Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Vestiging van tumororganoïden, carcinoom-geassocieerde fibroblasten en tegenhangende fibroblasten van dezelfde slokdarmkankerpatiënt

532 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/69548

⸱

3 april 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Esophageal and Gastroenterological Surgery, Graduate School of Medicine, Juntendo University, 2Department of Molecular Pathogenesis, Graduate School of Medicine, Juntendo University, 3Department of Pathology and Oncology, Graduate School of Medicine, Juntendo University, 4Faculty of Health Sciences, Graduate School of Medicine, Juntendo University

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een methode om kankerorganoïden, carcinoma-geassocieerde fibroblasten (AF's) en niet-tumor-geassocieerde fibroblasten (CF's) gelijktijdig te isoleren van dezelfde patiënt met slokdarmplaveiselcelcarcinoom (ESCC). Het gebruik van deze patiënt-gematchte materialen zou problemen door interpatibulaire variabiliteit kunnen voorkomen en een passend experimenteel platform bieden voor ESCC-onderzoek.

Samenvatting

Bij slokdarmplaveiselcelcarcinoom (ESCC) blijven het verkrijgen van therapieresistentie en het terugvallen van tumoren grote klinische uitdagingen. Carcinoom-geassocieerde fibroblasten (RAF's), belangrijke componenten van de tumormicro-omgeving, staan bekend om hun invloed op de voortgang en therapeutische respons van ESCC. Veel aspecten van de rol van CF's bij tumormaligniteit blijven echter onbekend, vermoedelijk vanwege interpatiënte variabiliteit bij ESCC-patiënten. Verschillende menselijke ESCC-cellijnen die beschikbaar zijn voor onderzoek worden gedacht de aard van menselijk carcinoom gedeeltelijk na te bootsen. Ze worden ook jarenlang in vitro vermeerderd in een petrischaal, wat resulteert in aanpassing aan de kweekomstandigheden. Bovendien bevatten menselijke ESCC-cellijnen verschillende genetische en epigenetische veranderingen die verschillen bij de oorspronkelijke patiënten, wat resulteert in variabiliteit tussen patiënten. Desalniettemin zijn langdurig gekweekte kankercellijnen in de meeste eerdere studies gebruikt voor experimenten met patiënt-mismatched CAVE's. Interpatiënt variabiliteit binnen elke kankercellijn en tussen kankercellen en AF's kan daardoor leiden tot verminderde reproduceerbaarheid en betrouwbaarheid van resultaten. Om interpatibulaire variabiliteit te elimineren, werden drie verschillende celtypen geïsoleerd van dezelfde patiënt: kankerorganoïden en AF's uit een chirurgisch gedissecte ESCC-regio, en tegenhangende fibroblasten (CF's) uit een aangrenzend niet-tumor gebied als patiëntspecifieke controles voor CAVE's. Er wordt een gedetailleerd protocol gepresenteerd dat gelijktijdige isolatie van kankerorganoïden, AF's en CF's mogelijk maakt. De kankerorganoïden groeiden goed onder driedimensionale omstandigheden. AF's en CF's zijn positief gekleurd op vimentine, een van de fibroblastenmarkers, die de verrijking van deze cellen in fibroblastische lijnen ondersteunen. Het beschreven protocol stelt ons in staat ESCC-organoïden en patiënt-gematchte fibroblasten vast te stellen, wat een waardevol experimenteel platform biedt dat interpatiënt variabiliteit uitsluit bij het bestuderen van tumor-stromale interacties.

Inleiding

Slokdarmkanker wordt wereldwijd geassocieerd met hoge incidentie en sterftecijfers1. Het wordt globaal ingedeeld in twee hoofdhistologische subtypen: oesofageale plaveiselcelcarcinoom (ESCC) en slokdarmadenocarcinoom (EAC)2. ESCC komt vaker voor dan EAC, met een bijzonder hogere incidentie in Oost-Azië en Afrika3. Behandelstrategieën voor ESCC zijn relatief goed vastgesteld 4,5. Voor laesies in een vroeg stadium beperkt tot de slijmvlieslaag is endoscopische resectie geïndiceerd als een curatieve en minimaal invasieve optie. Bij patiënten met lokaal gevorderde maar resectabele ziekte heeft de combinatie van neoadjuvante chemoradiotherapie gevolgd door een oesofagtomie klinische effectiviteit getoond. Bij niet-resectieve of uitgezaaide gevallen blijft systemische chemotherapie de basis van de behandeling. Desalniettemin blijven therapeutische resistentie en recidiventie van de ziekte grote klinische uitdagingen vormen.

Tumoren bestaan niet alleen uit kankercellen, maar ook uit een complex tumormicro-milieu met verschillende stromale celtypen. Onder hen zijn carcinoom-geassocieerde fibroblasten (RAF's), belangrijke cellulaire componenten van de tumormicro-omgeving, aangetoond een cruciale rol te spelen in tumorprogressie en therapeutische respons 6,7,8,9. In ESCC is de betrokkenheid van CF's bij tumormaligniteit en behandelingsresistentie ook steeds vaker gerapporteerd 10,11,12. De precieze moleculaire mechanismen van CF's die aan ESCC-maligniteit liggen zijn echter grotendeels onduidelijk.

