CRISPR/Cas9-gemedieerde generatie en karakterisering van een Ent2*/CyO Drosophila melanogasterstam

Samenvatting

Evenwichtige nucleosidetransporter 2 (ENT2) is een geconserveerd transmembraaneiwit dat betrokken is bij nucleosidetransport en cellulaire stofwisseling. In deze studie werd een CRISPR/Cas9-gebaseerde genoombewerkingsworkflow opgezet om een op Ent2 gerichte allel in Drosophila melanogaster te genereren. Een stabiele Ent2*/CyO heterozygote lijn werd geconstrueerd en onderhouden met behulp van een balancer-chromosoomstrategie. Dit werk beschrijft het ontwerp, de generatie en moleculaire validatie van de mutantlijn, evenals de fenotypische karakterisering onder verschillende temperatuurcondities. De gevestigde workflow en mutantenstam bieden een praktisch kader voor het bestuderen van genen met homozygote dodelijke fenotypen en voor het onderzoeken van temperatuurgeassocieerde fenotypische variatie bij Drosophila.

Samenvatting

In deze studie werd een op CRISPR/Cas9 gebaseerde genoombewerkingsmethode gebruikt om mutaties te introduceren in het evenwichtige nucleoside transporter 2 (Ent2)-gen in Drosophila melanogaster. Gids-RNA's die zich richten op het coderende gebied van Ent2 werden ontworpen en samen met Cas9 mRNA in w^{1118-embryo's} geïnjecteerd. Mutante allelen werden geïdentificeerd door Sanger-sequencing en gehandhaafd als een stabiele Ent2*/CyO heterozygote lijn met behulp van een balancerchromosoom. Vervolgens evalueerden we het lichaamsgewicht, het klimvermogen, de overlevingskans en de activiteiten van superoxide-dismutase (SOD) en katalase (CAT) bij fruitvliegen bij respectievelijk 22 °C en 25 °C. De resultaten geven aan dat bij zowel 22 °C als 25 °C de lichaamslengte en het gewicht van Ent2*/CyO-fruitvliegen significant werden verminderd ten opzichte van de w¹¹¹⁸, en hun ontwikkeling vertraagd was. Bij 22 °C was de totale levensduur van Ent2*/CyO-vliegen iets langer dan die van de w¹¹¹⁸, terwijl bij 25 °C geen significant verschil werd waargenomen. Wat betreft het voortbewegingsvermogen was de klimprestaties van heterozygote vliegen aanzienlijk lager dan die van de W¹¹¹⁸ bij beide temperaturen, waarbij mannetjes ernstiger werden getroffen. Daarnaast waren de antioxidante enzymactiviteit van CAT en SOD bij Ent2*/CyO fruitvliegjes significant verminderd, wat wijst op een duidelijke vermindering van de antioxidantcapaciteit. Deze resultaten beschrijven het fenotypische profiel van een door CRISPR gegenereerde Ent2-mutantlijn en tonen de haalbaarheid aan van het combineren van genoombewerking met balancerchromosoomstrategieën in Drosophila. Deze studie biedt een methodologisch kader en een genetische bron voor toekomstige onderzoeken naar genen die geassocieerd zijn met metabolisme en omgevingsreacties.

Inleiding

Drosophila melanogaster blijft een van de meest gebruikte modelorganismen voor genetica en ontwikkelingsbiologie¹. Het wordt gekenmerkt door een korte levenscyclus, snelle voortplanting, gevestigde genetische manipulatietools en een volledig geannoteerd genoom ^2,3. Deze soort wordt uitgebreid toegepast in studies naar genfunctie, metabole regulatie en milieuaanpassing ^4,5. Nucleosiden en hun afgeleiden zoals ATP zijn centraal voor de opwekking van cellulaire energie, nucleïnezuursynthese en signaaltransductie in Drosophila, wat de geconserveerde metabole regulatie over metazoën^{weerspiegelt 6}. Purinerge signaalroutes in Drosophila, die afhankelijk zijn van extracellulaire adenosin- en nucleosidetransportmechanismen, benadrukken de functionele rol van nucleosidebeweging over membranen bij het coördineren van energie- en signaaltransductieresponsen⁷. Onder deze processen wordt het transport van nucleosiden over het cytoplasmatisch membraan voornamelijk gemedieerd door de evenwichtige nucleosidetransporter (ENT) familie, waarbij DmENT2 functionele transportactiviteit vertoont in Drosophila⁸.

De KNO-familie bestaat uit meerdere subtypes, waarvan ENT2 een uitgebreid bestudeerde transmembraannucleosidetransporter⁹ is. Het faciliteert het energieonafhankelijke transmembraantransport van verschillende purine- en pyrimidinenucleosiden^10,11. Bij zoogdieren is ENT2 een alomtegenwoordige bidirectionele transporter die de cellulaire opname van purine- en pyrimidinenucleosiden en nucleobasen faciliteert. Deze transportactiviteit draagt bij aan het herstel van nucleotiden en helpt de cellulaire metabole homeostase¹² te behouden. ENT2 bemiddelt ook het transport van diverse nucleoside-afgeleide geneesmiddelen, waardoor de functionele relevantie ervan verder gaat dan de beweging van endogene nucleosiden, en het bredere fysiologische en klinische belang benadrukt¹³. Bovendien is ENT2 in verband gebracht met neurologische aandoeningen¹⁴, tumormetabolisme¹⁵, vasculaire disfunctie¹⁶ en cellulaire energiemetabolisme bij mensen¹⁷. Studies naar de rol van Ent2 op organismeniveau in Drosophila blijven echter beperkt.

De rollen van ENT2 in groei en ontwikkeling, energiemetabolisme, locomotorische prestaties en antioxidantcapaciteit onder wisselende temperatuurcondities zijn niet^{volledig onderzocht.} Temperatuur beïnvloedt sterk de basale stofwisseling en levensduur bij Drosophila, waarbij hogere opvoedingstemperaturen over het algemeen de metabole activiteit verhogen^{en de levensduur} verkorten. Deze temperatuurafhankelijke veranderingen in genexpressie kunnen fysiologische routes beïnvloeden en daarmee de fenotypische effecten van specifieke genmutaties wijzigen²⁰.

