Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Lentiviraal-geïnduceerde striatale pathologie als preklinisch model van polyglutamine spinocerebellaire ataxie

430 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/69550

⸱

13 maart 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1ABC-RI, Algarve Biomedical Center Research Institute, 2Faculdade de Medicina e Ciências Biomédicas, Universidade do Algarve, 3ABC Collaborative Laboratory: Integrated Ageing and Rejuvenation Solutions (ABC CoLAB - Ageing Better)

In dit artikel

Samenvatting

Polyglutamine spinocerebellaire ataxieën worden veroorzaakt door CAG-expansies die aggregatiegevoelige eiwitten produceren. Dit protocol beschrijft vectorproductie, stereotaxische toediening en analyse van inclusies en verlies van neuronale markers, en biedt een gecontroleerd platform om mechanismen te onderzoeken en gerichte therapieën voor neurodegeneratieve ziekten te evalueren.

Samenvatting

Polyglutamine spinocerebellaire ataxieën zijn een groep van zes neurodegeneratieve ziekten veroorzaakt door een mutatie in het trinucleotide CAG-traject binnen het coderende gebied van elk oorzakelijk gen. Deze mutatie leidt tot een abnormaal uitgebreide polyglutamine rek in het eiwit, waardoor het vatbaar is voor aggregatie en de vorming van intraneuronale inclusies, die kenmerkend zijn voor deze ziekten. De moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de pathogenese van deze ziekten zijn complex en niet volledig begrepen. Tot nu toe blijven deze ziekten ongeneeslijk. Het begrijpen van moleculaire mechanismen in kwetsbare hersengebieden is essentieel voor therapeutische ontwikkeling. Flexibele, regio-specifieke experimentele platforms zijn nodig om mechanismen en interventies snel te testen zonder de tijd en kosten van het genereren van meerdere transgene lijnen, ook al wordt selectieve kwetsbaarheid niet aangepakt. In de afgelopen jaren hebben wij en anderen verschillende lentivirale modellen ontwikkeld om de impact van uitgebreide eiwitexpressie in specifieke hersengebieden te bestuderen. Deze modellen tonen neuropathologische en gedragskenmerken die sommige ziektekenmerken nabootsen, wat hun belang benadrukt voor het begrijpen van de pathogenese en de ontwikkeling van nieuwe therapeutische strategieën. In dit artikel beschrijven we de ontwikkeling van een striataal model met SCA2 als voorbeeld. We belichten de ontwikkeling en productie van lentivirale vectoren, en de stereotaxische injectie van de vectoren die de uitgebreide vorm van ataxine-2 (het ziekteverwekkende eiwit) tot expressie brengen. Tot slot karakteriseren we twee belangrijkste neuropathologische kenmerken: de vorming van insluitsels en het verlies van neuronale markers. Door een gecontroleerd platform te bieden dat deze belangrijke pathologische kenmerken reproduceert, biedt dit model een waardevol hulpmiddel om regio-specifieke mechanismen van neurodegeneratie te ontleden en gerichte therapeutische interventies te evalueren.

Inleiding

Polyglutamine spinocerebellaire ataxieën (polyQ SCA's) zijn een groep van zes autosomaal dominante neurodegeneratieve aandoeningen veroorzaakt door CAG-trinucleotide-repeat-expansies in verschillende oorzakelijke genen, wat resulteert in toxische polyglutamine (polyQ) banen binnen gecodeerde eiwitten1. Daaronder zijn de meest voorkomende polyQ SCAs SCA3/Machado-Joseph ziekte en SCA222. Deze aandoeningen treffen voornamelijk neuronale cellen in specifieke hersengebieden, waaronder het cerebellum en de hersenstam, evenals het striatum en andere gebieden. Daardoor veroorzaken ze progressieve motorische incoördinatie, loopproblemen, ernstige neurodegeneratie en vroegtijdige dood3.

Er zijn meerdere diermodellen ontwikkeld om polyQ SCA's te bestuderen en therapeutische benaderingen te testen. Transgene muizen, knock-in lijnen en conditionele expressiemuismodellen zijn gebruikt om de moleculaire basis van ziekteprogressie en de betrokken cellulaire routeste verduidelijken. Het genereren van een nieuw ziektediermodel is echter tijdrovend en kostbaar, en het is vaak niet geschikt om de regionale betrokkenheid van de hersenen bij ziektepathogenese6 te bestuderen.

Lentivirale (LV) gebaseerde muismodellen bieden een complementair alternatief voor conventionele modellen, met lagere kosten en de mogelijkheid om specifieke hersengebieden te bestuderen 7,8. Lentivirusvectoren maken de levering van grote transgenen (tot 8 kb) mogelijk, wat leidt tot een snelle inductie van pathologie in gedefinieerde hersengebieden zonder de noodzaak van kiemlijnmodificatie, en ze kunnen worden gebruikt bij dieren van verschillende leeftijden. De directe injectie van lentivirale vectoren in het doelhersengebied kan regio-specifieke expressie van pathogene of therapeutische genen bereiken met verminderde immunogeniteit vergeleken met andere virale vectoren4. Bovendien voorkomt postnatale bevalling ontwikkelingscompensatie om ziektemechanismen te onderzoeken onder omstandigheden die meer lijken op de menselijke aanvangvan 9. Expressieniveaus kunnen worden getitreerd door de virale dosis aan te passen, waardoor fenotypen van gecontroleerde ernst worden geproduceerd en het modelleren van gegradueerde ziekteprogressie wordt vergemakkelijkt. Daarnaast maakt deze methode celtype-specifieke expressie mogelijk, afhankelijk van de gekozen promotor 4,7.

Verschillende studies hebben aangetoond dat LV-gebaseerde muismodellen praktisch en nuttig zijn voor het modelleren van polyQ SCAs 10,11,12,13. Wij en anderen hebben LV-gebaseerde modellen ontwikkeld voor SCA111, SCA212, SCA311, 12 en SCA714, die platforms vormen voor snelle, regio-specifieke expressie of het dempen van ziektegenen, terwijl ze belangrijke aspecten van de neuropathologie reproduceren.