In de meeste eerdere studies werden de effecten van AF's op kankercellen geëvalueerd met behulp van verschillende ESCC-cellijnen die jarenlang in petrischalen werden vermeerderd. Dergelijke cellijnen zouden zich aanpassen aan de kweekomstandigheden en lijken nauwelijks op de oorspronkelijke tumoren13. Bovendien zijn ESCC-cellijnen afkomstig van verschillende patiënten en bevatten ze diverse genetische en epigenetische veranderingen, die duidelijk verschillend zijn in de respectievelijke ESCC-cellen en dienen als interpatiënte variabiliteiten. Experimentele resultaten van de ene kankercellijn kunnen vaak niet consistent zijn met die van een andere kankercellijn. Daarom kunnen experimenten met verschillende ESCC-cellijnen en de door patiënten niet overeenkomende CF's moeilijk maken om interacties tussen deze cellen nauwkeurig op reproduceerbare en betrouwbare wijze te adresseren.

Om deze beperkingen aan te pakken, is er een protocol ontwikkeld om patiënt-gematchte tumororganoïden, AF's en niet-tumor-tegenhangende fibroblasten (CF's) gelijktijdig te isoleren uit hetzelfde ESCC-chirurgisch monster. Van patiënten afgeleide organoïden recapituleren over het algemeen belangrijke architecturale en fenotypische kenmerken van primaire tumoren, terwijl ze de moleculaire heterogeniteit behouden. De gevestigde organoïden vormden sferoïden onder driedimensionale (3D) kweekomstandigheden en vertoonden een stabiele proliferatieve capaciteit. Zowel AF's als CF's werden bevestigd verrijkt voor fibroblastische celpopulaties die positief zijn voor vimentine, een fibroblastenmarker.

Dit protocol biedt gedetailleerde, reproduceerbare stappen voor weefselverwerking, enzymatische dissociatie, organoïde zaaien, CAF/CF-isolatie, passaging en cryopreservatie. Om onderzoekers te helpen de toepasbaarheid vóór implementatie te beoordelen, is praktische informatie opgenomen: organoïden vormen zich doorgaans binnen 3–5 dagen, bereiken passage-gereedheid binnen 7–10 dagen en kunnen stabiel worden uitgebreid voor meer dan tien passages. CAFs en CF's kunnen gedurende minstens acht generaties worden doorgegeven. Organoïden en fibroblasten kunnen binnen ongeveer 20 dagen worden gecryopserveerd. De slagingspercentages van vestiging bereiken ongeveer 70% voor organoïden en 80% voor CAFs en CFs. Daarnaast is een gevalideerde geconditioneerde medium-assay opgenomen met CAF- of CF-geconditioneerd medium, wat een robuuste benadering biedt voor het evalueren van de paracriene effecten van stromale cellen op het gedrag van tumororganoïden. Gezamenlijk biedt dit gematchte tumor-organoïde–stromale platform een experimenteel toegankelijk en biologisch relevant model om ESCC-tumor–stromale interacties te onderzoeken en de ontwikkeling van precisietherapeutische strategieën te ondersteunen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle procedures waarbij menselijk weefsel betrokken is, moeten worden uitgevoerd onder de juiste institutionele bioveiligheidsgoedkeuringen en in een gecertificeerde biologische veiligheidskast. De patiënt gaf schriftelijke geïnformeerde toestemming en het project werd goedgekeurd door de Research Ethics Committee van de Faculteit Geneeskunde van de Juntendo Universiteit. Een overzicht van de procedure van protocollen 2 tot en met 6 is te zien in Figuur 1. De samenstelling en concentraties van elk component in het ESCC-organoïde medium (Eso_v1) werden bepaald op basis van Kijima et al.14 en andere studies 15,16,17 met slechts kleine aanpassingen. De reagentia en de gebruikte apparatuur worden vermeld in de Materiaaltabel.

