Een point-of-care platform voor gelijktijdige triplex PCR-detectie van Chikungunya-, dengue- en Zikavirusinfecties

Samenvatting

Dit artikel beveelt een volledig geautomatiseerd geïntegreerd systeem aan dat gebruikmaakt van triple PCR-technologie om gelijktijdig co-infecties van Chikungunya, Dengue en Zika-virus te diagnosticeren met één monster, waardoor de testefficiëntie in klinische en eerstelijnslaboratoria wordt geoptimaliseerd.

Samenvatting

Chikungunya-koorts (CHIKF), een acute virale ziekte die door muggen wordt overgedragen en voor het eerst werd ontdekt in Tanzania in 1952, vertoont een intermitterende verspreiding in China, met toenemende lokale uitbraken. In juli 2025 had de provincie Guangdong, momenteel het centrum van de uitbraak, 4.824 lokale gevallen gemeld, waaronder bijna 3.000 nieuwe besmettingen in slechts één week. Deze snelle toename creëert een dringende behoefte aan geavanceerde diagnostische technologieën. Dergelijke instrumenten zijn cruciaal om de indammingsinspanningen aan het front te ondersteunen. Wij stellen een oplossing voor voor de snelle gelijktijdige detectie van dengue (DENV), chikungunya (CHIKV) en Zika-virus (ZIKV) infecties om de mogelijkheden voor vroege epidemiepreventie en -controle te verbeteren. Deze aanpak omvat het ontwikkelen van aangepaste testprotocollen voor grenscontroles en eerstelijnszorginstellingen.

Traditionele diagnostische methoden voor CHIKV en DENV missen vaak gevoeligheid/specificiteit bij co-infectiegevallen. Aangezien CHIKV, DENV en ZIKV vergelijkbare transmissiepatronen en symptomen delen, is gelijktijdige monitoring cruciaal. Dit protocol biedt een triplex qPCR-methode waarbij TaqMan-probes worden gebruikt om deze arbovirussen binnen 90 minuten in één buis te detecteren. In vergelijking met virale kweek en serologische tests verbetert deze methode de efficiëntie door actieve infecties en co-infecties met hoge specificiteit te identificeren, terwijl de workflow wordt vereenvoudigd en gespecialiseerde apparatuur wordt geëlimineerd.

Validatie met klinische en External Quality Assessment (EQA) monsters bevestigde 100% overeenstemming met goudstandaard singleplex-assays. Deze methode dient als een effectief hulpmiddel om koortsziekten te monitoren in endemische gebieden, vooral in omgevingen met beperkte middelen waar snelle uitbraakbeheersing cruciaal is.

Inleiding

Chikungunya-koorts (CHIKF) is een steeds vaker voorkomende arbovirale ziekte die voornamelijk wordt overgedragen door de muggenvectoren Aedes aegypti en Aedes albopictus. Gekenmerkt door terugkerende uitbraken in tropische gebieden, manifesteert deze ziekte zich klinisch als een acute koortsziekte, vaak gepaard gegaan met hevige gewrichtspijn en aanhoudende artritis¹. Op 26 juli was het cumulatieve totaal van laboratoriumbevestigde chikungunya-gevallen in Foshan City 4.824 bereikt, waarvan een opmerkelijke 87,2% van deze gevallen in het district Shunde plaatsvond. Deze uitgesproken geografische concentratie legt een aanzienlijke last op de regionale volksgezondheidsinfrastructuur en leidt tot aanzienlijke zorgkosten, samen met bredere macro-economische uitdagingen².

In de context van de steeds overlappender circulatie van CHIKV-, DENV- en ZIKV-virussen ondervinden de huidige diagnostische methodologieën drie primaire beperkingen. Ten eerste kunnen serologische assays acute infecties niet onderscheiden vanwege de langdurige persistentie van antistoffen na virale clearance¹. Ten tweede vertonen virale kweektechnieken een lage gevoeligheidsgraad en vereisen ze enkele dagen, waardoor tijdige klinische besluitvorming wordt belemmerd. Ten derde, hoewel kwantitatieve PCR-assays een hoge specificiteit (boven de 95%) aantonen, kunnen ze geen co-infecties binnen één enkele reactie detecteren, wat een aanzienlijk nadeel is gezien het gerapporteerde CHIKV-DENV co-infectiepercentage van 12,8% in India³. Fylogenetische monitoring wijst op een paradigmaverschuiving. De ECSA-lijn, die dominant was tijdens de Indiase epidemie van 2019-2022, heeft convergente mutaties in haar enveloppeneiwitten verkregen: E1-A226V (versterkt de infectie van muggen) en E2-K252Q (geassocieerd met immuunontwijking). Deze mutaties hebben geleid tot een genotype met gedocumenteerde hogere virulentie, zoals gerapporteerd in recente surveillancestudies uit Kerala en Maharashtra³. Tegelijkertijd wordt China geconfronteerd met uitdagingen door de invoer van het ECSA-genotype, zoals gedocumenteerd in de uitbraak van Yunnan, en andere genotypen, waarbij autochtone overdracht in meerdere provincies is gemeld, waaronder Yunnan⁴.

