5. Droog de pellet bij 37 °C totdat ethanol volledig verdampt is. Herstel in 20 μL ddH₂O; aliquot en bewaren bij -80 °C.
    6. Meet de gRNA-concentratie met een NanoDrop-spectrofotometer en stel de concentratie aan op 250 ng/μL voor injectie. Zorg voor de zuiverheid van het gRNA met een A260/A280-verhouding van ongeveer 2,0.
      OPMERKING: We benadrukken dat handschoenen gedurende het hele proces gedragen moeten worden voor bescherming tegen RNase. Alle verbruiksmaterialen, inclusief voorgekoelde RNase-vrije centrifugebuizen en pipettoppen, moeten consequent worden gebruikt tijdens de procedure. Organisch reagentiaafval dat tijdens de operatie wordt geproduceerd, moet apart worden verzameld in aangewezen afvalcontainers volgens type en regelmatig worden vervoerd naar een gecertificeerde opslagfaciliteit voor gevaarlijk afval voor correcte behandeling.

3. Bereiding van Cas9 mRNA

  1. Voorbereiding van het transcriptiesjabloon
    OPMERKING: Gebruik RNase-vrije tips en buisjes tijdens RNA-gerelateerde stappen.
    1. Ontdooi het Cas9-expressieplasmide MLM3613 (zie Materiaaltabel) op ijs. In een RNase-vrije buis combineer je 20 μg plasmide-DNA, 7,5 μL 10x restrictiebuffer, 1 μL PmeI (10.000 U/mL) en nucleasevrije ddH₂O tot 75 μL.
    2. Bred 30 minuten uit bij 37 °C. Controleer volledige linearisatie door 5 μL op een 1% agarosegel bij 120 V te laden gedurende 30 minuten.
  2. Zuivering van transcriptiesjablonen
    1. Voeg 23 μL 2% natriumdodecylsulfaat toe (SDS, zie Materiaaltabel voor details) en 0,5 μL proteïnase K (zie Materiaaltabel voor details) aan 70 μL van de digestie; Incubeer bij 50 °C gedurende 30 minuten.
    2. Voeg 45 μL chloroform en 45 μL tris-verzadigd fenol toe; vortex kort; Centrifuge 13.800 x g, 5 min.
    3. Breng 90 μL waterige fase over naar een nieuwe buis. Voeg 10 μL natriumacetat toe (geleverd door de kit) en 200 μL voorgekoelde watervrije ethanol; mix; Incubeer −20 °C, 30 min.
    4. Centrifuge 20.000 x g, 4 °C, 15 min; Gooi supernatant weg. Was de pellet twee keer met 100 μL 70% ethanol; centrifuge 20.000 x g, elk 2 minuten; Luchtdrogen.
    5. Los DNA op in 20 μL nucleasevrije ddH₂O; Bevestig >500 ng/μL.
  3. In vitro transcriptie met co-capping
    1. Stel de reactie op met een T7 in vitro transcriptiekit met capping (zie Materiaaltabel) volgens de instructies van de fabrikant.
    2. Incubeer bij 37 °C gedurende 2 uur om geccaped Cas9 mRNA te produceren.
    3. Na voltooiing van de transcriptiereactie voeg je 1 μL DNase toe (inbegrepen in de kit, concentratie 2 U/μL), meng je grondig en incubeer je bij 37°C gedurende 15 minuten om het DNA-sjabloon af te breken.
  4. Voeg een poly(A) staart toe
    1. Breng het RNA naar 14 μL ddH₂O.
    2. Voeg 2 μL 10x E. coli Poly(A) polymerasebuffer, 2 μL ATP (10 mM), 1 μL RNase-inhibitor en 1 μL Poly(A) polymerase toe.
    3. Bred 45 minuten uit bij 37 °C.
  5. Zuiver het mRNA
    1. Pas de reactie toe op een spinkolom totale RNA-kit (zie Materiaaltabel). Laad het monster op een 2 mL silica-membraan spinkolom; centrifuge 8.000 x g, 15 s; Gooi doorstroom.
    2. Voeg 500 μL RPE-buffer toe aan de RNeasy-kolom, centrifugeer op 8000 x g gedurende 15 seconden en gooi de resterende vloeistof weg. Herhaal deze stap één keer, centrifugeer dan 2 minuten en gooi de restvloeistof weg.
    3. Plaats de RNeasy-kolom in een nieuwe 1,5 mL centrifugebuis. Voeg 30 μL RNase-vrije ddH₂O toe, centrifugeer op 8000 x g gedurende 1 minuut om het RNA te elueren. Pas de mRNA-concentratie aan op 500 ng/μL voor de injectie. Bewaar het geëlueerde RNA bij -80 °C.