1. Reagentia en weefselvoorbereiding

  1. Maak reagentia en apparatuur klaar.
    1. Steriliseer alle instrumenten, inclusief schaar, pincet en pipetten, voordat je met de procedure begint.
    2. Bereid 10 mL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) voor in een 15 mL buis.
    3. Bereid 15 mL buizen met lage hechting voor en label ze op basis van de oorsprong van het monster (bijv. Tumor Wash Tube (A), Tumor Digest Tube (B), Non-tumor Wash Tube (C), Non-tumor Digestive Tube (D)).
    4. Coaten werkende pipetten door 2–3 keer het foetaal rundserum (FBS) te aspireren en te doseren om celadhesie tijdens de verwerking te verminderen.
      OPMERKING: FBS-coating voorkomt dat weefselfragmenten aan plastic oppervlakken blijven plakken tijdens mechanische dissociatie.
  2. Bereid enzymoplossingen voor
    1. Bereid enzymoplossing I voor voor tumorvertering door 2,7 mL Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) te mengen met 10% FBS en 1x penicilline–streptomycine (PS) (hierna, DMEM/10% FBS), 0,3 mL 10 mg/mL collagenase, 0,15 mL 10.000 PU/mL dispase, en 0,03 mL 2,5 μg/mL amfotericine B. Warm tot 37 °C.
    2. Bereid enzymoplossing II voor niet-tumor digestie door 2,7 mL DMEM/10% FBS, 0,3 mL 1 mg/mL collagenase en 0,03 mL 2,5 μg/mL amfotericine B te mengen. Verwarm tot 37 °C.
      OPMERKING: Collagenase en dispase bevorderen de dissociatie van tumorweefsel.
  3. Bereid organoïde kweekmedium voor
    1. Bereid ESCC organoïde medium (Eso_v1 medium) met 60% organoïde basaal medium, 40% L-WRN geconditioneerd medium18 (zie stap 1.4), 50 ng/mL EGF (groeifactor), 1 mM N-acetyl-L-cysteïne (antioxidant), 5 mM nicotinamide (wateroplosbare vitamine), 500 nM A83-01 (TGF-βR-remmer (voorkomt de groei van fibroblasten)), 1x B-27 (serumvrije kweeksupplement), 1x N-2 (serumvrije kweeksupplement) en 10 μM Y-27632 (ROCK-remmer).
    2. Breng het medium in evenwicht tot 37 °C vóór gebruik.
      OPMERKING: L-WRN-geconditioneerd medium (Supernatant van L-WRN-cellen) levert WNT-, R-spondin- en Noggin-signalen die essentieel zijn voor organoïde initiatie. Y27632 is gedurende de hele cultuurperiode in het medium opgenomen.
  4. Bereid L-WRN geconditioneerd medium voor
    1. Ontdooi een flesje L-WRN-cellen en zaad deze op een schaal van 100 mm met 10 ml DMEM/10% FBS en kweek deze gedurende 1–2 dagen.
    2. Vervang het medium door 10 mL DMEM/10% FBS met G418 (eindwaarde 500 μg/mL) en Hygromycine B (eindwaarde 500 μg/mL), en kweek totdat de cellen 80% confluentie bereiken.
    3. Plaats de cellen op twee schalen van 100 mm met 10 mL DMEM/10% FBS (met G418 en Hygromycine B) en kweek totdat de cellen 100% samenvloeiing bereiken.
    4. Plaats de cellen op vijf schaaltjes van 150 mm met 20 mL DMEM/10% FBS (geen antibiotica) per schotel en kweek tot 100% confluence.
    5. Aspireer en gooi het medium uit elke schaal van 150 mm.
    6. Voeg 25 mL toe per schaal van het verzamelmedium (organoïde basaal medium aangevuld met 5% FBS).
    7. Incubeer 24 uur.
    8. Verzamel het medium uit alle vijf schalen (25 mL × 5 = 125 mL) in een steriele glazen fles.
    9. Herhaal stappen 1.4.6–1.4.8 voor in totaal 8 verzamelingen (doelpoolvolume: ~1.000 mL).
    10. Steriel filter het samengevoegde CM met een flesdekselfilter.
    11. Aliquot 40 mL in 25 steriele 50 mL buizen.
    12. Bewaar aliquots op −80 °C.
  5. Bereid fibroblastkweekmedium voor
    1. Bereid fibroblast medium-1 voor.
    2. Breng het medium in evenwicht tot 37 °C vóór gebruik.
  6. Bereid doekenbehandelingsschotels voor
    1. Doe meerdere (drie tot vijf) druppels FBS met een P1000-tip op twee schaaltjes van 100 mm om een coating te creëren (schaal T voor tumorweefsel, schaal N voor niet-tumorweefsel).
      OPMERKING: De FBS-coating bevordert een gladdere mechanische fijnhakking en voorkomt dat kleine weefselfragmenten aan het schaaloppervlak hechten.
  7. Weefselbehandeling en specimenidentificatie
    1. Controleer of tumor- en niet-tumormonsters op ijs worden vervoerd.
    2. Leg de zakdoekjes op een schaaltje van 60 mm met een kleine hoeveelheid DMEM/10% FBS en bewaar het op ijs tot gebruik. Begin met de verwerking binnen 16 uur na de chirurgische resectie om de levensvatbaarheid te behouden.
    3. Identificeer het tumorweefsel aan de hand van zijn stevige textuur en onregelmatige oppervlaktemorfologie, die verschilt van die van het niet-tumorweefsel.

2. Weefselverwerking, wasbeurt en enzymatische vertering

OPMERKING: Deze stap wordt uitgevoerd om gehakte tumor- en niet-tumorweefselsecties te verteren met verschillende enzymoplossingen.

