Standaardisatie van het Rat Intraluminal MCAO-model: Een gedetailleerd protocol met kwaliteitscontrolemaatregelen

Samenvatting

Dit protocol demonstreert een geoptimaliseerde 60-minuten middelste cerebrale arterie occlusie (MCAO) techniek bij ratten. Het protocol wordt gevalideerd met multimodale benaderingen, met een succespercentage van 87,5% en minimale sterfte, wat reproduceerbare infarcten en gedragsuitkomsten voor beroerteonderzoek oplevert.

Samenvatting

Het rat middle cerebrale artery occlusion (MCAO)-model blijft de referentiestandaard voor het ontrafelen van de pathofysiologie van ischemische beroerte en het valideren van neuroprotectieve therapieën. Subtiele chirurgische afwijkingen kunnen echter het infarctvolume en de gedragsuitkomsten ingrijpend veranderen. Met behulp van een "visual-then-systematise"-kader hebben we elke stap van modelopbouw en validatie opnieuw onderzocht. Gedetailleerde fotografische documentatie van belangrijke chirurgische herkenningspunten en kritieke stappen werd uitgevoerd om anatomische oriëntatie en filamentplaatsing te standaardiseren. 2,3,5-Trifenyltetrazoliumchloride (TTC) kleuring werd gebruikt om het volume en de topologie van infarcten nauwkeurig in kaart te brengen bij 24 uur en 72 uur na reperfusie. Neurologische tekorten werden beoordeeld met de Zea-Longa, Bederson en aangepaste Garcia-schalen. Vierentwintig mannelijke Sprague-Dawley-ratten ondergingen 60 minuten tijdelijke MCAO; Infarctvolume en neurologische scores werden beoordeeld op 24 uur en 72 uur. Ongeveer 87,50% van de dieren behaalde een succesvolle cerebrale bloedstroomblokkade (Zea-Longa ≥ 1 en een ondubbelzinnig TTC-gedefinieerd infarct), met een totale sterfte van 12,50%, wat getuigt van de hoge trouwheid van het model. Dit gestandaardiseerde protocol biedt een technisch verfijnde, reproduceerbare basis voor preklinisch beroerteonderzoek, waardoor interlaboratoriumconsistentie in studies naar beroertepathofysiologie en therapeutische interventies mogelijk is.

Inleiding

Beroerte is de op één na belangrijkste doodsoorzaak en de derde belangrijkste oorzaak van invaliditeit wereldwijd ^1,2. Beroerte treft onevenredig veel lage- en middeninkomenslanden, waar het gemiddeld 15 jaar eerder voorkomt dan in hoge-inkomenslanden¹. De twee hoofdtypen zijn ischemische beroerte (85%) en intracerebrale bloeding (15^%). Ischemische beroerte, die verantwoordelijk is voor het overgrote deel van de beroertes, ontstaat door een blokkade van de cerebrale bloedtoevoer, wat leidt tot celdood en herseninfarct⁴. De ischemische cascade omvat meerdere biochemische gebeurtenissen, waaronder significante pro-oxidatieve processen ^5,6.

Ondanks uitgebreide preklinische en klinische inspanningen zijn slechts een handvol therapieën—met name intraveneuze trombolyse met weefselplasminogenactivator en mechanische trombectomie—effectief gebleken, en deze behandelingen worden beperkt door smalle therapeutische vensters en strikte selectiecriteria voor patiënten. Daarom is er een dringende behoefte om de cellulaire en moleculaire mechanismen achter ischemisch letsel, neurovasculaire reparatie en herstel na een beroerte te verduidelijken. Een reproduceerbaar, klinisch relevant diermodel is onmisbaar om dit doel te bereiken.

Het midden-cerebrale arterie occlusie (MCAO) model wordt breed gebruikt om ischemische beroerte bij knaagdieren^te onderzoeken ^7,8. De intraluminale filamentocclusiemethode is een van de meest klassieke en meest gebruikte MCAO-technieken⁹. Deze techniek kan zowel permanente als tijdelijke occlusies modelleren zonder craniectomie te hoeven doen. Een nieuwere transfemorale techniek met endovasculaire draden heeft veelbelovend gebleken voor het induceren van tijdelijke MCAO bij ratten, wat consistentere resultaten biedt¹⁰. Dit model houdt in dat de middelste cerebrale arterie wordt geblokkeerd, meestal met behulp van een intraluminale filamenttechniek¹¹. MCAO veroorzaakt focale cerebrale hypoperfusie, wat leidt tot ischemie en reperfusieletsel¹².