4. Micro-injectie van Drosophila-embryo's

  1. Bereiding van injectiemonsters
    1. Meng 15 μg Cas9 mRNA met 7,5 μg dubbelstrengs gRNA bij een volumeverhouding van 2:1.
    2. Stel het in op 30 μL met DEPC-behandeld RNase-vrij water; blijf op ijs.
  2. Drosophila-opvoeding
    1. Breng de geïnjecteerde Drosophila-stam w1118 over naar grote voedselbuizen voor versterking. W1118 vliegen werden gebruikt als referentiecontrole om de basisfysiologische toestand te representeren zonder balancer-gerelateerde effecten.
    2. Houd de vliegen in een kunstmatige klimaatkamer ingesteld op 25 °C met een luchtvochtigheid van 60%–70% en een licht-donker cyclus van 12:12 gedurende 14 dagen.
    3. Om 17:00 uur op de dag na de 14-daagse opvoedingsperiode (dag 15) verzamel je volwassen vliegen om het getimede embryo-leggen te synchroniseren. Deze specifieke verzameltijd zorgt ervoor dat embryo's die voor injectie worden gebruikt in een consistent ontwikkelingsstadium verkeren. Het beheersen van het tijdstip is belangrijk om de effecten van het circadiane ritme op de ontwikkeling van embryo's en voortplantingsgedrag te minimaliseren, waardoor experimentele reproduceerbaarheid wordt gegarandeerd en de fysiologische variabiliteit tussen batches wordt verminderd.
  3. Micro-injectie van Drosophila
    1. Verzamel volwassen vliegen voor injectie in vliegenkooien, met ongeveer 400 volwassen vliegen per kooi. Embryo's verzamelen op gist gecoate agarplaten; Verzamel embryo's binnen 60 minuten na het leggen van het ei en spoel ze af op dekdekkers. Er werd geen dechorionatie uitgevoerd vóór de injectie.
    2. Lijn de embryo's uit op dekfolies met hun achterste polen naar buiten gericht, ordelijk gerangschikt van boven naar beneden. Zorg ervoor dat de injectienaald de achterpool tot een geschikte diepte (ongeveer een vijfde van de embryolengte) doordringt voor een consistente cytoplasmatische levering. In totaal werden 300 embryo's gebruikt in deze studie.
    3. Onder een stereomicroscoop richt je de naaldpunt en het embryo op hetzelfde vlak.
    4. Met het injectieinstrument doorboor je de achterpool en injecteer 0,001 μL van het mengsel in elk embryo.
    5. Geïnjecteerde embryo's worden overgebracht in voedselflesjes; Incubeer bij 25 °C, ~70% relatieve luchtvochtigheid (RH) om P₀-generatie te verkrijgen (de geïnjecteerde volwassen dieren die overleven om nakomelingen te produceren).