Deze realiteiten creëren urgente, beperkte middelen benodigde behoeften voor (i) differentiële diagnose ondanks overlappende klinische manifestaties⁵, (ii) diagnostische assays die de complexiteit van instrumentatie elimineren die typisch vereist is door conventionele realtime kwantitatieve PCR (qPCR)⁶, en (iii) uitgebreide validatie van nieuwe point-of-care technologieën, waaronder RT-LAMP en CRISPR-gebaseerde methoden⁵. Om deze diagnostische uitdagingen aan te pakken, stellen we een snelle triple-PCR-assay voor die gebruikmaakt van een volledig geautomatiseerd geïntegreerd systeem, waarmee gelijktijdige detectie van CHIKV, DENV en ZIKV in één enkele reactie mogelijk is. We valideerden de prestaties van onze triplex qPCR-assay door directe vergelijking met gevestigde singleplex assays⁵, die als referentiestandaard dienden. De volgende secties beschrijven de procedures voor zowel de triplex-assay als de referentie-singleplex-assays. De vergelijkende analyse van resultaten van beide methoden wordt gepresenteerd in de sectie Representatieve Resultaten.

Protocol

Deze studie volgt de ethische richtlijnen die zijn vastgesteld door de Ethische Commissie van het Guangdong Provincial Volksziekenhuis, Southern Medical University, Guangzhou, China (goedkeuringsnummer: KY2025-510-01). Gedetailleerde informatie over de materialen die in dit onderzoek zijn gebruikt (reagentia, chemicaliën, apparatuur en software) is te vinden in de Materiaaltabel.

1. Selectie van deelnemers

1. Kies deelnemers in de leeftijd van 18 tot 60 jaar.
2. Kies deelnemers die binnen 12 dagen na het begin van de symptomen een acute koortsziekte (axillaire T ≥ 38 °C) presenteren, plus uitslag, artralgie of cervicale lymfadenopathie, en recente reizen naar chikungunya-endemische gebieden; of asymptomatische personen met identieke reisgeschiedenis.
3. Uitsluiting: gebruik van antimicrobiale/antivirale middelen binnen 7 dagen of koortsziekte veroorzaakt door bevestigd hiv of kwaadaardigheid.

2. Monsterverzameling en verwerking

1. Controleer of de buitenste verpakking van de monsterdoos niet beschadigd is en niet is verlopen, en verwijder vervolgens de interne materialen.
2. Plaats het onderwerp met de arm uitgestrekt. Identificeer de mediane cubitala vene, breng een tourniquet aan en desinfecteer de veniptuurplaats met een 70% alcoholuittje.
3. Verzamel 1~3 ml bloed uit de antecubitale vena van het onderwerp met behulp van een bloedbuis zonder antistollingsmiddelen.
4. Draai de buis voorzichtig 5-8 keer om en laat hem 30 minuten stollen bij kamertemperatuur.
5. Centrifugeer het bloedmonster op 4 °C, 1000 x g op een centrifuge, gedurende 10 minuten. Het na centrifugatie verkregen serummonster kan onmiddellijk worden getest.
6. Verwijder het supernatant-serum zorgvuldig in steriele microcentrifugebuizen. Gebruik het serum onmiddellijk voor testen, of bewaar aliquoten bij -80 °C tot verdere analyse van pathogene nucleïnezuren via qPCR.