Samenvattend biedt de hier beschreven lentivirale benadering een veelzijdig en efficiënt hulpmiddel voor het modelleren van de pathogenese van polyQ SCA's. Door enkele van de belangrijkste nadelen van huidige diermodellen te overwinnen, versnelt deze methode proof-of-concept-studies en biedt het meer controle over het ontstaan, de lokalisatie en de ernst van de ziekte – kenmerken die het zeer geschikt maken voor therapeutische screening en het bestuderen van moleculaire mechanismen. Hier beschrijven we een reproduceerbare methode om een striataal lentiviraal model van polyglutamine spinocerebellaire ataxie te genereren en te karakteriseren, waardoor gedetailleerde analyse van vroege pathogene gebeurtenissen en evaluatie van kandidaattherapieën mogelijk is.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle dierproeven werden uitgevoerd volgens de richtlijnen voor Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments (ARRIVE) en de National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. De huidige studie werd goedgekeurd door de Direção-Geral da Alimentação e Veterinária (DGAV). C57BL/6J-muizen werden in deze studie gebruikt en werden in standaardkooien gehuisvest onder een 12 uur licht/12 uur donkercyclus, met voedsel en water ad libitum.

OPMERKING: Materialen die in dit protocol worden gebruikt, worden verder beschreven in de Materiaallijst.

1. Verpaking van lentivirale vectoren

OPMERKING: Alle procedures met lentivirale vectoren moeten worden uitgevoerd in een BSL-2 laboratorium volgens de veiligheidsrichtlijnen van de instelling. We gebruikten het 4-plasmidetransfectiesysteem vanwege de hogere bioveiligheid in vergelijking met andere lentivirale producerende systemen (zie Figuur 1 voor de details over het transferplasmide).

  1. Ontdooi HEK 293T-cellen in een waterbad en zaad ze in een T75-fles met behulp van Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), aangevuld met 2 mM L-glutamine, 10% FBS en 1% Pen-Strep. Dit volledige DMEM-medium werd in alle stappen van het protocol gebruikt. Gebruik cellen op passage nummer ≤10 om hoge virale titers en consistente resultaten te garanderen.
    OPMERKING: Controleer altijd op mycoplasma-besmetting voordat u verder gaat.
  2. Wanneer cellen 80%-90% confluentie bereiken, breiden ze uit tot 2 T175-kolven door de initiële cultuur 1:2 te splitsen. Zaai 20 100 mm kweekschalen met 3,8 x 106 cellen per schotel (eindvolume 10 mL) en incubeer ze 24 uur bij 37 °C in een bevochtigde broedmachine met 5% CO₂. Tel cellen met trypan blue exclusion met een Neubauer hemocytometer.
    OPMERKING: Overweeg om Pen-Strep uit het medium te sluiten om celstress te verminderen en daardoor celtransfectie te maximaliseren.
  3. De volgende dag bereid je de transfectiemix voor zoals beschreven in Tabel 1. Vortex en kort naar beneden draaien om te homogeniseren. Incubeer het mengsel op kamertemperatuur gedurende 10–20 minuten om DNA: PEI-complexen te laten vormen.
  4. Na het DNA: PEI-complexen mochten 15 minuten bij kamertemperatuur ontstaan, het mengsel werd aangepast naar 5 mL met volledige DMEM.
    Verwijder 5 ml medium uit elke kweekschaal (de helft van het totale volume) en vervang dit door 5 ml transfectiemengsel. Dit houdt het uiteindelijke kweekvolume tijdens transfectie op 10 mL.
  5. Transfecteer de cellen met de drie verpakkingsplasmiden en het transferplasmide zoals beschreven in Tabel 1.
    OPMERKING: Alle plasmiden die worden gebruikt voor lentivirale productie moeten worden voorbereid met endotoxinevrije zuiveringskits. Bovendien moet de integriteit van het plasmid worden gecontroleerd door restrictie-enzymanalyse om de correctheid van de LTR-regio's en de transgencassette vóór transfectie te bevestigen.
  6. Voeg 5 mL van het transfectiemengsel druppelgewijs toe aan elke plaat en incubeer 6 uur. Aspiratief al het medium en vervang het door 10 mL vers medium. Incubeer 48 uur.
    OPMERKING: Om de virale titer te verhogen, verzamel je het medium bij 48 uur, voeg je 10 ml vers medium toe aan elk bord en verzamel je na 24 uur opnieuw. Het eerder verzamelde medium kan tot 24 uur op 4 °C worden bewaard. Dit maakt een concentratie van het dubbele volume mogelijk en verhoogt de virale titer.
  7. Filter alle geconditioneerde mediums met lentivirale vectoren met een 0,22 μm filterunit.

2. Zuivering en titratie van lentivirale vectoren

  1. Overbreng het gefilterde supernatant in geschikte conische ultracentrifugebuizen en centrifugeer op 65.000 x g gedurende 1 uur 30 minuten bij 4 °C, bijvoorbeeld met behulp van een schandlerende rotor.
  2. Gooi het supernatant voorzichtig weg en suspendeer elke pellet opnieuw in 400 μL van 1% BSA, verdund in 1x PBS, zodat bubbelvorming wordt voorkomen. Incubeer minstens 1 uur op ijs.
  3. Na 1 uur incubatie meng je elke buis voorzichtig om te zorgen dat de pellets volledig opnieuw zijn opgehangen en homogeen zijn, en voeg je alle opnieuw gesuspendeerde pellets samen in één buis.
  4. Vul de buis met 1% BSA/PBS tot minstens tweederde vol is om inkluim tijdens centrifugatie te voorkomen.
  5. Centrifugeer opnieuw op 65.000 x g gedurende 1 uur 30 minuten bij 4 °C om de lentivirale vectoren te pelleten. Gooi het supernatant voorzichtig weg en droog de rand van de tube met steriel papier.
  6. Sussief de pellet met de lentivirale vectoren opnieuw in 45 μL van 1% BSA/PBS, zodat bubbels worden voorkomen. Sluit de buis af met transparante folie en incubeer bij 4 °C gedurende 24 uur.
  7. Bereid de volgende dag 10 μL aliquots van de lentivirale vectoren voor. Houd een 10 μL aliquot voor titratie: 5 μL voor de p24 ELISA-kit en 2 μL voor de qPCR-kit. Titreer de lentivirale vectoren met ELISA en qPCR volgens de instructies van de fabrikant.
    OPMERKING: De keuze van titratiemethode hangt af van de experimentele behoeften, bijvoorbeeld een snelle beoordeling of nauwkeurige kwantificering van infectieuze eenheden. ELISA op basis van p24 kwantificeert het capsideiwit en meet dus het totale aantal fysische deeltjes; Het is snel, goedkoper dan andere methoden en zeer reproduceerbaar. Het maakt echter geen onderscheid tussen infectieuze en niet-infectieuze deeltjes, wat kan leiden tot overschatting van functionele titer. De titratie op basis van qPCR meet het aantal virale genomen (vg) dat in deeltjes is verpakt, wat een nauwkeurigere schatting van genoomhoudende virionen geeft en directe vergelijking tussen vectorpreparaten mogelijk maakt. Toch kan het de effectieve infectiviteit van de virale deeltjes nog steeds niet beoordelen. Ten slotte meten infectiviteitsgebaseerde assays, zoals flowcytometrie voor fluorescerende vectoren of het vormen van antibioticaresistente kolonies, direct functionele transducerende eenheden (TU/ml) en zijn biologisch het meest relevant, hoewel ze arbeidsintensiver, celtype-afhankelijk, tijdrovend en duurder zijn.