  1. Fijnsnijd de tumor en niet-tumorweefsels
    1. Breng elk weefselmonster (ongeveer 5 mm × 5 mm) over op zijn respectievelijke FBS-gecoate schaal (schaal T voor tumorweefsel en schaal N voor niet-tumorweefsel).
    2. Snijd elk weefsel in fragmenten van ~0,5 mm met een steriel scalpel.
      OPMERKING: Kleinere fragmenten verhogen de enzymatische toegankelijkheid en verbeteren de efficiëntie van de vertering.
  2. Was het gehakte weefsel.
    1. Bedek een 10 mL pipet met FBS om weefselhechting te voorkomen.
    2. Voeg 5 ml PBS toe aan elk gerecht met de FBS-gecoate pipet en suspendeer het fijngehakte weefsel voorzichtig opnieuw.
    3. Breng de suspensie over naar de bijbehorende Tumor Wash Tube (Tube A) of Non-Tumor Wash Tube (Tube C).
    4. Herhaal stappen 2.2.2 en 2.2.3 (totaal volume: 10 mL).
    5. Laat de buizen 2 minuten staan bij kamertemperatuur; verwijder het supernatant terwijl ongeveer 0,5–1 mL PBS en weefsel onderaan achterblijft.
    6. Voeg 10 mL verse PBS toe met een nieuwe pipet; na het coaten van de pipet met FBS, pipeteert u de ophanging krachtig en voorkomt u bubbelvorming.
      OPMERKING: Krachtig pipetteren helpt bij mechanische dissociatie en het verwijderen van bloed en slijm. Het vermijden van bellen voorkomt door schuif-geïnduceerde cellysis. Alle wasstappen zijn bedoeld om vuil te verwijderen.
    7. Laat de buizen 2 minuten staan bij kamertemperatuur; verwijder het supernatant terwijl ongeveer 0,5–1 mL PBS en weefsel onderaan achterblijft.
    8. Herhaal de wasprocedure (stappen 2.2.6 en 2.2.7) twee keer voor in totaal drie wasbeurten.
  3. Breng weefsels over naar de spijsverteringsbuisjes.
    1. Voeg 10 mL verse PBS toe met een nieuwe pipet; na het coaten van de pipet met FBS, wordt het tumorweefsel overgebracht naar de Tumor Digest Tube (Tube B) en het niet-tumorweefsel naar de Non-tumor Digestive Tube (Tube D).
    2. Laat de buisjes 2 minuten op kamertemperatuur staan, verwijder het supernatant terwijl je ongeveer 0,5 mL PBS en weefsel onderin laat.
  4. Voer enzymatische vertering uit.
    1. Vertering van tumorweefsel
      1. Voeg het volledige volume van Enzyme Solution I (collagenase + dispase) toe aan de Tumor Digest Tube (Tube B).
      2. Incubeer op 37 °C gedurende 2 uur met zachte rotatie.
    2. Niet-tumorweefsel vertering
    3. Voeg het volledige volume van Enzymoplossing II (alleen collagenase) toe aan de Non-tumor Digestie Tube (Tube D).
      1. Incubeer 4 uur bij 37 °C met zachte rotatie.
    4. Ga door met stap 3 (verwerking van tumormonsters) of stap 6 (Counterpart fibroblast seeding), afhankelijk van de oorsprong van het monster.
      OPMERKING: De soorten enzymen die worden gebruikt om tumor- en niet-tumorweefsels te verteren, evenals de verwerkingstijden, zijn bepaald op basis van eerdere experimentele optimalisatie. Tumorweefsels bevatten vaak een dichte extracellulaire matrix; Dispase in combinatie met collagenase verbetert de spijsverteringscapaciteit.

3. Tumormonsterverwerking voor organoïde en CAF-isolatie

OPMERKING: Deze stap wordt uitgevoerd om epitheeltumorcellen te isoleren voor organoïde vorming en stromale fibroblasten (AF's) uit dezelfde verteerde tumormonsters.

  1. Filter en verzamel tumorcellen.
    1. Plaats een 100 μm celzeef op een 50 mL conische buis.
    2. Maak de zeef vooraf nat door 3 mL DMEM/10% FBS erdoorheen te laten gaan.
      OPMERKING: Voorbevochtiging vermindert celverlies door te voorkomen dat er aan droge mesh-vezels hechten.
    3. Breng alle inhoud van de Tumor Digestion Tube (Tube B) over op de zeef met behulp van een met FBS gecoate P1000-tip om onverteerde weefselfragmenten te verwijderen.
    4. Voeg nog eens 6 ml DMEM/10% FBS toe om restclusters door de zeef te spoelen.
    5. Verwijder de zeef en geef het filtraat terug naar buis B (een nieuwe laag-aanhechting 15 mL buis kan ook worden gebruikt).
  2. Was en concentreer het filtrat.
    1. Centrifugeer de buis op 300 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
    2. Verwijder het supernatant met een wegwerppipet.
    3. Voeg 10 mL DMEM/10% FBS toe, meng voorzichtig door inversie en centrifugeer opnieuw op 300 × g gedurende 5 minuten.
    4. Aspireer voorzichtig het supernatant terwijl je de pellet vasthoudt.
    5. Verlaag het resterende volume tot 40 μL met een P200-pipet.
  3. Verdeel cellen voor organoïde en CAF-kweek.
    1. Wees 30 μL toe voor het zaaien van organoïden.
    2. Wees 10 μL toe voor CAF-zaaien.
      OPMERKING: Deze verhouding levert empirisch voldoende epitheel- en fibroblastpopulaties voor parallelle expansie.

4. Organoïde zaaiden (3D-cultuur)

OPMERKING: Deze stap wordt uitgevoerd om ESCC-organoïden te vestigen uit een tumorafgeleide celsuspensie.