3. Geautomatiseerde Triplex qPCR-detectie van CHIKV, DENV en ZIKV

1. Reagens en buisvoorbereiding
   1. Haal alle benodigde reagentia uit de opslag en ontdooi ze bij kamertemperatuur.
   2. Controleer visueel elke afgesloten TD-detectiebuis op schade of afdichtingsfout. Gooi alle beschadigde buizen weg.
   3. Kort vortex je de TD nucleïnezuurextractiebuffer 5 seconden om homogeniteit te garanderen.
   4. Aseptisch doseer 500 μL van de gehomogeniseerde buffer in een TD-extractie-reagensbuis (met paarse gevriesdroogde magnetische kralen).
   5. Draai het mengsel krachtig 30 seconden totdat alle componenten volledig zijn opgelost en de kralen volledig opnieuw zijn opgehangen.
   6. Breng de gehele gereconstitueerde oplossing over in een vooraf gelabelde TD-detectiebuis.
2. Monsterlading
   1. Pipetteer 200 μL helder, niet-hemolyseerd en niet-lipemisch serum in de voorbereide TD-detectiebuis.
   2. Sluit de buis stevig af en keer hem tien keer om zodat het homogeen is.
      OPMERKING: Laat tijdens de inversie de paraffinelaag kort in de buis zweven. Dit is een normaal onderdeel van het proces.
3. Instrumentbediening en gegevensverzameling
   1. Plaats de afgesloten detectiebuizen in de aangewezen sleuven van de analyzer.
   2. Voer op de touchscreeninterface de voorbeeldidentificatiegegevens in.
   3. Druk op Start Detection om de volledig geautomatiseerde, gesloten buis workflow te starten.
      OPMERKING: Het systeem voert automatisch barcodescanning, nucleïnezuurextractie via magnetische parelvangst en fluorescentie PCR-versterking uit zonder verdere tussenkomst van de gebruiker. Het standaardprogramma omvat een denaturatiestap bij 95 °C gedurende 3 minuten, gevolgd door 40 cycli versterking.
4. Interpretatie van het resultaat
   1. Na voltooiing van de run observeer je de versterkingsresultaten voor alle drie de doelen (CHIKV, DENV, ZIKV) en de interne besturing op hetzelfde scherm.
   2. Noteer de automatisch gegenereerde uitlezing, "Positief," "Negatief," of "Ongeldig", voor elk doelpathogeen in zijn respectievelijke fluorescentiekanaal.
      OPMERKING: De interne software van het systeem gebruikt een cyclusdrempel (Ct) van 37,0 voor automatische interpretatie. Handmatige data-analyse is niet nodig.