Geclusterde Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-geassocieerd eiwit 9 (CRISPR/Cas9) is veel toegepast in Drosophila voor diverse genomische modificatieoperaties zoals site-specific knockout, deletie, vervanging en tag-introductie, waarmee de efficiëntie en betrouwbaarheid worden aangetoond 21,22,23. De laatste vooruitgang geeft aan dat CRISPR-afgeleide basiseditors ook kunnen worden gebruikt voor fijnere site-specifieke basismodificaties in Drosophila, wat een nieuw hulpmiddel biedt voor puntmutaties en precieze fenotypische controle²⁴. Traditionele mutagenesemethoden, waaronder chemische en stralingsmutagenese evenals transposon-gemedieerde screenings, kunnen genetische mutaties genereren²⁵. Deze benaderingen worden vaak beperkt door lage efficiëntie en hoge willekeur in de mutatiegebeurtenissen. Daarom moeten onderzoekers grote aantallen individuen screenen om specifieke allelen van belang te isoleren²⁶. CRISPR/Cas9 maakt geprogrammeerde gids-RNA (gRNA)-gestuurde splitsing mogelijk bij gespecificeerde DNA-sequenties. De resulterende dubbelstrengbreuken worden gerepareerd door niet-homologe eindverbindingen of homologiegerichte reparatie, wat gedefinieerde, erfelijke mutaties genereert en achtergrondmutaties aanzienlijk vermindert die fenotypische analyse kunnen verstoren^27,28. Mutante allelen die via CRISPR/Cas9 worden gegenereerd, kunnen in een heterozygote toestand worden gehouden door koppeling met balancerchromosomen, zoals Curly O (CyO)²⁹. Deze strategie is aangetoond effectief het verlies van dodelijke allelen in homozygote vorm te voorkomen in de genetica van Drosophila. Als gevolg hiervan ondersteunt het langetermijn- en systematische fenotypische beoordeling, inclusief functionele studies onder wisselende temperaturen of omgevingscondities^29,30. Het eenvoudige ontwerp en de hoge efficiëntie van CRISPR/Cas9 hebben de cyclus van de stamconstructie aanzienlijk verkort en de stabiliteit van de genetische achtergrond verbeterd. Dit is vooral belangrijk voor het bestuderen van langetermijnomgevingsfactoren zoals temperatuurrespons en ontwikkelingshomeostase.

Voortbouwend op deze basis werd het Ent2-gen in Drosophila melanogaster uitgeschakeld met behulp van het CRISPR/Cas9-systeem, en werd een stabiel geërfde Ent2*/CyO heterozygote mutantenstam opgebouwd. De ontwikkelingscyclus, het lichaamsgewicht, het bewegingsvermogen en de activiteiten van de antioxidantenzymen SOD en CAT werden systematisch beoordeeld. Door multidimensionale fenotypes van w¹¹¹⁸ en mutante vliegen onder wisselende temperatuurcondities te vergelijken, beoogt deze studie een reproduceerbare strategie te presenteren voor het genereren en onderhouden van CRISPR-afgeleide mutantlijnen en biedt het een beschrijvende karakterisering van de resulterende fenotypen. Dit werk biedt een methodologisch kader en een nuttige genetische bron voor toekomstige studies die genen onderzoeken die betrokken zijn bij metabolisme en omgevingsreacties.

Protocol

1. Ontwerp van CRISPR/Cas9-doelen voor het Ent2-gen

1. Selecteer kandidaat-CRISPR-locaties in exons 2 en 5 van Ent2 (FlyBase ID: FBgn0263916) met behulp van CHOPCHOP (v3)³¹ en de CCTop (v1.0)³².
2. Het referentiegenoom werd gedefinieerd als Drosophila melanogaster Release 6 (dm6) (RefSeq assembly accession: GCF_000001215.4). Vervolgens werden kandidaat-gRNA-locaties geïdentificeerd. Ten slotte werden de geïdentificeerde locaties gefilterd om de optimale gRNA's te verkrijgen.
3. Filter doelen op MIT Specificity Score ≥ 80 (CHOPCHOP), CFD-score ≤ 0,1 (CCTop), GC-inhoud 40%–60% en minimale PAM-afstand.
4. Rangschik doelen met een gewogen score (efficiëntie 50%, specificiteit 30%, GC-optimalisatie 20%) en kies twee gRNA's.
5. Voeg één "G" toe aan het 5′-uiteinde van elk gRNA om aan de T7-promotorvereiste te voldoen. Gebruik de volgende gRNA-specifieke vooraanstaande oligonucleotiden om het volledige sgRNA-transcriptiesjabloon te genereren met PCR:
   Ent2-sg1-F: TAATACGACTCACTCACT
   AGGTGACGTTAAATCCATCGTTTTAGAGCTAGATAGAAATAGĄG
   Ent2-sg2-F: TAATACGACTCAC
   TATATTGCCGTTGGAATCATGGGGGTTTTAGAGCTAGAAATAAATAGC
6. De resterende sgRNA-scaffoldsequentie wordt geleverd door de universele omgekeerde oligonucleotide tijdens PCR.

2. Voorbereiding van sgRNA-transcriptiesjablonen

1. Voorbereiding van sgRNA-transcriptietemplates
   1. Stel een 60 μL PCR-reactiemengsel samen met de double-oligonucleotide annealing–PCR methode³³ volgens de instructies van de fabrikant. Combineer het gRNA-specifieke forward oligonucleotide (Ent2-sg1-F of Ent2-sg2-F) met een universele reverse oligonucleotide die codeert voor de sgRNA-scaffold om het volledige dsDNA-sjabloon voor in vitro transcriptie te verkrijgen.
   2. Programmeer de thermocycler: 95 °C 3 min; 35 cycli van 95 °C 30 s, 55 °C 30 s, 72 °C 20 s; daarna 72 °C 10 min; Houd op 12 °C.
2. Zuiver het transcriptiesjabloon
   1. Voeg 100 μL ammoniumacetaat toe (zie Materiaaltabel) aan het 60 μL PCR-product; meng. Voeg 400 μL watervrij ethanol toe; Omkeren om te mengen en 20 minuten incuberen bij -20 °C.
   2. Centrifugeren op 4 °C, 20.000 x g gedurende 15 minuten; Gooi supernatant weg.
   3. Laat de pellet 10 minuten aan de lucht drogen met de buis open. Sussief de pellet opnieuw in 10 μL nucleasevrije ddH₂O.
3. In vitro transcriptie van gRNA
   1. Stel een 10 μL T7 in vitro transcriptiereactie op volgens de instructies van de kit (zie Materiaaltabel).
   2. Incubeer bij 37 °C gedurende 35 minuten. Voeg 0,5 μL DNase I toe (geleverd in de transcriptiekit) en incubeer bij 37 °C gedurende 15 minuten.
4. Zuiver gRNA
   1. Verdun het transcriptiemengsel tot 60 μL met nucleasevrije ddH₂O. Voeg 60 μL waterverzadigd fenol/chloroform toe (zie Materiaaltabel ); Draai kort en centrifugeer bij 4 °C, 16.000 x g gedurende 5 minuten.
   2. Breng 45 μL van de waterige fase over naar een nieuwe 1,5 mL RNase-vrije buis. Voeg 5 μL natriumacetaat toe; Mix.
   3. Voeg 125 μL voorgekoelde watervrije ethanol toe; Meng en bebroei bij -20 °C gedurende 20–30 minuten. Centrifugeren op 4 °C, 20.000 x g gedurende 15 minuten; Gooi supernatant weg.
   4. Was de pellet met 200 μL 70% ethanol (RNase-vrij); centrifugeren op 4 °C, 20.000 x g gedurende 5 minuten; Verwijder supernatant.
   5. Droog de pellet bij 37 °C totdat ethanol volledig verdampt is. Herstel in 20 μL ddH₂O; aliquot en bewaren bij -80 °C.
   6. Meet de gRNA-concentratie met een NanoDrop-spectrofotometer en stel de concentratie aan op 250 ng/μL voor injectie. Zorg voor de zuiverheid van het gRNA met een A260/A280-verhouding van ongeveer 2,0.
      OPMERKING: We benadrukken dat handschoenen gedurende het hele proces gedragen moeten worden voor bescherming tegen RNase. Alle verbruiksmaterialen, inclusief voorgekoelde RNase-vrije centrifugebuizen en pipettoppen, moeten consequent worden gebruikt tijdens de procedure. Organisch reagentiaafval dat tijdens de operatie wordt geproduceerd, moet apart worden verzameld in aangewezen afvalcontainers volgens type en regelmatig worden vervoerd naar een gecertificeerde opslagfaciliteit voor gevaarlijk afval voor correcte behandeling.

