Methodenartikel

Intramusculaire transplantatie van menselijke pluripotente stamcel-afgeleide alvleesklierendocriene cellen bij muizen

409 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/69562

⸱

10 april 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Instituto de Investigaciones Biomédicas Sols-Morreale, Consejo Superior de Investigaciones Científicas, Universidad Autónoma de Madrid, 2Centro de Investigación Biomédica en Red de Diabetes y Enfermedades Metabólicas Asociadas CIBERDEM, Instituto de Salud Carlos III

In dit artikel

Samenvatting

Wij bieden een minimaal invasief protocol voor de intramusculaire transplantatie van pancreasstamceleilandjes afkomstig van menselijke stamklieren in immunodeficiënte muizen voor in vivo implantatie en downstream analyse.

Samenvatting

Menselijke pluripotente stamcel (hPSC)-afgeleide endocriene pancreascellen vormen een veelbelovende bron voor diabetesceltherapie en ziektemodellering. Hoewel verschillende differentiatieprotocollen zijn vastgesteld, is in-vivo implantatie meestal vereist om rijping en functie binnen een fysiologische context te bestuderen. De meeste transplantatiemethoden zijn afhankelijk van locaties zoals de niercapsule of de subcutane ruimte, wat technische of fysiologische beperkingen kan opleveren. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor de intramusculaire transplantatie van hPSC-afgeleide pancreas-SC-eilandjes in immunodeficiënte muizen. Deze locatie maakt eenvoudige chirurgische toegang mogelijk, vermindert de invasieve invasieve werking en betrouwbare transplantaatwinning voor latere analyse. De procedure maakt intramusculaire implantatie van stamcel-afgeleide eilandjes mogelijk en ondersteunt hun herstel voor latere beoordeling van insulinesecretie na een orale glucose-uitdaging. Het protocol omvat stappen voor clustervoorbereiding en verdichting, transplantatiechirurgie, in vivo glucose-gestimuleerde insulinesecretie (GSIS) en transplantaatwinning voor histologische analyse, waarmee een reproduceerbaar kader wordt geboden voor intramusculaire transplantatie in preklinische muismodellen.

Inleiding

Diabetes is een heterogene stofwisselingsstoornis waarvan de prevalentie in de afgelopen drie decennia is verdubbeld en naar verwachting 1,3 miljard mensen zal treffen tegen 2050. Hoewel omgevingsfactoren, zoals dieet en levensstijl, een belangrijke rol spelen bij het ontstaan van type 2 diabetes (T2D), draagt genetische aanleg ook aanzienlijk bij aan de vormingvan de ziekte 2. Pancreas-β cellen zijn verantwoordelijk voor insulinesynthese en -afgifte en spelen een centrale rol in de pathofysiologievan diabetes. Om te begrijpen hoe genetisch risico bijdraagt aan β-celdisfunctie, bieden menselijke stamcel-afgeleide β cellen georganiseerd als driedimensionale endocriene clusters (hierna SC-eilandjes genoemd) een zeer informatief en relevant modelsysteem 4,5. Recente protocollen sturen effectief de differentiatie van menselijke stamcellen tot insulineproducerende β cellen door sleutelstadia van de ontwikkeling van de alvleesklier te recapituleren met behulp van specifieke remmers en groeifactoren 6,7.

Deze systemen repliceren ontwikkelingsmijlpalen betrouwbaar op schaalbare en reproduceerbare wijze, waarbij de beperkingen van donor-afgeleide eilandjes worden overwonnen, die geen ontwikkelingsmodellering ondersteunen en onderhevig zijn aan leveringsbeperkingen. Muismodellen hebben waardevolle inzichten gegeven in de ontwikkeling van de alvleesklier, maar slagen er vaak niet in de fenotypische manifestaties die bij menselijke patiënten zijn waargenomen volledigte reproduceren. Daardoor maakt het gebruik van een stamcelgebaseerd systeem het mogelijk genetische varianten te karakteriseren die betrokken zijn bij de ontwikkeling van de menselijke alvleesklier en β celdisfunctie8.