3. Stereotaxische chirurgie voor bilaterale lentivirale levering in het muisstriatum

  1. Dierlijke bereiding
    1. Weeg het dier en bereken de benodigde dosis narcose. Dien anesthesie intraperitoneaal toe met een dosis van 10 μL/g lichaamsgewicht met een kant-en-klare mixoplossing. Deze oplossing wordt bereid door 7,5 mL 0,9% NaCl, 500 μL medetomidine (1,0 mg/mL), 1,0 mL midazolam (5,0 mg/mL) en 1,0 mL fentanyl (0,05 mg/mL) te combineren, voor een eindvolume van 10 mL. Reken ongeveer 10 minuten in voor volledige inleiding van anesthesie.
    2. Bevestig de diepte van de anesthesie (bijvoorbeeld de reflex van de teenknypen). Breng oogzalf aan op beide ogen en scheer de hoofdhuid.
    3. Plaats het dier in het stereotacische frame op een warmtekussen. Positioneer het hoofd met behulp van de oorbeugels en de bijtstang.
      OPMERKING: Het aantal dieren dat geïnjecteerd moet worden en de tijdlijn zijn experimenteel afhankelijk en moeten worden bepaald door een a priori statistische machtanalyse op basis van de specifieke hypothesen en verwachte effectgroottes. Als voorbeeld: in onze vorige studie12 werden de geïnjecteerde hersenen geanalyseerd 4, 8 en 12 weken na injectie om het verloop van neuropathologische veranderingen te evalueren.
  2. Spuitvoorbereiding en virale lading
    1. Gebruik de standaard Hamilton-naald voor het laden en een 26G stompe naald voor de injectie. Laad 2 μL lentivirale vectoroplossing in de spuit. Zorg ervoor dat de virale dosis per injectieplaats 400 ng p24-antigeen/mL bedraagt, of 5 x 109 IU/mL 10,12,17.
    2. Bevestig de spuit in de automatische micro-injectiepomp (bijvoorbeeld Stoelting). Zet de spuit in infuusmodus totdat er een druppel vloeistof aan de punt van de naald verschijnt. Zorg ervoor dat de afschuining naar voren wijst.
    3. Stel de pompparameters in - snelheid: 0,25 μL/min, volume per halfrond: 2 μL, spuittype: passend bij wat wordt gebruikt.
      OPMERKING: Het volume dat geïnjecteerd moet worden hangt af van de knaagdiersoort en het doelgebied in de hersenen dat getransduceerd moet worden. Injecties van 1 μL leiden tot een focale expressie, terwijl grotere totale volumes (tot 10 μL) zeer trage injectiesnelheden vereisen en een hoger risico op weefselverstoring of reflux met zich meebrengen.
  3. Striatale targeting en injectie
    1. Desinfecteer de hoofdhuid met 70% ethanol. Maak een middenlijnincisie (~1–1,5 cm) met een steriel scalpelblad van tussen de oren naar de ogen.
    2. Maak de schedel bloot en maak schoon, verwijder het periost met wattenstaafjes. Zoek Bregma op en registreer het stereotaxische nulpunt (handmatig of digitaal).
    3. Bepaal injectiecoördinaten ten opzichte van Bregma (voor een muis van 8-12 weken oud met ongeveer 18-20 g): Antero-posterior (AP) +0,6 mm; Medio-lateraal (ML) ±1,8 mm; Dorso-ventral (DV): –3,3 mm.
    4. Oefen zorgvuldig op de gemarkeerde AP/ML-coördinaten. Ga langzaam te werk om te voorkomen dat je de hersenen binnendringt. Of stop zodra het bot voldoende is verdund – dit blijkt uit het visualiseren van bloedvaten in de dura mater door de schedel. Perforeer de dura mater voorzichtig met een kleine naald.
    5. Test of het gat in de juiste positie zit door de injectienaald te laten zakken. Test op verstopte naald door een deel van de oplossing te injecteren totdat er duidelijk een druppel zichtbaar is.
    6. Laat de injectienaald langzaam zakken naar de DV-coördinaat. Injecteer 2 μL virale oplossing per hemisfeer bij 0,25 μL/min. Wacht na de injectie 5 minuten voordat je de naald langzaam terugtrekt om reflux te voorkomen.
    7. Injecteer lentivirus, coderend voor het wildtype-eiwit (ATXN2WT of ATXN3WT), in één hemisfeer en lentivirus, coderend voor het mutante/uitgebreide eiwit (ATXN2MUT of ATXN3MUT) in de contralaterale zijde (gerandomiseerd of vooraf gedefinieerd)12,13.
      OPMERKING: Met behulp van de muishersenatlas18 kunnen vrijwel alle hersengebieden stereotactisch worden getarget voorbij het striatum, waaronder cortex, hippocampus, substantia nigra en cerebellum. Omdat het cerebellum de primaire pathologische locatie is bij SCA's, vormt het een bijzonder relevant doelwit voor vectoraflevering. Voor de ontwikkeling van dit cerebellaire SCA3-muismodel gebruikten we coördinaten van 1,6 mm rostral tot lambda, 0 mm vanaf de middenlijn, en 1 mm ventral ten opzichte van het schedeloppervlak, met de mondstaaf ingesteld op −3,3, wat zorgt voor een nauwkeurige targeting van de cerebellaire cortex12,15.
  4. Monitoring tijdens de operatie
    1. Houd de beweging en reflexen van de snorharen in de gaten. Als er beweging wordt waargenomen, dien dan een aanvullende dosis anesthesie toe (een derde van het initiële volume).
  5. Wondsluiting en herstel
    1. Sluit de incisie met 3–5 onderbroken 5-0 nylon hechtingen. Geef subcutaan een mengsel van antagonistische medicijnen bij een dosis van 10 μL/g lichaamsgewicht om de effecten van de initiële anesthetica te keren. Deze oplossing wordt bereid door 1,5 mL 0,9% NaCl, 500 μL atipamezol (5,0 mg/mL), 5,0 mL flumazenil (0,1 mg/mL) en 3,0 mL naloxon (0,4 mg/mL) te combineren, voor een eindvolume van 10 mL.
    2. Plaats het dier in een schone herstelkooi boven een warmtekussen en houd het 's nachts in de gaten.
      OPMERKING: De injectieruimte moet idealiter worden uitgerust met een biologische veiligheidskast voor vectorhantering. Onderzoekers moeten passende persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM) dragen, waaronder een labjas, handschoenen en oogbescherming. Al het afval (bijvoorbeeld naalden, spuiten en besmette materialen) moet worden afgevoerd in biohazard-containers volgens institutionele en nationale regelgeving.