3. Bereiding van Cas9 mRNA

1. Voorbereiding van het transcriptiesjabloon
   OPMERKING: Gebruik RNase-vrije tips en buisjes tijdens RNA-gerelateerde stappen.
   1. Ontdooi het Cas9-expressieplasmide MLM3613 (zie Materiaaltabel) op ijs. In een RNase-vrije buis combineer je 20 μg plasmide-DNA, 7,5 μL 10x restrictiebuffer, 1 μL PmeI (10.000 U/mL) en nucleasevrije ddH₂O tot 75 μL.
   2. Bred 30 minuten uit bij 37 °C. Controleer volledige linearisatie door 5 μL op een 1% agarosegel bij 120 V te laden gedurende 30 minuten.
2. Zuivering van transcriptiesjablonen
   1. Voeg 23 μL 2% natriumdodecylsulfaat toe (SDS, zie Materiaaltabel voor details) en 0,5 μL proteïnase K (zie Materiaaltabel voor details) aan 70 μL van de digestie; Incubeer bij 50 °C gedurende 30 minuten.
   2. Voeg 45 μL chloroform en 45 μL tris-verzadigd fenol toe; vortex kort; Centrifuge 13.800 x g, 5 min.
   3. Breng 90 μL waterige fase over naar een nieuwe buis. Voeg 10 μL natriumacetat toe (geleverd door de kit) en 200 μL voorgekoelde watervrije ethanol; mix; Incubeer −20 °C, 30 min.
   4. Centrifuge 20.000 x g, 4 °C, 15 min; Gooi supernatant weg. Was de pellet twee keer met 100 μL 70% ethanol; centrifuge 20.000 x g, elk 2 minuten; Luchtdrogen.
   5. Los DNA op in 20 μL nucleasevrije ddH₂O; Bevestig >500 ng/μL.
3. In vitro transcriptie met co-capping
   1. Stel de reactie op met een T7 in vitro transcriptiekit met capping (zie Materiaaltabel) volgens de instructies van de fabrikant.
   2. Incubeer bij 37 °C gedurende 2 uur om geccaped Cas9 mRNA te produceren.
   3. Na voltooiing van de transcriptiereactie voeg je 1 μL DNase toe (inbegrepen in de kit, concentratie 2 U/μL), meng je grondig en incubeer je bij 37°C gedurende 15 minuten om het DNA-sjabloon af te breken.
4. Voeg een poly(A) staart toe
   1. Breng het RNA naar 14 μL ddH₂O.
   2. Voeg 2 μL 10x E. coli Poly(A) polymerasebuffer, 2 μL ATP (10 mM), 1 μL RNase-inhibitor en 1 μL Poly(A) polymerase toe.
   3. Bred 45 minuten uit bij 37 °C.
5. Zuiver het mRNA
   1. Pas de reactie toe op een spinkolom totale RNA-kit (zie Materiaaltabel). Laad het monster op een 2 mL silica-membraan spinkolom; centrifuge 8.000 x g, 15 s; Gooi doorstroom.
   2. Voeg 500 μL RPE-buffer toe aan de RNeasy-kolom, centrifugeer op 8000 x g gedurende 15 seconden en gooi de resterende vloeistof weg. Herhaal deze stap één keer, centrifugeer dan 2 minuten en gooi de restvloeistof weg.
   3. Plaats de RNeasy-kolom in een nieuwe 1,5 mL centrifugebuis. Voeg 30 μL RNase-vrije ddH₂O toe, centrifugeer op 8000 x g gedurende 1 minuut om het RNA te elueren. Pas de mRNA-concentratie aan op 500 ng/μL voor de injectie. Bewaar het geëlueerde RNA bij -80 °C.

4. Micro-injectie van Drosophila-embryo's

1. Bereiding van injectiemonsters
   1. Meng 15 μg Cas9 mRNA met 7,5 μg dubbelstrengs gRNA bij een volumeverhouding van 2:1.
   2. Stel het in op 30 μL met DEPC-behandeld RNase-vrij water; blijf op ijs.
2. Drosophila-opvoeding
   1. Breng de geïnjecteerde Drosophila-stam w¹¹¹⁸ over naar grote voedselbuizen voor versterking. W¹¹¹⁸ vliegen werden gebruikt als referentiecontrole om de basisfysiologische toestand te representeren zonder balancer-gerelateerde effecten.
   2. Houd de vliegen in een kunstmatige klimaatkamer ingesteld op 25 °C met een luchtvochtigheid van 60%–70% en een licht-donker cyclus van 12:12 gedurende 14 dagen.
   3. Om 17:00 uur op de dag na de 14-daagse opvoedingsperiode (dag 15) verzamel je volwassen vliegen om het getimede embryo-leggen te synchroniseren. Deze specifieke verzameltijd zorgt ervoor dat embryo's die voor injectie worden gebruikt in een consistent ontwikkelingsstadium verkeren. Het beheersen van het tijdstip is belangrijk om de effecten van het circadiane ritme op de ontwikkeling van embryo's en voortplantingsgedrag te minimaliseren, waardoor experimentele reproduceerbaarheid wordt gegarandeerd en de fysiologische variabiliteit tussen batches wordt verminderd.
3. Micro-injectie van Drosophila
   1. Verzamel volwassen vliegen voor injectie in vliegenkooien, met ongeveer 400 volwassen vliegen per kooi. Embryo's verzamelen op gist gecoate agarplaten; Verzamel embryo's binnen 60 minuten na het leggen van het ei en spoel ze af op dekdekkers. Er werd geen dechorionatie uitgevoerd vóór de injectie.
   2. Lijn de embryo's uit op dekfolies met hun achterste polen naar buiten gericht, ordelijk gerangschikt van boven naar beneden. Zorg ervoor dat de injectienaald de achterpool tot een geschikte diepte (ongeveer een vijfde van de embryolengte) doordringt voor een consistente cytoplasmatische levering. In totaal werden 300 embryo's gebruikt in deze studie.
   3. Onder een stereomicroscoop richt je de naaldpunt en het embryo op hetzelfde vlak.
   4. Met het injectieinstrument doorboor je de achterpool en injecteer 0,001 μL van het mengsel in elk embryo.
   5. Geïnjecteerde embryo's worden overgebracht in voedselflesjes; Incubeer bij 25 °C, ~70% relatieve luchtvochtigheid (RH) om P₀-generatie te verkrijgen (de geïnjecteerde volwassen dieren die overleven om nakomelingen te produceren).

