Deze studie presenteert een protocol voor het opzetten van een reproduceerbaar, minimaal invasief rattenmodel van superieure sagittale sinustrombose, geïnduceerd door ferrichloride, waarbij een zijde-hechtingsmethode wordt gebruikt in combinatie met laserspeckle-contrastbeeldvorming en hoogresolutie-echografie voor evaluatie.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Vestiging van een gemodificeerde door ferrichloride geïnduceerde superior sagittale sinus-trombose
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Cerebrale veneuze trombose (CVT) is een zeldzame maar potentieel levensbedreigende neurologische aandoening. Diermodellen bieden cruciale platforms om hun pathofysiologie te onderzoeken en potentiële therapieën te evalueren. In deze studie presenteren we een aangepast rattenmodel van superior sagittale sinus (SSS) trombose met behulp van een FeCl₃-doordrenkte hechtingstechniek. Mannelijke Sprague-Dawley-ratten (220-250 g) ondergingen een paramediane hoofdhuidincisie en het creëren van een schedelbeenvenster van 1 cm boven de SSS. In vergelijking met de traditionele middenlijnincisie voorkomt deze methode adhesie tussen de ingesneden huid, het botvenster en de onderliggende dura mater. Daarnaast voorkomt het interferentie veroorzaakt door hechtknopen boven de SSS, waardoor de kwaliteit van de echobeeldvorming verbetert. Een 2-0 zijden hechting doordrenkt met 40% FeCl3 werd direct op de blootgestelde sinus aangebracht gedurende twee opeenvolgende intervallen van 5 minuten. In vergelijking met de traditionele FeCl3-filter papiermethode minimaliseert deze techniek directe chemische schade aan de parasagittale cortex. Laser-speckle contrast imaging werd gebruikt om cerebrale veneuze perfusie te beoordelen vóór en na het aanbrengen van FeCl3 . Een significante vermindering van de bloedstroom bevestigde succesvolle trombose. Zeven dagen na de operatie werden de vorming van de tromben en de hemodynamische veranderingen geëvalueerd met behulp van een ultrageluid met hoge resolutie en geanalyseerd met Vevo LAB-software, die volumetrische en hemodynamische gegevens van de trombus leverde. Dit aangepaste model biedt een reproduceerbare, minimaal invasieve en beeldvormingscompatibele benadering voor preklinisch CVT-onderzoek.
Inleiding
Cerebrale veneuze trombose (CVT) is een speciaal type cerebrovasculaire aandoening, die 0,5-3% van alle beroertes uitmaakt en een belangrijke oorzaak is van beroertes bij jongvolwassenen1. De kernpathologische verandering van deze ziekte is trombose in de durale veneuze sinussen en/of cerebrale venen, wat leidt tot een verstoorde cerebrale veneuze drainage, wat vervolgens leidt tot verhoogde intracraniële druk, cerebraal oedeem, veneuze infarct of bloeding2. Om de onderliggende mechanismen beter te verduidelijken en nieuwe therapeutische interventies te evalueren, zijn betrouwbare en reproduceerbare diermodellen onmisbaar. Aangezien de superior sagittale sinus (SSS) de meest getroffen locatie is en de oppervlakkige ligging operationele proceduresfaciliteert 2,3, maken huidige dierproeven voornamelijk gebruik van het superior sagittale sinus thrombose (SSST) model.
Onder de verschillende modelleringsmethoden is de inductiemethode voor ferrichloride (FeCl3) een van de meest gebruikte technieken geworden vanwege de operationele eenvoud en kosteneffectiviteit4. In dit model beschadigt de topische toepassing van een FeCl3-oplossing direct het veneuze sinusendotheel, waarbij de subendotheliale matrix wordt blootgelegd door zijn sterke oxidatieve eigenschappen. Deze blootstelling activeert de aggregatie van bloedplaatjes en de stollingscascade, wat uiteindelijk veneuze sinus-trombose5 induceert. Echter, vergeleken met andere methoden heeft het traditionele FeCl3-filter papiermodel ook verschillende nadelen. Het meest kritieke probleem is dat de paramagnetische eigenschappen en hoge magnetische gevoeligheid van FeCl3 aanzienlijke artefacten genereren tijdens magnetische resonantiebeeldvorming, wat de nauwkeurigheid van de trombusbeoordeling en veneuze sinusrecanalisatieobservatie6 ernstig aantast. Bovendien past de vorm van het filterpapier niet goed bij de SSS, waardoor het vatbaar is voor schade aan het hersenparenchym rondom de sinus. Daarom is het moeilijk vast te stellen of de parenchymale schade rond de SSS het gevolg is van de trombose zelf of van directe chemische schade veroorzaakt door FeCl3.