Hoewel MCAO waardevol is voor het onderzoeken van de pathofysiologie van beroertes en mogelijke behandelingen, kan het variabele laesievolumes⁷ veroorzaken. Daarom kunnen verbeteringen aan het MCAO-model—zoals het verfijnen van reperfusietechnieken, het opstellen van gestandaardiseerde bedrijfsprotocollen en het ontwikkelen van uniforme evaluatiecriteria—de variabiliteit in infarctlocatie en -volume verminderen, waardoor het nut ervan in ischemisch beroerteonderzoek wordt vergroot.

Dit protocol vereist een leercurve van ongeveer 10–15 operaties om consistente^{resultaten te} behalen. De slagingspercentages kunnen variëren afhankelijk van de ervaring van de gebruiker en rattenstam¹⁴. Het model is geschikt voor het bestuderen van acute ischemische beroerte, maar kan mogelijk niet volledig menselijke comorbiditeiten zoals hypertensie of diabetes¹⁵ repliceren. Daarom wilden we een geoptimaliseerd MCAO-protocol ontwikkelen en rigoureus valideren dat tot doel heeft experimentele variabiliteit te verminderen door middel van gestandaardiseerde procedures en strenge kwaliteitscontrolemaatregelen. Vier complementaire innovaties werden geïntegreerd om dubbele verbeteringen in standaardisatie en databetrouwbaarheid te bereiken: (1) Dual-time-point longitudinale beoordeling—neurologische scores van de Zea-Longa, Bederson en Modified Garcia schalen werden parallel verkregen met 2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride (TTC)-afgeleide infarctvolumes bij 24 uur en 72 uur na reperfusie, waarmee de temporele relatie tussen oedeemoplossing en functioneel herstel werd afgebakend; (2) Drievoudige kruisvalidatie—geblindeerde, dubbele onderzoekerscoring met geïntegreerde tri-schaal kalibratie verhoogde de gevoeligheid en precisie van gedragsevaluatie significant; (3) Volledige hypothermische rapid-sectioning—een standaardprocedure (SOP) van "90 s ijsbadextractie gevolgd door enkelstaps 2-mm coronale snijden in voorgekoelde mallen" werd vastgesteld om autolyse en menselijke fouten te minimaliseren, zodat hoge volumemetrische metingen werden gegarandeerd; (4) Geïntegreerd kwaliteitscontrolekader — een uitgebreide SOP die preoperatief vasten, anesthesiedieptecontrole, preoperatieve thermoregulatie en kruisbesmettingspreventie omvat, werd opgesteld om een reproduceerbare en gemakkelijk overdraagbare MCAO-standaardprocedure te leveren, waarmee een solide basis werd gelegd voor consistentie tussen laboratoriums en kruisstudievergelijkbaarheid.

Protocol

Het experiment werd goedgekeurd en begeleid door de Institutional Animal Experiments and Experimental Animal Welfare Committee van de Capital Medical University. Alle protocollen voldoen aan de NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (NIH Publ. 80-23, 1996 rev.), en steriele apparatuur en aseptische technieken zijn vereist.

1. Dierselectie

1. Gebruik mannelijke Sprague-Dawley-ratten (6–8 weken oud, 240–270 g) verkregen van een gecertificeerde leverancier van laboratoriumdieren (vergunning nr. SCXK (Beijing) 2021-0011) om een model van MCAO op te stellen.
2. De dieren conventioneel te huisvesten met ad libitum voedsel en water; alle procedures volgden de Internationale Ethische Code.
3. Gebruik de volgende criteria op basis van het lichaamsgewicht van het dier voor de keuze van filamentgrootte om consistente occlusie te garanderen:
   - 220–250 g: 0,33–0,35 mm diameter
   - 250–280 g: 0,35–0,38 mm diameter
   - 280–310 g: 0,38–0,40 mm diameter
   OPMERKING: Deze specificaties houden rekening met leeftijdsgebonden toename in vatdiameter en verminderen de incidentie van SAH of incomplete occlusie¹³.