5. Constructie van stabiele expressiestammen in Drosophila

  1. Kruis met P₀ met Bc/CyO vliegen.
    1. Microinjecteer een mengsel van gRNA gericht op het gen van interesse en Cas9-eiwit in 300 embryo's van de w1118 Drosophila-stam . Na injectie wordt in totaal 30 levensvatbare en vruchtbare P0-volwassenen veroverd. Kruis elke volwassen P0 (mozaïek) afzonderlijk met vliegen uit de w1118-stam , wat resulteert in 16 enkelpaarige kruisingen (8 flesjes met P0-mannetjes gekruist met maagdelijke vrouwtjes en 8 flesjes met P0-vrouwtjes gekruist met mannetjes). Houd alle kruisingen op 25 °C onder constante kweekomstandigheden.
    2. Na het verschijnen van F1-larven verwijder je de P0-oudervliegen. Haal genomisch DNA uit de F1-nakomelingen en onderwerp het aan PCR-analyse om de F1-genotypen (Ent2/+) te bepalen.
    3. Genereer F2-nakomelingen door enkele kruisingen tussen Bc/CyO-vliegen . Selecteer individuele F2-volwassenen en genotype hen om vliegen met het Ent2/CyO-genotype te identificeren.
    4. Intercross F3 vliegt (Ent2/CyO) om de aanwezigheid van homozygote mutanten te beoordelen. Als er geen homozygote vliegen worden gevonden, kruisen Ent2/CyO-vliegen voor een extra generatie om verder te bepalen of het homozygote genotype dodelijk is.
  2. Drosophila genomische DNA-extractie
    1. Verzamel één of twee volwassen vliegen in een 1,5 mL EP-buis en voeg 110 μL Plant DNA Extraction Buffer PA toe.
    2. Homogeniseer monsters grondig met een weefselgrinder gedurende minstens 3 minuten.
    3. Incubeer de homogenaten in een metalen bad van 65 °C gedurende minstens 30 minuten.
    4. Voeg 100 μL chloroform toe, draai het mengsel voorzichtig om te mengen en laat het 10 seconden vortexen. Centrifugeer de monsters op 14.000 rpm gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
    5. Voorzichtig doe je ongeveer 65 μL (of meer) van het supernatant over in een nieuwe buis, voeg twee volumes voorgekoelde absolute ethanol toe (vooraf geïncubeerd bij 4 °C gedurende minstens 10 minuten), keer voorzichtig om te mengen en incubeer bij -20 °C gedurende minstens 15 minuten.
    6. Centrifugemonsters bij 14.000 rpm gedurende 10 minuten bij 4 °C en gooi het supernatant zorgvuldig weg.
    7. Laat de DNA-pellet aan de lucht drogen op kamertemperatuur of in een broedmachine tot het volledig droog is, en laat het daarna opnieuw ophangen in een passend volume PB-buffer. Voor vrouwelijke (f) monsters voeg je 50 μL PB-buffer toe, terwijl voor mannelijke (m) monsters 15 μL wordt toegevoegd.
  3. PCR-versterking en Sanger-sequencing
    1. Voer PCR-amplificatie uit met specifieke primers die ontworpen zijn om de upstream- en downstreamgebieden van de gRNA-doellocatie te flankeren.
    2. Zuiver de PCR-producten en onderwerp ze aan Sanger-sequencing. Analyseer de sequencingchromatogrammen met SnapGene software34 en lijn af met de wildtype referentiesequentie voor vergelijkende analyse.
    3. Onderzoek de piekplots nabij de gRNA-doellocatie op overlappende pieken die wijzen op indelmutaties. Voer pieksplitsing uit om gemengde signalen te onderscheiden en het type mutatie te bevestigen, inclusief inserties of deleties op de doellocatie.
    4. Terugkruising met Bc/CyO-mannetjes gedurende 4 generaties om Ent2/CyO vast te stellen.
      Opmerking: Er is waargenomen dat Ent2*/Ent2* en CyO/CyO dodelijk zijn in de vroege ontwikkelingsstadia; daarom worden Ent2*/CyO-heterozygoten behouden.
  4. Na het vaststellen van de Ent2*/CyO-heterozygoten, verzamel je monsters van dezelfde batch Ent2*/CyO-heterozygoten onder een stereomicroscoop.
  5. Selecteer willekeurig 20 volwassen vliegen en weeg ze met een precisieweegschaal met een resolutie van 0,001 g. Maak foto's van de monsters om de fenotypische kenmerken te documenteren.