Ondanks deze vooruitgang blijven SC-eilandjes die in vitro worden gegenereerd transcriptomisch en functioneel onrijp vergeleken met inheemse volwassen β cellen. Ze vertonen suboptimale glucose-gestimuleerde insulinesecretie en missen expressie van rijpe β-celmarkers zoals MAFA en G6PC2 9,10. Om deze kloof te overbruggen, wordt vaak in vivo rijping via transplantatie in immunodeficiënte muizen toegepast; Dit verbetert doorgaans zowel de insulinesecretiedynamiek als de genexpressieprofielen6.

De glucosemetabolisme is streng gereguleerd en vereist de integratie van systemische signalen. Getransplanteerde SC-eilandjes kunnen signalen van meerdere organen integreren, waardoor een fysiologisch relevantere omgeving ontstaat die cruciaal is voor het beoordelen van de functionele gevolgen van genetische variatie in menselijke β cellen11.

SC-eilandtransplantatie bij muizen is uitgevoerd op verschillende anatomische locaties. De conventionele locatie is de niercapsule, effectief voor het bevorderen van β-celrijping en het omkeren van diabetes bij met streptozotocine (STZ)-behandelde knaagdieren12, maar het omvat een complexe invasieve operatie, wat de toepassing ervan beperkt in laboratoria13. Bovendien is deze methode niet toepasbaar in klinische omgevingen om patiënten met type 1 diabetes te behandelen vanwege beperkingen in grootte en vascularisatie14. Alternatieve transplantatieplaatsen, zoals intramusculair, subcutaan en vetweefsel, zijn gerapporteerd en bieden minder invasieve en klinisch toepasbare routes. Hoewel intramusculaire transplantatie uitdagingen kan opleveren voor optimale rijpte celvorming en insulinesecretie β cel in vergelijking met niercapsule12, kan het toch effectieve insulinesecretie en het behoud van glucosehomeostase bereiken, terwijl het een eenvoudigere en toegankelijkere chirurgische aanpak biedt15,16.

Daarom presenteren we in dit protocol een intramusculaire transplantatiebenadering die verschillende beperkingen van andere transplantatieprotocollen aanpakt. Deze methode is minimaal invasief en biedt een betrouwbare in vivo strategie voor het rijpen van SC-eilandjes en het onderzoeken van genetische varianten die gekoppeld zijn aan β-celdisfunctie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle experimenten met pluripotente stamcellen (hPSC's) en proefdieren werden goedgekeurd door institutionele, regionale en nationale ethische commissies. De hPSC-lijnen die hier worden gebruikt, zijn oorspronkelijk afgeleid en verspreid volgens de juiste ethische goedkeuringen en procedures voor geïnformeerde toestemming bij de broninstellingen. Figuur 1 toont de algemene workflow, van hPSC-onderhoud tot gerichte differentiatie van alvleesklierlijn en rijping tot SC-eilandjes geschikt voor transplantatie.

1. Differentiatie van hPSC's naar alvleeskliervoorlopers

OPMERKING: Dit protocol bouwt voort op twee essentiële voorbereidende stappen: 1) het onderhoud en de uitbreiding van hPSC's, en 2) hun gerichte differentiatie richting de endocriene alvleesklierlijn. Beide stappen zijn in detail beschreven 7,17. hPSC's worden bewaard in gecoate platen met B8-media volgens de aanbevelingen van Lyria-Leyte et al.17. Oogst hPSC's voor differentiatie tijdens exponentiële groei voordat ze samenvloeien. Bij de aanbevolen zaaidichtheid zouden ze de volgende dag een samenvloeiing van 90-100% moeten bereiken, klaar om te beginnen met differentiatie. De differentiatie naar de endocriene alvleesklierlijn wordt uitgevoerd volgens de procedure beschreven door Barsby et al.7. Volledige details van de media zijn te vinden in Tabel 1.