2. Steekproefgrootte

1. Bereken de steekproefgrootte met behulp van een steekproefgrootte-berekeningssoftware. Op basis van voorlopige gegevens die een verwacht infarctvolume van 35% ± 10% (gemiddelde ± SD) in de MCAO-groep laten zien tegenover 0% ± 2% in de SAM-groep, schat een effectgrootte (Cohen's d). Voor een tweezijdige Mann-Whitney U-test (niet-parametrisch alternatief voor de t-test), met α = 0,05 en vermogen (1-β) = 0,80, bereken een minimale steekproefgrootte.
   OPMERKING: De effectgrootte werd geschat op 3,5 en de minimale steekproefgrootte was 6 dieren per groep.
2. Om rekening te houden met de verwachte sterfte (12,5%) en het uitsluitingspercentage (5–10%), worden 24 ratten in de MCAO-groep en 6 ratten in de SAM-groep opgenomen, wat voldoende vermogen (>0,90) biedt voor het primaire eindpunt (infarctvolume bij 24 uur).

3. Inclusie- en uitsluitingscriteria

1. Neem de dieren mee als ze aan de volgende criteria voldeden: (1) mannelijke Sprague-Dawley ratten, 240–270 g, 6–8 weken oud; (2) afwezigheid van reeds bestaande neurologische tekorten (preoperatieve neurologische score = 0); (3) succesvolle inleiding van anesthesie zonder complicaties.
2. Sluit dieren uit van de analyse als ze het volgende vertoonden: (1) subarachnoïdale bloeding (SAH) zichtbaar bij de necropsie; (2) vroegtijdige dood (<24 uur na reperfusie) niet gerelateerd aan experimentele interventie; (3) mislukte occlusie (neurologische score = 0 en afwezigheid van door TTC gedefinieerde infarct); (4) technische chirurgische falen (bijv. CCA-ruptuur).
   OPMERKING: Deze criteria waren vooraf vastgesteld vóór de start van het onderzoek om selectiebias te minimaliseren.
3. Dierenvervangingsbeleid: Vervang alleen dieren die zijn uitgesloten vanwege technische chirurgische fouten of intraoperatieve dood om de statistische kracht te behouden. Vervang dieren niet door mislukte modellering (mislukte occlusie), maar rapporteer ze als onderdeel van de berekening van het succespercentage om te voorkomen dat de variabiliteit kunstmatig wordt verminderd.

4. Pre-operatieve voorbereidingen

1. Bereid autoclaved gereedschap, steriel filament en een gedrapeerd veld voor.
2. Er is geen routinevast vereist; Beperk indien nodig de vastenduur tot 2–4 uur. Induceer anesthesie met isoflurane (3–4%) en houd deze tijdens de procedure op 1,5–2% in 30–40% O₂. Bevestig de diepte van de anesthesie door het verlies van de rechtstaande reflex en de teenknelling.
3. Houd de lichaamstemperatuur op 37 ± 0,5 °C met een feedbackgestuurde verwarmingsmat met rectale temperatuurmonitoring.
4. Scheer de nek en hoofdhuid, maak het gebied schoon met povidonjodium, gevolgd door 70% ethanol.
5. Dien buprenorfine (0,05 mg/kg, subcutaan) 30 minuten voor de operatie toe en elke 12 uur postoperatief gedurende 48 uur, of meloxicam (1 mg/kg, subcutaan) eenmaal dagelijks gedurende 3 dagen¹⁶. Beoordeel pijn door het verzorgingsgedrag, houding en spontane activiteit te monitoren; Geef extra pijnstillende middelen als de tekenen van ongemak aanhouden.

