Methodenartikel

Analyse van vitamine A stabiele isotooptracers met behulp van LC-MS/MS

684 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/69558

⸱

30 december 2025

 ,  ,  , 
1Human Nutrition and Exercise Research Centre, Newcastle University, 2Newcastle University Centre for Cancer, 3Fera Science Ltd

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol om zowel isotopisch gelabelde als native retinoïden in menselijk plasma gelijktijdig te kwantificeren, met behulp van LC-MS/MS, met detectielimieten van 6 fmol on-kolom. De methode omvat een eenvoudige procedure voor monsterextractie en een korte analytische looptijd, wat een hoge doorvoer van monsters mogelijk maakt.

Samenvatting

De retinolisotoopverdunningsmethode (RID) schat de totale lichaamsvoorraden (TBS) van vitamine A bij mensen door stabiele isotoopverdunning met de vitamine A-pool van het lichaam. Hiervoor is het cruciaal om nauwkeurig en efficiënt de plasma-isotopenverhouding van gelabeld tot niet-gelabeld retinol te bepalen via massaspectrometrie. Om uitgebreide en tijdrovende extractie- en/of zuiveringsprocedures, zoals preparatieve HPLC en derivatisatie, te vermijden, wordt LC-MS/MS ingezet voor snelle, gevoelige en gelijktijdige analyse van gelabelde en niet-gelabelde retinoïden. De methode maakt gebruik van twee detectieniveaus: (i) een initiële massa/lading (m/z) scheiding van ouder- (voorloper-)ionen, gevolgd door (ii) detectie van gefragmenteerde dochter-(product-)ionen. Dit resulteert in een hoge gevoeligheid, met retinoldetectielimieten zo laag als 6 fmol on-column. Ondanks de voordelen van tandem massaspectrometrie is een vloeistofchromatografische scheiding nodig om retinol van retinylesters te scheiden, aangezien de terminale functionele groepen verloren gaan tijdens ionisatie, wat resulteert in vergelijkbare fragmentatiepatronen van ouder (m/z van 269) en dochterionenfragmentatie. Het artikel beschrijft de isolatie van endogene en gelabelde (13C of 2H) retinol uit plasma door oplosmiddelextractie, gevolgd door kwantificering door LC-MS/MS onder atmosferische druk chemische ionisatie (APCI) in positieve ionenmodus.

Inleiding

Vitamine A is een vetoplosbare voedingsstof die essentieel is voor de menselijke gezondheid1. Vitamine A-tekort verhoogt de vatbaarheid voor ernstige infectieuze morbiditeit en mortaliteit en wordt geschat op een wereldwijde prevalentie van 29%, met hogere niveaus in Sub-Sahara Afrika (48%) en Zuid-Azië (44%)2. Vitamine A-suppletie is een effectieve strategie om de overmatige kindersterfte te verminderen, vooral in risicovolle gebieden zoals Sub-SaharaAfrika. De introductie van halfjaarlijkse vitamine A-supplementen, samen met grootschalige vitamine A-verrijking van basisvoedingsmiddelen en distributie van micronutriëntenpoeder, die vaak via verschillende publieke en private instanties worden beheerd, heeft echter het potentieel om mensen bloot te stellen aan een overmatige vitamine A-inname 4,5,6,7,8,9,10 . Daarom zouden biomarkers van vitamine A idealiter het hele spectrum van vitamine A-status moeten kunnen omvatten, van tekort tot toxiciteit. De retinolisotoopverdunningsmethode (RID) is momenteel de meest nauwkeurige indirecte methode om de totale vitamine A-voorraad bij mensen te beoordelen 11,12,13 en is gevalideerd tegen levervitamine A-concentraties, wat wordt beschouwd als de beste biochemische marker voor vitamine A-status 14,15. De methode is gebaseerd op het principe dat een orale tracer-dosis van stabiele, isotoopgelabelde vitamine A zich mengt met niet-gelabelde vitamine A (de trace) in uitwisselbare lichaamspools. De meting van plasma-retinolspecifieke activiteit (d.w.z. de verhouding van gelabelde retinoltracer tot totale retinol in plasma (tracer/tracee in plasma)) op een gespecificeerd moment na dosering maakt het mogelijk de vitamine A-status te schatten met behulp van een RID-vergelijking 11,12,13.

Om nauwkeurige en precieze concentraties van zowel retinoltracer als trace in plasma te bepalen, zijn verschillende methoden toegepast om stabiele isotoop-gelabelde vitamine A te kwantificeren, waaronder gaschromatografie-massaspectrometrie (GC-MS), isotoopverhoudingsmassaspectrometrie (IRMS) en vloeistofchromatografie tandem massaspectrometrie (LC-MS/MS)16,17,18,19,20,21,22, 23,24,25,26. Belangrijk is dat LC-MS/MS hoge gevoeligheid, specificiteit en operationele eenvoud combineert met de mogelijkheid om zowel native als gelabelde retinol direct te meten in complexe matrices. Om tijdrovende monstervoorbereiding te voorkomen, zoals preparatieve high-performance vloeistofchromatografie (HPLC) voor IRMS of derivatisatie voor GC-MS, is LC-MS/MS-analyse een ideale keuze omdat deze methode een eenvoudige extractieprocedure vereist, zeer lage detectielimieten voor stabiele isotopen en korte looptijdenvan 7,18,19. Hier presenteren we een bijgewerkte LC-MS/MS-methode met kortere uitvoeringstijd, eenvoudige workflows gecombineerd met hoge gevoeligheid en selectiviteit als een zeer geschikte methode voor high-throughput analyse van monsters uit grootschalige menselijke interventie en observationele studies, waarbij de bepaling van de totale lichaamsvoorraden van vitamine A vereist is.

Protocol

De studie werd goedgekeurd door de Research Ethics Board van de University of the Philippines, Manilla (IRB ID: UPMREB 2016-282-01), de Institutional Review Board van UC, Davis (IRB ID: 903681-2), en was geregistreerd bij ClinicalTrials.gov (ID: NCT03030339). De studie werd goedgekeurd door de Ethical Review Committee van de Ghana Health Services (GHS-ERC 07/012/20), en de proef werd geregistreerd op https://clinicaltrials.gov als NCT04632771.

