Effecten van Cordyceps Polysacchariden op door D-Galactose geïnduceerde niersenescentie

Samenvatting

Er werd een senescentiemodel ontwikkeld in muizen en HK-2-cellen met behulp van D-galactose. De effecten van Cordyceps-polysacchariden (CCP) op nierveroudering werden geëvalueerd met behulp van western blotting en immunofluorescentie, waarbij mitochondriale veranderingen werden beoordeeld door detectie van reactieve zuurstofsoorten en JC-1-kleuring.

Samenvatting

Chronische nierziekte (CKD) vormt een aanzienlijk wereldwijd gezondheidsprobleem. Veroudering van niertubulaire epitheelcellen (RTEC's) belemmert nierregeneratie en -herstel en bevordert de progressie van CKD door de afgifte van het senescentie-geassocieerde secretorische fenotype (SASP). Cordyceps sinensis, waarvan de belangrijkste bioactieve bestanddelen Cordyceps polysacchariden (CCP) omvatten, wordt verwerkt in meerdere klinische preparaten voor CKD en heeft aangetoonde therapeutische voordelen. Om de rol van CCP bij nierveroudering te onderzoeken, werd een door D-galactose geïnduceerd renale senescentiemodel bij muizen opgezet, waarbij CCP als interventie werd toegediend. Behandelingsuitkomsten werden geëvalueerd met behulp van senescence-gerelateerde kleuring en beoordelingen van de nierfunctie. Een door D-galactose geïnduceerd verouderingsmodel in HK-2-cellen werd verder ontwikkeld om onderliggende cellulaire mechanismen te onderzoeken. JC-1-kleuring en detectie van reactieve zuurstofsoorten (ROS) werden gebruikt om mitochondriale veranderingen na CCP-behandeling onder senescente omstandigheden te beoordelen. Immunofluorescentie, western blotting en kwantitatieve PCR (RT-PCR) werden uitgevoerd om de effecten van CCP op MAPK-fosforylering, NF-κB nucleaire translocatie en NLRP3-inflammasoomactivatie te evalueren. De resultaten tonen aan dat CCP de tubulointerstitiele celsenescentie, nierschade en fibrose vermindert, terwijl de mitochondriale functie verbetert in zowel cellulaire als diermodellen van door D-galactose geïnduceerde senescentie. Deze effecten zijn geassocieerd met modulatie van de ROS/MAPK/NF-κB/NLRP3 signaalroute.

Inleiding

Chronische nierziekte (CKD) is een van de meest voorkomende nieraandoeningen en treft wereldwijd een grote bevolking. Het voorkomen ervan is nauw verbonden met veroudering¹. Niertubuli zijn de primaire functionele eenheden van de nier, en cellulaire senescentie binnen niertubulaire epitelcellen (RTEC's) is een belangrijke factor van de nierfunctieachteruitgang². Blootstelling aan medicijnen en andere stressfactoren kunnen tubeulare, stress-geassocieerde senescentie veroorzaken, wat leidt tot progressief verlies van nierfunctie en uiteindelijk progressie naar eindstadium nierziekte (ESKD). Daarom kan het richten op veroudering bij RTEC's een effectieve strategie zijn om de veroudering van de nieren te vertragen en CKD te voorkomen of te behandelen.

Chronische ontsteking is een kenmerk van het ouder worden van³ jaar oud en een belangrijke oorzaak van veel leeftijdsgerelateerde ziekten. Pro-inflammatoire cytokines die door senescente cellen vrijkomen, staan gezamenlijk bekend als het senescentie-geassocieerde secretorisch fenotype (SASP)⁴. SASP bevordert aanhoudende ontsteking, induceert senescentie in naburige cellen en draagt bij aan progressieve functionele achteruitgang⁵. Het D-galactose (D-gal)-geïnduceerde senescentiemodel is een van de meest gebruikte experimentele verouderingsmodellen. Eerdere studies hebben aangetoond dat D-gal-behandeling leidt tot intracellulaire accumulatie van reactieve zuurstofsoorten (ROS), mitochondriale disfunctie, verstoring van de redoxhomeostase en inductie van stressgerelateerde cellulaire senescence⁶. In vergelijking met natuurlijke verouderingsmodellen, die tijdrovend zijn en een hoge interindividuele variabiliteit vertonen, biedt het door D-galactose geïnduceerde model voordelen zoals eenvoud, snelle inductie en relatief lage intra-groep variabiliteit. Dit model is toepasbaar op zowel in vivo- als in vitro-studies. Hoewel het niet volledig langzame, pathologievrije natuurlijke veroudering reproduceert, is het goed geschikt om niersenescentie te modelleren, gezien de hoge metabole activiteit van de nier en de vatbaarheid voor oxidatieve stress. Vanuit mechanistisch perspectief bevordert D-galactose de cellulaire senescentie voornamelijk door oxidatieve stress, in overeenstemming met onderzoeken gericht op ROS-generatie en mitochondriale disfunctie tijdens veroudering.