5. Constructie van stabiele expressiestammen in Drosophila

1. Kruis met P₀ met Bc/CyO vliegen.
   1. Microinjecteer een mengsel van gRNA gericht op het gen van interesse en Cas9-eiwit in 300 embryo's van de w1118 Drosophila-stam . Na injectie wordt in totaal 30 levensvatbare en vruchtbare P0-volwassenen veroverd. Kruis elke volwassen P0 (mozaïek) afzonderlijk met vliegen uit de w1118-stam , wat resulteert in 16 enkelpaarige kruisingen (8 flesjes met P0-mannetjes gekruist met maagdelijke vrouwtjes en 8 flesjes met P0-vrouwtjes gekruist met mannetjes). Houd alle kruisingen op 25 °C onder constante kweekomstandigheden.
   2. Na het verschijnen van F1-larven verwijder je de P0-oudervliegen. Haal genomisch DNA uit de F1-nakomelingen en onderwerp het aan PCR-analyse om de F1-genotypen (Ent2/+) te bepalen.
   3. Genereer F2-nakomelingen door enkele kruisingen tussen Bc/CyO-vliegen . Selecteer individuele F2-volwassenen en genotype hen om vliegen met het Ent2/CyO-genotype te identificeren.
   4. Intercross F3 vliegt (Ent2/CyO) om de aanwezigheid van homozygote mutanten te beoordelen. Als er geen homozygote vliegen worden gevonden, kruisen Ent2/CyO-vliegen voor een extra generatie om verder te bepalen of het homozygote genotype dodelijk is.
2. Drosophila genomische DNA-extractie
   1. Verzamel één of twee volwassen vliegen in een 1,5 mL EP-buis en voeg 110 μL Plant DNA Extraction Buffer PA toe.
   2. Homogeniseer monsters grondig met een weefselgrinder gedurende minstens 3 minuten.
   3. Incubeer de homogenaten in een metalen bad van 65 °C gedurende minstens 30 minuten.
   4. Voeg 100 μL chloroform toe, draai het mengsel voorzichtig om te mengen en laat het 10 seconden vortexen. Centrifugeer de monsters op 14.000 rpm gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
   5. Voorzichtig doe je ongeveer 65 μL (of meer) van het supernatant over in een nieuwe buis, voeg twee volumes voorgekoelde absolute ethanol toe (vooraf geïncubeerd bij 4 °C gedurende minstens 10 minuten), keer voorzichtig om te mengen en incubeer bij -20 °C gedurende minstens 15 minuten.
   6. Centrifugemonsters bij 14.000 rpm gedurende 10 minuten bij 4 °C en gooi het supernatant zorgvuldig weg.
   7. Laat de DNA-pellet aan de lucht drogen op kamertemperatuur of in een broedmachine tot het volledig droog is, en laat het daarna opnieuw ophangen in een passend volume PB-buffer. Voor vrouwelijke (f) monsters voeg je 50 μL PB-buffer toe, terwijl voor mannelijke (m) monsters 15 μL wordt toegevoegd.
3. PCR-versterking en Sanger-sequencing
   1. Voer PCR-amplificatie uit met specifieke primers die ontworpen zijn om de upstream- en downstreamgebieden van de gRNA-doellocatie te flankeren.
   2. Zuiver de PCR-producten en onderwerp ze aan Sanger-sequencing. Analyseer de sequencingchromatogrammen met SnapGene software³⁴ en lijn af met de wildtype referentiesequentie voor vergelijkende analyse.
   3. Onderzoek de piekplots nabij de gRNA-doellocatie op overlappende pieken die wijzen op indelmutaties. Voer pieksplitsing uit om gemengde signalen te onderscheiden en het type mutatie te bevestigen, inclusief inserties of deleties op de doellocatie.
   4. Terugkruising met Bc/CyO-mannetjes gedurende 4 generaties om Ent2/CyO vast te stellen.
      Opmerking: Er is waargenomen dat Ent2*/Ent2* en CyO/CyO dodelijk zijn in de vroege ontwikkelingsstadia; daarom worden Ent2*/CyO-heterozygoten behouden.
4. Na het vaststellen van de Ent2*/CyO-heterozygoten, verzamel je monsters van dezelfde batch Ent2*/CyO-heterozygoten onder een stereomicroscoop.
5. Selecteer willekeurig 20 volwassen vliegen en weeg ze met een precisieweegschaal met een resolutie van 0,001 g. Maak foto's van de monsters om de fenotypische kenmerken te documenteren.

6. Beschrijvende fenotypische karakterisering

1. Achterin 120 mannetjes en 120 vrouwtjes (drie flesjes per groep getest, waarbij elk flesje 20 vliegen bevatte) elk van Ent2*/CyO en w¹¹¹⁸ bij 22 °C en 25 °C.
2. Noteer wekelijks het aantal sterfgevallen en teken de overlevingscurves uit.
3. Stel 30 willekeurige paren per groep op; 24 uur koppeling toestaan;
4. Volwassen dieren overbrengen naar verse buizen; Achterafkomelingen.
5. Beoordeel 7 dagen na de eclosie het klimsucces (≥8 cm binnen 30 seconden) met zes replicaties per groep.
6. Alle observaties werden vastgelegd als beschrijvende kenmerken van de mutantenlijn en werden niet gebruikt om genfunctie af te leiden.

7. Meet de activiteiten van antioxidante enzymen

1. Verzamel 300 mannelijke en 300 vrouwelijke volwassen dieren (drie flesjes per groep getest, waarbij elk flesje 100 vliegen bevat) Ent2*/CyO en w¹¹¹⁸ controlevliegen die 5 dagen na de eclosie zijn om fysiologische volwassenheid en vergelijkbare leeftijd te waarborgen.
2. Vliegen overbrengen naar lege buisjes zonder voedsel en 2 uur verhongeren om de metabole toestand te standaardiseren vóór biochemische tests.
3. Voeg één stalen kraal/buis toe; homogeniseer bij 60 Hz, 2 minuten.
4. Centrifuge 4 °C, 161 x g, 10 min; Verzamel het supernatant.
5. Meet totale superoxide-dismutase (SOD, zie Tabel van Materialen voor details) en katalase (CAT, zie Tabel van Materialen voor details) volgens de instructies van de kit.