1. Voorbereiding van interne normen

  1. Interne standaardvoorraadoplossing: Bereid de interne voorraadoplossing voor bij een concentratie van 1 mg/mL retinylacetaat in ethanol met 0,1% butylgehouden hydroxytolueen (BHT; w/v). Verdeel de voorraadoplossingen in aliquoten en bewaar ze tot 3 maanden bij -80 °C.
    OPMERKING: Voor de interne standaard is het mogelijk om niet-gelabelde retinylacetatie of gelabelde retinylacetaat te gebruiken. Als een niet-gelabelde retinylacetaatstandaard wordt gebruikt, is het van vitaal belang dat de basisresolutie van de retinylacetaat- en retinolpieken wordt verkregen (zie Figuur 1).
  2. Interne standaardwerkoplossing: Bereid een interne standaardwerkoplossing voor door de standaardstandaard (1 mg/mL) te verdunnen tot 1 μg/mL. Verdunn eerst 60 μL van de standaardstandaard met 300 μL ethanol, gevolgd door 60 μL van deze oplossing te verdunnen in 10.000 μL ethanol. Voor elk monster wordt 20 μL van de werkende interne standaardoplossing toegevoegd, met 20 ng retinylacetaat.
    OPMERKING: Interne standaardwerkoplossingen kunnen tot 1 week worden opgeslagen bij -20 °C.

2. Voorbereiding van kalibratiestandaarden

  1. Kalibratiestandaard: Bereid de kalibratiestandaardoplossingen voor met een concentratie van 1 mg/mL retinol in ethanol met 0,1% BHT (w/v) voor zowel de tracee als de tracer. Aliquot heeft oplossingen op voorraad en bewaar tot 3 maanden bij -80 °C. Gebruik elke aliquot maar één keer om vries-dooi-cycli te vermijden.
  2. Werkoplossing voor kalibratiestandaard: Haal 100 μL van de standaardoplossing van de kalibratie en verdun met 10.000 μL ethanol in een volumetrische kolf. Bepaal de concentratie van de verdunde kalibratievoorraadoplossing bij 325 nm in een spectrofotometer met behulp van een kwartscuvette (zie Tabel 1 voor details).
  3. Neem een aliquot van de verdunde kalibratiestandaard en stel de concentratie aan op 8 μM voor de tracee en naar 2 μM voor de tracer met 50% ethanol en 50% acetonitril/dH2O (70:30 (v/v)).
  4. Bereid dubbele kalibratiestandaarden voor bij zeven verschillende concentraties met 50% ethanol en 50% acetonitril/dH2O (70:30 (v/v). Als 200 μL plasma wordt geëxtraheerd, moeten de tracee-kalibratiestandaarden variëren van 6 μM tot 0,03 μM, en de tracerkalibratiestandaarden van 0,5 μM tot 0,004 μM.
    OPMERKING: Voor nauwkeurige kwantificatie worden isotopisch gelabelde retinol- en retinylesters in plasma gekwantificeerd met behulp van gedupliceerde 7-punts kalibratiecurves27. Het hoogste punt op de kalibratiecurve (het dubbele van de hoogste verwachte concentratie van de tracee en tracer in plasma) beschouwt de concentratiefactor van het gereconstitueerde extract uit het oorspronkelijke plasmavolume.

3. Extractie van retinoïden uit plasma

  1. Verwijder plasmamonsters uit de vriezer van -80 °C en ontdooi ze bij kamertemperatuur (ongeveer 30 minuten).
  2. Eenmaal ontdooid, laat je elk monster vortexen en laat je het een paar seconden ronddraaien om te zorgen dat er geen plasma meer in het deksel zit. Daarna leg je monsters op ijs.
  3. Zet een gekoelde centrifuge aan en laat deze afkoelen tot 4 °C. Label 15 mL glazen buizen met schroefdoppen (onderwerp-ID en tijdstip) en pipetteer 200 μL gedeïoniseerd water (dH2O) in elke monsterbuis.
  4. Vanuit de interne standaardwerkoplossing pipette je 20 μL van het interne standaardmengsel in de glazen buis.
  5. Met een pipet doseert u 200 μL plasma in de betreffende buis met de interne standaard en dH2O.
  6. Pipette 400 μL ethanol in elk monsterbuisje en draai de buis om de ethanol met het plasma te mengen. Draai niet in vortex om te voorkomen dat eiwitresten aan de glazen wand blijven plakken.
  7. Voor de eerste hexaanextractie voeg je 2 ml hexaan toe aan elke buis en sluit je de buisdeksels stevig vast.
  8. Plaats de buizen in een orbitale shaker en schud 30 minuten op 15.000 toeren. Breng buizen over naar een gekoelde centrifuge en draai ze op 1.800 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
  9. Met behulp van glazen Pasteur-pipetten overbreng je het supernatant naar een schone set gelabelde glazen reageerbuizen. Let erop dat je geen eiwit, neerslag of water overdraagt.
  10. Maak een tweede hexaanextractie door nog eens 2 ml hexaan toe te voegen aan het resterende residu, sluit de buisdeksels stevig vast, plaats de buizen in de orbitale shaker en schud ze 15.000 rpm op 15.000 rpm gedurende 15 minuten.
  11. Breng buizen over naar een gekoelde centrifuge en draai ze op 1.800 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Met behulp van glazen Pasteur-pipetten wordt het supernatant respectievelijk overgebracht naar het glazen reageerbuisje met het supernatant van de eerste hexaanextractie (stap 3.9) per monster.
  12. Verdamp het gecombineerde hexaanextractie-oplosmiddel (eerste en tweede extractie-supernatant voor elk monster) onder een zachte stroom N2 in een verduisterde dampkap gedurende ongeveer 30 minuten. Zet het verwarmingsblok op 35 °C.
  13. Suspendeer het gedroogde residu opnieuw in 50 μL ethanol, vortex kort, voeg 50 μL mobiele fase toe (70:30 acetonitril/dH2O (v/v)) en vortex opnieuw.
    OPMERKING: Re-suspension van het gedroogde residu moet alleen worden uitgevoerd met 100 μL ethanol als het doel is om retinylesters te kwantificeren.
  14. Overbrengen in gelabelde 0,5 mL microcentrifugebuizen. Centrifugeer op 16.900 x g gedurende 5 minuten.
  15. Breng 80 μL van het gereconstitueerde residu over naar amberkleurige HPLC-flesjes met 300 μL inserts. Sluit het flesje onmiddellijk af om verlies van oplosmiddel door verdamping te voorkomen.
  16. Breng glazen flesjes over in een cryobox, label ze met de naam van het onderzoek, de extractiedatum en de monster-ID's, en bewaar ze in een vriezer van -80 °C tot analyse.
    OPMERKING: Analyse van opgeslagen monsters moet binnen 3-5 dagen worden afgerond. Een plasmavolume van 200 μL is normaal gesproken voldoende om de gelabelde vitamine A-tracer tot 90 dagen na de dosering te detecteren. Het plasmavolume kan echter worden aangepast tot 400 μL als de verhoudingen plasma/water/ethanol op 1:1:2 qua volume worden gehandhaafd.