6. Beschrijvende fenotypische karakterisering

  1. Achterin 120 mannetjes en 120 vrouwtjes (drie flesjes per groep getest, waarbij elk flesje 20 vliegen bevatte) elk van Ent2*/CyO en w1118 bij 22 °C en 25 °C.
  2. Noteer wekelijks het aantal sterfgevallen en teken de overlevingscurves uit.
  3. Stel 30 willekeurige paren per groep op; 24 uur koppeling toestaan;
  4. Volwassen dieren overbrengen naar verse buizen; Achterafkomelingen.
  5. Beoordeel 7 dagen na de eclosie het klimsucces (≥8 cm binnen 30 seconden) met zes replicaties per groep.
  6. Alle observaties werden vastgelegd als beschrijvende kenmerken van de mutantenlijn en werden niet gebruikt om genfunctie af te leiden.

7. Meet de activiteiten van antioxidante enzymen

  1. Verzamel 300 mannelijke en 300 vrouwelijke volwassen dieren (drie flesjes per groep getest, waarbij elk flesje 100 vliegen bevat) Ent2*/CyO en w1118 controlevliegen die 5 dagen na de eclosie zijn om fysiologische volwassenheid en vergelijkbare leeftijd te waarborgen.
  2. Vliegen overbrengen naar lege buisjes zonder voedsel en 2 uur verhongeren om de metabole toestand te standaardiseren vóór biochemische tests.
  3. Voeg één stalen kraal/buis toe; homogeniseer bij 60 Hz, 2 minuten.
  4. Centrifuge 4 °C, 161 x g, 10 min; Verzamel het supernatant.
  5. Meet totale superoxide-dismutase (SOD, zie Tabel van Materialen voor details) en katalase (CAT, zie Tabel van Materialen voor details) volgens de instructies van de kit.

8. Datastatistiek en analyse

  1. Druk alle gegevens uit als gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde (figure-protocol-1± SEM).
  2. Gebruik eenrichtings-ANOVA om enzymactiviteitsgegevens te vergelijken; Pas drievoudige ANOVA toe (factoren: genotype, temperatuur, geslacht) op lichaamsgewicht, klimvermogen en lichaamslengte. Voer Tukey's HSD post hoc test uit wanneer passend35.
  3. Definieer significantie als P < 0,05 voor alle statistische tests.
  4. Analyseer levensduurgegevens met behulp van overlevingscurves en voer de log-rank (Mantel-Cox) test uit, die beoordeelt of er significante verschillen zijn in overlevingstrajecten tussen experimentele cohorten36.
  5. Voer alle analyses en plotten uit in GraphPad Prism 9.5.0 software volgens de softwarerichtlijnen37.
  6. Alle statistische analyses werden uitsluitend uitgevoerd voor beschrijvende vergelijking en niet om oorzakelijke relaties vast te stellen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Ontwerp- en effectiviteitsverificatieanalyse van Ent2-gentargetinglocaties
Kandidaat-doellocaties voor het Ent2-gen zijn ontworpen met behulp van CHOPCHOP- en CCTop-platforms (Figuur 1). Twee gRNA's die zich richten op exon 2 en exon 5 regio's werden geselecteerd op basis van specificiteits- en efficiëntiecriteria. Om succesvolle genoombewerking te verifiëren, werd genomisch DNA van willekeurig geselecteerde individuen van de gevestigde Ent2*/Cy...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Ent is een evolutionair geconserveerd eiwit dat meerdere biologische processen beaamt38. Wanneer het tot expressie komt in Xenopus laevis-oocyten, vertoont Ent2 nucleoside transportactiviteit8. Studies hebben aangetoond dat de homozygote mutant van Ent2 dodelijk is tijdens het late larvale of vroege popstadium10. In deze studie werd een CRISPR/Cas9-gebaseerde genoombewerkingsworkflow opgest...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Alle auteurs hoeven geen belangenconflicten aan te geven.