5. Occlusie van de MCA

1. Plaats de rat in dorsale rust met het hoofd voorzichtig uitgestrekt om de ventrale nek bloot te leggen.
2. Maak een middenlijn cervicale incisie (1,5–2,0 cm) met een irisschaar.
3. Scheid stomp de sternomastoideus en omohyoïdale spieren met behulp van gebogen pincet om de bifurcatie van de linker arteria carotis (CCA) bloot te leggen.
4. Ligaer de arteria carotis (ECA) distaal met een permanente 4-0 zijdehechting en proximaal met een tijdelijke ligatuur. Maak een kleine incisie tussen de twee ECA-ligaturen met behulp van een microschaar.
5. Sluit tijdelijk de CCA en de interne halsslagader (ICA) af met microvasculaire klemmen (60 g druk).
6. Steek een 4-0 siliconengecoate monofilament (0,35–0,40 mm diameter) door de ECA-incisie. Zet het achteraf in de CCA en leid het vervolgens om naar de ICA voorbij de CCA-bifurcatie.
   OPMERKING: Zorg ervoor dat het filament de ICA binnenkomt richting de schedelbasis, niet naar de arteria pterygopalatine (PPA) die lateraal vertakt. Als er weerstand wordt gevonden op <10 mm, trek dan het filament terug, draai de kop van het dier 30° naar de contralaterale zijde en beweeg je weer naar voren om voorbij de oorsprong van de PPA te leiden.
7. Schuif het filament 18–20 mm verder vanaf de CCA-bifurcatie totdat lichte weerstand wijst op occlusie van de MCA-oorsprong. Controleer de diepte met behulp van de vooraf gemarkeerde referentielijn op het filament (geplaatst 2 mm proximaal van de siliconen stop), gemeten met een remklauw vanaf het ECA-stronkeninzetpunt. Maak de CCA-klem los zodra het filament op zijn plek zit.

6. Reperfusie

1. Na 60 minuten occlusie, open de incisie weer en maak je de tijdelijke ECA-ligatuur los.
2. Trek het filament voorzichtig terug totdat de punt de ECA-stomp bereikt, waardoor de bloedstroom wordt hersteld. Plaats onmiddellijk een permanente ligatuur proximaal aan de stomp om terugbloeding te voorkomen. Sluit de wond in lagen.
3. Breng de rat over in een verwarmde herstelkooi voor continue monitoring.

7. Schijnoperatie

1. Bereid het dier voor volgens dezelfde hierboven beschreven procedure voor MCAO (nuchteren, anesthesie, temperatuurbeheersing, steriel afhangen).
2. Voer een cervicale incisie en CCA-bifurcatie uit zoals hierboven.
3. Ontleed en ontbloot het vat. Steek het filament niet in.
4. Laat de slagaders open blijven; Induceer geen cerebrale ischemie.
5. Sluit de incisie in lagen na 10 minuten blootstelling. Breng het dier naar een verwarmde herstelkooi voor monitoring.

8. Postoperatieve neurologische scores

1. Evalueer 24 uur en 72 uur na reperfusie, direct voor het opofferen voor het infarctvolume.
2. Laat het dier 30 minuten wennen aan een rustige kamer, 25 °C.
3. Laat twee onafhankelijke onderzoekers blind zijn voor groepstoewijzing. Laat elke onderzoeker scores op aparte bladen noteren zonder overleg; elk verschil tussen beoordelaars ≥1 punt triggert herbeoordeling.
4. Schalen (in volgorde van toediening): Voer Zea-Longa¹⁷ uit (Tabel 1), Bederson¹⁸ (Tabel 2) en Modified Garcia¹⁹ (Tabel 3) scores, volgens de laatst gepubliceerde protocollen voor consistente criteria.
5. Gebruik het gemiddelde van de twee waarnemers voor statistische analyse. Sluit gegevens van elk dier uit als de gemiddelde scores met >10% verschillen en vervang door een nieuw proefpersoon.