4. Referentie Singleplex qPCR-assays voor methodevergelijking

1. Bereiding van nucleïnezuurextractie-reagentia
   1. Haal de voorverpakte 96-wells plaat uit de kit. Tik voorzichtig op de 96-put plaat zodat de reagentia en magnetische kralen allemaal op de bodem van de 96-well plaat geconcentreerd zijn. Scheur voorzichtig de aluminiumfolie-afdichtfolie af, waarbij je trillingen van de 96-put plaat voorkomt om vloeistof te voorkomen.
   2. In kolommen 1 en 7 van een 96-wellplaat wordt eerst 20 μL proteïnase K toegevoegd, gevolgd door 200~300 μL van het te extraheren monster.
   3. Geautomatiseerde extractie van nucleïnezuur (magnetische kralen-gebaseerde methode)
      1. Voorverpakte platen met 96 putten (met monsters) worden geplaatst in de overeenkomstige sleuven van het geautomatiseerde nucleïnezuurextractorsysteem.
      2. Het extractieproces van nucleïnezuur verloopt als volgt: Adsorb de met nucleïnezuur gebonden magnetische kralen met een magnetische staaf in de laboratoriumkamer. Breng het kralencomplex over in het volgende aangewezen reagensgat. Activeer het roerapparaat om de vloeistof grondig met de magnetische kralen te mengen door snel en herhaaldelijk roeren. Laat de automatische nucleïnezuurextractor de volgende stappen automatisch uitvoeren: i) Cellysis: 10 min bij 25 °C. ii) Nucleïnezuuradsorptie: 15 min bij 70 °C, met magnetische adsorptie 3 keer. iii) Wassen: Meng 2 minuten (herhaal 3 keer), gevolgd door magnetische adsorptie twee keer (15 s elk). iv) Elutie: Twee keer uitvoeren (5 minuten elk), met magnetische adsorptie 3 keer. Uiteindelijk verkrijg je hoogzuivere nucleïnezuren.
   4. Voor onmiddellijke detectie aspireer je direct het nucleïnezuurhoudende eluaat uit kolommen 6 en 12. Voor langdurige opslag brengt u de resterende nucleïnezuurmonsters over tot -20°C.
2. Bereiding van versterkingsreagentia
   OPMERKING: Voor een Singleplex PCR-reactie bereid je drie aparte PCR-buizen voor met drie verschillende enzymen en drie bijbehorende reactiemengsels. Voltooi de voorbereiding van het reagens in drie afzonderlijke stappen. Aangezien de voorbereidingsstappen vergelijkbaar zijn, zullen we hieronder alleen de voorbereidingsstappen voor het CHIKV-detectiereagens demonstreren.
   1. Verwijder de nucleïnezuuramplificatie-reactieoplossing en de CHIKV-reactieoplossing (CHIKV-specifieke primers/probes) uit de kit. Na het ontdooien plaats je ze in een omgeving van 22~25 °C, meng ze grondig door krachtig schudden, en voer je vervolgens een korte centrifugatie uit (1000 x g, 15 s, 22~25 °C).
   2. Bereken het totale aantal reacties als N + 2 (waarbij N = aantal testmonsters, +2 = één negatieve en één positieve kwaliteitscontrole). Bereid de Master Mix voor in een passend formaat microcentrifugebuis door voor elke reactie het volgende te combineren: 17 μL nucleïnezuurversterkingsreactieoplossing (met buffer, dNTP's, DNA-polymerase, UDG-enzym), 3 μL CHIKV-reactieoplossing (met primers, probes voor CHIKV-doelgenen en IC). Vortex de Master Mix grondig om een volledige mix te garanderen. Centrifugeer de buis kort op 10.000 x g gedurende 15 seconden bij kamertemperatuur (22~25 °C) om de oplossing op de bodem op te vangen. Dozeer 20 μL van de Master Mix in elke PCR-reactiebuis.
   3. Voeg nucleïnezuur- en kwaliteitscontrolemonsters toe: Voeg respectievelijk 5 μL nucleïnezuur toe uit geteste monsters, positieve controle en negatieve controle, wat een eindvolume van 25 μL per buis bereikt; Sluit de buizen strak af en voer onmiddellijke centrifugatie uit (1000 x g, 15 s, 22 ~25 °C) en plaats vervolgens de buizen in het PCR-instrument.
3. PCR-versterking
   1. Stel het cyclusprogramma als volgt in: Pre-denaturatie: 50 °C gedurende 15 minuten, daarna op 95 °C voor 15 minuten (beide stappen samen vormen 1 cyclus); de volgende 2 stappen voor 40 cycli: 94 °C denaturatie voor 15 seconden en 55 °C gloeien voor 45 seconden.
   2. Stel de parameters voor het detecteren van het fluorescentiesignaal als volgt in: FAM-fluorescentielabeling van CHIKV-genen; VIC-fluorescentielabeling van het IC-gen wordt gebruikt als interne controle van de kit. Verzamel gegevens bij 55 °C. Na voltooiing van de reactie zorg ervoor dat de gegevens worden opgeslagen voor toekomstige analyse.
   3. Analyseer data met qPCR-specifieke software
      1. Voorbeeldinformatie: In het indelingsdiagram van de putplaat van de software labelen de monstertypes (bijv. positieve controle, negatieve controle, onbekend monster, intern referentiegen, enz.) die overeenkomen met de laadposities van het monster.
      2. Plaatsen van de reactiebuizen: Open het deksel van de verwarmingsmodule van het instrument, plaats de afgesloten PCR-plaat/buizen stevig binnenin, zorg dat ze nauw aansluiten op de verwarmingsmodule en sluit het moduledeksel stevig (om temperatuurverschillen te voorkomen)
      3. De reactie starten: Nadat je hebt bevestigd dat de programma-instellingen in de software correct zijn, klik je op Start Run en noteer je de experiment-ID voor toekomstige referentie.
      4. Het stoppen van de aanloop en het verwijderen van buizen: Zodra het programma voltooid is, wacht tot de temperatuur van het verwarmingsmodule onder de 50 °C is gedaald. Open vervolgens het deksel en verwijder voorzichtig de PCR-plaat of tubes. Ga verder met downstream analyse of monsteropslag indien nodig.
      5. Data-analyse Voordat je met de analyse begint, bevestig dat: i) de versterkingscurves voor alle monsters en de interne controle karakteristiek S-vormig zijn; ii) De fluorescentiedrempel wordt ingesteld binnen de exponentiële fase, wat Ct-waarden ≤ 38 cycli oplevert (CV < 5%); iii) Controleresultaten zijn geldig en wijzen op geen besmetting. Als aan een voorwaarde niet voldaan is of als een monster abnormale versterking vertoont (bijvoorbeeld een atypische curve of een kritische Ct), controleer dan de hele batch of het specifieke monster opnieuw.
      6. Verwerk de ruwe data met de software om de CT-waarden te bepalen, met behulp van de automatisch geselecteerde drempel; een steekproef wordt als positief beschouwd als Ct < 38 en de versterkingscurve een sigmoïdale vorm vertonen.