4. Voorbereiding van interne standaard controlemonsters

  1. Bereid de ethanol/mobiele faseoplossing voor door 120 μL ethanol in een microcentrifugebuis te pipetten en 200 μL (70:30) acetonitril/dH2O (v/v) toe te voegen en vortexen te vormen.
  2. In drie afzonderlijke 0,6 mL buizen wordt 20 μL van de interne standaard werkoplossing gepipet.
  3. Voeg 80 μL van de ethanol/mobiele faseoplossing toe die wordt voorbereid en vortex. Breng de drie interne standaard controlemonsters over in amberkleurige HPLC-flesjes met 300 μL inserts en sluit de flesjes onmiddellijk af om verlies van oplosmiddel door verdamping te voorkomen.

5. Plasma-huisstandaarden

  1. Om de huisstandaardmonsters voor te bereiden, moet men voldoende plasmavolume verkrijgen om minimaal drie monsters per analytische run te kunnen analyseren. Het totale benodigde plasmavolume wordt bepaald door het aantal monsters dat geanalyseerd moet worden.
  2. Aliquot huisvesten standaardplasma in kleine cryovialen op de volumes die nodig zijn voor elke analytische run en slaan op bij -80 °C.
    OPMERKING: Het is cruciaal dat de huisstandaard het isotoop-gelabelde retinoltracer bevat dat in de onbekende monsters wordt gebruikt. Voldoende materiaal kan worden verkregen door vrijwillige monsters samen te voegen in één aliquot.
  3. Haal voor elke analytische run minstens drie plasma house standaardmonsters uit op hetzelfde volume als onbekende plasmamonsters, zoals gedaan in stap 3.
  4. Plaats de plasmahuisstandaarden door het monsterrek met minstens 10 onbekende plasmamonsters ertussen. Gebruik plasma-huisstandaarden om intra- en interdagvariaties te berekenen.

6. Externe standaardvoorbeelden

  1. Verkrijg gecertificeerde externe standaardmonsters en bewaar bij -80 °C. Een veelgebruikte gecertificeerde externe standaard is de NIST Standard Reference Material SRM 968.
  2. Haal per analyse minstens vier plasma externe standaardmonsters uit op hetzelfde volume als onbekende plasmamonsters met stap 3. Gebruik externe standaardmonsters om de nauwkeurigheid van de verkregen resultaten te verifiëren.

7. Handmatige samengestelde optimalisatie

  1. Zorg ervoor dat de APCI Heated Nebulizer-probe in de MS-bronbehuizing is geïnstalleerd. Bereid de infusieoplossing voor elke stabiele isotooptracer voor bij ongeveer 1 μg/mL.
    OPMERKING: De oplossing moet vergelijkbaar zijn met de mobiele fase en wat zuur bevatten voor protonatie. Een goed oplosmiddel om te gebruiken is 1:1 acetonitril/dH2O met 0,1% mierenzuur (v/v).
  2. Vul een 1 mL Luer-lock Hamilton-spuit met de infusieoplossing en verbind de spuit vervolgens met een PEEK-buis via de aardingsverbinding op de bron. Stel de infusiesnelheid in op 10 μL/s.
  3. Selecteer handmatig stemmen en zorg dat het instrument in Tune and Calibrate Mode staat. Start de spuitpomp en selecteer Q1 Scantype in positieve modus.
  4. Stel een lagere massa-range in van 50 Da en een hogere massa-bereik ongeveer 100 Da boven de molecuulmassa van de doelverbinding.
  5. Stel de cycli in op 500, scansnelheid 200 Da/s. Klik op Start en observeer het signaal in het massaspectravenster.
  6. Wacht tot het signaal stabiel is en controleer dan of de verwachte m/z-pieken verschijnen. Beschouw de [M+H]+ en [M+2H]2+ pieken aangezien de MS in positieve modus is.
  7. De maximale beoogde hoogte zou rond de 1e6 moeten liggen. De totale ionenstroom (TIC) moet 1e7-1e9 zijn. Blijf infuseren totdat het signaal stabiel is, klik dan op Stop. Er moet een duidelijke piek met hoge intensiteit zijn die wordt gevormd uit de verbinding in de infusieoplossing. De totale ionenstroom (TIC) wordt weergegeven, wat het totale signaal voor alle gecombineerde ionen toont.
    OPMERKING: de verwachte massa van 12C Retinol is 269 Da, dus een bereik van 50-300 Da is passend om [M+H]+ en [M+2H]2+ ionen te tonen.

8. Product ion (MS2) scan / CE spectra check

  1. Stel de Startmassa in op een lagere massa, bijvoorbeeld 50 Da, en de Stopmassa net boven de Q1-massa (bijv. 269,1 voor 12C Retinol). Stel Cycles in op 5 en verander botsingsenergie (CE) naar 10. Controleer op de Q1-massa als het voorloper-ion. Als er geen kleinere fragmenten verschijnen, verhoog dan CE naar 20.
  2. Naarmate de CE toeneemt, zullen er meer productionen worden gevormd. Blijf CE verhogen totdat het precursor-ion rechts van de spectra volledig verdwenen is. Verhoog de CE nog verder om mogelijke secundaire fragmentatie te zien.

9. MRM-scan

  1. Selecteer vanuit de MS2-scan de drie meest voorkomende of meest geschikte productionen om verder te optimaliseren.
  2. Voor elk production voeren de Q1 (voorloper) massa en de Q3 (product) massa's in. Stel de verblijftijd in op 200 ms. Noem elk fragment dienovereenkomstig (bijvoorbeeld 12C_Frag_93).
  3. Selecteer de botsingsenergie en identificeer de optimale CE-waarde met behulp van de rampfunctie. Vul de CE-kolom in met de geoptimaliseerde CE-waarde voor elk fragment.
  4. Optimaliseer het Declustering Potential (DP) geoptimaliseerd na het optimaliseren van CE om isobare interferenties te minimaliseren. Optimaliseer het Collision Cell Exit Potential (CXP) voor één overgang tegelijk.