  1. Maak de koepels van de keldermembraanmatrix klaar.
    1. Verwarm een standaard 24-put plaat voorverwarmend tot 37 °C.
      OPMERKING: Het voorverwarmen van de plaat versnelt de stolling van de Basement Membrane Matrix-koepels.
    2. Meng 30 μL van de tumorafgeleide suspensatie met 90 μL ijskoude Basement Membrane Matrix (1:3 verhouding).
    3. Breng 30 μL per koepel aan op vier putten.
    4. Laat de koepels 15 minuten uitharden in een CO₂-incubator.
  2. Voeg organoïde kweekmedium toe
    1. Bereid organoïde medium voor met voorgemengde supplementen (FGF10, SB202190 en antibiotica, zoals 1× Amfotericine B en 100 μg/mL Primocine, indien gebruikt).
      OPMERKING: Nou 1: Eso_v1; Put 2: Eso_v1 + 10 μM SB202190; Put 3: Eso_v1 + 100 ng/mL FGF10; Put 4: Eso_v1 + 10 μM SB202190 + 100 ng/mL FGF10 (eindconcentraties).
    2. Voeg voorzichtig 1 ml medium toe aan elke put langs de muur.
    3. Incubeer onder standaard CO₂-kweekomstandigheden.
    4. Vervang het medium elke 3–5 dagen.
      OPMERKING: Het vooraf mengen van de supplementen voorkomt dat kleine volumes direct op fragiele Basement Membrane Matrix-koepels gepipetterd hoeven te worden. Antibiotica worden alleen toegevoegd in de eerste 6 dagen na het vestigen van organoïden. Kweekcondities (FGF10 +/-, SB202190 +/-) worden bepaald op basis van groeisnelheid en morfologie (bij voorkeur bolvormig).
  3. Monitor de vorming van organoïden.
    1. Bekijk koepels dagelijks met een omgekeerde microscoop.
      OPMERKING: Verwachte morfologie: Dag 3–5 → zichtbare sferoïden; Dag 7–10 → dichte sferoïden klaar om te passeren.
    2. Passage de organoïden wanneer ze een grootte van ongeveer 100–200 μm bereiken of een koepeldruk van 90% of meer vertonen.

5. CAF-zaaiing

OPMERKING: Deze stap wordt uitgevoerd om AF-waarden vast te stellen uit een tumor-afgeleide celsuspensie.

  1. Zaad CAFs op een met collageen bedekt schaaltje.
    1. Bereid een collageengecoate schaal van 60 mm voor met 1,5 mL fibroblast medium-1.
    2. Voeg 10 μL van het tumorfiltraat toe dat is toegewezen voor CAF-zaaien.
    3. Voeg antibiotica toe zoals 1× Amfotericine B en 100 μg/mL Primocin.
    4. Incubeer onder standaard CO₂-kweekomstandigheden.
    5. Vervang het medium elke 3–5 dagen.
      OPMERKING: Empirisch gezien is fibroblast medium-1 vaak geschikter dan andere media voor de initiële vestiging en groei van AF's en CF's. Antibiotica worden alleen gedurende de eerste 6 dagen toegevoegd.
  2. Monitor de groei van CAF
    1. Houd de verschijning van fibroblast-achtige spindelmorfologie in de gaten rond dag 3–5.
    2. Doorgang fibroblasten bij 90%–100% confluentie.
      OPMERKING: Als er epitheelcelbesmetting optreedt, kunnen fibroblasten selectief worden geïsoleerd door de trypsinisatieduur aan te passen, omdat fibroblasten tijdens het passeren sneller loskomen dan epitheelcellen.

6. CF-plaatsing

OPMERKING: Deze stap wordt uitgevoerd om patiënt-gematchte CF's te verkrijgen van aangrenzend niet-tumorweefsel.

  1. Was en bereid de niet-tumor digest voor.
    1. Centrifugeer de Non-tumor Digest Tube (Tube D) op 300 × g gedurende 5 minuten.
    2. Verwijder het supernatant met een wegwerppipet.
    3. Voeg 10 mL DMEM/10% FBS toe, meng voorzichtig door inversie, en centrifugeer opnieuw op 300 × g gedurende 5 minuten.
    4. Aspireer voorzichtig het supernatantant, terwijl je de pellet behoudt.
    5. Herhaal stappen 6.1.3 en 6.1.4 nogmaals.
  2. Zaad CF's op een met collageen bedekt schaaltje
    1. Breng de volledige suspensie over op een collageengecoate 60 mm schaal met 1,5 mL fibroblast medium-1.
    2. Voeg antibiotica toe zoals 1× Amfotericine B en 100 μg/mL Primocin.
    3. Incubeer onder standaard CO₂-kweekomstandigheden.
    4. Vervang het medium elke 3–5 dagen.
      OPMERKING: Antibiotica worden alleen toegevoegd in de eerste 6 dagen.
  3. Monitor de groei van CF.
    1. Observeer de morfologie van de fibroblastachtige spindel vanaf 3–5 dagen.
    2. Doorgang fibroblasten bij 90%–100% confluentie.