4. Weefselverzameling, voorbereiding en verwerking

  1. Bereiding
    1. Bereid alle dissectie-instrumenten en benodigde oplossingen voor muizeuthanasie en weefselverzameling voor (bijv. anesthesie, 4% paraformaldehyde [PFA] in PBS).
    2. Bereid 4% PFA van tevoren voor, bewaar het bevroren en ontdooi het niet meer dan 24 uur voor gebruik. Zorg ervoor dat de oplossing grondig is gekoeld voordat hij wordt geperfuseerd.
      VOORZICHTIG: PFA is giftig. Hanteer alleen binnen een dampkap met passende persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM) en training.
    3. Geef een dodelijke dosis pentobarbital (100–200 mg/kg, intraperitoneaal) om het dier te verdoven. Bevestig diepe anesthesie door het ontbreken van de teenknellingsreflex; Als de reflex aanhoudt, geef dan een extra dosis.
  2. Transcardiale perfusie
    1. Plaats en beveilig het dier in het dissectieapparaat. Met een tang til je de buikhuid op en maak een oplopende verticale incisie met een schaar (Figuur 2A, roze pijl).
    2. Til de oppervlakkige fascia op en maak een bovenste incisie totdat de lever zichtbaar is, zodat schade aan de buikorganen wordt voorkomen.
    3. Snijd het middenrif horizontaal af en verleng vervolgens de incisie naar de oksel (Figuur 2A, witte pijl). Reflecteer en zet de thoracale wand vast.
    4. Steek een perfusienaald in de top van de linker ventrikel en zorg ervoor dat deze de ventrikelwand niet doorboort. Maak een kleine incisie in het rechter atrium met een fijne schaar (Figuur 2B).
    5. Begin met transcardiale perfusie met 50 mL ijskoude 4% paraformaldehyde (PFA) bij een debiet van 1-2 mL/min.
      OPMERKING: Vaak veroorzaakt de koude oplossing staartkrullen en spiertrekkingen, wat een teken is van een goede perfusie.
  3. Hersendissectie
    1. Bereid een buis voor met voldoende PFA 4% om de hersenen volledig onder te dompelen. Onthoofd de muis met een grote schaar. Gooi het lichaam weg in een afgesloten biohazard-zak voor verbranding.
    2. Reflecteer de hoofdhuid om de schedel bloot te leggen. Identificeer het foramen magnum en begin met het verwijderen van de schedel door zijwaarts te knippen met een fijne schaar, parallel aan de hersenen (Figuur 2C).
    3. Herhaal aan de contralaterale zijde, en snijd dan de schedel tussen de ogen boven de reukbollen.
    4. Til de schedel van het cerebellum naar de reukbollen om de hersenen bloot te leggen. Verwijder de hersenen met een spatel voorzichtig van achterste naar voorste en dompel deze onder in 4% PFA voor niet langer dan 24 uur bij 4 °C.
    5. Vervang de inbeddingsoplossing door 20%-30% sucrose in PBS en incubeer bij 4 °C totdat de infiltratie voltooid is. De hersenen zullen aanvankelijk zweven en dan zakken zodra ze volledig geïnfiltreerd zijn, meestal binnen 24 uur. Als het blijft drijven, verleng dan de incubatie totdat het zich op de bodem van de buis vestigt.
      OPMERKING: Deze cryobeschermingsstap minimaliseert bevriesartefacten door het watergehalte in het weefsel te verminderen.
      Droog de hersenen en de buis voorzichtig, bewaar dan op -80 °C tot verder gebruik.
  4. Cryosectie en vrij zwevend weefselverzameling
    1. Stel de cryostaat vóór het delen in op -20 °C en de gewenste dikte.
      OPMERKING: Voor het striatum bieden coronale secties met een dikte van 20-25 μm een ideale compromis tussen structureel behoud en antilichaampenetratie, waarbij secties robuust genoeg zijn voor behandeling terwijl ze een hoge kleuringskwaliteit en ruimtelijke resolutie behouden. Cryosectievoorwaarden moeten ook worden gespecificeerd voor andere hersengebieden, aangezien de optimale dikte kan variëren met de cytoarchitectuur. Voor het cerebellum worden sagittale secties van 25–35 μm doorgaans aanbevolen, omdat deze dikte de gelaagde organisatie van de cerebellaire cortex behoudt.
    2. Vervoer de hersenen op droogijs en laat ze 5-10 minuten in balans zijn in de cryostaat. Deze stap is belangrijk om weefselschade te voorkomen.
    3. Verwijder de reukbollen met een scalpel; Ze moeten zacht zijn en makkelijk te knippen. Breng een druppel verse O.C.T. ter grootte van een erwt aan op de schijf van het monster en breng het cerebellum in contact (Figuur 1D). Positioneer de hersenen voor coronale doorsnede. Na het bevroren voeg je extra O.C.T. toe om de hele hersenen in te sluiten.
      OPMERKING: O.C.T. is transparant bij kamertemperatuur en wordt dekkend wit wanneer volledig bevroren; Als het glanzend blijft, laat dan meer vriestijd in de cryostaat toe.
    4. Bevestig de monsterschijf in de houder en trim totdat het striatum (twee witte cirkels in elke halfrond) zichtbaar is. Als hemisferen verschillende behandelingen hebben gekregen, steek dan één hemisfeer door met een naald om de oriëntatie te behouden. Noteer dit voor latere analyse.
    5. Schakel over naar sectiemodus en verzamel vrij zwevende secties in een plaat met 48 putten met een fijne borstel of een vuurgepolijste glazen Pasteur-pipet.
      OPMERKING: De vrij-zwevende methode verbetert de penetratie van antistoffen, vermindert de achtergrond, maakt langdurige opslag mogelijk en zorgt voor gelijkmatig verdeelde delen voor volledige striatale dekking.
    6. Vul putten met PBS dat 0,05% natriumazide bevat.
      VOORZICHTIG: Natriumazide is giftig - behandel met PBM en voer afval op de juiste manier af.
    7. Plaats het eerste gedeelte in put A1, het tweede in A2, en ga achtereenvolgens verder. Wanneer de plaat vol is, ga je door in een nieuwe plaat of keer je terug naar put A1 en ga je door totdat het hele striatum is doorgesneden (~3 volle platen met 48 gaten). Sluit platen af met transparante folie en bewaar bij 4 °C tot gebruik.
      OPMERKING: Voor de analyse van het hele striatum levert het selecteren van één kolom van de plaat gelijkmatig verdeelde secties op die representatief zijn voor het gehele gebied.