Cordyceps sinensis is een traditionele Chinese medicinale schimmel die veel wordt gebruikt bij de behandeling van niergerelateerde^ziekten. Het bevat meerdere bioactieve componenten, waaronder polysachariden, adenosine, aminozuren, cordycepine en ergosterol. Extracten en gefermenteerde preparaten van Cordyceps sinensis vertonen ontstekingsremmende, antioxiderende en anti-verouderingseigenschappen 8,9,10,11. Zo is aangetoond dat Cordyceps-polysacchariden ontstekingsinfiltratie verminderen in een astma-muismodel door het remmen van de TGF-β1/Smad-signaalroute¹². Daarnaast kunnen Cordyceps-polysacchariden de fosforylering van de MAPK-route onderdrukken en de expressie van inflammatoire cytokines zoals IL-6 en IL-1β in RAW264.7 cellen¹³ verminderen. Eerdere studies hebben aangetoond dat Cordyceps polysaccharides (CCP), het belangrijkste bioactieve bestanddeel van Cordyceps sinensis, de veroudering in renale tubulaire epitheelcellen kan verminderen door autofagie te reguleren en de productie van SASP te onderdrukken. De moleculaire mechanismen waarmee CCP ROS-gemedieerde schade tegengaat, blijven echter onvolledig gekarakteriseerd.

De huidige studie onderzoekt de beschermende effecten van CCP tegen nierveroudering bij muizen en onderzoekt de effecten ervan op ontsteking, oxidatieve stress en veroudering met behulp van een door D-galactose geïnduceerd model van veroudering van renale tubulaire epitheelcellen. We onderzoeken verder of CCP de ROS-productie, mitochondriale functie en downstream signaalroutes moduleert, waaronder MAPK-fosforylering, NF-κB nucleaire translocatie en NLRP3-inflammasoomactivatie. Samen is dit werk bedoeld om experimenteel bewijs te leveren dat het gebruik van CCP ondersteunt in studies naar nierveroudering en leeftijdsgebonden nierletsel. De algehele experimentele workflow en het voorgestelde mechanisme worden samengevat in Figuur 1.

Protocol

Alle dierprocedures werden uitgevoerd volgens de institutionele richtlijnen en goedgekeurd door de Animal Ethics Committee van de Nanjing University of Chinese Medicine (Ethische Goedkeuring nr. 202108A006). Al het afval dat werd geproduceerd tijdens celkweek en kleuringsprocedures werd verzameld in afgesloten containers en biohazardzakken en afgevoerd door een erkende medische afvalbeheerdienst.

Diermodel en therapeutische interventies

Om interindividuele variatie te minimaliseren, werden 40 muizen willekeurig toegewezen aan vijf groepen (n = 8 per groep) en onderworpen aan de volgende interventies: (1) Controlegroep: Kreeg intragastrische toediening van 0,2 mL zoutoplossing per muis; (2) Modelgroep: Kreeg dagelijks subcutane injecties van D-galactose (250 mg/kg), toegediend als 0,2 mL van een 25 mg/mL oplossing per muis; (3) CCP-groep met lage dose: Kreeg D-galactose-injecties gecombineerd met intragastrische toediening van CCP bij 50 mg/kg (0,2 mL van een 5 mg/mL oplossing per muis); (4) Hoogdosis CCP-groep: Kreeg D-galactose-injecties gecombineerd met intragastrische toediening van CCP bij 100 mg/kg (0,2 mL van een 10 mg/mL oplossing per muis); (5) Vitamine E-groep: Kreeg D-galactose-injecties gecombineerd met intragastrische toediening van vitamine E bij 100 mg/kg (0,2 mL van een 10 mg/mL oplossing per muis). Na 8 weken behandeling werden muizen geëuthanaseerd en werden serum-, urine- en nierweefselmonsters verzameld voor latere analyses.