8. Datastatistiek en analyse

1. Druk alle gegevens uit als gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde (± SEM).
2. Gebruik eenrichtings-ANOVA om enzymactiviteitsgegevens te vergelijken; Pas drievoudige ANOVA toe (factoren: genotype, temperatuur, geslacht) op lichaamsgewicht, klimvermogen en lichaamslengte. Voer Tukey's HSD post hoc test uit wanneer passend³⁵.
3. Definieer significantie als P < 0,05 voor alle statistische tests.
4. Analyseer levensduurgegevens met behulp van overlevingscurves en voer de log-rank (Mantel-Cox) test uit, die beoordeelt of er significante verschillen zijn in overlevingstrajecten tussen experimentele cohorten³⁶.
5. Voer alle analyses en plotten uit in GraphPad Prism 9.5.0 software volgens de softwarerichtlijnen³⁷.
6. Alle statistische analyses werden uitsluitend uitgevoerd voor beschrijvende vergelijking en niet om oorzakelijke relaties vast te stellen.

Resultaten

Ontwerp- en effectiviteitsverificatieanalyse van Ent2-gentargetinglocaties
Kandidaat-doellocaties voor het Ent2-gen zijn ontworpen met behulp van CHOPCHOP- en CCTop-platforms (Figuur 1). Twee gRNA's die zich richten op exon 2 en exon 5 regio's werden geselecteerd op basis van specificiteits- en efficiëntiecriteria. Om succesvolle genoombewerking te verifiëren, werd genomisch DNA van willekeurig geselecteerde individuen van de gevestigde Ent2*/CyO-lijn geamplificeerd en onderworpen aan Sanger-sequencing. Sequencingchromatogrammen toonden overlappende pieken die nabij de doelplaats begonnen, consistent met insertion/deletion (indel) mutaties. Verdere sequentieanalyse onthulde frameshift-mutaties die leiden tot voortijdige stopcodons (Figuur 2). Deze resultaten bevestigen dat het CRISPR/Cas9-systeem met succes mutaties heeft geïntroduceerd op de beoogde Ent2-locus en tonen de haalbaarheid van de genoombewerkingsworkflow aan.

Figuur 1. Het schematische diagram van de knockoutplaats van het Ent2-gen en de locatie van de detectieprimer in het genoom. Dit schema illustreert de genomische structuur van de Ent2-locus, met de CDS (groen), start- en stopcodons (rood), het gRNA PAM-motief (grijs), de gRNA-doelsequentie (blauw) en de gRNA-amplificatieprimersequentie (geel). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2. De piekgrafiek van sequencingresultaten van Drosophila-nakomelingen van stabiele lijn zelf-inteelt Ent2*/CyO. Sequencingchromatogram dat het genotype van nakomelingen bevestigt dat is verkregen door zelfkruising van de stabiele Ent2*/CyO heterozygote lijn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Beschrijvende morfologische waarnemingen van de Ent2/CyO-lijn
We observeerden verschillen in lichaamsvorm tussen de twee genotypen van fruitvliegen over geslachten onder 22 °C en 25 °C condities met behulp van een stereomicroscoop (Figuur 3). Onder beide temperatuuromstandigheden vertoonden zowel mannelijke als vrouwelijke fruitvliegen een typische "lange spin" lichaamsvorm. De vrouwelijke buiken waren breed en spilvormig, met vleugeltips die iets verder uitstaken dan de buikpunt. De overgang tussen borstborst en buik bij mannetjes was duidelijk afgebakend, en de donkere pigmentatie aan het uiteinde van het achterlijf—een onderscheidend kenmerk van mannetjes—was zichtbaar. De vleugels van w¹¹¹⁸ vliegen van beide geslachten waren transparant met duidelijk gedefinieerde aders, en er werd geen vleugelrandkromming of aderbreuk waargenomen. Daarentegen vertoonden Ent2*/CyO heterozygoten merkbare buiging van de vleugelbasis en kromming van de vleugelrand. Bij 22 °C, ongeacht het geslacht, was de lichaamslengte van fruitvliegjes aanzienlijk groter dan die van hetzelfde genotype bij 25 °C. Bovendien was de lichaamslengte van vrouwen bij dezelfde temperatuur aanzienlijk groter dan die van mannen. Bovendien was de lichaamsgrootte van Ent2*/CyO-heterozygoten bij zowel 22 °C als 25 °C kleiner dan die van de overeenkomstige w¹¹¹⁸ vliegen. Om de morfologische basis te onderzoeken, maten we tegelijkertijd de lichaamslengte van de vliegen (Figuur 3E, Tabel 1). Een drievoudige ANOVA toonde significante hoofdeffecten aan van genotype (F(1,16)=230,1, P<0,0001), temperatuur (F(1,16)=19,50, P=0,0004) en geslacht (F(1,16)=166,9, P<0,0001). Significante seksinteractie tussen genotype x (F(1,16)=14,96, P=0,0014) en een significante drievoudige interactie tussen genotype x temperatuur x geslacht (F(1,16)=6,231, P=0,0239) werden ook waargenomen.

Figuur 3. De controlemorfologie van volwassen dieren w¹¹¹⁸ en Ent2*/CyO. Representatieve afbeeldingen tonen houdingskenmerken van vrouwelijke (A, C) en mannelijke (B, D) Drosophila bij 22 °C en 25 °C, samen met kwantitatieve vergelijking van lichaamslengte (E). ** P < 0,01. Schaalbalk: 1 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Overlevingsanalyse onder verschillende temperatuurcondities
We analyseerden statistisch de overlevingscurves van Ent2*/CyO heterozygoten en w¹¹¹⁸ vliegen bij 22 °C en 25 °C (Figuur 4). De resultaten toonden aan dat de overlevingscurve van Ent2*/CyO heterozygote vrouwtjes de hoogste was, met twee personen die nog leefden in de 14e week. Alle ¹¹¹⁸ vrouwen stierven in de 14e week. Alle Ent2*/CyO heterozygote mannen stierven in de 12e week, terwijl alle ^{W 1118} mannen in de 11e week overleden. Deze bevindingen geven aan dat bij 22 °C de totale levensduur van vrouwtjes langer is dan die van mannen, en binnen hetzelfde geslacht is het overlevingsvermogen van Ent2*/CyO-heterozygoten iets sterker dan dat van het ^w-1118-type.