5. Immunohistochemie met DAB-kleuring

  1. Was secties 3 keer in PBS om restanten van natriumazide te verwijderen. Incubeer in fenylhydrazineoplossing (0,2 - 0,3 mg/mL in PBS) gedurende 30 minuten bij 37 °C.
    VOORZICHTIG: fenylhydrazine is kankerverwekkend - voer deze stap uit in een dampkap en voer afval als gevaarlijk af.
  2. Was 3 keer in PBS gedurende 5 minuten, 10 minuten en 10 minuten achter elkaar. Blokkeer het weefsel 1 uur bij RT in PBS met 10% normaal geitenserum (NGS) en 0,1% Triton X-100.
  3. Incubeer een nacht bij 4 °C met primaire antistoffen in de aanbevolen verdunning (bijv. muis anti-ataxine-2, 1:1000 in blokkerende oplossing) onder zachte agitatie. Was 3 keer in PBS gedurende 5 minuten, 10 minuten en 10 minuten achter elkaar.
  4. Incubeer met biotinylerd secundair antilichaam (1:200 in blokkerende oplossing) gedurende 2 uur bij RT onder zachte agitatie. Was 3 keer in PBS gedurende 5 minuten, 10 minuten en 10 minuten achter elkaar.
  5. Incubeer in het ABC-complex van 30–40 minuten bij RT. Was 3x in PBS gedurende 5 minuten, 10 minuten en 10 minuten achter elkaar.
  6. Bereid DAB-oplossing vers voor: voor 2,5 mL ultrazuiver water, voeg 1 druppel buffer en vortex toe; voeg 2 druppels toe DAB en vortex; Voeg 1 druppel H₂O₂ toe en vortex opnieuw.
    VOORZICHTIG: DAB is kankerverwekkend – hanteer het in een dampkap en gooi afval correct weg.
  7. Ontwikkel secties in DAB-oplossing afzonderlijk totdat de gewenste kleurintensiteit is bereikt (meestal 1–10 minuten). Stop de reactie onmiddellijk door over te zetten naar PBS.
    OPMERKING: DAB-reactiviteit neemt af in de loop van de tijd; Werk efficiënt. Als er meer dan één sectie tegelijk in de put zit, zorg er dan voor dat ze niet in contact komen, want dat beïnvloedt het kleuringsproces.
  8. Was 3 keer in PBS gedurende 5 minuten, 10 minuten en 10 minuten achter elkaar. Bevestig secties op met gelatine gecoate glaasjes en laat ze volledig drogen. Label dia's niet met een grafietpotlood, omdat dit de beeldvorming kan verstoren.
  9. Dehydrateren, doormaken en dekker als volgt: 30 seconden onderdompelen in gedestilleerd water, droog via ethanolseries: 75%, 96%, 100% (3 minuten elk). Maak het 5 minuten schoon in xyleenvervanger en laat het aan de lucht drogen. Breng coverslip aan met een snelhardend montagemedium en laat het minstens 24 uur uitharden in de afzuigkap voordat je beeldvorming of opslag doet.

6. Kwantificering van DARPP-32-uitgeputte volume in het muisstriatum met behulp van FIJI (ImageJ)

  1. Beeldverwerving
    1. Maakt beelden van coronale hersensecties die het gehele striatum beslaan (ongeveer Bregma +1,0 tot –0,5 mm). Houd consistente verlichting, vergroting (bijv. 10x) en resolutie. Sla afbeeldingen op in TIFF-formaat met opeenvolgende bestandsnamen (bijvoorbeeld Striatum_Bregma_+0.5.tif).
  2. Beeldvoorbereiding in FIJI
    1. Open elke afbeelding in FIJI. Kalibreer de pixelgrootte: Ga naar Analyseren > Setschaal. Gebruik een bekende schaal van een micrometer of de beeldmetadata (bijv. 1 pixel = 1 μm).
    2. Afbeeldingen omzetten naar 8-bit: Afbeelding > Type > 8-bit. Pas helderheid/contrast aan indien nodig voor een optimale visualisatie van het uitgeputte gebied (vermijd drempelwaarden in deze stap).
  3. ROI-selectie van uitgeputte gebieden
    1. Gebruik het Polygon-, Vrijhand- of Penseelgereedschap om het door DARPP-32 uitgedroogde gebied af te tekenen (meestal lichtere of afwezige vlekken in het striatum). Ga naar Analyze > Measure om het gebied in μm2 vast te leggen.
    2. Sla de ROI op door naar ROI Manager te gaan > Voeg > Meer toe > Sla op of gebruik de Multi-measure-functie voor batchanalyse.
    3. Herhaal dit voor alle relevante hersensecties.
  4. Berekening van uitgeput volume
    1. Vermenigvuldig het uitgeputte oppervlak in elk deel met de afstand tussen de secties (meestal 120 – 240 μm, afhankelijk van de dikte en afstand tussen de sectie).
      Volume per sectie (mm3) = Uitgeputte ruimte (mm2) × Doorsnedeinterval (mm)
    2. Tel het volume op over alle secties:
      Totaal uitgeput volume (mm3) = Σ (oppervlakte × interval)
    3. Optioneel: Overlay voor visualisatie. Gebruik Image > Overlay > From ROI om de uitgeputte gebieden over secties te visualiseren. Exporteer een samenvattende afbeelding of animatie voor figuren.
  5. Controleer altijd de uitlijning met de muishersenatlas voor nauwkeurige rostro-caudale mapping. Analyseer elk halfrond afzonderlijk om unilaterale effecten te onderscheiden (bijv. WT versus mutant injectie).