5. Bioveiligheid en afvalverwerking

1. Breng alle materialen over naar een aangewezen, prikbestendige biohazardcontainer en ontsmet door autoclaven voordat het laatste gedoe wordt door het institutionele medische afvalsysteem. Breng deze materialen onmiddellijk over in een lekvrije, doorboorbare biohazardcontainer die is gelabeld voor hoogrisicoafval. Na institutionele richtlijnen moet u al het afval met geamplificeerde producten ontsmetten door autoclaven (bijv. 121 °C gedurende 30 minuten) om pathogenen te inactiveren en nucleïnezuren af te breken. Voer tenslotte het gesteriliseerde afval af via het aangewezen systeem voor medisch afvalbeheer.
   OPMERKING: Voer alle stappen uit in overeenstemming met de Biosafety Level 2 (BSL-2) praktijken, waarbij u passende persoonlijke beschermingsmiddelen gebruikt om blootstellingsrisico's te minimaliseren.

Resultaten

Om de stabiliteit en nauwkeurigheid van het triple PCR-detectiesysteem te valideren, selecteerden we vijf klinisch representatieve monsters uit ons interne laboratorium en tien externe EQA-blinde monsters voor verificatie. Deze vijf representatieve klinische steekproeven bevatten zowel negatieve als positieve gevallen (S1-S5), waaronder positieve steekproeven voor CHIKV en DENV, geselecteerd om de klinische toepasbaarheid van de assay aan te tonen en interne validatie van testprestaties te ondersteunen (Tabel 1

Discussie

CHIKV is een enkelstrengs RNA-virus met positieve zin, geclassificeerd binnen het alfavirusgeslacht van de familie^{Togaviridae 7}. Versnelde opwarming van de aarde, intensieve internationale handel en uitbreiding van toerismenetwerken hebben samen het risico op menselijke blootstelling aan arbovirale dreigingen^verhoogd. In het afgelopen decennium heeft de snelle evolutie van moleculaire diagnostiek het landschap van infectieziektebeheer funda...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Automated nucleic acid extractor	DAAN	Smart 32	Voor DNA-extractie
BECKMAN X-12	BECKMAN	ALA04H01	Voor  serumcentrifugeren
BSC-1500IIA2-X	BIOBASE	SEDA 20143222263	Bioveiligheidskabinet
E-Centrifuge	WEALTEC		Centrifugeer de resterende vloeistof van de wand van de buis
Volledig automatische medische PCR-analyzer	Bioustar‌	UP0102	Fluorescente kwantitatieve PCR-amplificatie
Nucleïnezuur detectiekit voor chikungunya virus (PCR-fluorescentie sonde methode)	DAAN	20250804	Detectie van  chikungunya virus genen
Nucleïnezuur detectiekit voor Dengue virus (PCR-fluorescentie sonde methode)	DAAN	202504003	Detectie van  Dengue virus genen
Nucleïnezuur detectiekit voor Dengue virus, Zika virus en chikungunya virus (PCR-fluorescentie sonde methode)	Bioustar‌	20250724	Detectie van  Dengue virus, Zika virus en chikungunya virus genen
Nucleïnezuur detectiekit voor Zika virus (PCR-fluorescentie sonde methode)	DAAN	202508041	Detectie van Zika virus  genen
Nucleïnezuur extractiekit	DAAN		Extraheer nucleïnezuur
SLAN Volledig automatisch medisch PCR-analysesysteem	HONGSHI		Gegevensanalyse
SLAN-96S Real-Time PCR-machine	HONGSHI	SLAN-96S	Fluorescente kwantitatieve PCR-amplificatie
Ultra-lage temperatuur vriezers (DW-YL450)	MELING	SEDA 20172220091	-20 °C voor het bewaren van reagentia
Vortex-5	Kylin-bell		Voor het mengen van reagens