  1. Bedek de differentiatieplaten vers met een basalmembraan-afgeleide extracellulaire matrix.
  2. Zaad 0,16-0,19 miljoen cellen/cm2 op dag 0 (1,7 miljoen cellen in een put van een 6-well plaat). Gebruik 1,5-2 keer het volume B8 + CEPT om nutriëntenverlies te voorkomen (3-4 mL per put in een plaat met 6 putten).
    OPMERKING: Bij het doorgeven van hPSC's of seeding-differentiatie-experimenten vullen we B8-media bij voorkeur aan met CEPT, een cocktail van chromaan 1, emricasan, polyaminen en trans-ISRIB, in plaats van de conventionele ROCK-remmer Y-27632, vanwege zijn bewezen vermogen om de hPSC-overleving18 te verbeteren. Desalniettemin blijft Y27632 een geldig alternatief voor dit protocol.
  3. Voer mediawisselingen uit met differentiatiemedia S1 tot en met S4 volgens het volgende schema: S1 (Dag 1-4), S2 (Dagen 4-7), S3 (Dagen 7-9) en S4 (Dagen 9-11).
    OPMERKING: Zie Tabel 1 voor volledige mediacomposities; aanvullende procedurele details worden beschreven door Barsby et al.7.

2. Generatie van 3D-clusters en differentiatie naar insulineproducerende cellen

OPMERKING: Op dag 11 zouden gedifferentieerde cellen zich moeten hebben ontwikkeld tot alvleeskliervoorlopers. Om de endocriene differentiatie in deze fase verder te bevorderen, schakelen de cellen over van planaire kweek naar 3D-cultuur.

  1. Voeg 0,5 mL 5% (w/v) anti-adhesieoplossing toe (zie Tabel 1 voor details) om de onderkant van een 24-wells microwellplaat te bedekken met omgekeerde piramidale microwells (400 μm diameter). Centrifugeer op 1.300 g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur (RT).
    OPMERKING: De anti-hechtingsoplossing creëert een anti-hechtend oppervlak dat voorkomt dat cellen aan het plastic blijven plakken en een gelijkmatige aggregatie bevordert.
  2. Onderzoek de microwells onder een microscoop op luchtbellen en centrifugeer indien nodig opnieuw om eventuele gevangen lucht te verwijderen (Figuur 2A). Aspireer de anti-hechtingsoplossing en was 2x met 0,5 mL PBS/put. Laat de putten bedekt met PBS totdat ze klaar zijn voor gebruik.
  3. Was de cellen met 1 mL PBS-0,5 mM EDTA, aspiratief de PBS-EDTA en bedek de putten met trypsine (1 mL voor een put van een 6-put plaat). Incubeer bij 37 ºC gedurende 8-12 minuten (totdat het tikken merkbare loskoppeling veroorzaakt).
  4. Verwijder de trypsine niet; verdunn in plaats daarvan met 2x volumes DMEM-F12 of PBS, en doe het voorzichtig opnieuw op door te pipetteren. Plaats de suspensie in een kegelvormige buis en ga direct door naar de volgende stap.
    OPMERKING: Het is beter om langer in trypsine te incuberen dan een harde mechanische trituratie uit te voeren.
  5. Centrifugeer de suspensie op 200 g gedurende 3 minuten bij RT. Aspireer het supernatant voorzichtig en suspendeer de pellet voorzichtig opnieuw in voorverwarmd S4-medium (1,25 mL per put van een microwell met 24 putten).
  6. Aspiraat de PBS uit microwell-schotels. Voeg voorzichtig 1,25 mL van de suspente cellen toe aan elke put van de microwellplaat.
    OPMERKING: Elke put van de 24-microput plaat bevat 1.200 microwells. De zaaddichtheid die nodig is om clusters van passende grootte te verkrijgen is 1.500 cellen per microwell, wat overeenkomt met 1,8 miljoen cellen per put. Alternatief kunnen microwells met 6 putten worden gebruikt, waarbij volumes en aantal cellen worden aangepast (ongeveer 8,85 miljoen cellen in 5 mL Stadium 4 medium).
  7. Centrifugeer de plaat op 100 g gedurende 3 minuten bij RT om de cellen gelijkmatig in de microwells te verdelen. Breng de microwell-platen voorzichtig over in een bevochtigde broedmachine.
  8. Voer mediawisselingen uit met differentiatiemedia S5 (D14-D18), S6 (D18-D25) en S7 (D25-D46).
    OPMERKING: Volledige compositiedetails zijn opgenomen in Tabel 1, met aanvullende procedurele details beschreven door Barsby et al.7.
    De CEPT-cocktail kan tijdens deze stap worden gebruikt in plaats van de ROCK-remmer Y-27632, vanwege het bewezen vermogen om celoverleving tijdens organoïdevorming 18 te verbeteren. Succesvolle aggregatie wordt aangegeven door de vorming van compacte, bolvormige clusters binnen 24-48 uur (zie Figuur 2B).