7. Kwantificering van eiwitaggregaten in het muisstriatum

  1. Handmatige kwantificatie met FIJI
    1. Laad en kalibrer het beeld. Open de afbeelding in FIJI. Kalibreer de pixelgrootte (sla deze stap over als je afbeeldingen met metadata gebruikt).
    2. Ga naar Analyze > Set Scale, voer de bekende afstand in (bijv. 1 pixel = 0,5 μm). Ga in FIJI naar Plugins > Analyze > Cell Counter > Cell Counter. Klik op Initialiseren en selecteer vervolgens de afbeelding.
    3. Kies een markertype (bijvoorbeeld Type 1) voor aggregaten. Klik handmatig op elk zichtbaar aggregaat om het te labelen. Recordgegevens: FIJI toont de telling in het celtellerpaneel. Recordaantallen voor elke afbeelding/sectie. Exporteer tellingen handmatig of gebruik een macro om resultaten samen te stellen.
  2. Semi-geautomatiseerde kwantificatie met behulp van IHCAggreCount
    1. Upload en verwerk afbeeldingen. Open IHCAggreCount en klik op Afbeelding uploaden (Aanvullende Figuur 1).
      OPMERKING: De IHCAggreCount-applicatie is door ons laboratorium ontwikkeld als een zelfstandig wetenschappelijk hulpmiddel om de kwantificatie van celaggregaten uit microscopiebeelden te stroomlijnen en te standaardiseren. De software is volledig gebouwd in Python met een modulaire architectuur die beeldbehandeling, verwerking, selectiecorrecties, meetberekening en andere onderdelen scheidt. IHCAggreCount is volledig compatibel met Windows 10 en Windows 11, evenals macOS 13 Ventura en macOS 14 Sonoma, en is succesvol getest op beide platforms. In vergelijking met conventionele handmatige beeldinspectiemethoden biedt de software aanzienlijke analytische voordeel: het vermindert de subjectiviteit van de gebruiker, elimineert repetitieve handmatige stappen, versnelt beeldverwerking, zorgt voor reproduceerbare metingen, maakt consistente extractie van interessegebieden mogelijk en maakt batchverwerking van meerdere omgevingen mogelijk. Over het algemeen biedt de applicatie een snellere, objectievere en robuustere workflow voor globuledetectie en kwantificatie dan de traditionele handmatige aanpak. De aanvraag is op redelijk verzoek beschikbaar bij de auteurs.
    2. De afbeelding verschijnt in het Originele Afbeeldingsdisplay. Ga naar het tabblad Verwerking. Pas HiLo toe om aggregaten/achtergrondcontrast te verbeteren (zie Aanvullende Figuur 2). Pas een helderheidsdrempel toe om aggregaten van de achtergrond te filteren (Aanvullende Figuur 3). Gebruik het Min Size Filter om kleine deeltjes (ruis) te verwijderen (Aanvullende Figuur 4). Passen optioneel de rondheidsdrempel toe om niet-aggregate vormen uit te sluiten (Aanvullende Figuur 5).
    3. Voor IHC-aggregaatdetectie ga naar het tabblad Algemeen en klik op Totale aggregaten berekenen en Geaggregeerd gebied berekenen. Alle gedetecteerde aggregaten worden gemarkeerd en weergegeven in de Matrixtabel (ID, oppervlakte, gemiddelde grootte; Aanvullende figuur 6).
  3. Handmatige correcties (optioneel)
    1. Ga naar het correctietabblad, gebruik Smart Add om aggregaten in geselecteerde regio's automatisch te detecteren (Aanvullende Figuur 8). Gebruik handmatig toevoegen om aggregaten handmatig te labelen. Gebruik Smart Delete om ongewenste labels te verwijderen. (Gemarkeerde aggregaten worden getoond voor visuele inspectie; Aanvullende Figuur 7).
  4. Resultaten exporteren
    1. Klik op CSV exporteren om de huidige afbeeldingsgegevens te exporteren. Klik op Alles exporteren om gegevens uit meerdere geanalyseerde afbeeldingen te batch-exporteren. Analyseer altijd beelden onder dezelfde helderheid/contrastinstellingen en andere parameters (bijv. drempel) over experimentele groepen in IHCAggreCount.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Deze studie identificeerde met succes de expressie van ataxine-2 en DARPP-32 met behulp van het huidige protocol. Na stereotaxische injectie van lentivirale vectoren in het striatum van C57BL/6J-muizen werd na 12 weken robuuste expressie van zowel wildtype als mutant ataxine-2 vastgesteld. We toonden eerder12 aan dat deze constructen specifiek zijn voor neuronen, waardoor gemiddeld 20.000 neuronen per millimeter3 worden getransduceerd. Onder on...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Dit artikel beschrijft de generatie van een striataal lentiviraal muismodel voor een polyQ SCA. Het beschrijft ook de productie van hoog-titer lentivirale vectoren die coderen voor het wildtype en de uitgebreide vorm van het oorzakelijke eiwit, en de bilaterale injectie van de LV's in het muisstriatum door middel van stereotaxische chirurgie. Daarnaast beschrijft het het proces van hersenverzameling, de histologische verwerking en de beeldgebaseerde kwantificering van ziektekenm...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen concurrerende belangen.