10. Bron-/gasoptimalisatie

  1. Deze parameters kunnen niet automatisch worden geoptimaliseerd. Als je de signaalintensiteit moet verbeteren, voer dan een handmatig optimalisatieproces uit. Verander één parameter tegelijk en vergelijk of het signaal toenam, hetzelfde bleef of afnam.

11. Vloeistofchromatografiecondities

  1. Voor chromatografie gebruik je een binaire mobiele fasegradiënt van 0,1% (v/v) mierenzuur in dH2O (A) en 0,1% (v/v) mierenzuur in acetonitril (B).
  2. Afhankelijk van het toegepaste LC-systeem kunt u ofwel een 100 mm x 2,1 mm (3 μm) ABZ PLUS-kolom gebruiken met een 4 mm x 2 mm C18-patroon (voor HPLC), of een Premier BEH Shield van 100 mm x 2,1 mm (1,7 μm) met een RP18 FIT-kolom (voor ultra-hogedrukchromatografie (UPLC)) voor de analyse van retinol. Houd kolommen respectievelijk op een temperatuur van 40 °C of 50 °C.
  3. Injecteer 10 μL van het plasma-extract op de kolom. Elute analyten met een debiet van 0,4 mL/min. Voor HPLC-systemen is de lineaire gradiënt: 60% B naar 95% B in 6,0 minuten; 100% B van 6,1 min tot 13,0 min; 100% B tot 60% B van 13,1 tot 14,0 min; en 60% B van 14,0 tot 17,0 min. Voor UPLC-systemen hangt de lineaire gradiënt af van de onderzoeksvragen. Als alleen retinol bepaald moet worden, is de gradiënt: 40% B naar 60% B in 1,0 minuten; 60% B naar 95% B van 1,0 min tot 6,0 min; 100% B van 6,5 min tot 7,5 min; 100% B tot 40% B van 7,5 naar 7,6 min; en 40% B van 7,6 tot 8,5 min. Als het doel is om retinylesters naast retinol te analyseren, is de lineaire gradiënt: 60% B naar 95% B in 3,0 minuten; 100% B van 3,5 min tot 6,5 min; 100% B naar 60% B van 6,5 tot 7,0 min; en 60% B van 7,0 tot 8,5 min.

12. MS/MS-voorwaarden

  1. Voer MS/MS-analyse uit onder atmosferische druk chemische ionisatie (APCI) in positieve ionenmodus. APCI wordt gekozen boven elektrospray-ionisatie omdat het een hogere signaalintensiteit biedt, een breder lineair bereik en minder achtergrondruisbiedt (26).
  2. Voor respectieve massa-overgangen voor [12C]retinol, [13C10]retinol en [2H6]retinol en hun respectievelijke esters/acetaat met geselecteerde reactiemonitoringsparameters (SRM) voor de API4000 en de QTRAP 5500 massaspectrometer, raadpleeg Tabel 2, Tabel 3 en Figuur 2.
    OPMERKING: Geselecteerde ionenmonitoring voor retinol, retinylesters en retinylacetaat was hetzelfde fragmention van m/z 269 voor APCI-kwantificatie, aangezien dit ion overeenkomt met het verlies van water, vetzuren of azijnzuur uit de geprotoneerde moleculen. Omdat de LC-MS/MS in staat is de retinolpieken van zijn esters te scheiden, maakt een enkele injectie het mogelijk om isotoopverrijking in zowel de retinol- als de retinylesterfracties in één monster te bepalen.

13. Kwantificering van retinol

  1. Kwantificeer de concentraties van [12C] retinol, [2H6] retinol en [13C10] retinolmonsters aan hun respectievelijke kalibratiestandaarden.
  2. Bepaal extractieverliezen door de interne standaardconcentraties per monster terug te winnen ten opzichte van de interne standaard controlemonsters.
  3. Voer bevestiging uit van plasma-retinolconcentraties met behulp van het National Institute of Standards and Technology (NIST) standaard referentiemateriaal (SRM) 968.

Resultaten

Om de effectiviteit van de analytische methode om stabiele isotoop-gelabelde retinol te analyseren in verschillende chromatografische systemen te illustreren, presenteren we resultaten van twee verschillende studies.

Voor het gebruik van de API4000 met vooraangaande HPLC werden plasmamonsters van 111 Filipijnse kinderen van 12 tot 18 maandengeanalyseerd, die op dag 0 een orale dosis retinylacetaat van 400 μg (1,17 μmol) [13C10] ontvingen, gevolgd door een bloedmonsterafname van 6 ml 4 dagen na de dosis, 7,28. De gemiddelde totale retinolconcentraties in het plasma waren 1,1 μmol/L, en het gemiddelde [13C10] retinol was 0,007 μmol/L. Aangezien het achtergrondruisniveau binnen de m/z 279 naar 100 overgang een gemiddelde piekhoogte van ~50 cps had (Figuur 1), werden het detectieniveau (LOD) en kwantificatie (LOQ) voor [13C10] retinol ingesteld op 150 cps en 500 cps, wat overeenkomt met respectievelijk 6 fmol en 19 fmol op kolom. Omdat er een goede basisresolutie werd verkregen tussen de [12C] retinol en de toegepaste interne standaard van retinylacetaat, was het niet nodig om een stabiel isotoop-gelabeld retinylacetaat te gebruiken.

Een snellere chromatografische scheiding kan worden bereikt met UPLC in combinatie met de QTRAP 5500, met looptijden onder de 10 minuten. Afhankelijk van de onderzoeksvraag kunnen twee verschillende scheidingsmethoden worden toegepast; (i) als het doel is om inheemse en isotoopgelabelde retinol te bepalen met een niet-gelabelde interne standaard van retinylacetaat, zorgen retentietijden tussen retinol (4,37 min) en retinylacetat (5,33 min) voor een goede basislijnscheiding (Figuur 3); (ii) als het doel is om inheemse en isotoopgelabelde retinol te scheiden naast inheemse en gelabelde retinylesters, kan een goede scheiding binnen een run van 8,5 minuten worden bereikt (Figuur 4). Vanwege de nauwe retentietijden tussen retinol (2,10 min) en retinylacetat (2,43 min) is het echter aan te raden om isotopisch gelabeld retinylacetat ([2H4] retinylacetaat) te gebruiken. In dit voorbeeld werden serummonsters geanalyseerd van 80 Ghanese vrouwen van vruchtbare leeftijd die een 2 mg retinol-equivalente dosis van [2H6] retinylacetaat ontvingen, gevolgd door bloedafname 21 dagen na de dosis. De gemiddelde totale retinolconcentraties in het serum waren 1,89 μmol/L, met gemiddeld [2H6] retinol op 0,027 μmol/L en gemiddeld op0,025 μmol/L.