Dankbetuigingen

Steun dit onderzoek door het Wetenschaps- en Technologieontwikkelingsprogramma van de provincie Jilin (projectnr. 20230505044ZP).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Ammonium acetateSigma A1542
Catalase (CAT) Assay Kit (Visible Light Method) (Ammonium Molybdate Method)Nanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA007-1-1
Dodecyl sulfateSigmaL3771
Injection deviceEppendorf FemtoJet 4i
Linearized plasmid: MLM3613Addgene42251
MicroscopeOLYMPUS CKX3-SLP
mMESSAGE mMACHINE T7 kitThermo FisherAM1344
mMESSAGE mMACHINE T7 Transcription KitThermo FisherAM1344
PmeI restriction enzymeNEB R0560S
Poly(A) polymeraseNEBM0276S
Protease KThermo FisherEO0491
RNeasy Mini KitQIAGEN74104
T7 RiboMAX Express Large Scale RNA Production SystemPromega P1320
T7 RiboMAX KitPromega P1320
Total Superoxide Dismutase (T-SOD) assay kit (Hydroxylamine method)Nanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA001-1
w1118 Drosophila Fangjing Biology
Water-saturated phenol/chloroformSigmaP2069

Referenties

  1. Tolwinski, N. S. Introduction: Drosophila-A Model System for Developmental Biology. J Dev Biol. 5 (3), (2017).
  2. Ogienko, A. A., et al. Drosophila as a Model Organism to Study Basic Mechanisms of Longevity. Int J Mol Sci. 23 (19), (2022).
  3. Lu, T. C., et al. Aging Fly Cell Atlas identifies exhaustive aging features at cellular resolution. Science. 380 (6650), eadg0934(2023).
  4. Koyama, T., Texada, M. J., Halberg, K. A., Rewitz, K. Metabolism and growth adaptation to environmental conditions in Drosophila. Cell Mol Life Sci. 77 (22), 4523-4551 (2020).
  5. Moraes, K. C. M., Montagne, J. Drosophila melanogaster: A Powerful Tiny Animal Model for the Study of Metabolic Hepatic Diseases. Frontiers in Physiology. 12, 2021(2021).
  6. Chatterjee, N., Perrimon, N. What fuels the fly: Energy metabolism in Drosophila and its application to the study of obesity and diabetes. Sci Adv. 7 (24), (2021).
  7. Volonté, C., Alberti, F., Vitale, G., Liguori, F. Delineating Purinergic Signaling in Drosophila. International Journal of Molecular Sciences. 23 (23), 15196(2022).
  8. Machado, J., Abdulla, P., Hanna, W. J., Hilliker, A. J., Coe, I. R. Genomic analysis of nucleoside transporters in Diptera and functional characterization of DmENT2, a Drosophila equilibrative nucleoside transporter. Physiol Genomics. 28 (3), 337-347 (2007).
  9. Ho, H. T., Xia, L., Wang, J. Residue Ile89 in human plasma membrane monoamine transporter influences its organic cation transport activity and sensitivity to inhibition by dilazep. Biochem Pharmacol. 84 (3), 383-390 (2012).
  10. Knight, D., et al. Equilibrative nucleoside transporter 2 regulates associative learning and synaptic function in Drosophila. J Neurosci. 30 (14), 5047-5057 (2010).
  11. Sidorov, R., Kucerova, L., Kiss, I., Zurovec, M. Mutation in the Drosophila melanogaster adenosine receptor gene selectively decreases the mosaic hyperplastic epithelial outgrowth rates in wts or dco heterozygous flies. Purinergic Signal. 11 (1), 95-105 (2015).
  12. Naes, S. M., Ab-Rahim, S., Mazlan, M., Abdul Rahman, A. Equilibrative Nucleoside Transporter 2: Properties and Physiological Roles. Biomed Res Int. 2020, 5197626(2020).
  13. Boswell-Casteel, R. C., Hays, F. A. Equilibrative nucleoside transporters-A review. Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. 36 (1), 7-30 (2017).
  14. Wu, K. C., Lee, C. Y., Chou, F. Y., Chern, Y., Lin, C. J. Deletion of equilibrative nucleoside transporter-2 protects against lipopolysaccharide-induced neuroinflammation and blood-brain barrier dysfunction in mice. Brain Behav Immun. 84, 59-71 (2020).