3. Transplantatie van SC-eilandjes in de strakke spier van immuundeficiënte muizen

OPMERKING: SC-eilandjes zijn in verschillende stadia van differentiatie getransplanteerd (van stadium 4 tot stadium 7). Hoewel transplantatie van gedifferentieerde S7 SC-eilandjes de optimale strategie is voor het beoordelen van glucoseresponsiviteit6, kan de transplantatie van voorlopers in een vroeger stadium (S4-S5) of onrijpe SC-eilandjes (S6) helpen differentiatie- of rijpingsverschillen aan het licht te brengen die in vitro worden gemaskeerd door het gebruik van gedefinieerde kweekvoorwaarden. Het transplanteren van minder gedifferentieerde voorlopers brengt echter een verhoogd risico op teratoomvorming met zich mee, voornamelijk door resterende ongedifferentieerde celpopulaties.

  1. Verdichting van clusters
    1. Breng de juiste hoeveelheid clusters over in een 1,5 mL microcentrifugebuis (zie noot).
      OPMERKING: De celdosering hangt af van het experimentele doel. Voor histologie zijn 0,5-1 miljoen cellen per muis voldoende voor betrouwbare transplantaatwinning, terwijl functionele assays of diabetesomkering bij met STZ behandelde muizen doorgaans hogere doses vereisen, tot 2-5 miljoen cellen. Voorafgaand aan verdichting moeten SC-eilandjes een uniforme bolvormige morfologie vertonen met een doeldiameter van ~150-250 μm (acceptabel bereik: 100-300 μm). Dit groottebereik komt overeen met ongeveer ~10³-4 × 10³ cellen per cluster; oversized aggregaten (>300-400 μm) moeten worden vermeden, omdat ze gevoeliger zijn voor centrale necrose. De clustergrootte en uniformiteit worden vóór verdichting gecontroleerd door brightfield- of stereomicroscoopbeeldvorming van representatieve putten, gevolgd door diametermeting met standaard beeldanalysesoftware.
    2. Sluit de spuit aan op de naaldbuis en vul deze met S7 medium.
    3. Aspireer de clusters rechtstreeks vanuit de microcentrifugebuis in de slang. Vouw de buis doormidden en steek het gevouwen gedeelte in een pipettip van 200 μL. Steek de tip-tubing-naald in een 15 mL conische buis en bevestig de uiteinden aan de rand van de buis met tape.
    4. Centrifugeer de buis op 100 g gedurende 2 minuten bij 4 °C om de clusters te verdichten. Leg de buis onmiddellijk op ijs.
  2. Transplantatie van clusters in muizen
    OPMERKING: Alle chirurgische ingrepen moeten worden uitgevoerd met passende persoonlijke beschermingsmiddelen en in overeenstemming met institutionele bioveiligheids- en dierenwelzijnsvoorschriften. Anesthesiemiddelen en scherpe middelen moeten worden behandeld en afgevoerd volgens goedgekeurde veiligheidsprocedures.
    1. Induceer anesthesie bij NOD-scid-gamma muizen met 3-5% isofluran.
    2. Scheer de achterzijde van het rechterbeen onder de knie en desinfecteer met 70% ethanol.
    3. Maak de slang los van de pipettip en sluit deze aan op de spuit. Knip de buis dicht bij de samengeperste clusters en bevestig deze aan het stompe uiteinde van de naald. Duw de zoutoplossing totdat de eerste cluster de punt van de naald bereikt.
    4. Plaats de muis op de buik, leunend naar rechts, en strek het rechterbeen uit. Steek de naald 4-5 mm diep in het mediale compartiment van de rechterdij, in het gebied tussen de adductor en de gracilisspieren.
    5. Injecteer de clusters terwijl je de naald met ~3 mm terugtrekt. Draai de spuit en trek de naald terug.
    6. Houd de muis in de gaten totdat hij volledig hersteld is van de narcose.
      OPMERKING: Voor functionele karakterisering (d.w.z. in vivo GSIS, sectie 4) moeten SC-eilandjes van één genotype per muis worden gebruikt; één enkele transplantatie is voldoende. Voor histologische of transcriptomische karakterisering van rijping na implantatie kunnen echter beide poten worden gebruikt (bijvoorbeeld één poot met SC-clusters afgeleid van hPSC's die een ziekte-geassocieerde genetische variant bevatten, en het andere been met de variant gecorrigeerd). Correcte intramusculaire toediening kan niet direct direct in vivo direct na injectie worden bevestigd. Succesvolle implantatie wordt in plaats daarvan retrospectief geverifieerd door macroscopische identificatie van het transplantaat op het moment van punctie (Figuur 3) en door histologische analyse (Figuur 4).