De gepresenteerde methode bereikte een laag detectieniveau (LOD = 6 fmol; LOQ = 19 fmol op kolom), wat een hoge gevoeligheid en specificiteit toont voor het detecteren van stabiele isotoop-gelabelde retinol met duidelijke basislijn scheiding tussen native retinol en interne standaarden. Bovendien werkte de methode effectief met zowel HPLC- als UPLC-opstellingen, ondanks verschillen in retentietijden. Het gebruik van isotopisch gelabelde interne standaarden ([2H4] retinylacetaat) zorgde voor nauwkeurige kwantificering onder snellere UPLC-omstandigheden, als retinylesters moeten worden bepaald. Validatie tegen NIST-gecertificeerde referentiestandaarden bevestigde de nauwkeurigheid, terwijl intradag- en interdagcoëfficiënten van variatie (respectievelijk 2,3% en 4,4%) uitstekende precisie en reproduceerbaarheid aantoonden. Succesvolle analyse van plasma/serummonsters uit twee verschillende populaties (Filipijnse kinderen en Ghanese vrouwen) met verschillende doseringsprotocollen toont robuustheid en praktische bruikbaarheid in diverse voedingsstudies.

figure-results-1
Figuur 1: LC-MS/MS chromatogram met de API4000 massaspectrometer. Het chromatogram van serumretinol werd 4 dagen na orale inname van 0,4 mg [13C10] retinylacetaat verkregen. Geselecteerde reactiemonitoring (SRM) van m/z 269 tot 93 toont de scheiding van [12C] retinol (RT = 5,06 min) en [12C] retinylacetat (RT = 5,83 min) als interne standaard (IS). Het retinolsignaal [13C10] bij m/z 279 tot 100 overschrijdt voldoende zowel de detectiegrens (LOD) als de kwantificatiegrens (LOQ). Chromatografische voorwaarden: (A) binaire mobiele fasegradiënt van 0,1% (v/v) mierzuur in dH2O en (B) 0,1% (v/v) mierzuur in acetonitril; Debiet van 0,4 mL/min met een lineaire gradiënt van: 60% B tot 95% B in 6,0 minuten; 100% B van 6,1 min tot 13,0 min; 100% B tot 60% B van 13,1 tot 14,0 min; en 60% B van 14,0 tot 17,0 min; 100 mm x 2,1 mm (3 μm) ABZ PLUS-kolom, uitgerust met een 4 mm x 2 mm C18-patroon die op 40 °C wordt gehouden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: APCI-MS/MS product ionenmassaspectra. Flow-injectie APCI-MS/MS product-ionenmassaspectra van (A) m/z 269 [12C] retinol, (B) m/z 273 [2H4] retinol, (C) m/z 275 [2H6] retinol en (D) m/z 279 [13C10] retinol in positieve ionenmodus. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: LC-MS/MS chromatogram met de QTRAP 5500 massaspectrometer. LC-MS/MS-chromatogram van een typisch extract uit een plasma-huisstandaard, bemonsterd 21 dagen na orale inname van 1,0 mg [2H6] retinylacetaat en 90 dagen na orale inname van 1,0 mg [13C10] retinylacetaat. Geselecteerde reactiemonitoring (SRM) van m/z 269→93 toont de [12C] retinolpiek (RT = 4,37 min) en retinylacetaat (RT = 5,33 min) als interne standaard (IS); de [2H6] retinol (RT = 4,36 min) op m/z 275→96; en de [13C10] retinolpiek (RT = 4,38) op m/z 279→100. Chromatografische voorwaarden: (A) binaire mobiele fasegradiënt van 0,1% (v/v) mierenzuur in dH2O en (B) 0,1% (v/v) mierenzuur in acetonitril; Debiet van 0,4 ml/min met een lineaire gradiënt van: 40% B naar 60% B in 1,0 min; 60% B naar 95% B van 1,0 min tot 6,0 min; 100% B van 6,5 min tot 7,5 min; 100% B tot 40% B van 7,5 naar 7,6 min; en 40% B van 7,6 tot 8,5 min; 100 mm x 2,1 mm (1,7 μm) AcquityTM Premier BEH Shield RP18 VanGuard FIT-kolom, gehandhaafd op 50°C. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: LC-MS/MS chromatogram van retinol en retinylesters met behulp van de QTRAP 5500 massaspectrometer. LC-MS/MS chromatogram van een typisch extract uit een plasma-huisstandaard, bemonsterd 6 uur na orale inname van 1,0 mg [2H6] retinylacetaat en 90 dagen na orale inname van 1,0 mg [13C10] retinylacetaat. Geselecteerde reactiemonitoring (SRM) van m/z 269→93 toont de [12C]retinolpiek (RT = 2,10 min); de [2H4]retinylacetat bij m/z 273→94 (RT = 2,43 min) als interne standaard (IS); de scheiding van [2H6]retinol (RT = 2,09 min) en [2H6]retinylpalmitaat (RT = 5,11 min) piekt bij m/z 275→96; en de [13C10]retinolpiek (RT = 2,10) bij m/z 279→100. Chromatografische voorwaarden: (A) binaire mobiele fasegradiënt van 0,1% (v/v) mierenzuur in dH2O en (B) 0,1% (v/v) mierenzuur in acetonitril; Debiet van 0,4 ml/min met een lineaire gradiënt van: 60% B naar 95% B in 3,0 minuten; 100% B van 3,5 min tot 6,5 min; 100% B naar 60% B van 6,5 tot 7,0 min; en 60% B van 7,0 tot 8,5 min; 100 mm x 2,1 mm (1,7 μm) AcquityTM Premier BEH Shield RP18 VanGuard FIT-kolom, gehandhaafd op 50 °C. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Parameters
Molaire absorptiviteit (ɛ) van retinol in ethanol:52.770 M-1 cm-1
Verdunningsfactor:100 (100μL standaard kalibratiestandaard in 10 mL ethanol)
Gemeten gemiddelde absorptie:0.575
Berekening
Concentratie (mol) van [12C] retinol in ethanol:Concentratie (mol) = Absorptie / ɛ x Lengte van de cuvet
= 0,575 / 52770 M-1 cm-1 x 1 cm = 1,09 x 10-5 M
Corrigeren voor verdunning:1,09 x 10-5 M x 100 = 1,09 x 10-3 M of 1,09 mM

Tabel 1: Bepaling van de kalibratiestandaard retinolvoorraadconcentratie.