9. Meting van het volume van herseninfarcten

1. Na 24 en 72 uur na reperfusie doof je ratten diep met 5% isofluran. Bevestig diepe anesthesie door verlies van de rechtstaande reflex en de teenknyprespons, samen met stabiele ademhaling, voordat je verder gaat.
2. Verwijder de hersenen snel binnen 90 seconden na diepe verdoving, spoel met ijskoude PBS en snijd in 2 mm coronale sneetjes met behulp van een gekoelde rattenhersenmatrix. Houd je tijdens het snijden aan de volgende voorzorgsmaatregelen
   1. Houd de hele procedure op ijs op 0–4 °C; Oogst de hersenen binnen 90 seconden en plaats ze plat in een voorgekoelde matrix.
   2. Gebruik een scherp mes om enkele, schone sneden te maken voor precieze 2 mm coronale doorsneden, waarbij elke snee in rostro-caudale volgorde wordt verzameld in ijskoude PBS.
   3. Maak de matrix en het mes direct schoon met 75% ethanol tussen de dieren om kruisbesmetting te voorkomen.
3. Na het voorverwarmen van 2% TTC tot 37 °C, dompel je de plakjes helemaal onder en laat je ze 20 minuten in het donker incuberen, waarbij je zachtjes elke 5 minuten draait op 20 minuten.
4. Stop de reactie direct door drie keer te spoelen met 4 °C PBS. Daarna 4% paraformaldehyde 's nachts bij 4 °C aanbrengen.
5. Bij 300 dpi fotografeer je beide kanten van elke plak één keer.
   1. Gebruik vaste verlichting tegen een witte achtergrond om schaduwen en reflecties te elimineren.
   2. Leg sneden plat zonder overlapping, en voeg een schaalbalk en ID-label toe in elk frame. Houd de camera loodrecht op de secties en houd de brandpuntsafstand en witbalans constant gedurende de hele foto.
6. Kwantificeer het infarctvolume met behulp van ImageJ.
   1. Importeer de 300 dpi afbeelding (RGB-formaat) en zet deze om naar 8-bit grijswaarden (afbeelding > Type > 8-bit).
   2. Pas Otsu's automatische drempel toe (Afbeelding > Aanpassen > automatische drempel > selecteer Otsu) om het infarct (wit) te scheiden van levensvatbaar weefsel (rood).
   3. Gebruik het Freehand-selectiegereedschap om de ipsilaterale hemisfeergrens te omlijnen.
   4. Meet het gebied (Analyze > Measure) en registreer het aantal pixels.
   5. Bereken infarctvolume: Σ (infarctoppervlak × snitdikte [2 mm]) × (contralateraal hemisfeervolume/ipsilateraal hemisfeervolume), uitgedrukt als een percentage van het contralaterale hemisfeer.

10. Statistische analyse

1. Presenteer de gegevens als gemiddelde ± standaarddeviatie (SD) of mediaan [interkwartielbereik] indien van toepassing.
2. Voer vergelijkingen tussen groepen uit met behulp van de ongepaarde Student's t-test of de Mann-Whitney U-test voor niet-normaal verdeelde gegevens.
3. Stel statistische significantie in op P < 0,05. Voer alle analyses uit met een geschikte statistische analysesoftware.

Resultaten

Dieren werden willekeurig toegewezen aan ofwel 24 uur (n = 10) of 72 uur (n = 10) post-reperfusie overlevingsgroepen voor terminale TTC-kleuring. Nog eens 4 ratten ondergingen MCAO, maar stierven vóór het geplande eindpunt (sterftecijfer 12,5%). De SAM-groep bestond uit n = 6. Het totale aantal gebruikte dieren was dus 30 (24 MCAO + 6 SHAM).

Ratten ondergingen 60 minuten MCAO om cerebrale ischemie op te wekken (Figuur 1). Reperfusie werd gestart door het intraluminale filament te verwijderen en de proximale ligatuur bij ECA los te laten. Van de 24 MCAO-ratten stierven er 3 binnen 72 uur; de een vertoonde uitgebreide infarct bij postmortale TTC-kleuring binnen 24 uur, terwijl de ander binnen 72 uur aan onbekende oorzaken overleed. Twee extra ratten werden uitgesloten vanwege onsuccesvolle modellering (neurologische scores voldeden niet aan de criteria en TTC-kleuring toonde geen infarct aan). Dus was het sterftecijfer van 72 uur 12,50%. We definieerden succesvolle modelopbouw als overleving van 24 uur plus een Longa-score van 1–3 en het succesvolle modelleringspercentage bereikte 87,50%.

De neurologische functie werd geëvalueerd 24 uur en 72 uur na het begin van de beroerte (vóór de meting van het infarctvolume). Drie meest gebruikte schalen die in de literatuur worden gerapporteerd—Zea-Longa, Bederson en aangepaste Garcia—werden gebruikt om een uitgebreide beoordeling te bieden (Figuur 2). Bij 24 uur scoorden de ratten (n = 20) 2,02 ± 0,41 op de Zea-Longa-schaal, 2,80 ± 0,41 op de Bederson-schaal en 8,15 ± 1,18 op de aangepaste Garcia-schaal; deze tekorten bleven uitgesproken op 72 uur (Zea-Longa: 1,65 ± 0,59; Bederson: 1,93 ± 0,38; aangepaste Garcia: 11.00 ± 1.34). Het infarctvolume, uitgedrukt als percentage van de contralaterale hemisfeer, was 37,61 ± 2,81% na MCAO en daalde tot 28,32 ± 4,18% na 72 uur.