Het algemene doel van het huidige werk is het opstellen van een aangepast FeCl 3-geïnduceerd SSST-rattenmodel dat directe corticale schade veroorzaakt door FeCl3 vermindert en het mogelijk maakt de bloedstroom en trombusgrootte binnen de SSS te beoordelen. Deze studie introduceert een paramediane benadering gecombineerd met een met FeCl3 doordrenkte hechtingstechniek, die directe corticale chemische schade veroorzaakt door FeCl3 minimaliseert en realtime, niet-invasieve en kwantitatieve monitoring van de bloedstroom van veneuze sinussen en trombenvorming mogelijk maakt met behulp van hoogresolutie-echografie.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Dit protocol is goedgekeurd door het Animal Experiments and Experimental Animal Welfare Committee van de Capital Medical University met goedkeuringsnummer AEEI-2025-138. De reagentia en de gebruikte apparatuur worden vermeld in de Materiaaltabel.
1. Vaststelling van een gemodificeerd FeCl 3-geïnduceerd rat SSST-model
- Gebruik mannelijke Sprague-Dawley (SD) ratten van 6-7 weken oud, met een gewicht van 220-250 g voor het experiment. Voor de operatie moet je de ratten 1 week laten acklimatiseren en 12 uur geen voedsel geven.
- Bereid de volgende reagentia, instrumenten en apparatuur voor: 2% pentobarbitaloplossing, 40% FeCl3-oplossing , 5% povidonjodium, normale zoutoplossing, oogzalf, wegwerpscheermesjes, scalpels, chirurgische schaar, pincet, 2-0 en 4-0 zijden hechtingen, omgekeerde snijdnaalden, naaldhouders, 1-mL en 5-mL spuiten, medische tapes, een knaagdier-bedieningsplatform, een verwarmingskussen met rectale temperatuursonde en een micro-handzaakboor voor de schedel.
- Na het wegen doe je de rat met intraperitoneale injectie van 2% pentobarbital (50 mg/kg) (volgens institutioneel goedgekeurde protocollen). Knijp vervolgens met een tang in de huid van het achterbeen om te bevestigen dat er geen onttrekkings- en pijnreacties zijn.
- Breng oogzalf aan en scheer het hoofdhaar van de rat met een wegwerpscheermesje.
- Zet de rat vast in een buikligging op een knaagdierbedieningsplatform met medische tapes en houd de lichaamstemperatuur op 37 ± 0,2 °C met een verwarmingskussen en monitor continu de kerntemperatuur met een rectale sonde.
- Desinfecteer de hoofdhuid met 5% povidonjodium.
- Maak een 15 mm lange paramediane huidincisie op de hoofdhuid en ontleed vervolgens stomp de onderliggende fascia en het periost om de schedel volledig bloot te leggen.
- Dunner de schedel met een craniale boor totdat de SSS duidelijk zichtbaar is, beginnend bij de lambda en 10 mm naar voren langs de sagittale hechting. Gebruik een intermitterende boortechniek om schade aan de onderliggende dura mater en SSS te voorkomen, en irrigeer de boorbit herhaaldelijk met gewone zoutoplossing om thermische schade aan de cortex te voorkomen.
- Breng een segment van 10 mm 2-0 zijden hechting aan, geweekt met 40% FeCl3-oplossing , op het blootgestelde SSS-oppervlak gedurende 5 minuten, en vervang daarna de hechting door een nieuw geweekt segment voor nog eens 5 minuten aanbrengen.
- Spoel het operatieveld drie keer af met 0,5 mL normale zoutoplossing om het resterende FeCl3 te verwijderen.
- Sluit de huid met onderbroken hechtingen met 4-0 zijde hechtingen, gevolgd door povidon-jodium desinfectie.
- Observeer de rat tot hij helemaal wakker is, en breng hem dan terug naar de kooi.
2. Beoordeling van succesvolle modelopbouw
OPMERKING: Tijdens de operatie werd LSCI gebruikt om de veneuze bloedstroom in de SSS te meten na het creëren van het craniale venster en vóór de toepassing van FeCl3 , en opnieuw na het aanbrengen van FeCl3 en het spoelen van het operatieveld, maar vóór het sluiten van de huid. Het model wordt als succesvol gevestigd beschouwd wanneer de veneuze bloedstroom in de SSS een significante afname vertoont.
- Zet de LSCI en de bijbehorende software (RFLSI v5.0) aan en druk vervolgens op de online modus-knop .
- Pas de hoogte en positie van het instrument aan totdat de indicatorlaser in het gezichtsveld is gecentreerd.
- Plaats de rat op een schuimplatform en pas de positie aan totdat de SSS uitlijnt met de indicatorlaser.
- Pas de vergroting en scherpstelling aan totdat het beeld duidelijk wordt weergegeven. Stel de onder- en bovengrenzen van de pseudokleurdrempel in op 10 en 200 om het visuele uiterlijk van het pseudokleurbeeld te optimaliseren.