7. Organoïde passaging en cryopreservatie

  1. Organoïde passaging.
    OPMERKING: Het doel van deze stap is om organoïden uit te breiden zodra ze een geschikte dichtheid bereiken.
    1. Aspiraat het oude medium en was elke keer goed met 1 ml PBS.
    2. Voeg 0,5 ml voorverwarmde trypsine voor organoïde toe aan elke put.
    3. Pipetteer krachtig met een P1000-tip, waarbij je de rand van de tip gebruikt om de Basement Membrane Matrix-koepel te verstoren.
      OPMERKING: Mechanische afschuiving helpt bij het afbreken van de dichte Basement Membrane Matrix, waardoor de enzymatische toegang verbetert.
    4. Broed 10–15 minuten in een CO₂-incubator totdat alle gelklonten zijn opgelost. Dissocieer organoïden in 20–50 celklonten.
      OPMERKING: Vermijd volledige single-cell dissociatie, omdat dit de levensvatbaarheid vermindert.
    5. Verzamel de vering in een laag aanhechtende 15 mL buisje.
    6. Spoel de put vier keer met 0,5 mL DMEM/10% FBS en breng alle spoelingen over in dezelfde tube met lage hechting.
    7. Centrifugeer de buis op 300 × g gedurende 5 minuten.
    8. Verwijder het supernatant en suspendeer de pellet opnieuw in minimale DMEM/10% FBS; stel het ophangingsvolume aan op 80 μL.
    9. Meng 80 μL organoïde suspensie met 240 μL ijskoude Basement Membrane Matrix (1:3 verhouding).
    10. Plat het mengsel op een voorverwarmde 6-putplaat (37 °C), met 4–6 koepels per put.
    11. Laat de koepels 15 minuten stollen, voeg dan 3 mL Eso_v1 medium toe (de samenstelling die optimaal was in de eerste kweek bij stap 4.2) per put.
    12. Vervang het medium elke 3–5 dagen.
      OPMERKING: Organoïden worden doorgevoerd wanneer ze een diameter van ongeveer 100–200 μm bereiken of wanneer koepelverdichting meer dan 90% bedraagt. Er wordt geen celtelling uitgevoerd. Voor routinematige subculturen worden organoïden verdeeld in een verhouding van 1:4 tot 1:10. Snelle hervorming van sferoïden wordt verwacht binnen 48–72 uur.
  2. Organoïde cryopreservatie
    1. Was elke put met 3 ml PBS.
    2. Voeg 1,5 ml trypsine voor organoïde toe aan elke put, pipetteer krachtig en laat het 10 minuten incuberen.
    3. Verzamel de volledige suspension in een laag-aanhechtende 15 mL buis en spoel de put vier keer uit.
    4. Centrifugeer de buis op 300 × g gedurende 5 minuten en verwijder het supernatant.
    5. Suspendeer de pellet opnieuw in 2 mL 90% FBS/10% DMSO.
    6. Aliquot 0,5 mL in elke cryovial.
    7. Plaats de flesjes in een vriescontainer en bewaar deze 's nachts bij −80 °C.
    8. Breng de flesjes over in vloeibare stikstof voor langdurige opslag.
      OPMERKING: Organoïden worden bevoorraad wanneer ze een diameter van ongeveer 100–200 μm bereiken of wanneer de koepeldruk meer dan 90% bedraagt.
  3. Terugvinding van bevroren organoïden
    1. Ontdooi het cryoviaal snel in een waterbad van 37 °C.
    2. Breng de inhoud over in 5 mL DMEM/10% FBS in een 15 mL buis.
    3. Centrifugeer de buis op 300 × g gedurende 5 minuten.
    4. Verwijder het supernatant en suspendeer het pellet opnieuw in 40–60 μL DMEM/10% FBS.
    5. Meng de suspensie met ijskoude Basement Membrane Matrix in een verhouding van 1:3.
    6. Plat het mengsel op een voorverwarmde 6-put plaat (37 °C) met 4–6 koepels per put.
    7. Laat de koepels 15 minuten stollen, voeg dan 3 mL Eso_v1 medium toe (de samenstelling die optimaal was in de eerste kweek bij stap 4.2) per put.

8. Fibroblastdoorgang en cryopreservatie

  1. Passaging CAFs en CFs
    OPMERKING: Het doel van deze stap is om fibroblasten uit te breiden zodra ze een geschikte dichtheid bereiken.
    1. Was het bord af met 2 ml PBS.
    2. Voeg 0,4 mL 0,25% trypsine toe.
    3. Incubeer 5 minuten in een CO₂-incubator, waarbij je de ontkoppeling onder een microscoop monitort.
    4. Neutraliseer de trypsine met DMEM/10% FBS en breng de volledige celsuspensie over op een schotel van 100 mm met 10 mL medium.
      OPMERKING: Fibroblasten worden doorgelaten wanneer ze 90%–100% confluentie bereiken. Voor routinematige subculturen worden ze verdeeld in een verhouding van 1:3. Empirisch vertraagt of stopt de proliferatie van fibroblasten wanneer de celdichtheid laag is.
  2. Fibroblast cryopreservatie
    1. Was de cellen met 5 ml PBS.
    2. Voeg 1 ml 0,25% trypsine toe en incubeer dan 5 minuten in een CO₂-incubator.
    3. Neutraliseer de trypsine met DMEM/10% FBS en breng de volledige celsuspensie over in een buis van 15 mL.
    4. Centrifugeer op 300 × g gedurende 5 minuten.
    5. Suspensie de celpellet opnieuw in 2 mL 90% FBS/10% DMSO.
    6. Aliquot 0,5 mL in elke cryovial.
    7. Plaats de flesjes in een vriescontainer en bewaar ze 's nachts op −80 °C.
    8. Plaats de flesjes in vloeibare stikstof voor langdurige opslag.

9. Conditioned medium assay

OPMERKING: Het doel van deze stap is het evalueren van de paracriene effecten van fibroblasten op ESCC-tumororganoïden met behulp van een geconditioneerd medium (CM). Deze assay biedt een reproduceerbaar stromaal–tumor interactiemodel wanneer directe co-kweek nog niet is geoptimaliseerd.