AnalyteMRM-overgangen (m/z)Declusteringspotentiaal (V)Ingangspotentiaal (V)Botsingsenergie (eV)Botsingsuitgangspotentiaal (V)
[12C]-retinol/esters269→935110276
[2H4]retinylacetaat273→945110276
[2H6]retinol/esters275→965110276
[13C10]-retinol/esters279→1004110276

Tabel 2: Geselecteerde parameters voor reactiemonitoring (SRM). Parameters voor [12C] retinol, [13C10] retinol en [2H6] retinol en hun respectievelijke esters met behulp van de API4000

AnalyteMRM-overgangen (m/z)Declusteringspotentiaal (V)Ingangspotentiaal (V)Botsingsenergie (eV)Botsingsuitgangspotentiaal (V)
[12C]-retinol/esters269→939410338
[2H4]retinylacetaat273→9454102011
[2H6]retinol/esters275→966910253
[13C10]-retinol/esters279→10010210359

Tabel 3: Geselecteerde parameters van reactiemonitoring (SRM). Parameters voor [12C] retinol, [13C10] retinol en [2H6] retinol en hun respectievelijke esters met behulp van de QTRAP 5500

Discussie

De gepresenteerde LC-MS/MS-methode biedt een extreem hoge gevoeligheid, met detectielimieten van slechts 6 fmol/L, waardoor onderzoekers slechts 100 - 200 μL plasma19 kunnen gebruiken. Deze gerichte tandem MS-methode is bijzonder krachtig voor bevestiging van de identiteit van retinoïde isotopologen wanneer zowel kwantor- als kwalifiseerderproductionen worden gebruikt18. Omdat isotoop-gelabelde retinoïden echter in aanzienlijk lagere concentraties aanwezig zijn dan fysiologische niet-gelabelde retinoïden, kunnen plasmamonsters met gelabelde retinol- en retinylesters een extra concentratiestap vereisen. Deze noodzaak hangt af van factoren zoals het tijdstip van het bloedmonster na de dosis, de concentratie orale tracer en de gevoeligheid van het LC-MS/MS-systeem. Historisch gezien werden hogere doses toepassingen gebruikt om de lagere gevoeligheid van eerdere massaspectrometers te overwinnen, maar recente ontwikkelingen hebben het gebruik van lagere doses13 vergemakkelijkt. In de gepresenteerde voorbeelden verhoogt een hogere orale dosis het niveau van stabiele, isotoop-gelabelde retinol zelfs op latere tijdstippen, dat wil zeggen na 21 dagen versus na 4 dagen.

Aangezien de terminale functionele groepen van retinylesters verloren gaan tijdens ionisatie, worden dezelfde ouder m/z van 269 en vergelijkbare dochterionfragmentatiepatronen waargenomen voor zowel retinol- als retinylesters. Daarom is chromatografische scheiding cruciaal om hun afzonderlijke concentraties te bepalen18. Bovendien wordt vanwege de hoge natuurlijke hoeveelheid 13C stabiele isotopen in endogene retinolisotopolen aanbevolen om meer dan drie 13C-atomen in de retinoltracer te verwerken om te voorkomen dat de basis natuurlijke 13C-verrijking van retinol in menselijk plasma29 gecorrigeerd hoeft te worden.

Plasmamonsters vereisen verwerking vóór isotoopanalyse in twee stappen. Eerst moeten plasmamonsters worden gedeïnïniseerd, gevolgd door het extraheren van retinol- en retinylesters met een niet-polair oplosmiddel, wat een bifasisch systeemcreëert 18,19,20. Hoewel een duidelijke fase-scheiding wordt verkregen met het bovenstaande protocol, is het cruciaal dat de interfase in het bifasische systeem niet wordt verstoord of verzameld, omdat dit de droogtijd verlengt en de nauwkeurigheid van de analyse vermindert. Alternatief heeft onze groep ook de toepassing van een eenfasige extractieprocedure voor retinoïden20 onderzocht. Hiervoor worden 200 μL plasmamonsters gepipetteerd in een 2 mL plastic microcentrifugebuis, en worden retinoïden gewonnen met een combinatie van ethanol en ethylacetaat. Door dit extractieprotocol toe te passen kan retinol en meer polaire retinoïden, zoals retinoïnezuurisomeren, worden geanalyseerd met gelijkwaardige opbrengst vergeleken met biphasische extractie, en is het ook vergelijkbaar met de eenstaps acetonitrilextractiemethode van Kane en Napoli30.

Aangezien retinoïden gevoelig zijn voor oxidatie en isomerisatie bij blootstelling aan UV-licht en hitte, is het cruciaal om de analyse zo snel mogelijk uit te voeren, en moeten algemene voorzorgsmaatregelen worden genomen tijdens het verzamelen, hanteren en opslaan van plasma30. Traditionele methoden voor het analyseren van stabiele isotoop-gelabelde retinoïden maken gebruik van tijdrovende isolatie en/of derivatisaties. GC-MS-analyse vereist het isoleren van de retinolfractie uit het menselijk serum met behulp van high-performance liquid chromatografie (HPLC), gevolgd door de derivatisatie van retinol22. Hoewel derivatisatie niet nodig is voor GC-C-IRMS, wordt voorafgaande scheiding van retinol met twee afzonderlijke HPLC-zuiveringsstappen aanbevolen 17,25,31, en is ook de bepaling van de basisverrijking van 13C retinol in menselijk plasma in de monsterpopulatie vereist17,32. Daarentegen heeft de gepresenteerde LC-MS/MS-methode verschillende voordeel. Het voorkomt uitgebreide en tijdrovende extractie- en/of zuiveringsprocedures, waardoor snelle, gevoelige en gelijktijdige analyse van retinylesters en vrije retinolmogelijk is. Bovendien is de methode effectief omdat deze hoge nauwkeurigheid met lage variabiliteit biedt en aanpasbaar is aan verschillende LC-MS/MS-systemen.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te verklaren.