- Druk op de Set ROI-knop , selecteer het ronde gereedschap en markeer het SSS-gebied.
- Druk op de Record-knop om de veneuze bloedstroom te bepalen en zowel originele als pseudocolor-afbeeldingen vast te leggen.
3. Beoordeling van trombusgebied/volume en hemodynamische veranderingen
OPMERKING: Enkele dagen tot enkele weken na de ingreep gebruik je een ultrageluid met hoge resolutie om trombusveranderingen en vasculaire recanalisatie te beoordelen.
- Bereid de volgende medicijnen, instrumenten en apparatuur voor: isoflurane, ultrasone gel, wegwerpscheermesjes, medische tapes, een anesthesiemachine voor kleine dieren, een hoogresolutie ultrageluids- en fotoakoestisch beeldvormingssysteem voor kleine dieren, een 70 MHz ultra-hoogfrequent UHF57x lineaire array transducer en een 3D-opnamemotor.
- Installeer de 3D-acquisitiemotor en de UHF57x-transducer. Begin dan de motor.
- Verdoof de rat in een inductiekamer met 3% isoflurane gemengd met 1 L/min zuurstof.
- Plaats de rat in buikligging op de 37 °C thermostatische beeldplaat, met het hoofd en de ledematen voorzichtig vastgezet met medische tapes, en houd de anesthesie met 1,5%-2% isofluraan via een neuskegel.
- Scheer het hoofdhaar met een wegwerpscheermes om het detectiegebied bloot te leggen, en breng daarna ultrageluidsgel aan.
- Pas de positie en oriëntatie van de rat ten opzichte van de transducer aan totdat de SSS en intraluminale tromben duidelijk zichtbaar zijn.
- Maakt sequentiële tomografische beelden van de SSS in zowel sagittale als coronale vlakken met behulp van 3Dimaging in B-modus met een stapgrootte van 0,04 mm.
- Gebruik de kleur-Dopplermodus om de bloedstroom in de SSS te observeren en pas vervolgens de Pulsed-Wave (PW) Dopplermodus toe om de bloedstroomsnelheid te meten.
- Stop met de narcose en breng de rat terug in de kooi zodra hij volledig wakker is.
- Exporteer de afbeeldingen en analyseer ze met Vevo LAB-software. Noteer de maximale sagittale en coronale dwarsdoorsnede, en het volume van de trombus in de SSS, samen met de maximale bloedstroomsnelheid van de sinus.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Het schematische diagram van het aangepaste FeCl 3-geïnduceerde SSST-model is weergegeven in Figuur 1. Experimentele resultaten toonden aan dat na het aanbrengen van de met FeCl3 verzadigde zijdehechting op de SSS, LSCI een significante vermindering van de lokale bloedstroom detecteerde, wat wijst op succesvolle occlusie van de veneuze sinus en de gevoeligheid van LSCI voor het detecteren van dynamische perfusieveranderingen bevestigde ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
CVT is een zeldzame maar mogelijk levensbedreigende specifieke vorm van cerebrovasculaire aandoening1. Om de pathologische mechanismen verder te onderzoeken en effectieve interventiestrategieën te ontwikkelen, hebben onderzoekers verschillende diermodellen van SSST ontwikkeld, voornamelijk waaronder SSS-ligatie of -occlusie 7,8,9, protrombotische substantie-injectie
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hoeven geen belangenconflicten aan te geven.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (82401527).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 1 mL Spuit | Shenzhen Huayon Biotechnology Co., Ltd. | 21-3020 | |
| 2-0 zijdedraad | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co.,Ltd | A224 | |
| 3D-acquisitiemotor | Fujifilm VisualSonics | https://www.visualsonics.com/gallery/extended-3d-motor | |
| 4-0 zijdedraad | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co.,Ltd | A222 | |
| 5% povidon-jodium | Shandong Lircon Medical Technology Co., Ltd. | https://www.lircon.cn/products_details/100.html | |
| 5 mL Spuit | Shenzhen Huayon Biotechnology Co., Ltd. | 21-3023 | |
| Wegwerp scheermesje | Dongyang Jinmin Trading Co., Ltd. | ST300 | |
| FeCl3 | Macklin | I811935 | |
| Verwarmingspad | Shenzhen Huayon Biotechnology Co., Ltd. | 36-0001 | |
| Isofluraan | RWD Life Science | R510-22-10 | |
| Laser speckle beeldvormingssysteem | RWD Life Science | RFLSI III | |
| Lineaire array transducer | Fujifilm VisualSonics | UHF57x | |
| Medische tape | Suzhou Konlida Medical Supplies Co., Ltd. | B02 | |
| Micro handmatige schedelboor | RWD Life Science | 78001 | |
| Naaldhouder | RWD Life Science | F31025-13 | |
| Fysiologische zoutoplossing | Shanghai Beyotime Biotechnology Co., Ltd. | ST341-500ml | |
| Oftalmische zalf | Shenzhen Huayon Biotechnology Co., Ltd. | 19-7223 | |
| Omgekeerd snijdende naalden | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co.,Ltd | TJ-3-514 | |
| Rodent operatieplatform | Shanghai Yuyan Scientific Instrument Co., Ltd. | 30150 | |
| Schelpmesje | RWD Life Science | S31015-01 | |
| Schelpsteel | RWD Life Science | S32003-12 | |
| Kleine dier anesthesie machine | RWD Life Science | R500 | |
| Ultrageluid en foto-akoestisch beeldvormingssysteem voor kleine dieren | Fujifilm VisualSonics | Vevo F2 | |
| Vlotte tang | RWD Life Science | F12013-10 | |
| Natrium Pentobarbital | Sigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co., Ltd. | P3761 | |
| Chirurgische schaar | RWD Life Science | S14014-10 | |
| Getande tang | RWD Life Science | F12011-13 | |
| Ultrageluidgel | Shandong Lircon Medical Technology Co., Ltd. | https://www.lircon.cn/products_details/230.html |
Referenties
- Saposnik, G., et al. Diagnosis and management of cerebral venous thrombosis: a scientific statement from the American Heart Association. Stroke. 55 (3), e77-e90 (2024).