Dankbetuigingen

Het laboratorium van Clévio Nóbrega wordt gefinancierd door het Cure CSB-project, door de Viljem Julijan Vereniging voor Kinderen met Zeldzame Ziekten (Slovenië) en door het Algarve Biomedisch Centrum Onderzoeksinstituut (ABC-Ri). Sommige auteurs van dit artikel hebben een PhD-beurs gefinancierd door Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT), met de volgende referenties: Tiago Moreira-Gomes (2022.11008.BD), Inês T Afonso (2022.10161.BD) en Rafael G Costa (2022). 11973.BD).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.9% NaClLokaal leverancier—Wordt gebruikt voor de bereiding van anesthesie en antagonistmengsels
100 mm weefselkweekschalenSPL Life Sciences11090
ABC-kit (Avidine-Biotine Complex)VECTASTAIN Elite
Atipamezole (5,0 mg/ml)Lokaal leverancier—Antagonist van medetomidine
Centrifuge op tafel--
Bioveiligheidskast, Klasse II (BSL-2 compliant)--
Biotinyleerde secundaire antilichamen--
Rundserumalbumine (BSA)NZYTechMB47002
Hersensecties (bijv. 30–40 µm coronale secties) geïmmunokleurgekleurd voor DARPP-32--
Cell Counter plugin (FIJI)Built-in / ImageJ—Hulpmiddel voor handmatige aggregaattelling
CO2-incubator (37 °C, 5% CO2, bevochtigd)--
ComputerwerkstationLokaal leverancier—Wordt gebruikt voor beeldverwerking en software-uitvoering
Conische ultracentrifugebuizenBeckman Coulter358126
WattenstaafjesLokaal leverancier—Wordt gebruikt voor periostverwijdering
Cryostat met specimendiskhouder--
DAB (Diaminobenzidine)--
Digitaal stereotaxisch coördinatenlezerStoelting/WPI51725Digitaal display voor coördinatenmeting
Dulbecco’s Gemodificeerd Arendsmiddel (DMEM, hoge glucose)Gibco/Thermo Fisher11-965-092
Ethanol 70, 96 en 100%--
Ethanol, 70%Lokaal leverancier—Voor ontsmetting van de hoofdhuid
Fentanyl (0,05 mg/ml)Lokaal leverancier—Anesthetisch bestanddeel
Fetaal runder serum (FBS), hitte-geïnactiveerdGibco/Thermo Fisher10500064
FIJI (ImageJ distributie)NIH / ImageJhttps://fiji.sc/Open-source software voor handmatige kwantificering van aggregaten
Fijne pincetten (voor teenprik)Lokaal leverancier—Voor monitoring van anesthesiediepte
Flumazenil (0,1 mg/ml)Lokaal leverancier—Antagonist van midazolam
Pincet en scalpelLokaal leverancier—Voor periostverwijdering en blootstelling van de schedel
Hamilton 700/1700 Serie Microliter/Gastight SpritzenHamilton / Fisher Sci.7653-01/10550203Voor het laden van virale oplossing
Hamilton Small Hub Verwijderbare Naalden (26G)Hamilton / Fisher Sci.7804-03/ 10698205Voor virale levering
Verwarmingspad (voor knaagdieren)Kent Scientific / SOMNIbijv. 04-777-177Voor het handhaven van de lichaamstemperatuur
HEK 293T-cellen (≤ passage 10, mycoplasma-vrij)ATCC of gelijkwaardigCRL-3216
Waterstofperoxide--
IHCAggreCount softwareWordt geleverd op aanvraagN/APropriëtaire in-house software voor semi-automatische detectie en kwantificering van aggregaten
Omgekeerde microscoop (voor celconfluency)--
Laboratoriumvortexmixer--
Lentivirale vectoren (WT en mutant)In-house / KernfaciliteitN/AVirale oplossing voor injectie
L-glutamine (200 mM)Gibco/Thermo Fisher25030081
Lichtmicroscoop met camera (brightfield)--
Medetomidine (1,0 mg/ml)Lokaal leverancier—Anesthetisch bestanddeel
Micro-boor (stereotaxisch compatibel)Stoelting / Lokale leverancier—Voor craniotomie
Microinjectiepomp (bijv. Stoelting)Stoelting/WPI53210Automatische infuuspomp voor virale injecties
Micropipet (P1000, P200, P10) en tips--
Microscoopbeelden (IHC-secties)In-house gegenereerdN/AImmunohistochemische beelden om te worden geanalyseerd
Microtoommessen (laag profiel, wegwerpbaar)--
Midazolam (5,0 mg/ml)Lokaal leverancier—Anesthetisch bestanddeel
Montagemedium--
Naloxon (0,4 mg/ml)Lokaal leverancier—Antagonist van fentanyl
Naaldhouder en fijne dissectienaalden--
Normaal geitenserum (NGS)--
O.C.T. compoundTissue-Tek
Oogzalf (Bepanthen Eye and Nose Ointment, 5% Dexpanthenol)Bayer11568-0053Voorkomt droogheid van het hoornvlies tijdens de chirurgie
Orbitaalmixer--
p24 ELISA-kitZeptoMetrix0801111
Parafilm--
Paraformaldehyde (PFA)--
PBS--
PBS zonder Ca2+/Mg2+, pH 7,0Gibco/Thermo Fisher10-010-031
pCMV-dR8.2AddgenePlasmid #12263
Penicilline-Streptomycine (100×)Gibco/