4. In vivo glucose-gestimuleerde insulinesecretie (GSIS)

OPMERKING: In vivo GSIS via orale glucose-uitdaging beoordeelt functionele insulinesecretie als reactie op een fysiologische stimulus. Alle procedures moeten voldoen aan de richtlijnen voor de institusionele dierenzorg en -aanhouding. Functionele responsen van getransplanteerde β-cellen verbeteren met in vivo rijping: humaan C-peptide kan al 2 weken na transplantatie worden gedetecteerd, terwijl robuuste glucose-responsieve secretie doorgaans na 4 weken wordt bereikt. Deze tijdlijnen kunnen variëren afhankelijk van de ontwikkelingsfase van de SC-eilandjes bij transplantatie

  1. Snelle muizen 4-6 uur voor glucosetoediening, zodat je toegang tot water kunt garanderen.
  2. Maak een 20% (w/v) D-(+)-glucoseoplossing in water. Steriliseer door door een 0,22 μm filter te gaan en het op kamertemperatuur te verwarmen voordat je het gebruikt.
  3. Weeg elke muis en bereken de benodigde glucosedosis op 3 g/kg lichaamsgewicht.
  4. Vul het juiste volume glucoseoplossing in een 20 G gebogen gavage-naald die aan een 1 mL spuit is bevestigd.
  5. Beperk de muis voorzichtig en voer orale gavage uit, waarbij een soepele inbreng van de gavagenaald wordt gewaarborgd om tracheale aspiratie te voorkomen.
  6. Verzamel bloedmonsters via submandibulaire of staartaderpunctie bij de basislijn (0 min) en 15 en 30 minuten na de gava, met capillaire buizen en 1,5 mL microcentrifugebuizen. Laat het bloed ongeveer 15 minuten op kamertemperatuur stollen, en bewaar de buisjes dan op ijs.
  7. Centrifugeer de monsters op 1.000 g gedurende 15 minuten bij 4 °C en breng het serum over in nieuwe buizen. Bewaar bij −80 °C tot analyse door ELISA.
    OPMERKING: Tijdspunten kunnen worden aangepast afhankelijk van het experimentele model. Het is cruciaal om een assay te gebruiken die in staat is om menselijke en muisinsuline of C-peptide te onderscheiden om de transplantatie-afgeleide insulinesecretie in xenotransplantatiemodellen te beoordelen.