Onder omstandigheden van 25 °C werd de algehele overlevingstijd aanzienlijk verkort. De overlevingscurves van w¹¹¹⁸ vrouwtjes en Ent2*/CyO heterozygote mannetjes daalden tegen de 10e week tot nul. De overlevingscurves van Ent2*/CyO heterozygote vrouwtjes en w¹¹¹⁸ mannetjes daalden tot 1–2 individuen tegen de 8e week en bereikten nul in de 9e week. Het verschil tussen de mutant en w¹¹¹⁸ was niet statistisch significant (P > 0,05). Deze observaties beschrijven de overlevingskenmerken van de mutantenlijn onder verschillende omgevingsomstandigheden.

Figuur 4. Overlevingscurves van Drosophila onder verschillende temperatuurcondities. Overlevingsanalyse waarbij de levensduur van Ent2*/CyO en w¹¹¹⁸ vliegen bij 22 °C en 25 °C worden vergeleken. n=3. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Locomotorische activiteitsbeoordeling
De klimmogelijkheden van w¹¹¹⁸ en Ent2*/CyO fruitvliegen werden vergeleken onder twee temperatuurcondities: 22 °C en 25 °C (Figuur 5, Tabel 2). De resultaten tonen aan dat bij 22 °C (Figuur 5A) 98,15% van de¹¹¹⁸ vrouwen binnen 30 seconden met succes meer dan 8 cm klommen, terwijl dit aandeel daalde tot 89,74% bij Ent2*/CyO heterozygote vrouwen (P < 0,05). Alle ¹¹¹⁸ mannetjes konden meer dan 8 cm klimmen, terwijl het klimsucces bij Ent2*/CyO heterozygote mannetjes 98,14% was (P < 0,05). Bij 25 °C (Figuur 5B) klom alle ¹¹¹⁸ vrouwtjes (100%) binnen 30 seconden meer dan 8 cm, maar dit aandeel daalde tot 91,31% bij Ent2*/CyO heterozygote vrouwen (P < 0,05). Onder w¹¹¹⁸ mannen klom 77,28% succesvol meer dan 8 cm (P < 0,01), terwijl slechts 63,57% van de Ent2*/CyO heterozygote mannen dit bereikte (P < 0,01). Om de voortbewegingsprestaties verder te beoordelen, werd het aandeel vliegen dat boven de 15 cm klimmen geanalyseerd (Figuur 5C). Een drievoudige ANOVA toonde zeer significante hoofdeffecten van geslacht (F(1,16) = 201,7, P < 0,0001) en opgroeitemperatuur (F(1,16) = 72,60, P < 0,0001) op klimprestaties. Het belangrijkste effect van het genotype was echter niet significant (F(1,16) = 0,59, P = 0,4545). Deze resultaten geven aan dat de lokomotorische prestaties variëren afhankelijk van de experimentele omstandigheden en per groep op contextafhankelijke wijze kunnen verschillen.

Figuur 5. Vergelijking van het klimvermogen van Drosophila bij verschillende temperaturen. Kwantificering van klimprestaties bij 22 °C (A) en 25 °C (B) en statistieken voor individuen met klimafstand > 15 cm (C). ** P < 0,01. n=3. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Meting van lichaamsgewicht
Het lichaamsgewicht werd gemeten in w¹¹¹⁸ en Ent2*/CyO heterozygote fruitvliegen bij 22 °C en 25 °C (Figuur 6). Onze resultaten tonen aan dat, vergeleken met W¹¹¹⁸ vliegen, het gewicht van Ent2*/CyO-heterozygoten significant was verminderd bij zowel 22 °C als 25 °C (P < 0,05 of P < 0,01). We observeerden dat het gewicht van mannelijke w¹¹¹⁸ vliegen significant lager was dan dat van vrouwtjes w¹¹¹⁸ vliegen (P < 0,01). Evenzo was het gewicht van mannelijke Ent2*/CyO heterozygoten significant lager dan dat van vrouwelijke Ent2*/CyO heterozygoten (P < 0,01). We voerden een drievoudige ANOVA uit om de onafhankelijke en interactieve effecten van genotype, opvoedingstemperatuur en geslacht op het lichaamsgewicht bij Drosophila te evalueren. De analyse toonde significante hoofdeffecten van genotype (F(1,16) = 32,38, P < 0,0001), temperatuur (F(1,16) = 23,31, P = 0,0002) en geslacht (F(1,16) = 25,52, P = 0,0001) (Figuur 6; Tabel 3). Daarnaast was er een significante tweerichtingswisselwerking tussen temperatuur en geslacht (F(1,16) = 24,76, P = 0,0001), wat aangeeft dat het effect van temperatuur op het lichaamsgewicht per geslacht verschilde. Er werden echter geen significante interacties gevonden tussen genotype en temperatuur (F(1,16) = 0,40, P = 0,538), genotype en geslacht (F(1,16) = 1,31, P = 0,269), of de driehoeksinteractie (genotype x temperatuur x geslacht: F(1,16) = 0,48, P = 0,497), wat suggereert dat de respons van Ent2*/CyO-mutanten op temperatuur en geslacht vergelijkbaar was met die van het wildtype.

Gezien de significante temperatuur × seksuele interactie hebben we eenvoudige effectanalyses uitgevoerd om het specifieke patroon te verduidelijken. De resultaten toonden aan dat bij vrouwelijke vliegen individuen die bij 22 °C werden grootgebracht aanzienlijk een hoger lichaamsgewicht hadden dan degenen die bij 25 °C werden opgevoed (P = 0,0012); bij mannen was er echter geen significant verschil in lichaamsgewicht tussen de twee temperaturen (P > 0,9999). Dit wijst erop dat het verlagen van de temperatuur van 25–22 °C specifiek het lichaamsgewicht van vrouwelijke vliegen heeft verhoogd, terwijl het geen significant effect had op mannetjes.

Hoewel er geen significante interacties waren tussen genotype en andere factoren, gaf het sterke hoofdeffect van genotype aan dat de Ent2*/CyO-mutanten over het algemeen een lager lichaamsgewicht hadden over alle aandoeningen vergeleken met het wildtype. Post-hoc vergelijkingen toonden verder aan dat bij 22 °C wildtype-vrouwtjes (vrouwtjes¹¹¹⁸:22 °C) significant een hoger lichaamsgewicht hadden dan alle mutantengroepen (P < 0,0001), en binnen dezelfde temperatuur vertoonden beide genotypen significant seksueel dimorfisme (vrouwtjes > mannetjes, P < 0,01). Bij 25 °C liet het verschil in lichaamsgewicht tussen wild type en mutanten een vergelijkbare trend zien, maar bereikte het geen statistische significantie. Deze bevindingen beschrijven de lichaamsgewichtkenmerken van de mutantlijn onder verschillende omgevings- en biologische omstandigheden.