- Cohen, O., Pegoraro, S., Ageno, W. Cerebral venous thrombosis. Minerva Med. 112 (6), 755-766 (2021).
- Li, M., Chen, J., Meng, R., Ji, X. Rhythmic deep-brain magnetic stimulation promotes angiogenesis and inhibits apoptosis by regulating the JAK2/STAT3 pathway in rats with superior sagittal sinus thrombosis. Brain Res. 1852, 149509(2025).
- Röttger, C., et al. A new model of reversible sinus sagittalis superior thrombosis in the rat: magnetic resonance imaging changes. Neurosurgery. 57 (3), 573-580 (2005).
- Schoenwaelder, S. M., Jackson, S. P. Ferric chloride thrombosis model: unraveling the vascular effects of a highly corrosive oxidant. Blood. 126 (24), 2652-2653 (2015).
- Hachenberger, M., et al. Aluminium chloride instead of ferric chloride for inducing superior sagittal sinus thrombosis to reduce ferromagnetic artifacts on MRI imaging in experimental models. Sci Rep. 14 (1), 10998(2024).
- Gotoh, M., Ohmoto, T., Kuyama, H. Experimental study of venous circulatory disturbance by dural sinus occlusion. Acta Neurochir (Wien). 124 (2-4), 120-126 (1993).
- Mu, S., et al. A novel rat model for cerebral venous sinus thrombosis: verification of similarity to human disease via clinical analysis and experimental validation. J Transl Med. 20 (1), 174(2022).
- Fries, G., et al. Occlusion of the pig superior sagittal sinus, bridging and cortical veins: multistep evolution of sinus-vein thrombosis. J Neurosurg. 77 (1), 127-133 (1992).
- Wang, J., Ji, X., Ling, F., He, X. Comparison of anticoagulation and thrombolysis treatments in a rat model of superior sagittal sinus thrombosis. Int J Neurosci. 124 (7), 532-541 (2014).
- Ye, Y., et al. Impacts on thrombus and chordae Willisii during mechanical thrombectomy in the superior sagittal sinus. Front Neurol. 12, 639018(2021).
- Chen, C., et al. Photothrombosis combined with thrombin injection establishes a rat model of cerebral venous sinus thrombosis. Neuroscience. 306, 39-49 (2015).
- Rahal, J. P., Malek, A. M., Heilman, C. B. Toward a better model of cerebral venous sinus thrombosis. World Neurosurg. 82 (1-2), 50-53 (2014).
- Kim, D. E., Schellingerhout, D., Jaffer, F. A., Weissleder, R., Tung, C. H. Near-infrared fluorescent imaging of cerebral thrombi and blood-brain barrier disruption in a mouse model of cerebral venous sinus thrombosis. J Cereb Blood Flow Metab. 25 (2), 226-233 (2005).
- Srivastava, A. K., Kalita, J., Haris, M., Gupta, R. K., Misra, U. K. Radiological and histological changes following cerebral venous sinus thrombosis in a rat model. Neurosci Res. 65 (4), 343-346 (2009).
- Wang, W., et al. Establishment of a rat model of superior sagittal-sinus occlusion and recanalization via a thread-embolism method. Neuroscience. 416, 41-49 (2019).
- Hachenberger, M., et al. Comparison of edoxaban and enoxaparin in a rat model of AlCl3-induced thrombosis of the superior sagittal sinus. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 396 (12), 3887-3892 (2023).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