Dankbetuigingen

Ondersteuning voor dit werk werd geleverd door de Bill & Melinda Gates Foundation (Projectnummer: OPP1115464) en het Internationaal Atoomenergieagentschap (IAEA) in Wenen (Projectnummer E4.30.30).

Materialen

```html
Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Solventen
Absolute ethanol HPLC-kwaliteitFisher10428671
Acetonitrile HPLC-kwaliteitFisher10660131
Hexaan 95% n-Hexaan voor HPLC Certified HPLCFisherH/0406/17
Isopropanol HPLC-kwaliteitVWR20880.32
Isopropanol HPLC-kwaliteitVWR20880.32
Methanol 99% 2,5 LThermo Scientific11367996
Standaarden/isotopen
all-trans-retinolBioXtra95144
RetinylacetaatSigmaPHR1236
Stabiel isotoop gelabeld retinol:ReseaChem/Buchem BV
Stabiel isotoop gelabeld retinylacetaat:ReseaChem/Buchem BVN/AEen reeks stabiele isotopen kan worden gebruikt voor de RID-methode. Een lijst van verschillende commercieel verkrijgbare isotopen wordt gegeven in Tabel 1. 
Vitamine A  (19,19,19,20,20,20-D6)
Vitamine A  (8,9,10,11,12,13,14,15,19,20-13C10)
Vitamine A acetaat (10,19,19,19-D4)
Vitamine A acetaat (19,19,19,20,20,20-D6)
Vitamine A acetaat (8,9,10,11,12,13,14,15,19,20-13C10)
Apparatuur
5ml instelbare solvaten dispenserSigma-AldrichZ627607-1EA
ABI 4000 LC-MS/MS.AB Sciex
Analytische weegschalen Fisher13592970
Capillaire zuigers (pipettipjes) CP100 10x96 TIPACKGilsonFD148314
Capillaire zuigers CP250ST 6x96GilsonF148714
Dampkast
Microman E M100E Pipette (positieve verplaatsing)GilsonFD10004
Microman E M250E Pipette (positieve verplaatsing)GilsonFD10005
Pipetman P100, 10-100ul, metalen ejectorGilsonF114057M
Pipetman P1000, 100-1000ul, metalen ejectorGilsonF114059M
Pipetman P20, 2-20ul, metalen ejectorGilsonF144056M
QTRAP 5500 LC-MS/MSAB Sciex
Gekoelde centrifuge 5810 REppendorf
Soniserend waterbadVWRUSC100T
SpectrofotometerThermo Fisher ScientificA51119600C
Techne monster concentrator en heat block.VWR
Vibrax VXR Basic ShakerIKA0002819002
Vortex mixer; MS3 basic IKAFisherMPR-555-050L
VX2 testbuis bevestiging - werke typ VX2IKA0000568900
Verbruiksartikelen
1,5ml microcentrifuge buisjesFisherFB74323
100 mm x 2,1 mm (1,7 μm) AcquityTM Premier BEH Shield RP18 VanGuard FIT kolomWaters186009498
100 mm x 2,1 mm (3 µm) Supelcosil ABZ PLUS kolomSupelco57917
1000ul pipette tipsStarlabS1122-1830
100ml volumetrische kolvenFisher11323644Pyrex Borosilicaat Glas Klasse A Gecertificeerde Volumetrische Kolf
200ul pipette tipsStarlabS1120-8810
4 mm x 2 mm SecurityGuard C18 cartridgePhenomenexAJ0-4286
50ml volumetrische kolvenFisher11313644Pyrex Borosilicaat Glas Klasse A Gecertificeerde Volumetrische Kolf
9mm barnstenen glazen flesjes met inzetstukkenFisher11583680
9mm flesjes schroefdopFisher13206419
Carton cryoboîteStarlabA9623-8181
Hellma cuvet UV kwartsSLSCEL1600
Stiekstofgas (hoogste zuiverheid en zuurstofvrij)BOC
Pasteur PipetteFisher11546963
Pyrex kweekbuisjes 100x16mmCorningCLS9944916
Schroefdop PTFE voering 16mmCorningCLS999815
Vial glas barnsteen 2ml PTFE doppenFisher11573542
Vial schroefdop 9mm siliconen wit/PTFE roodThermo 13206419
```