  1. Bereiding van CAF/CF geconditioneerd medium
    1. Kweek hetzelfde aantal CAFs of CF's in 3 mL DMEM/10% FBS op 60-mm schotels tot 80%–90% confluentie.
    2. Was cellen één keer met 2 ml PBS.
    3. Voeg 3 mL DMEM/2% FBS toe.
    4. Incubeer 48 uur in een CO₂-incubator.
    5. Verzamel het supernatant in een 15 mL buis.
    6. Centrifugeer op 2000 × g gedurende 5 minuten om cellulair afval te verwijderen.
    7. Verzamel 2,5 mL van het supernatant in een nieuwe 15 mL buis.
    8. Aliquot het geconditioneerde medium in porties van 100–500 μL en bewaar bij -80 °C.
  2. Bereiding van organoïde assaymedium
    1. Bereid het ESCC-organoïde medium voor zoals beschreven in stap 1.3.
    2. Meng het organoïde medium en het geconditioneerde medium in een verhouding van 1:1 (50% v/v).
  3. Kweek van kankerorganoïden met behulp van het organoïde assaymedium.
    1. Na organoïdepassaging zoals beschreven in stap 7, zaad organoïden in één enkele 20 μL Basement Membrane Matrix-koepel per put op een voorverwarmde plaat met 48 putten (37 °C).
    2. Na de stolling van de koepel voeg je 0,3 ml organoïde assaymedium toe aan elke put.
    3. Vervang het organoïde assaymedium elke 3–7 dagen.
    4. Beoordeel de morfologie en grootte van de kankerorganoïden.
      OPMERKING: Alle materialen van menselijke basis worden als potentieel besmettelijk behandeld. Geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen, waaronder handschoenen, mondkapjes en beschermende brillen, worden altijd gedragen. Collagenase, dispase en dimethylsulfoxide (DMSO) kunnen irritatie veroorzaken op huid, oog en ademhalings; Daarom worden direct contact en inademing vermeden. Alle enzymatische procedures met menselijke weefsels worden uitgevoerd in overeenstemming met institutionele bioveiligheidsrichtlijnen. Vloeibaar afval met menselijk weefsel wordt verzameld in afgesloten biohazard-containers en geautoclaveerd voordat het wordt afgevoerd. Chemisch afval, waaronder DMSO en enzymoplossingen, wordt afgevoerd volgens de institutionele richtlijnen voor gevaarlijk afval. Alle herbruikbare instrumenten worden afgespoeld met 70% ethanol en geautoclaveerd voordat ze opnieuw worden gebruikt.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Weefselmonsters werden afgenomen uit het tumorgebied en een aangrenzende niet-tumorregio op 3 cm afstand van de tumor, chirurgisch verwijderd van een patiënt met ESCC die geen neoadjuvante chemotherapie had ontvangen. Kankerorganoïden en CF's werden geïsoleerd uit het tumorgebied, terwijl CF's werden geïsoleerd uit het niet-tumorgebied. Chirurgisch weefsel werd in stukken van ongeveer 0,5 mm gehakt (Figuur 2A), daarna enzymatisch behandeld, waarna kankerorga...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De eerdere rapporten maakten gebruik van kankerorganoïden en patiëntgematchte AF's om de rol van AF's bij proliferatie en geneesmiddelresistentie bij menselijke darm-, borst-, alvleesklier- en hoofd- en halskankerte onderzoeken. Deze studies toonden aan dat AF's proliferatie en resistentie tegen geneesmiddelen beïnvloeden. Aan...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten om te melden.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door de Juntendo University Young Investigator Award (2024 en 2025) voor P. Z. en subsidies voor wetenschappelijk onderzoek van het Ministerie van Onderwijs, Cultuur, Sport, Wetenschap en Technologie, Japan (23K07362, 21K08693). We willen alle leden van de afdelingen Pathologie en Oncologie, en van Oesofageale en Gastro-enterologische Chirurgie bedanken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
100 mm schaalTPP93100
100x Penicillin-Streptomycin (PS)Nacalai26253-84
15 ml buisFastGeneFG2001
24-well celcultuurplaatTPP92024
48-well celcultuurplaatTPP92448
50 ml buisFastGeneFG2004
60 mm schaalTPP93060
6-well celcultuurplaatTPP92006
A83-01Cayman9001799
Advanced DMEM/F12 Gibco12634010Organoid basaal medium = Advanced DMEM/F12 + GlutaMAX + 1x PS
Alexa488 anti-muis IgGInvitrogenA11029
Amphotericin BThermoFisher15290018
Anti-Vimentin antilichaam (V9)Santa Cruzsc-62601/500 verdunning voor gebruik
B-27ThermoFisher17504044
Fles-top filterSartorius180F15
Celzeef, 100 µm poriënBD Falcon352360
Collageenase, Type ISIGMAC0130
Collageen-gecoate 60 mm schaalIWAKI4010-010
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)Wako043-07216
Dispase IGODO SHUSEI386-02271
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Nacalai08459-64
ECLIPSE Ti2Nicon
Fetaal bovien serum (FBS)SERANAS-FBS-CO-015
Fibroblast Groei Medium 2PromoCellC-23020Fibroblast medium-1 = Fibroblast Groei Medium 2
G418Invivogenant-gn-1
GlutaMAX Gibco35050061
HFDM-1KSK87-160Fibroblast medium-2 = HFDM-1 + 1% FBS + 1 x PS
Hoechst33342 Nacalai04929-82
HygromycinInvivogenant-hg-1
IncuCyte systeemEssen BioScience
L-WRN cellenATCCCRL-3276
MatrigelCorning354234Basement Membrane Matrix = Matrigel
N2ThermoFisher17502048
N-acetyl-L-CysteineWako017-05131
NicotinamideTCIN0078
Phosphate Buffered Saline (PBS)Nacalai14249-24
PrimocinInvivogenant-pm-05
Recombinant humaan EGFPEPROTECHAF-100-15
Recombinant humaan FGF-10PEPROTECHPEP-100-26
SB202190SelleckS1077
Schaar, No 11Feather8-3086-02
STEMFULLSumitomo bakelietMS-90150Laag-aanhechtende 15 mL buis = STEMFULL
TrypLE ExpressGibco12605028Trypsine voor organoïd = TrypLE Express
TrypsineNacalai35556-44
Y-27632SelleckS1049