Analyse van de nierfunctie

De nierfunctie werd beoordeeld met commerciële assay-kits om creatinine, urinezuur en urine-eiwit te meten volgens de instructies van de fabrikant. De absorptiewaarden werden gemeten op 505 nm voor creatinine, 510 nm voor urinezuur en 585 nm voor urineproteïne met behulp van een multifunctionele microplaatlezer.

Weefseldoorsnedekleuring

Paraffine-ingebedde nierweefsels werden doorgesneden met een dikte van 4 μm. De secties werden gedeparaffiniseerd, 5 minuten geïncubeerd met hematoxyline, afgespoeld met stromend water, gedifferentieerd met 1% zuuralcohol gedurende 5 seconden, en opnieuw afgespoeld. Na een 1 minuut durende fosfaatgebakken zoutoplossing (PBS) wasbeurt werden secties 3 minuten gekleurd met eosine, gedehydrateerd en gemonteerd. Voor Massons trichrome kleuring werden secties gedeparaffiniseerd en gekleurd met hematoxyline zoals hierboven beschreven, gevolgd door Ponceau S gedurende 5 minuten en anilineblauw gedurende 5 minuten. Secties werden vervolgens uitgedroogd en gemonteerd.

Cellevensvatbaarheidstest

HK-2-cellen werden in 12-wellplaten geplaatst met 1 × 10⁵ cellen per put. Na 24 uur blootstelling aan D-galactose en Cordyceps-polysacchariden werd 10% CCK-8-oplossing aan elke put¹⁴ toegevoegd. Na incubatie bij 37 °C gedurende 30 minuten werd de absorptie geregistreerd bij 450 nm met een microplaatlezer. Kwaliteitscontroledocumentatie voor Cordyceps-polysacchariden en STR-authenticatie van HK-2-cellen wordt verstrekt in Supplemental File 1.

Omgekeerde transcriptie kwantitatieve polymerasekettingreactie

Na 24 uur celkweek werd het kweekmedium verwijderd en werd het totale RNA geëxtraheerd met het extractiereagens. De RNA-concentratie werd bepaald met een microplaatspectrofotometer en de integriteit van RNA werd geverifieerd door 2% agarosegelelektroforese. Genomisch DNA werd verwijderd en cDNA werd gesynthetiseerd door reverse transcriptie. Primerreeksen worden vermeld in de Materiaaltabel.

Meting van intracellulaire ROS-niveaus

HK-2-cellen werden in 12-wellplaten geplaatst met 1 × 10⁵ cellen per put. Bij het bereiken van 60-70% confluentie ondergingen cellen een voorbehandeling met D-galactose gedurende 12 uur. Na 24 uur blootstelling aan het medicijn werd het medium afgevoerd en werden de cellen één keer gespoeld met PBS. Intracellulaire ROS werd gedetecteerd door incubatie met een ROS-gevoelige fluorescerende sonde bij 37 °C gedurende 20 minuten, en fluorescentiebeelden werden gemaakt bij excitatie-/emissiegolflengten van 488/525 nm¹⁵.

Westelijk vlek

Cellulaire eiwitten werden gelyseerd met behulp van een RIPA-buffer en geklarificeerd door centrifugatie bij 13.000 × g gedurende 15 minuten bij 4 °C. Eiwitten werden gedenatureerd door 10 minuten te koken, en gelijke hoeveelheden eiwit (20 μg per monster) werden elektroforetisch gescheiden en overgedragen aan PVDF-membranen. Na 1 uur blokken werden membranen 's nachts geïncubeerd met primaire antistoffen. Vervolgspoelingen van PBST werden gevolgd door incubatie met HRP-geconjugeerde secundaire antilichamen, en detectie werd uitgevoerd met een versterkt chemiluminescentie (ECL) substraat¹⁶. Gegevens over antistoffen en reagensidentificaties staan vermeld in de Materiaaltabel.

SA-β-gal verouderingskleuring

HK-2-cellen werden geplateerd in platen met 12 putten met een dichtheid van 1 × 10⁵ cellen per put. Wanneer de cellen 60-70% confluentie bereikten, werden ze voorbehandeld met D-galactose gedurende 12 uur. SA-β-gal kleuring werd uitgevoerd volgens het protocol van de fabrikant, en gekleurde cellen werden waargenomen met een optische microscoop¹⁷.