Figuur 1: Schematisch diagram van de arteriële fysiologie van de arteriële fysiologie van de linker cervico-cerebrale arterie en de embolisme van de middencerebrale arterie bij de rat. Schematisch diagram van (A) cervico-cerebrale arteriële anatomie, (B) pre-insertie, (C) post-insertie, en (D) filamentmispositie in de pterygopalatine arterie. CCA: arteria halsslagader (arteria halsslagader); ICA: arteria halsslagader interna; ECA: externe halsslagader; PPA: arteria pterygopalatine; MCA: middenarterie cerebrale arterie. "Zwarte driehoek": de incisieplaats; Blauwe lijn: Het filament. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Meting van infarctvolume en neurologische gedragsbeoordeling na occlusie van de cerebrale arterie bij ratten. (A) TTC-kleuring van hersensecties. (B) Het infarctvolume bij 72 uur is kleiner dan dat bij 24 uur. (C,D) De Zea-Longa-scores en Bederson-scores bij 72 uur zijn lager dan die bij 24 uur. (E) De aangepaste Garcia-scores bij 72 uur zijn hoger dan die bij 24 uur. ****P < 0,0001, ***P < 0,001, **P < 0,01. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Manifestatie	Score / punten
Geen neurologisch tekort	0
Contralaterale voorpoot gebogen en geadduceerd tijdens de staartophanging (milde neurologische deficiëntie)	1
Spontaan cirkelen naar de contralaterale kant tijdens het kruipen (matig neurologisch tekort)	2
Vallen naar de tegenoverliggende kant bij staan of lopen	3
(ernstig neurologisch tekort)
Geen spontane beweging vergezeld van verminderd bewustzijn	4

Tabel 1: Zea-Longa score^.

Manifestatie	Score/punten
Pak de staart van het dier vast en til deze op zodat het lichaam 10 cm boven de bank hangt. Bij normale ratten blijven beide voorpoten naar de vloer gestrekt. Ratten met neurologische tekorten kunnen de volgende gedragingen vertonen:
Geen neurologisch tekort	0
De paretische voorpoot wordt gebogen en dicht bij de buik gehouden, terwijl het niet-aangetaste ledemaat naar de bank uitstrekt	1
Naast het gedrag beschreven in 1, neemt de weerstand tegen laterale duwen naar de paretische zijde aanzienlijk af wanneer het dier op de bank wordt gelegd	2
Naast de gedragingen beschreven in 1 en 2, cirkelt het dier tijdens het lopen naar de paretuszijde	3

Tabel 2: Bederson-score^.

Item	Manifestatie	Score/punten
a) Spontane Beweging	Normale activiteit	3
(Observeer de activiteit van de rat in zijn thuiskooi gedurende 5 minuten)	Licht aangetast	2
	Matig beperkt	1
	Geen spontane beweging	0
b) Symmetrische ledemaatbeweging	Symmetrische houding	3
	Asymmetrische houding	2
	Hemiplegie	1
c) Voorpoot uitstrekken	Symmetrisch	3
(Pak de staart vast en breng de voorpoten naar de rand van de tafel; let op de voorpootstrekking)	Licht asymmetrisch	2
	Duidelijk asymmetrisch	1
	Hemiplegie	0
d) Grip en klimvermogen	Klimt sterk met stevige grip	3
	Unilateraal tekort waargenomen	2
	Niet in staat om te klimmen of cirkels te maken	1
e) Bilaterale tactiele reflex op het lichaam	Symmetrisch aan beide zijden	3
	Traag respons aan één kant	2
	Geen reactie aan één kant	1
f) Bilaterale vibrissae-aanrakingsrespons	Symmetrisch	3
	Asymmetrisch	2
	Geen reactie	1

Tabel 3: Aangepaste Garcia-score. Totale score: 0–18 punten; Hogere scores duiden op een betere neurologische functie.

Discussie

Het is belangrijk te verduidelijken dat het primaire doel van deze studie methodologische standaardisatie was in plaats van biologische ontdekking. Het ontwikkelen van een gestandaardiseerd MCAO-protocol is essentieel om de variabiliteit tussen laboratoriums te verminderen en de reproduceerbaarheid in ischemisch beroerteonderzoek te vergroten. Dit protocol verbetert de procedurele transparantie door rigoureuze kwaliteitscontrolemaatregelen en pakt veelvoorkomende technische tekortkomingen in MCAO-modellering aan, waaronder gestandaardiseerde filamentinsertie, temperatuurregulatie en histologische verwerking.