Referenties

  1. Sung, H., et al. Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 71 (3), 209-249 (2021).
  2. Abbas, G., Krasna, M. Overview of esophageal cancer. Ann Cardiothorac Surg. 6 (2), 131-136 (2017).
  3. Morgan, E., et al. Global burden of colorectal cancer in 2020 and 2040: Incidence and mortality estimates from GLOBOCAN. Gut. 72 (2), 338-344 (2023).
  4. Lagergren, J., Smyth, E., Cunningham, D., Lagergren, P. Oesophageal cancer. Lancet. 390 (10110), 2383-2396 (2017).
  5. Lordick, F., et al. Oesophageal cancer: ESMO Clinical Practice Guidelines for diagnosis, treatment and follow-up. Ann Oncol. 27 (suppl 5), v50-v57 (2016).
  6. Chhabra, Y., Weeraratna, A. T. Fibroblasts in cancer: Unity in heterogeneity. Cell. 186 (8), 1580-1609 (2023).
  7. Caligiuri, G., Tuveson, D. A. Activated fibroblasts in cancer: Perspectives and challenges. Cancer Cell. 41 (3), 434-449 (2023).
  8. Mezawa, Y., Orimo, A. The roles of tumor- and metastasis-promoting carcinoma-associated fibroblasts in human carcinomas. Cell Tissue Res. 365 (3), 675-689 (2016).
  9. Mezawa, Y., Orimo, A. Phenotypic heterogeneity, stability and plasticity in tumor-promoting carcinoma-associated fibroblasts. FEBS J. 289 (9), 2429-2447 (2022).
  10. Qiu, L., et al. Cancer-associated fibroblasts: An emerging target against esophageal squamous cell carcinoma. Cancer Lett. 546, 215860(2022).
  11. Xue, M., Tong, Y., Xiong, Y., Yu, C. Role of cancer-associated fibroblasts in the progression, therapeutic resistance and targeted therapy of oesophageal squamous cell carcinoma. Front Oncol. 13, 1257266(2023).
  12. Dunbar, K. J., Wong, K. K., Rustgi, A. K. Cancer-associated fibroblasts in esophageal cancer. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 17 (5), 687-695 (2024).
  13. Pimkhaokham, A., et al. Nonrandom chromosomal imbalances in esophageal squamous cell carcinoma cell lines: Possible involvement of the ATF3 and CENPF genes in the 1q32 amplicon. Jpn J Cancer Res. 91 (11), 1126-1133 (2000).
  14. Kijima, T., et al. Three-dimensional organoids reveal therapy resistance of esophageal and oropharyngeal squamous cell carcinoma cells. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 7 (1), 73-91 (2019).
  15. Fuchino, T., et al. Characterization of residual cancer by comparison of a pair of organoids established from a patient with esophageal squamous cell carcinoma before and after neoadjuvant chemotherapy. Hum Cell. 37 (2), 491-501 (2024).
  16. Shen, S., et al. Advancing precision medicine in esophageal squamous cell carcinoma using patient-derived organoids. J Transl Med. 22 (1), 1168(2024).
  17. Zhang, S., Wang, C. Protocol to establish patient-derived xenograft and organoid for radiosensitivity of esophageal squamous cell carcinoma. STAR Protoc. 5 (4), 103273(2024).
  18. Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nat Protoc. 8 (12), 2471-2482 (2013).
  19. Mashima, Y., et al. KIF24 depletion induces clustering of supernumerary centrosomes in PDAC cells. Life Sci Alliance. 5 (11), e202201470(2022).
  20. Hogstrom, J. M., et al. Simultaneous isolation of hormone receptor-positive breast cancer organoids and fibroblasts reveals stroma-mediated resistance mechanisms. J Biol Chem. 299 (8), 105021(2023).
  21. Schuth, S., et al. Patient-specific modeling of stroma-mediated chemoresistance of pancreatic cancer using a three-dimensional organoid-fibroblast co-culture system. J Exp Clin Cancer Res. 41 (1), 312(2022).
  22. Farin, H. F., et al. Colorectal cancer organoid-stroma biobank allows subtype-specific assessment of individualized therapy responses. Cancer Discov. 13 (10), 2192-2211 (2023).
  23. Zapatero, M. R., et al. Trellis tree-based analysis reveals stromal regulation of patient-derived organoid drug responses. Cell. 187 (25), 7335-7349 (2024).
  24. Rademaekers, M., Johansson, E. O., Johansson, E., Roberg, K., Wiechec, E. Tumor-matched and unmatched cancer associated fibroblasts exhibit differential effect on proliferation and FMOD and MMP9 gene expression in head and neck squamous cell carcinoma cells when co-cultured in spheroids. Cancer Cell Int. 24 (1), 190(2024).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

ESCC-organoïdentumor-micro-omgevingfibroblastmarkerspatiënt-gematchte fibroblastendriedimensionale kweektumor-stroma-interacties
Vestiging van tumororganoïden, carcinoom-geassocieerde fibroblasten en tegenhangende fibroblasten van dezelfde slokdarmkankerpatiënt
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.