Meting van het mitochondriale membraanpotentiaal

Het mitochondriale membraanpotentiaal werd geëvalueerd met de JC-1 fluorescentieprobe volgens de instructies van de leverancier. JC-1 monomeren werden gedetecteerd bij excitatie-/emissiegolflengten van 490/530 nm, terwijl JC-1 aggregaten werden gedetecteerd bij 525/590 nm. Beelden werden gemaakt wanneer heldere rode of groene fluorescentiesignalen werden waargenomen.

Statistische analyse

De gegevens werden gepresenteerd als staaf- of puntdiagrammen en geanalyseerd met behulp van de geraadpleegde software. Western-blotbandintensiteiten werden gekwantificeerd met behulp van ImageJ. De gegevens werden geanalyseerd door variantieanalyse (ANOVA) met daaropvolgende t-tests voor vergelijkingen tussen groepen. Statistische significantie werd gedefinieerd als een P-waarde < 0,05. Symbolen geven vergelijkingen aan met de controlegroep (*) of de D-gal groep (#) (*P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001).

Resultaten

D-galactose werd gebruikt om een muisverouderingsmodel op te stellen, waarbij vitamine E vaak diende als een veelgebruikte positieve controle tegen senescentie. Verouderde muizen werden behandeld met verschillende doses Cordyceps polysacchariden (CCP). Oudere muizen vertoonden aanzienlijke nierbeschadiging, zoals blijkt uit verhoogde urine-eiwitspiegels, serumurinezuur en creatinineniveaus (Figuur 2B-D). Zowel vitamine E- als CCP-suppletie v...

Discussie

Deze studie toont de beschermende effecten van Cordyceps-polysacchariden aan op niertubulaire epitheelcellen en levert bewijs dat ze inflammatoire senescentie in HK-2-cellen verzwakken door het ROS/MAPK/NF-κB/NLRP3-signaalpad te moduleren. Deze bevindingen verduidelijken verder mogelijke mechanismen die ten grondslag liggen aan de effecten van Cordyceps sinensis-afgeleide verbindingen bij de behandeling van acute en chronische nierziekten en bied...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Casepase1/Cleaved Rabbit pAb	WL03450	Wanlei, Shengyang, China
CCK-8 Kit	C0037	Biyotime,Shanghai,China
CCP	B21296	Yuanye Bio,Shengyang, China
Creatinine Test Kit	C011-2-1	Jiancheng,Nanjing,China
D-gal	HY-N0210	MCE, USA
ERK Rabbit pAb	4695	CST, USA	AB_390779
gapdh Rabbit pAb	ac033	Abclonal, Wuhan, China
H & E staining Kit	G1120	Solarbio,Beijing,China
JC-1 Kit	C2003S	Biyotime,Shanghai,China
Masson's staining Kit	G1340	Solarbio,Beijing,China
NLRP3 Rabbit pAb	WLH3383	Wanlei, Shengyang, China
P21 Rabbit pAb	64016s	CST, USA	AB_2892063
p38 Rabbit pAb	9212	CST, USA	AB_330713
p50 Rabbit pAb	3035	CST, USA	AB_330564
p65 Rabbit pAb	8242	CST, USA	AB_10859369
p-ERK Rabbit pAb	4370	CST, USA	AB_2315112
Phospho-SAPK/JNK mAntibody	4668	CST, USA	AB_823588
p-p38 Rabbit pAb	4511	CST, USA	AB_2139682
ROS Staining Kit	S0033S	Biyotime,Shanghai,China
SAPK/JNK Antibody	9256	CST, USA	AB_2250373
SA-β-gal Kit	C0602	Biyotime,Shanghai,China
Uric Acid Test Kit	C012-2-1	Jiancheng,Nanjing,China
Urinary Protein Detection Kit	C035-2-1	Jiancheng,Nanjing,China
Vitamin E	S27812	Yuanye Bio,Shengyang, China
Primer voor pcr
Gennaam	Voorwaartse primer	Omgekeerde primer
Caspase-1	5’-TACAGACAAGGGTGCTGAACAA-3’	5’-CGGAATAACGGAGTCAATCAAA-3’
GAPDH	5’-AGAAGGTGGTGAAGCAGGCGTC-3’	5’-AAAGGTGGAGGAGTGGGTGTCG-3’
NLRP3	5’-GATCTTCGCTGCGATCAACAG-3’	5’-CGTGCATTATCTGAACCCCAC-3’