Hoewel de waargenomen vermindering van infarctvolume van 24 uur naar 72 uur en gedeeltelijk neurologisch herstel de verwachte pathofysiologische verschijnselen bij tijdelijke MCAO vertegenwoordigen, ligt de bijdrage van deze studie in het vaststellen van de temporele betrouwbaarheid van deze eindpunten met behulp van een streng gestandaardiseerde procedure. Door een gedetailleerd, stapsgewijs technisch kader te bieden, zorgt dit protocol ervoor dat toekomstige mechanistische studies—of het nu gaat om neuro-inflammatoire cascades, apoptotische paden of therapeutische interventies—worden gebaseerd op reproduceerbare en vergelijkbare basisgegevens. We positioneren dit werk expliciet als een technische bron die past bij de scope van JoVE, en bieden een basis voor gestandaardiseerd preklinisch beroerteonderzoek in plaats van het bevorderen van mechanistische inzichten.

Verschillende stappen in dit protocol zijn bijzonder belangrijk om consistente ischemie en reperfusie te waarborgen. Ten eerste is het nauwkeurig verplaatsen van de occlusielijn totdat er een lichte weerstand wordt gevoeld essentieel voor reproduceerbare MCAO, aangezien een kleine afwijking in insertiediepte kan leiden tot onvolledige occlusie of subarachnoïdale bloeding ^20,21. Ten tweede is het handhaven van een strikte intraoperatieve normale lichaamstemperatuur (37 ± 0,5 °C) en postoperatief temperatuurbeheer cruciaal, omdat zowel te lage als te hoge lichaamstemperatuur het infarctgebied en de neurologische uitkomst aanzienlijk kan veranderen^12,22. Ten derde kan het snel verwijderen van de hersenen binnen 90 seconden en het uitvoeren van koeling van een ijsbad autolyse minimaliseren en de weefselintegriteit behouden, waardoor de nauwkeurigheid van TTC-kleuring en volumeanalyse^wordt gegarandeerd. Als deze stappen consequent kunnen worden uitgevoerd, zullen ze de modelnauwkeurigheid en vergelijkbaarheid tussen studies aanzienlijk verbeteren.

We hebben de traditionele MCAO-methode verbeterd om de reproduceerbaarheid en gebruiksgemak te vergroten. Het gebruik van voorgekoelde hersensnijmallen en gestandaardiseerde snijprotocollen heeft menselijke fouten en snijartefacten verminderd. Daarnaast heeft de invoering van een drieschaal (Zea-Longa, Bederson en aangepaste Garcia) neurologische functiebeoordeling door twee geblindeerde onderzoekers de robuustheid en gevoeligheid van de functionele beoordeling verhoogd 17,18,19. Door gedetailleerde standaardprocedures voor elke programmafase helpt het veelvoorkomende problemen te identificeren zoals filamentafscheid, voortijdige reperfusie of postoperatieve onderkoeling. Richtlijnen voor probleemoplossing voor veelvoorkomende complicaties zijn: (1) Verkeerd geplaatste occlusielijn (PPA-ingang), herkend door het ontbreken van weerstand op 10–12 mm en directe neurologische verbetering—indien aangetroffen, trek het filament onmiddellijk terug, draai het hoofd van het dier 30° naar de contralaterale zijde, en beweeg je met lichte mediale hoek naar de schedelbasis; (2) Voortijdige reperfusie, aangegeven door plotselinge neurologische verbetering tijdens occlusie—zorg dat de siliconenstop stevig vastzit op de ECA-stomp, controleer of de filamentdiameter overeenkomt met de slagadergrootte (0,35–0,40 mm voor ratten van 240–270 g), en overweeg het gebruik van een langer filament (verhoging van de siliconencoating met 0,5 mm) als de verplaatsing aanhoudt; en (3) Postoperatieve onderkoeling (rectale temperatuur <36ºC)—verhoog de temperatuur van het verwarmingskussen tot 38 °C, plaats een warmtelamp 30 cm boven het dier en geef warme steriele zoutoplossing (0,5 mL, intraperitoneaal, 37ºC).