Referenties

  1. Tanumihardjo, S. A., et al. Biomarkers of Nutrition for Development (BOND)-Vitamin A Review. J Nutr. 146 (9), 1816-1848 (2016).
  2. Stevens, G. A., et al. Trends and mortality effects of vitamin A deficiency in children in 138 low-income and middle-income countries between 1991 and 2013: a pooled analysis of population-based surveys. Lancet Global Health. 3 (9), E528-E536 (2015).
  3. Baye, K., et al. Estimates of child mortality reductions attributed to vitamin A supplementation in sub-Saharan Africa: scale up, scale back, or refocus. Am J Clin Nutr. 116 (2), 426-434 (2022).
  4. Bielderman, I., Vossenaar, M., Melse-Boonstra, A., Solomons, N. W. The potential double-burden of vitamin A malnutrition: under- and overconsumption of fortified table sugar in the Guatemalan highlands. Eur J Clin Nutr. 70 (8), 947-953 (2016).
  5. Brown, K. H., Engle-Stone, R., Kagin, J., Rettig, E., Vosti, S. A. Use of Optimization Modeling for Selecting National Micronutrient Intervention Strategies: An Example Based on Potential Programs for Control of Vitamin A Deficiency in Cameroon. Food Nutr Bull. 36 (3 Suppl), S141-S148 (2015).
  6. Bruins, M. J., et al. Maximizing the benefits and minimizing the risks of intervention programs to address micronutrient malnutrition: symposium report. Matern Child Nutr. 12 (4), 940-948 (2016).
  7. Engle-Stone, R., et al. Filipino Children with High Usual Vitamin A Intakes and Exposure to Multiple Sources of Vitamin A Have Elevated Total Body Stores of Vitamin A But Do Not Show Clear Evidence of Vitamin A Toxicity. Curr Dev Nutr. 6 (8), nzac115(2022).
  8. Engle-Stone, R., et al. Weighing the risks of high intakes of selected micronutrients compared with the risks of deficiencies. Ann New York Acad Sci. 1446 (1), 81-101 (2019).
  9. Raiten, D. J., et al. Perspective: Integration to Implementation (I-to-I) and the Micronutrient Forum-Addressing the Safety and Effectiveness of Vitamin A Supplementation. Adv Nutr. 11 (2), 185-199 (2020).
  10. van Stuijvenberg, M. E., et al. South African preschool children habitually consuming sheep liver and exposed to vitamin A supplementation and fortification have hypervitaminotic A liver stores: a cohort study. Am J Clinical Nutr. 110 (1), 91-101 (2019).
  11. Gannon, B. M., Tanumihardjo, S. A. Comparisons among Equations Used for Retinol Isotope Dilution in the Assessment of Total Body Stores and Total Liver Reserves. J Nutr. 145 (5), 847-854 (2015).
  12. Green, M. H., Green, J. B., Ford, J. L. Better Predictions of Vitamin A Total Body Stores by the Retinol Isotope Dilution Method Are Possible with Deeper Understanding of the Mathematics and by Applying Compartmental Modeling. J Nutr. 150 (5), 989-993 (2020).
  13. Lietz, G., et al. Current Capabilities and Limitations of Stable Isotope Techniques and Applied Mathematical Equations in Determining Whole-Body Vitamin A Status. Food Nutr Bull. 37, S87-S103 (2016).
  14. Furr, H. C., et al. Vitamin A concentrations in liver determined by isotope dilution assay with tetradeuterated vitamin A and by biopsy in generally healthy adult humans. Am J Clin Nutr. 49 (4), 713-716 (1989).
  15. Haskell, M. J., et al. Assessment of vitamin A status by the deuterated-retinol-dilution technique and comparison with hepatic vitamin A concentration in Bangladeshi surgical patients. Am J Clin Nutr. 66 (1), 67-74 (1997).
  16. Fleshman, M. K., Riedl, K. M., Novotny, J. A., Schwartz, S. J., Harrison, E. H. An LC/MS method for d8-β-carotene and d4-retinyl esters: β-carotene absorption and its conversion to vitamin A in humans. J Lipid Res. 53 (4), 820-827 (2012).
  17. Gannon, B., et al. Biofortified orange maize is as efficacious as a vitamin A supplement in Zambian children even in the presence of high liver reserves of vitamin A: a community-based, randomized placebo-controlled trial. Am J Clin Nutr. 100 (6), 1541-1550 (2014).
  18. Oxley, A., et al. An LC/MS/MS method for stable isotope dilution studies of beta-carotene bioavailability, bioconversion, and vitamin A status in humans. J Lipid Res. 55 (2), 319-328 (2014).
  19. Oxley, A., et al. Determination of Vitamin A Total Body Stores in Children from Dried Serum Spots: Application in a Low- and Middle-Income Country Community Setting. J Nutr. 151 (5), 1341-1346 (2021).
  20. Oxley, A., Lietz, G. Use of stable isotopes to study bioconversion and bioefficacy of provitamin A carotenoids. Meth Enzymol. 670, 399-422 (2022).
  21. Parker, R. S., et al. Study of beta-carotene metabolism in humans using 13C-beta-carotene and high precision isotope ratio mass spectrometry. Ann N Y Acad Sci. 691, 86-95 (1993).
  22. Tang, G. W., Qin, J., Dolnikowski, G. Deuterium enrichment of retinol in humans determined by gas chromatography electron capture negative chemical ionization mass spectrometry. J Nutr Biochem. 9 (7), 408-414 (1998).
  23. Tang, G. W., Qin, J., Dolnikowski, G. G., Russell, R. M. Short-term (intestinal) and long-term (postintestinal) conversion of beta-carotene to retinol in adults as assessed by a stable-isotope reference method. Am J Clin Nutr. 78 (2), 259-266 (2003).
  24. Tang, G. W., Qin, J., Hao, L. Y., Yin, S. A., Russell, R. M. Use of a short-term isotope-dilution method for determining the vitamin A status of children. Am J Clin Nutr. 76 (2), 413-418 (2002).
  25. Tanumihardjo, S. A. Vitamin A status assessment in rats with C-13(4)-retinyl acetate and gas chromatography/combustion/isotope ratio mass spectrometry. J Nutr. 130 (11), 2844-2849 (2000).
  26. van Breemen, R. B., et al. Development of a method for quantitation of retinol and retinyl palmitate in human serum using high-performance liquid chromatography-atmospheric pressure chemical ionization-mass spectrometry. J Chromatogr A. 794 (1-2), 245-251 (1998).
  27. Fu, Y., Li, W., Flarakos, J. Recommendations and best practices for calibration curves in quantitative LC-MS bioanalysis. Bioanalysis. 11 (15), 1375-1377 (2019).
  28. Ford, J. L., et al. Use of Model-Based Compartmental Analysis and a Super-Child Design to Study Whole-Body Retinol Kinetics and Vitamin A Total Body Stores in Children from 3 Lower-Income Countries. J Nutr. 150 (2), 411-418 (2020).
  29. van Lieshout, M., West, C. E., van Breemen, R. B. Isotopic tracer techniques for studying the bioavailability and bioefficacy of dietary carotenoids, particularly beta-carotene, in humans: a review. Am J Clinical Nutr. 77 (1), 12-28 (2003).
  30. Kane, M. A., Napoli, J. L. Quantification of endogenous retinoids. Methods Mol Biol. 652, 1-54 (2010).
  31. Preston, T. Existing and emerging technologies for measuring stable isotope labelled retinol in biological samples: isotope dilution analysis of body retinol stores. Int J Vitam Nutr Res. 84, 30-39 (2014).
  32. Valentine, A. R., Davis, C. R., Tanumihardjo, S. A. Vitamin A isotope dilution predicts liver stores in line with long-term vitamin A intake above the current Recommended Dietary Allowance for young adult women. Am J Clin Nutr. 98 (5), 1192-1199 (2013).

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Vitamine A tracersretinol isotoopverdunningtandemmassaspectrometrieplasmaretinolanalyseretinolkwantificeringoplosmiddelextractieionisatie bij atmosferische drukscheiding van retinylesters
Video binnenkort beschikbaar
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.