  15. Rattray, Z., et al. ENT2 facilitates brain endothelial cell penetration and blood-brain barrier transport by a tumor-targeting anti-DNA autoantibody. JCI Insight. 6 (14), (2021).
  16. Chiang, H. L., et al. The Critical Role of Equilibrative Nucleoside Transporter-2 in Modulating Cerebral Damage and Vascular Dysfunction in Mice with Brain Ischemia-Reperfusion. Pharm Res. 40 (11), 2541-2554 (2023).
  17. Chen, M., et al. SLC29A1 and SLC29A2 are human nicotinamide cell membrane transporters. Nat Commun. 16 (1), 1181(2025).
  18. Bajgar, A., et al. Extracellular adenosine mediates a systemic metabolic switch during immune response. PLoS Biol. 13 (4), e1002135(2015).
  19. Mołoń, M., et al. Effects of Temperature on Lifespan of Drosophila melanogaster from Different Genetic Backgrounds: Links between Metabolic Rate and Longevity. Insects. 11 (8), (2020).
  20. Chen, J., Nolte, V., Schlötterer, C. Temperature-Related Reaction Norms of Gene Expression: Regulatory Architecture and Functional Implications. Mol Biol Evol. 32 (9), 2393-2402 (2015).
  21. Gratz, S. J., Rubinstein, C. D., Harrison, M. M., Wildonger, J., O'Connor-Giles, K. M. CRISPR-Cas9 Genome Editing in Drosophila. Curr Protoc Mol Biol. 111, 31.32.31-31.32.20 (2015).
  22. Bassett, A., Liu, J. L. CRISPR/Cas9 mediated genome engineering in Drosophila. Methods. 69 (2), 128-136 (2014).
  23. Port, F., Muschalik, N., Bullock, S. L. Systematic Evaluation of Drosophila CRISPR Tools Reveals Safe and Robust Alternatives to Autonomous Gene Drives in Basic Research. G3 Genes|Genomes|Genetics. 5 (7), 1493-1502 (2015).
  24. Clark, M., et al. Expanding the CRISPR base editing toolbox in Drosophila melanogaster. Communications Biology. 7 (1), 1126(2024).
  25. Venken, K. J., Bellen, H. J. Chemical mutagens, transposons, and transgenes to interrogate gene function in Drosophila melanogaster. Methods. 68 (1), 15-28 (2014).
  26. Port, F., Boutros, M. Drosophila: Methods and Protocols. Dahmann, C. , Springer US. 157-176 (2022).
  27. Liao, H., Wu, J., VanDusen, N. J., Li, Y., Zheng, Y. CRISPR-Cas9-mediated homology-directed repair for precise gene editing. Mol Ther Nucleic Acids. 35 (4), 102344(2024).
  28. Shumega, A. R., et al. CRISPR/Cas9 as a Mutagenic Factor. International Journal of Molecular Sciences. 25, 823(2024).
  29. Miller, D. E., Cook, K. R., Hawley, R. S. The joy of balancers. PLoS Genet. 15 (11), e1008421(2019).
  30. Muron, S., Kucera, S., Oliver, B., Benner, L. Creation of a new Drosophila melanogaster X chromosome balancer, First Multiple 8 ( FM8 ), using the CRISPR/Cas9 gene-editing system. MicroPubl Biol. 2022, (2022).
  31. Labun, K., et al. CHOPCHOP v3: expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing. Nucleic Acids Res. 47 (W1), W171-W174 (2019).
  32. Stemmer, M., Thumberger, T., Del Sol Keyer, M., Wittbrodt, J., Mateo, J. L. CCTop: An Intuitive, Flexible and Reliable CRISPR/Cas9 Target Prediction Tool. PLoS One. 10 (4), e0124633(2015).
  33. Bassett, A. R., Tibbit, C., Ponting, C. P., Liu, J. L. Highly efficient targeted mutagenesis of Drosophila with the CRISPR/Cas9 system. Cell Rep. 4 (1), 220-228 (2013).
  34. Wang, H., Zheng, S., Yu, X., Wu, K., Zhao, M. Clinical characteristics and genotypes of patients with Congenital fibrinogen disorders. Zhonghua Yi Xue Yi Chuan Xue Za Zhi. 42 (3), 264-273 (2025).
  35. Chotcomwongse, P., et al. The Impact of Various Surface Treatments on Adhesion Between Co-Cr Alloy and Acrylic Teeth. Int J Dent. 2026, 2199689(2026).