5. Terugwinning van geënt clusters

  1. Euthanaser de muis volgens de ethische richtlijnen van de institutionele dieren.
  2. Om weefselbesmetting met vacht te minimaliseren, spray je ethanol met 70% (v/v) over het lichaam.
  3. Verwijder de huid om de spieren van de onderledematen bloot te leggen en lokaliseer de getransplanteerde clusters met een vergrootglas. Verwijder weefsel met transplantatie met schaar en pincet.
  4. Spoel het weefsel één keer af met PBS en breng het over op 4% (w/v) paraformaldehyde (PFA) op ijs. Bevestig het weefsel in 4% PFA op 4 °C gedurende 4 uur met zacht schudden.
  5. Was het monster 1 uur in PBS met zacht schudden. Breng het weefsel over naar 30% (w/v) sucrose op PBS en breng het een nacht uit bij 4 °C.
    OPMERKING: Biologisch weefsel, bloedmonsters en chemisch afval (inclusief fixatieven en anesthesieresiduen) moeten worden afgevoerd volgens de institutionele richtlijnen voor bioveiligheid en beheer van chemisch afval.

6. Kleuring van explants

  1. OCT-embedding
    1. Leg het weefsel in een mal gevuld met Optimal Cutting Temperature (OCT) verbinding.
    2. Plaats de schimmel in een droogijs-isopropanolbad om het monster snel in te vriezen. Bewaar op -80 °C tot cryosectie.
    3. Met een cryostaat snijd je 5-7 μm doorsneden en bewaar je de glaasjes bij -80 °C.
  2. Immunokleuring
    1. Houd de slides in balans bij RT gedurende 15 minuten in een container om condensatie te voorkomen.
    2. Spoel de glaasjes 3 x 5 minuten af met PBS.
    3. Incubeer elke sectie met 100 μL blokkerende/permeabilisatieoplossing gedurende 30 minuten bij RT (0,1% niet-ionische surfactieve stof in PBS, met 5% serum van de soort waar het secundaire antilichaam is gehoogd).
    4. Incubeer elke sectie met 50 μL primaire antistoffen, verdund in blokkerende/permeabilisatieoplossing 's nachts bij 4 °C.
    5. Spoel de glaasjes 3 x 5 minuten af met PBS.
    6. Incubeer elke sectie met 50 μL secundair antilichaam, verdund in blokkerings-/permeabilisatieoplossing 1 uur bij RT.
    7. Spoel de glaasjes 3 x 5 minuten af met PBS.
    8. Bevestig de geleiden met 15 μL bevestigingsoplossing met DAPI en breng een coverslip aan. Bewaar op 4 °C in het donker tot de beeldopname.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De getoonde resultaten komen overeen met intramusculaire transplantatie van stadium 7 SC-eilandjes in immunodeficiënte muizen en een analyse uitgevoerd 6 weken na de transplantatie. Een beperkt aantal dieren met representatieve grafts werd geanalyseerd om de haalbaarheid van de procedure te illustreren. In deze studie wordt een succesvol resultaat gedefinieerd als het macroscopisch terughalen van het intramusculaire transplantaat, gevolgd door histologisc...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

In dit protocol beschrijven we intramusculaire transplantatie van SC-eilandjes als een eenvoudige, reproduceerbare en minimaal invasieve benadering voor in vivo rijping, met potentieel voor functionele beoordeling. Hoewel transplantatie onder de niercapsule algemeen wordt beschouwd als de "gouden standaard" voor eilandjes- of SC-eilandjestransplantatie bij knaagdieren, vereist het meer technische expertise en een langere chirurgische procedure. Daarentegen biedt de intramusculai...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hoeven geen belangenconflicten aan te geven.

