Method Article

Thrombus Profiling Assay: Een op microfludiica gebaseerd platform voor het volledig karakteriseren van biomechanische trombogenese

DOI:

10.3791/69555

⸱

January 9th, 2026

 ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology and Department of Pathology, University of Texas Medical Branch

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk beschrijft een microfluissue-assay die schuifspanning gebruikt om de vorming van tromben in het bloed te triggeren en karakteriseert de trombus aan de hand van meerdere dimensies van uitlezen. De test kan de protrombische neiging van bloedmonsters meten en is daardoor nuttig voor ziektediagnose, geneesmiddelenontdekking, evenals basismechanistische studies gerelateerd aan trombose.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Trombose is een pathologische aandoening die de abnormale ophoping van bloedplaatjes en stollingsfactoren in een bloedvat beschrijft. Hoewel veel onderzoeken zich richtten op de activatie van bloedplaatjes door oplosbare agonisten als onderliggend mechanisme van trombose, is vaak over het hoofd gezien dat de bloedstroom ook de vorming van trombus bevordert. Vooral in de slagaders wordt trombose meestal geassocieerd met arteriële stenose, die de schuifspanning in de bloedstroom verhoogt en het proces van trombogenese bevordert, een fenomeen dat biomechanische trombogenese wordt genoemd. Lange tijd was er geen bioassay beschikbaar om alomvattende en gedetailleerde inzichten te bieden in het proces van biomechanische trombogenese. Om dit aan te pakken werd een trombusprofieltest ontwikkeld door microfluidica te combineren met meerkleurige fluorescentiebeeldvorming, wat een uitgebreide karakterisering van biomechanische trombogenese mogelijk maakt met zeven metingen die de grootte en samenstelling van de trombus en het activatieniveau van de bloedplaatjes behandelen. Deze trombusprofieltest kan worden gebruikt om de protrombotische neiging bij mensen en de effectiviteit van anti-trombotische middelen te evalueren, en is ook nuttig om de mechanismen achter arteriële trombose beter te begrijpen.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Trombose is een hoofdoorzaak van hart- en vaatziekten en veroorzaakt jaarlijks miljoenen sterfgevallen wereldwijd1. Momenteel is er geen bioassay beschikbaar in standaard klinische omgevingen om het risico op trombose te evalueren. Onder de gecommercialiseerde laboratorium- en point-of-care hematologische functie-assays zijn conventionele stollingsassays en aggregometrie onbetrouwbaar gebleken in het voorspellen van trombose of grote nadelige cardiovasculaire gebeurtenissen 2,3,4. Globale trombosetest....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol volgt de richtlijnen van en is goedgekeurd door de Human Research Ethics Committee van de University of Texas Medical Branch. De experimentele hardware-opstelling bestaat uit een microfluidisch apparaat, perfusiecomponenten (connectoren, slangen, spuit en spuitpomp) en een omgekeerde microscoop met optische componenten die helderveld- en meerkleurige fluorescentiebeeldvorming mogelijk maken. Een multi-LED vuurtoren en een multi-pass filterkubus worden in de microscoop gebruikt om 4 fluorescerende kanalen te splitsen met minimale wederzijdse doorloop: excitatie: 391/32, 479/33, 554/24, 638/31, en emissie: 435/30, 519/25, 5....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De trombusprofileringsassay perfuseert bloed via een stenotisch kanaal om door schuif aangedreven trombusvorming mogelijk te maken, en voert realtime meerkleurige fluorescentiebeeldvorming uit om multidimensionale informatie over de gevormde trombus te verzamelen. Door experimenten uit te voeren met zowel Set 1- als Set 2-sensoren, zou men de trombus moeten kunnen karakteriseren in aspecten zoals grootte, verrijking van crosslinking-eiwitten (von Willebrand-factor, fibrinogen), evenals h.