Ondanks deze vooruitgang kent dit protocol verschillende beperkingen. Ten eerste vereist de techniek een aanzienlijke leercurve (10–15 operaties) om consistente succespercentages te bereiken, en individuele variaties in de anatomie van de vaaten van ratten kunnen de plaatsing van filamenten^{beïnvloeden.} Ten tweede is het huidige protocol gebaseerd op post-hoc verificatie (neurologische scoring en TTC-kleuring) in plaats van intraoperatieve cerebrale bloedstroommonitoring (LDF of LSCI), wat de kwaliteitscontrole tijdens de operatie beperkt en vroege uitsluiting van dieren met onvolledige occlusie²⁵ voorkomt. Ten derde was validatie beperkt tot jonge mannelijke Sprague-Dawley ratten, waardoor de generaliseerbaarheid beperkt werd tot vrouwtjes, oudere dieren en comorbide modellen^26,27. Toekomstige studies moeten het volgende bevatten: (1) beide geslachten om geslacht als biologische variabele te behandelen; (2) oudere ratten (12–18 maanden) met vaatcomorbiditeiten; en (3) realtime CBF-monitoring om de reproduceerbaarheid in geneesmiddeleninterventiestudies te vergroten.

Deze methode is bijzonder waardevol bij preklinische geneesmiddelscreening, omdat de consistentie en translationele relevantie van de resultaten van cruciaal belang zijn. Het gestandaardiseerde protocol dat in dit artikel wordt beschreven, biedt veel potentie om de strengheid en reproduceerbaarheid van ischemische beroerteonderzoek te verbeteren. Toekomstige toepassingen van dit protocol omvatten: (1) preklinische screening van neuroprotectieve middelen toegediend tijdens het reperfusievenster; (2) mechanistische studies van ischemie-reperfusieschade met behulp van de 24 uur en 72 uur tijdstip; (3) onderzoek naar neuroplasticiteit en functioneel herstel na een beroerte; en (4) validatie van therapeutische doelwitten in combinatie met genetische of farmacologische interventies. Door gedetailleerde en video-ondersteunde SOP te bieden, is ons doel de brede adoptie van deze methode in laboratoria van verschillende professionele niveaus te faciliteren, wat uiteindelijk bijdraagt aan betrouwbaarder en klinisch relevanter preklinisch beroerteonderzoek.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
2% TTC-kleuringsoplossing	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.	T8170	25 g/fles, ≥98 % zuiverheid
4% PFA	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.	P1110	500 mL kant-en-klaar
Absorbeerbare hechtdraad	Shandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd.	VCP345H	5-0 Vicryl
Adson-tang	Shanghai Jinzhong Surgical Instrument Co., Ltd.	JD-11010	1×2 tanden, 12 cm
Dumont gebogen tang	Shanghai Jinzhong Surgical Instrument Co., Ltd.	JD-11052	11 cm lengte, 0,05 mm fijne punt
Feedback-verwarmingskussen	Shenzhen Reward Life Science & Technology Co., Ltd.	69001	37 ± 0,3 °C gesloten lus
ImageJ	National Institutes of Health	versie 1.53k
Irisschaar	Shanghai Jinzhong Surgical Instrument Co., Ltd.	JD-14060	Geboogde punt, 10 cm
Micro-vasculaire clips	Shenzhen Ruiwode Lift Technology Co.,Ltd.	JD-16010	1,5 cm gebogen clip
Niet-absorbeerbare zijde	Shanghai Pudong Jin-Huan Medical Products Co., Ltd.	S-2304	6-0 Zwarte zijden draad
PASS-software	NCSS, LLC, Kaysville, UT, USA	versie 15.0	Software voor berekening monstergrootte
Rattenhersenmatrix	Shenzhen Ruiwode Lift Technology Co.,Ltd.	68610	2 mm coronale sleuven
Silicone-gecoat nylon filament	Shenzhen Ruiwode Lift Technology Co.,Ltd.	60-1250	0,35 mm OD, 30 mm siliconen punt, EO-steriel
Klein-dier anesthesieapparaat	Shenzhen Ruiwode Lift Technology Co.,Ltd.	R500IE	Isofluraanevaporator, inductiekamer & masker inbegrepen
SPSS	IBM Corp., Armonk, NY, USA	versie 26.0	Statistische analysesoftware
Vannas micro-schaar	Shanghai Jinzhong Surgical Instrument Co., Ltd.	JD-14058	Geboogde punt, 8 cm