Dankbetuigingen

Wij danken Dr. Danwei Huangfu (Memorial Sloan Kettering Cancer Center, New York, VS) voor het gul verstrekken van de hPSC-lijnen die in deze studie zijn gebruikt. Dit werk werd ondersteund door subsidies PID2021-122284NA-I00 en CNS2023-145179 van het Spaanse Ministerie van Wetenschap, Innovatie en Universiteiten MICIU/AEI/10.13039/501100011033 en Next GenerationEU/PRTR (A.B.), en door het CIBER-Consortium for Biomedical Research in Network, CB07/08/0029 en PID2023-150719OB-I00 (M.V.), Instituto de Salud Carlos III (ISCIII). Het Centrum voor Biomedisch Onderzoek in Diabetes en Gerelateerde Metabole Aandoeningen (CIBERDEM) is een initiatief van ISCIII en wordt gedeeltelijk ondersteund door het Europees Fonds voor Regionale Ontwikkeling (FEDER).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
2-Phosfo-L-ascorbinezuur trinatriumzoutSigma Aldrich49752
Activine AQkineQk001
AggreWell 400 24-well (microwell plate)Stemcell34415
BetacellulineGenScriptZ03102
Rund serumalbumine, fractie V, vetzuurvrijGoldbioA-421
CHIR 99021LC labsC-6556 
Chromaan-1Medchem ExpressHY-15392CEPT cocktail
CMRL-1066Pan BiotechP04-84600
D-(+)-GlucoseSigma AldrichG7021
Dibenzazepine (DBZ)SyncomAangepast productGamma-secretase remmer
Dulbecco's gemodificeerd Eagle-medium en Ham's F12-medium (DMEM/F12)Corning15383541
EGFQkineQk011
EmricasanMedchem ExpressHY-10396CEPT cocktail
EthanolamineSigma AldrichE9508
FGF2-G3GenScriptAangepast product
FGF7GenScriptZ03047
HeparineSigma AldrichH3149
InsulinGibco30284510
L-Alanyl-L-GlutamineLinusX0551-100
L-AscorbinezuurSanta Cruzsc-202686
LDN-193189 Sigma AldrichSML0559
LipidconcentraatGibco11548846
Matrigel (van basementmembraan afgeleide extracellulaire matrix)Falcon354230
MCDB 131Corning15-100-CV
N-acetylcysteïneThermo Scientific10521221
NaHCO3Fisher Scientific10553325
NicotinamideSigma AldrichN0636
NRG-1QkineQk045
Pluronic F-127 (anti-adherentieoplossing)Sigma Aldrich82184Gebruikt bij 5% (w/v)
Polyaminesupplement (1000×)Sigma AldrichP8483CEPT cocktail
RepSoxMedChemExpressHY-13012Alk5 Inhibitor
RetinoïnezuurSigma AldrichR2625
SANT-1SelleckchemS7092
Sobetirome (GC1)Sigma AldrichSML1900-5MGCeldoorlaatbare T3-analogon
NatriumpyruvaatCorning25-000-CI
NatriumselenietSigma AldrichS5261
T3 (3,3′,5-Trijodo-L-thyronine natriumzout)Sigma AldrichT6397
TGF-β1 QkineQk010
TPBTocris5343
Trace Elements ACorning15333641
Trace Elements BCorning15343641
Trans-ISRIBMedchem ExpressHY-12495CEPT cocktail
TransferrineInVitria777TRF029
Triton X-100 (niet-ionogene oppervlakteactieve stof)Thermo Scientific11488696
TrypLEGibco11538856
Y-27632LC LaboratoriesY-5301ROCK inhibitor
ZM-447439 MedChemExpressHY-10128
ZnSO4Sigma AldrichZ0251
Antilichamen
Rat anti-Human C-peptide (insuline)DSHBGN-ID4-sGebruikt bij 150 ng/mL
Muis anti-glucagonProteintech67286-1-Ig1:2000
Konijn anti-somatostatineMilliporeAB54941:500
Gentiaan anti-rat AF488InvitrogenA-110061:500
Ezel anti-muis AF488InvitrogenA-212021:500
Ezel anti-konijn AF488InvitrogenA-212061:500