Figuur 6. De vergelijking van het lichaamsgewicht in Drosophila bij verschillende temperaturen. Lichaamsgewichtmetingen bij 22 °C en 25 °C. ^N P > 0,05, * P < 0,05, ** P < 0,01. n=3. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Antioxidante enzymactiviteit
De antioxidante enzymactiviteit van w¹¹¹⁸ en Ent2*/CyO heterozygote Drosophila werden vergeleken bij 25 °C (Figuur 7). Onze resultaten toonden aan dat, vergeleken met W¹¹¹⁸ vliegen, zowel mannelijke als vrouwelijke Ent2*/CyO heterozygoten significant verminderde catalase (CAT) en superoxide dismutase (SOD) activiteiten vertoonden (P < 0,01). We ontdekten ook dat de activiteiten van CAT- en SOD-dieren bij w¹¹¹⁸ mannelijke vliegen significant hoger waren dan bij w¹¹¹⁸ vrouwtjes (P < 0,05 of P < 0,01). Evenzo waren de antioxidante enzymactiviteiten bij Ent2*/CyO heterozygote mannen significant hoger dan die bij Ent2*/CyO heterozygote vrouwen (P < 0,01).

Figuur 7. De vergelijking van de antioxidantcapaciteit van Drosophila bij optimale voedingstemperatuur. Enzymatische activiteitsassays tonen CAT (A) en SOD (B) activiteit bij Ent2/CyO-vliegen vergeleken met W¹¹¹⁸ vliegen. * P < 0,05, ** P < 0,01. n=3. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

	SS	DF	MS	F (DFn, DFd)	P-waarde
Genotype	0.8026	1	0.8026	F (1, 16) = 230,1	P<0,0001
Temperatuur	0.06803	1	0.06803	F (1, 16) = 19,50	P=0,0004
Geslacht	0.5822	1	0.5822	F (1, 16) = 166,9	P<0,0001
Genotype x Temperatuur	0.005798	1	0.005798	F (1, 16) = 1,662	P=0,2156
Genotype x Geslacht	0.05218	1	0.05218	F (1, 16) = 14,96	P=0,0014
Temperatuur x Geslacht	0.01323	1	0.01323	F (1, 16) = 3,793	P=0,0692
Genotype x Temperatuur x Geslacht	0.02173	1	0.02173	F (1, 16) = 6,231	P=0,0239
Residu	0.05581	16	0.003488

Tabel 1: Variantieanalyse van lichaamslengtemetingen bij Drosophila.

ANOVA-tabel	SS	DF	MS	F (DFn, DFd)	P-waarde
Geslacht	0.1483	1	0.1483	F (1, 16) = 201,7	P<0,0001
Genotype	0.0004319	1	0.0004319	F (1, 16) = 0,5877	P=0,4545
Temperatuur	0.05336	1	0.05336	F (1, 16) = 72,60	P<0,0001
Geslacht x Genotype	0.01418	1	0.01418	F (1, 16) = 19,30	P=0,0005
Geslacht x Temperatuur	0.007134	1	0.007134	F (1, 16) = 9,708	P=0,0067
Genotype x Temperatuur	0.0135	1	0.0135	F (1, 16) = 18,37	P=0,0006
Geslacht x Genotype x Temperatuur	0.005903	1	0.005903	F (1, 16) = 8,032	P=0,0120
Residu	0.01176	16	0.0007349

Tabel 2: Variantieanalyse van klimvermogen (> 15 cm) bij Drosophila.

	SS	DF	MS	F (DFn, DFd)	P-waarde
Genotype	4.363E-07	1	4.363E-07	F (1, 16) = 32,38	P<0,0001
Temperatuur	3.141E-07	1	3.141E-07	F (1, 16) = 23,31	P=0,0002
Geslacht	3.439E-07	1	3.439E-07	F (1, 16) = 25,52	P=0,0001
Genotype x Temperatuur	5.333E-09	1	5.333E-09	F (1, 16) = 0,3958	P=0,5381
Genotype x Geslacht	1.765E-08	1	1.765E-08	F (1, 16) = 1,310	P=0,2692
Temperatuur x Geslacht	3.336E-07	1	3.336E-07	F (1, 16) = 24,76	P=0,0001
Genotype x Temperatuur x Geslacht	6.513E-09	1	6.513E-09	F (1, 16) = 0,4834	P=0,4968
Residu	2.156E-07	16	1.347E-08

Tabel 3: Variantieanalyse van lichaamsgewichtmetingen bij Drosophila.

Discussie

Ent is een evolutionair geconserveerd eiwit dat meerdere biologische processen beaamt³⁸. Wanneer het tot expressie komt in Xenopus laevis-oocyten, vertoont Ent2 nucleoside transportactiviteit⁸. Studies hebben aangetoond dat de homozygote mutant van Ent2 dodelijk is tijdens het late larvale of vroege popstadium¹⁰. In deze studie werd een CRISPR/Cas9-gebaseerde genoombewerkingsworkflow opgesteld om Ent2-gerichte allelen te genereren in Drosophila melanogaster. De waargenomen dodelijkheid van homozygote mutanten tijdens de stamopbouw is consistent met deze eerdere rapporten, wat de geldigheid van de genoombewerkingsstrategie ondersteunt. Binnen dit kader biedt de in deze studie gegenereerde Ent2*/CyO-heterozygote lijn een model voor het documenteren van fenotypische kenmerken die samenhangen met gedeeltelijk verlies van Ent2. Onder de geteste experimentele omstandigheden werden verschillen waargenomen in lichaamsgrootte, lichaamsgewicht, bewegingsactiviteit en antioxidantenzymniveaus tussen Ent2*/CyO en W¹¹¹⁸ vliegen. Deze waarnemingen beschrijven het fenotypische profiel van de gevestigde mutantenlijn.

Wat betreft ontwikkeling en lichaamsgrootte waren Ent2*/CyO heterozygote individuen significant kleiner dan w¹¹¹⁸ vliegen bij zowel 22 °C als 25 °C. Dit verschil kan worden toegeschreven aan een verminderde efficiëntie van nucleosidetransport als gevolg van de afwezigheid van het Ent2-gen, wat op zijn beurt de stabiliteit van het energiemetabolisme en de regulatie van ecdysone beïnvloedt. Bovendien werden de negatieve effecten sterker bij 25 °C. Onderzoek heeft aangetoond dat de levensduur van dieren wordt beïnvloed door de stofwisselingssnelheid, een concept dat bekendstaat als de metabolische snelheidstheorie¹⁹. De bevindingen van deze studie suggereren dat de verhoogde stofwisselingssnelheid van fruitvliegen bij hogere temperaturen nauw samenhangt met voedingstekorten en ontwikkelingsvertragingen als gevolg van een verminderd nucleosidemetabolisme. Gezien het gebruik van één CRISPR-afgeleid allel moeten deze bevindingen echter worden geïnterpreteerd als beschrijvende observaties in plaats van direct bewijs van genfunctie.