Referenties

  1. Afonso-Reis, R., Afonso, I. T., Nóbrega, C. Current Status of Gene Therapy Research in Polyglutamine Spinocerebellar Ataxias. Int J Mol Sci. 22 (8), 4249(2021).
  2. Durr, A. Autosomal dominant cerebellar ataxias: polyglutamine expansions and beyond. Lancet Neurol. 9 (9), 885-894 (2010).
  3. McIntosh, C. S., Li, D., Wilton, S. D., Aung-Htut, M. T. Polyglutamine Ataxias: Our Current Molecular Understanding and What the Future Holds for Antisense Therapies. Biomedicines. 9 (11), 1499(2021).
  4. Henriques, C., et al. Viral-based animal models in polyglutamine disorders. Brain. 147 (4), 1166-1189 (2024).
  5. Doyle, A., McGarry, M. P., Lee, N. A., Lee, J. J. The Construction of Transgenic and Gene Knockout/Knockin Mouse Models of Human Disease. Transg Res. 21 (2), 327-349 (2012).
  6. Tello, J. A., Williams, H. E., Eppler, R. M., Steinhilb, M. L., Khanna, M. Animal Models of Neurodegenerative Disease: Recent Advances in Fly Highlight Innovative Approaches to Drug Discovery. Front Mol Neurosci. 15, 883358(2022).
  7. Moreira-Gomes, T., Nóbrega, C. Development of a gene therapy with lentiviral vectors for spinocerebellar ataxias. Methods Mol Biol. 2974, 215-225 (2026).
  8. Parr-Brownlie, L. C., et al. Lentiviral vectors as tools to understand central nervous system biology in mammalian model organisms. Front Mol Neurosci. 8, 14(2015).
  9. Zwi-Dantsis, L., Mohamed, S., Massaro, G., Moeendarbary, E. Adeno-Associated Virus Vectors: Principles, Practices, and Prospects in Gene Therapy. Viruses. 17 (2), 239(2025).
  10. Moreira-Gomes, T., Nóbrega, C. From the disruption of RNA metabolism to the targeting of RNA-binding proteins: The case of polyglutamine spinocerebellar ataxias. J Neurochem. 168 (8), 1442-1459 (2024).
  11. Matsuzaki, Y., Oue, M., Hirai, H. Generation of a neurodegenerative disease mouse model using lentiviral vectors carrying an enhanced synapsin I promoter. J Neurosci Meth. 223, 133-143 (2014).
  12. Marcelo, A., et al. Autophagy in Spinocerebellar ataxia type 2, a dysregulated pathway, and a target for therapy. Cell Death Dis. 12 (12), 1117(2021).
  13. Alves, S., et al. Striatal and nigral pathology in a lentiviral rat model of Machado-Joseph disease. Human Mol Genet. 17 (14), 2071-2083 (2008).
  14. Alves, S., et al. Lentiviral vector-mediated overexpression of mutant ataxin-7 recapitulates SCA7 pathology and promotes accumulation of the FUS/TLS and MBNL1 RNA-binding proteins. Mol Neurodegenerat. 11 (1), 58(2016).
  15. Geraerts, M., Willems, S., Baekelandt, V., Debyser, Z., Gijsbers, R. Comparison of lentiviral vector titration methods. BMC Biotechnol. 6 (1), 34(2006).
  16. Arrasate, A., et al. Establishment and Characterization of a Stable Producer Cell Line Generation Platform for the Manufacturing of Clinical-Grade Lentiviral Vectors. Biomedicines. 12 (10), 2265(2024).
  17. Nóbrega, C., et al. Overexpression of Mutant Ataxin-3 in Mouse Cerebellum Induces Ataxia and Cerebellar Neuropathology. Cerebellum. 12 (4), 441-455 (2013).
  18. Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , Compact Second Edition, Gulf Professional Publishing. (2004).
  19. Bateup, H. S., et al. Distinct subclasses of medium spiny neurons differentially regulate striatal motor behaviors. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (33), 14845-14850 (2010).
  20. Nóbrega, C., et al. Molecular hallmarks of neurodegeneration in polyglutamine spinocerebellar ataxias. Cell Death Dis. 16 (1), 826(2025).
  21. Murakami, Y., et al. AAV-based gene therapy ameliorated CNS-specific GPI defect in mouse models. Mol Ther Meth Clin Dev. 32 (1), 101176(2024).
  22. Wada, H., et al. AAV-based gene therapy ameliorates neurological deficits in a mouse model of childhood-onset neurodegeneration with cerebellar atrophy. Mol Ther J Am Soc Gene Ther. 33 (11), 5829-5839 (2025).
  23. Konno, A., Shinohara, Y., Hirai, H. Production of Spinocerebellar Ataxia Type 3 Model Mice by Intravenous Injection of AAV-PHP.B Vectors. Int J Mol Sci. 25 (13), 7205(2024).
  24. Jansen-West, K., et al. Plasma PolyQ-ATXN3 Levels Associate With Cerebellar Degeneration and Behavioral Abnormalities in a New AAV-Based SCA3 Mouse Model. Front Cell Dev Biol. 10, 863089(2022).
  25. Nóbrega, C., Mendonça, L., Matos, C. A. A Handbook of Gene and Cell Therapy. , Springer International Publishing. Cham. (2020).
  26. Thomas, C. E., Ehrhardt, A., Kay, M. A. Progress and problems with the use of viral vectors for gene therapy. Nat Rev Genet. 4 (5), 346-358 (2003).
  27. Schambach, A., Zychlinski, D., Ehrnstroem, B., Baum, C. Biosafety Features of Lentiviral Vectors. Human Gene Ther. 24 (2), 132-142 (2013).
  28. de Almeida, L. P., Ross, C. A., Zala, D., Aebischer, P., Déglon, N. Lentiviral-Mediated Delivery of Mutant Huntingtin in the Striatum of Rats Induces a Selective Neuropathology Modulated by Polyglutamine Repeat Size, Huntingtin Expression Levels, and Protein Length. J Neurosci. 22 (9), 3473-3483 (2002).
  29. Fisher, E. M. C., Bannerman, D. M. Mouse models of neurodegeneration: Know your question, know your mouse. Sci Transl Med. 11 (493), eaaq1818(2019).
  30. Bii, V. M., Collins, C. P., Hocum, J. D., Trobridge, G. D. Replication-incompetent gammaretroviral and lentiviral vector-based insertional mutagenesis screens identify prostate cancer progression genes. Oncotarget. 9 (21), 15451-15463 (2018).
  31. Alves-Cruzeiro, J. M. D. C., Mendonça, L., Pereira de Almeida, L., Nóbrega, C. Motor Dysfunctions and Neuropathology in Mouse Models of Spinocerebellar Ataxia Type 2: A Comprehensive Review. Front Neurosci. 10, 572(2016).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Polyglutamine ataxie nLentiviraal modelStereotaxische injectieAtaxine 2 expressieNeuronale inclusiesMechanismen van neurodegeneratieTherapeutische interventiesVerlies van neuronale markersRegiospecifieke modellen
Lentiviraal-geïnduceerde striatale pathologie als preklinisch model van polyglutamine spinocerebellaire ataxie
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.