Referenties

  1. Ong, K. L., et al. regional, and national burden of diabetes from 1990 to 2021, with projections of prevalence to 2050: A systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2021. The Lancet. 402 (10397), 203-234 (2021).
  2. Ismail, L., Materwala, H., Al Kaabi, J. Association of risk factors with type 2 diabetes: A systematic review. Comput Struct Biotechnol J. 19, 1759-1785 (2021).
  3. Prasad, M. K., Mohandas, S., Ramkumar, K. M. Dysfunctions, molecular mechanisms, and therapeutic strategies of pancreatic β-cells in diabetes. Apoptosis. 28 (7-8), 958-976 (2023).
  4. Xue, D., et al. Functional interrogation of twenty type 2 diabetes-associated genes using isogenic human embryonic stem cell-derived β-like cells. Cell Metab. 35 (11), 1897-1914.e11 (2023).
  5. Bartolomé, A. Stem cell-derived β cells: A versatile research platform to interrogate the genetic basis of β cell dysfunction. Int J Mol Sci. 23 (1), 501(2022).
  6. Balboa, D., et al. Functional, metabolic and transcriptional maturation of human pancreatic islets derived from stem cells. Nat Biotechnol. 40 (7), 1042-1055 (2022).
  7. Barsby, T., et al. Differentiating functional human islet-like aggregates from pluripotent stem cells. STAR Protoc. 3 (4), 101711(2022).
  8. Shi, Z. -D., et al. Genome editing in hPSCs reveals GATA6 haploinsufficiency and a genetic interaction with GATA4 in human pancreatic development. Cell Stem Cell. 20 (5), 675-688.e6 (2017).
  9. Fantuzzi, F., et al. In depth functional characterization of human induced pluripotent stem cell-derived beta cells in vitro and in vivo. Front Cell Dev Biol. 10, e967765(2022).
  10. Augsornworawat, P., Maxwell, K. G., Velazco-Cruz, L., Millman, J. R. Single-cell transcriptome profiling reveals β cell maturation in stem cell-derived islets after transplantation. Cell Rep. 32 (8), 108850(2020).
  11. Lin, H., et al. Glucose metabolism and regulation in establishing human stem cell-derived β cell maturation. Cell Rep. 44 (7), 115892(2025).
  12. Maxwell, K. G., Kim, M. H., Gale, S. E., Millman, J. R. Differential function and maturation of human stem cell-derived islets after transplantation. Stem Cells Transl Med. 11 (3), 322-331 (2022).
  13. Thévenet, J., Gmyr, V., Delalleau, N., Pattou, F., Kerr-Conte, J. Pancreatic islet transplantation under the kidney capsule of mice: Model of refinement for molecular and ex-vivo graft analysis. Lab Anim. 55 (5), 408-416 (2021).
  14. Scholl, V. G. S., et al. Assessing implantation sites for pancreatic islet cell transplantation: Implications for type 1 diabetes mellitus treatment. Bioengineering. 12 (5), 499(2025).
  15. Sui, L., et al. Reduced replication fork speed promotes pancreatic endocrine differentiation and controls graft size. JCI Insight. 6 (5), e141553(2021).
  16. Lithovius, V., et al. Non-invasive quantification of stem cell-derived islet graft size and composition. Diabetologia. 67 (9), 1912-1929 (2024).
  17. Lyra-Leite, D. M., Fonoudi, H., Gharib, M., Burridge, P. W. An updated protocol for the cost-effective and weekend-free culture of human induced pluripotent stem cells. STAR Protoc. 2 (1), 100213(2021).
  18. Chen, Y., et al. A versatile polypharmacology platform promotes cytoprotection and viability of human pluripotent and differentiated cells. Nat Methods. 18 (5), 528-541 (2021).
  19. Wells, S. A., Ellis, G. J., Gunnells, J. C., Schneider, A. B., Sherwood, L. M. Parathyroid autotransplantation in primary parathyroid hyperplasia. N Engl J Med. 295 (2), 57-62 (1976).
  20. Kim, H. -I., Yu, J. E., Park, C. -G., Kim, S. -J. Comparison of four pancreatic islet implantation sites. J Korean Med Sci. 25 (2), 203(2010).
  21. Axen, K. V., Pi-Sunyer, F. X. Long-term reversal of streptozotocin-induced diabetes in rats by intramuscular islet implantation. Transplantation. 31 (6), 439-441 (1981).
  22. Prokhorova, T. A., et al. Teratoma formation by human embryonic stem cells is site dependent and enhanced by the presence of Matrigel. Stem Cells Dev. 18 (1), 47-54 (2009).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Pluripotente stamcellenstamcel eilandjesceltherapie bij diabetesimmuundefici nte muizenglucose gestimuleerde insulinesecretieretrieval van het transplantaatclusterpreparatiehistologische analyse

Gerelateerde artikelen