Temperatuurafhankelijke variatie was ook zichtbaar over meerdere fenotypische metingen. De mutant vertoont een bescheiden levensduurverlenging bij 22 °C, vooral bij vrouwen, een bevinding die overeenkomt met eerdere studies^39,40. Daarentegen neemt het verschil in levensduur bij 25 °C af of verdwijnt het zelfs. Als poikilotherme organismen vertonen fruitvliegen een hogere stofwisselingssnelheid en daardoor een kortere levensduur bij verhoogde temperaturen^{van 41,42}, wat overeenkomt met de bevindingen van deze studie. In deze context kunnen de waargenomen patronen algemene fysiologische reacties op temperatuur weerspiegelen.

Locomotorische prestaties en de activiteiten van antioxidantenzymen varieerden ook tussen genotypen, geslachten en temperatuurcondities. Verminderde klimprestaties en lagere SOD- en CAT-activiteiten werden waargenomen bij Ent2/CyO-vliegen onder bepaalde omstandigheden. Eerdere studies hebben nucleosidetransporters gekoppeld aan NAD⁺-metabolisme, mitochondriale functie en regulatie van oxidatieve stress 17,43,44,45,46,47. Hoewel deze rapporten een mogelijke biologische context bieden, zijn de huidige gegevens beperkt tot fenotypische karakterisering en leggen ze geen mechanistische verbanden vast tussen Ent2 en deze routes.

Onze resultaten tonen ook aan dat onder dezelfde omstandigheden mannelijke fruitvliegjes meestal een hogere antioxidante enzymactiviteit vertonen dan vrouwelijke fruitvliegen^39,48. Dit betekent dat gendergerelateerde factoren de antioxidantrespons via verschillende signaalroutes kunnen reguleren. Transcriptiefactoren gerelateerd aan antioxidantresponsen, zoals Nrf2/CncC en hun downstream doelgenen, tonen expressieverschillen tussen verschillende geslachten, waardoor de totale antioxidantcapaciteit^{beïnvloed 49}. Deze observatie komt overeen met meldingen van geslachtsverschillen in oxidatieve stressweerstand en antioxidantafweer bij Drosophila, waarbij vrouwen doorgaans lagere ROS-niveaus en hogere basisactiviteiten van antioxidantenzymen hebben ten opzichte van mannen, wat kan bijdragen aan verschillen in stressweerstand en levensduur tussen de geslachten⁵⁰. Deze observaties benadrukken verder het belang van het meenemen van biologische variabelen zoals geslacht bij het karakteriseren van mutantfenotypes.

Vanuit methodologisch perspectief schetst deze studie een reproduceerbare workflow voor het genereren en valideren van CRISPR/Cas9-gemedieerde mutaties in Drosophila. Nauwkeurig ontwerp en selectie van gRNA is essentieel, aangezien effectieve gRNA's de efficiëntie van gerichte splitsing door Cas9 bepalen en ongewenste modificaties minimaliseren^21,51. Nauwkeurige micro-injectie van Cas9- en gRNA-componenten in embryo's is ook cruciaal, omdat inefficiënte injecties kunnen leiden tot lage bewerkingssnelheden of mosaicisme⁵². Grondige genotypebevestiging door sequencing zorgt ervoor dat de bedoelde bewerkingen aanwezig zijn en sluit off-target of onvolledige bewerkingen uit, waardoor de integriteit van het model⁵³ wordt versterkt. Opmerkelijk is dat het gebruik van het CyO-balancerchromosoom essentieel was voor het behouden van het Ent2-mutantenallel vanwege de dodelijkheid van homozygote mutanten. Deze benadering wordt veel gebruikt in de Drosophila-genetica om schadelijke mutaties te behouden en downstream-analyses mogelijk te maken. De huidige studie toont de praktische toepassing van deze strategie binnen een CRISPR/Cas9-bewerkingskader.

Verschillende beperkingen moeten worden erkend. Eerst werden fenotypische analyses uitgevoerd met een enkele CRISPR-afgeleide mutantlijn. Het is algemeen bekend dat CRISPR/Cas9-bewerking heterogene allelen kan genereren, en analyse van meerdere onafhankelijke lijnen wordt over het algemeen aanbevolen om genetische conclusies te versterken. Daarom moeten de hier gerapporteerde bevindingen worden geïnterpreteerd als een voorlopige karakterisering van één mutant allel. Toekomstige studies met extra onafhankelijk gegenereerde Ent2-allelen zullen nodig zijn om de robuustheid van de conclusies te verbeteren. Ten tweede werd de mutantlijn behouden met behulp van het CyO-balancerchromosoom, terwijl de controlegroep (w¹¹¹⁸) geen balancerchromosoom draagt. Omdat balancerchromosomen zelf invloed kunnen hebben op ontwikkelings- en fysiologische kenmerken, vormt het ontbreken van een balancer-matched control een mogelijke bron van verwarring. Deze beperking moet worden meegenomen bij het interpreteren van fenotypische verschillen tussen genotypen. Ten derde werden omgevingscondities zoals luchtvochtigheid, lichtcyclus en dieet gehandhaafd onder standaard laboratoriuminstellingen, maar niet systematisch gevarieerd. Aangezien deze factoren metabolisme en stressreacties kunnen beïnvloeden, zouden toekomstige studies met gecontroleerde omgevingsgradiënten een meer uitgebreide beoordeling bieden van de interacties tussen fenotype en omgeving.

Samenvattend stelt deze studie een CRISPR/Cas9-gebaseerde workflow vast voor het genereren en onderhouden van Ent2-mutante allelen in Drosophila melanogaster en biedt een beschrijvende karakterisering van de resulterende heterozygote lijn onder verschillende omgevingsomstandigheden. De resultaten benadrukken de toepasbaarheid van deze aanpak voor het bestuderen van genen met dodelijke fenotypes en benadrukken het belang van experimentele ontwerpoverwegingen, waaronder genetische achtergrond, balancerende chromosomen en omgevingsvariabelen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Ammonium acetate	Sigma	A1542
Catalase (CAT) Assay Kit (Visible Light Method) (Ammonium Molybdate Method)	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	A007-1-1
Dodecyl sulfate	Sigma	L3771
Injection device	Eppendorf FemtoJet	4i
Linearized plasmid: MLM3613	Addgene	42251
Microscope	OLYMPUS	CKX3-SLP
mMESSAGE mMACHINE T7 kit	Thermo Fisher	AM1344
mMESSAGE mMACHINE T7 Transcription Kit	Thermo Fisher	AM1344
PmeI restriction enzyme	NEB	R0560S
Poly(A) polymerase	NEB	M0276S
Protease K	Thermo Fisher	EO0491
RNeasy Mini Kit	QIAGEN	74104
T7 RiboMAX Express Large Scale RNA Production System	Promega	P1320
T7 RiboMAX Kit	Promega	P1320
Total Superoxide Dismutase (T-SOD) assay kit (Hydroxylamine method)	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	A001-1
w1118 Drosophila	Fangjing Biology
Water-saturated phenol/chloroform	Sigma	P2069