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Door de microfluidische stenosetest te combineren met meerkleurige fluorescentiebeeldvorming, biedt de trombusprofieltest een handige en krachtige methode om biomechanische trombogenese en plaatjesmechanobiologie te bestuderen. Ondertussen is de assay nuttig in een breed scala aan toepassingen. Zo kan het bijvoorbeeld worden gebruikt om anti-trombotische middelen te screenen die specifiek de biomechanische plaatjesaggregatie remmen, waarbij het moleculaire doelwit en werkingsmechanisme k.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflicten om te melden.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Onderzoek gerelateerd aan dit artikel en de ontwikkeling van de trombusprofieltest in het Chen-laboratorium werden ondersteund door een subsidie van het National Heart, Lung, and Blood Institute R00HL153678 (Y.C.), National Institute on Aging, de Claude D. Pepper Older Americans Independence Center Award #P30-AG024832 (Y.C.), UTMB Team Science Pilot Research Award (Y.C.), American Heart Association Postdoctoral Fellowship 20POST35080023 (Y.C.), en American Heart Association Transformational Project Award 25TPA1471420 (Y.C.). Dit werk werd deels uitgevoerd bij de San Diego Nanotechnology Infrastructure (SDNI) van UCSD, een lid van de ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10-mL SyringesHenke Sass Wolf5100-X00V0Blood sample collection
15-mL falcon tubesGenesee Scientific28-101Blood sample storage
1-mL gastight glass syringeHamilton81331Hardware assembly
2.2.9MERU VasImmuneThrombus staining
20 X1/2 Probe NeedlesMcMaster-CarrM919Making PDMS devices
20-mL SyringesHenke Sass Wolf5200-X00V0Blood sample collection
70% ethanolSigma-AldrichEX0281-1Disinfection of gastight syringes and cleaning of glass slides
AK4-Alexa Fluor 647BioLegend304918Thrombus staining
Alexa Fluor 405 NHS EsterInvitrogenA30000Fibrinogen labeling
Alexa fluor 555 antibody labeling kitInvitrogenA88065MBC 370.2 and 2.2.9 labeling
Annexin V-Pacific BlueInvitrogen501121505Thrombus staining
Cleaning DusterOffice Depot911245Making PDMS devices
Craft Hobby Knife Set with Wooden BoxExcel Blades44282Making PDMS devices
Deionized water ThermoFisher Scientific 751-628Washing of gastight syringes
DesiccatorBel ArtF420270000Degasing PDMS
Disposable Multipurpose Laboratory SpatulaLevGo17211Mixing the silicone elastomer base and curing agent 
Dye and Biotin Removal Spin ColumnZebaA44296SFibrinogen labeling
FibrinogenInnovative ResearchIHUFBG25MGThrombus staining
Fusion 200-X syringe pumpChemyx Inc.0720XHardware assembly
Heparin Sigma-AldrichH3149Blood sample anticoagulation
High Frequency GeneratorElectro-technic product Inc.BD-20Making PDMS devices
Human VWF monomerSino Biological Inc.10973-H08CMicrofuidic device coating
Image J v1.53 softwareFiji, National Institute of HealthData analysis
Inverted microscopeLeicaDM IL LED; filter cube: Leica DFT51010; lighthouse: LED5Hardware assembly
KimwipesKimberly- Clark Professional34120Cleaning of glass slides
Luer lock capsInternational Medical Industries, Inc.57100BBlood sample collection
MBC 370.2KerafastEBW104Thrombus staining
Microscope cover glassesPaul Marienfeld GmbH & Co. KGES0107222Making PDMS devices
Mini-Razor Blade ScraperStanley28-100Making PDMS devices
NanoDrop 2000 UV-Vis SpectrophotometerThermo ScientificND-2000Protein concentration and F/P ratio measurement
OvenLab-Line Instruments3512Making PDMS devices
PAC-1-Alexa Fluor 647BioLegend362806Thrombus staining
Plastic cupThermoFisher Scientific S04589Mixing the silicone elastomer base and curing agent 
SU-8 photoresist master  moldUC San Diego Nano3 Nanofabrication Cleanroom FacilityMaking PDMS devices
Sylgard 184 Silicone Elastomer KitKrayden DowDC4019862PDMS
SZ22-FITC Beckman CoulterIM 1756UThrombus staining
TubingCole -Palmer Instrument Co.06422-01Hardware assembly

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lindstrom, M., et al. Global burden of cardiovascular diseases and risks collaboration, 1990-2021. J Am Coll Cardiol. 80 (25), 2372-2425 (2022).
  2. Lim, H. Y., O'malley, C., Donnan, G., Nandurkar, H., Ho, P. A review of global coagulation assays ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Thrombus ProfilingBiomechanical ThrombogenesisMicrofluidic DevicesPlatelet ActivationFluorescence ImagingArterial ThrombosisVon Willebrand FactorProthrombotic TendencySyringe PumpImageJ Analysis

Related Articles