  36. Prakash, S., Havard, M., Hodges, E., Agrawal, A., Ahuja, S. In the artificial intelligence age, is Oswestry spinal risk index still useful? an external validation of Oswestry spinal risk index applied to radiotherapy patients and its relevance. Br J Neurosurg. , 1-9 (2026).
  37. Anaya-Ayala, J. E., et al. Analysis of Inflammatory and Angiogenic Activities in Patients with Abdominal Aortic Aneurysms with the Radiotracers (99m)Tc-HYNIC-CCR2-L and (99m)Tc-RGD with Single-Photon Emission Computed Tomography. Ann Vasc Surg. 124, 312-317 (2026).
  38. Rose, J. B., Coe, I. R. Physiology of nucleoside transporters: back to the future. Physiology (Bethesda). 23, 41-48 (2008).
  39. Niveditha, S., Deepashree, S., Ramesh, S. R., Shivanandappa, T. Sex differences in oxidative stress resistance in relation to longevity in Drosophila melanogaster. Journal of Comparative Physiology B. 187 (7), 899-909 (2017).
  40. Carvalho, G. B., et al. The 4E-BP growth pathway regulates the effect of ambient temperature on Drosophila metabolism and lifespan. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (36), 9737-9742 (2017).
  41. Martelli, F., Alves, A. N., Yang, Y. T., Batterham, P., Wedell, N. Genotype and sex affect the combined impact of temperature and low-dose insecticide exposure on insect survival. Insect Sci. , (2024).
  42. Goh, G. H., Blache, D., Mark, P. J., Kennington, W. J., Maloney, S. K. Daily temperature cycles prolong lifespan and have sex-specific effects on peripheral clock gene expression in Drosophila melanogaster. J Exp Biol. 224 (10), (2021).
  43. Robillard, K. R., Bone, D. B. J., Hammond, J. R. Hypoxanthine uptake and release by equilibrative nucleoside transporter 2 (ENT2) of rat microvascular endothelial cells. Microvasc Res. 75 (3), 351-357 (2008).
  44. Kropotov, A., et al. Equilibrative Nucleoside Transporters Mediate the Import of Nicotinamide Riboside and Nicotinic Acid Riboside into Human Cells. Int J Mol Sci. 22 (3), (2021).
  45. Katsyuba, E., et al. De novo NAD(+) synthesis enhances mitochondrial function and improves health. Nature. 563 (7731), 354-359 (2018).
  46. Suman, R., et al. Deregulation of mitochondrial reverse electron transport alters the metabolism of reactive oxygen species and NAD+/NADH and presents a therapeutic target in Alzheimer's disease. Ageing Neur Dis. 4 (1), 4(2024).
  47. Pérez, S. E., Gooz, M., Maldonado, E. N. Mitochondrial Dysfunction and Metabolic Disturbances Induced by Viral Infections. Cells. 13 (21), (2024).
  48. Ballard, J. W., Melvin, R. G., Miller, J. T., Katewa, S. D. Sex differences in survival and mitochondrial bioenergetics during aging in Drosophila. Aging Cell. 6 (5), 699-708 (2007).
  49. Yi, Y., Xu, W., Fan, Y., Wang, H. X. Drosophila as an emerging model organism for studies of food-derived antioxidants. Food Res Int. 143, 110307(2021).
  50. Tiberi, J., et al. Sex differences in antioxidant defence and the regulation of redox homeostasis in physiology and pathology. Mechanisms of Ageing and Development. 211, 111802(2023).
  51. Gratz, S. J., et al. Genome engineering of Drosophila with the CRISPR RNA-guided Cas9 nuclease. Genetics. 194 (4), 1029-1035 (2013).
  52. Yan, Y., Schetelig, M. F. Protocol for genetic engineering in Drosophila suzukii using microinjection. STAR Protocols. 5 (3), 103248(2024).
  53. Aguilar, G., et al. Seamless knockins in Drosophila via CRISPR-triggered single-strand annealing. Developmental Cell. 59 (19), 2672-2686.e5 (2024).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

GeneticaEditie 234Editie 234Lege waardeEditieoxidatieve stress
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.